CN116323923A - 冷冻保存的内皮细胞组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在冷冻培养基中包含高密度内皮细胞(例如人脐静脉内皮细胞)的组合物、生产此类组合物的方法以及使用此类组合物制备治疗性内皮细胞组合物的方法。此类组合物和方法提供了许多优点，包括消除了在将治疗性内皮细胞组合物给予人受试者之前去除冷冻保存剂的需要，以及在用于治疗方法之前需要最少的操作和人为干预。

Description

冷冻保存的内皮细胞组合物
相关申请的引用
本申请要求2020年8月10日提交的美国临时专利申请号63/063,668的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包括已以ASCII格式电子提交的序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2021年8月10日，命名为Angiocrine_027_WO1_SL.txt且大小为1,543字节。
通过引用并入
出于仅仅那些允许通过引用并入的管辖区的目的，本公开中引用的参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商说明或目录均通过引用并入。通过引用并入本文本的文献或其中的任何教导可用于本发明的实践。美国专利号8,465,732中提供的许多一般教导可与本发明结合使用，或可适于与本发明一起使用。因此，美国专利号8,465,732的全部内容特此通过引用明确地并入本申请。
背景技术
内皮细胞(EC)，诸如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，广泛用于研究，并且也用于细胞疗法应用的临床开发。EC(诸如HUVEC)通常以约100万个细胞/ml的浓度冷冻在含有一种或多种冷冻保存剂(诸如二甲基亚砜(DMSO))的细胞冷冻培养基中(例如，参见Polchow etal.,(2012),“Cryopreservation of human vascular umbilical cord cells undergood manufacturing practice conditions for future cell banks,”Journal ofTranslational Medicine,10:98；Sultani et al.,(2016),“Improved Cryopreservationof Human Umbilical Vein Endothelial Cells:A Systematic Approach,”Sci.Rep.,6,34393；和Pegg et al.,(2002),“Cryopreservation of vascular endothelial cells asisolated cells and as monolayers.”Cryobiology,44,46–53)。对于临床应用，向用户提供的小瓶EC经冷冻，然后解冻、成粒以将EC与冷冻培养基和冷冻保存剂分离，重新悬浮在生理盐水中，并转移到输液袋中，然后可以将它们给予患者。可以需要合并多瓶冷冻EC的内容物和/或EC需要在培养物中扩增，以获得足够的细胞向患者给药。从接收冷冻细胞到将细胞给予患者的整个过程涉及许多操作，包括多次离心步骤、容器更换和培养基/溶液更换—每一个操作都有污染的风险。该过程也非常耗费劳力和时间，并且容易出现人为错误。因此，本领域需要提供可以允许整个过程—从接收冷冻EC到使用EC(例如通过将细胞输注到患者体内)—以最少的操作安全且有效地进行的组合物和方法。本发明解决了这种需要。
发明内容
本发明部分地基于这样的发现，即EC(诸如HUVEC)可以以每ml约1亿个细胞的密度冷冻和解冻，具有极好的细胞复苏(恢复，recovery)和细胞活力，然后可以在去除或不去除冷冻保存剂的情况下简单地稀释解冻的细胞，以产生可以安全地给予人类患者的治疗组合物。据我们所知，以如此密度冷冻和解冻EC是前所未有的。
通常情况下，EC以我们在本文中描述的浓度的约1/20倍至1/100倍的浓度进行冷冻和解冻。例如，Sultani et al.的题为“Improved Cryopreservation of HumanUmbilical Vein Endothelial Cells:A Systematic Approach”的出版物描述了开发改善的HUVEC冷冻保存系统的工作。参见Sultani et al.,2016,Sci.Rep.,Vol.6,34393,p.1-14。在Sultani的研究中，以100-200万个细胞/ml的浓度冷冻HUVEC，并且虽然Sultani描述了经过调整和优化的冷冻保存方案的许多方面，但没有改变细胞冷冻密度。类似地，Polchow et al.的题为“Cryopreservation of human vascular umbilical cord cellsunder good manufacturing practice conditions for future cell banks”的出版物描述了用于临床使用的HUVEC的制备，并且描述了在含有10％DMSO和20％人血清白蛋白(HSA)的冷冻培养基中以100万个细胞/ml的浓度冷冻HUVEC。参见Polchow et al.,2012,Journalof Translational Medicine,Vol.10,98,p.1-17。并且许多其它论文和细胞培养指南描述了以50万至500万个细胞/ml的浓度的冷冻保存EC和HUVEC。(例如，参见Lehle et al.,“Cryopreservation of human endothelial cells for vascular tissueengineering,”2005,Cryobiology,Vol.50,p.154–161；Lonza,“CloneticsTMEndothelialCell System；Technical Information&Instructions,”2002,www.lonza.com；Pegg.,“Cryopreservation of vascular endothelial cells as isolated cells and asmonolayers,”2002,Cryobiology,Vol.44,p.46–53；Reardon et al.,“Investigatingmembrane and mitochondrial cryobiological responses of HUVEC usinginterrupted cooling protocols,”2015,Cryobiology,Vol.71,p.306–317；和vonBomhard et al.,“Cryopreservation of Endothelial Cells in VariousCryoprotective Agents and Media–Vitrification versus Slow Freezing Methods,”2016,PLoS ONE,Vo.11.No.2)。
可以已经预期我们在本文中描述的极高细胞冷冻密度是不利的—例如，由于限制了每个细胞的冷冻保存剂和/或营养物的可用性或对细胞造成的物理应激(应力，stress)。事实上，先前使用各种细胞类型的研究已经发现在高密度下冷冻细胞会产生不利影响。例如，De Loecher et al.的一项研究发现，在冷冻保存期间增加红细胞浓度会增加解冻后的溶血，并且在冷冻保存期间增加肝细胞浓度会显著降低解冻后肝细胞的活力和代谢活性。参见De Loecher et al.,“Effects of Cell Concentration on Viability andMetabolic Activity During Cryopreservation,”1998,Cryobiology,Vol.37(2),p.103-109。作者De Loecher et al.提出这可能是由于冷冻和解冻循环期间发生的非生理细胞-细胞接触产生的细胞应激所致。然而，令人惊讶的是，当我们以典型内皮细胞冷冻浓度的20至100倍的密度冷冻内皮细胞时，我们发现并没有不利效果的证据。相反，我们解冻的EC表现出预期或优于预期的细胞活力、细胞增殖以及扩增共培养的CD34+脐血细胞的能力。
我们在本文中描述的极高细胞冷冻密度提供了许多优点。一个优点是可以在单个容器中提供用于输注到患者体内的足够EC(例如HUVEC)—避免需要合并多个EC容器的内容物。另一个主要优点是可以稀释解冻的含有EC的组合物以直接产生治疗上有用的EC组合物—即在溶液中具有适合于给予患者的EC数量和密度的EC组合物，该溶液适合于给予患者。这是可以实现的，因为在需要/使用的稀释水平下，稀释组合物中冷冻保存剂的浓度对于给予患者是安全的。这消除了通过进行离心和再悬浮步骤去除冷冻保存剂的需要，并且也意味着如果期望，可以消除将EC转移到不同容器的需要。例如，如果期望，可以将合适的稀释剂组合物直接添加到容器中，EC在该容器中冷冻和解冻以产生最终的EC组合物—然后可以在封闭系统中将该最终EC组合物直接转移至患者。
基于发现了EC(例如HUVEC)可以在本文所述的高密度下冷冻和解冻，我们还寻求对我们用于冷冻和解冻EC以及将它们给予患者的组合物和方法发展各种其它改善，包括优化所使用的人血清白蛋白(HSA)的水平。
在下文和本专利公开的其它地方进一步描述了我们为EC的冷冻保存和使用发展的改善的组合物和方法。
因此，在某些方面，本发明提供了多种组合物，其包含在冷冻培养基中的内皮细胞(EC)。这些组合物可在不同温度下和以不同状态存在—例如它们可以以冷冻前状态、冷冻/冷冻保存状态或解冻(冷冻后/冷冻保存后)状态存在。
例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含(a)高密度的内皮细胞(EC)，和(b)包含有效量的冷冻保存剂的冷冻培养基。在一些此类实施方式中，EC的密度为约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml。在一些此类实施方式中，EC的密度为约7500万个细胞/ml至约1.25亿个细胞/ml。在一些实施方式中，EC的密度为约1亿个细胞/ml。
在一些实施方式中，该组合物可以包含任何所需的EC。在一些实施方式中，该组合物包含来自选自以下组织的EC：肺、肝、肾、膀胱、胰腺、胸腺、肠、睾丸、卵巢、子宫、心脏、神经系统、脑、脊髓、眼睛、视网膜、皮肤、脂肪组织、淋巴组织、骨髓、胎盘和脐带。在一些实施方式中，该组合物中的EC是脐静脉内皮细胞(UVEC)。在一些实施方式中，该组合物中的EC是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在一些实施方式中，该组合物中的EC是E4ORF1+EC。在此类实施方式中，EC包含编码腺病毒E4ORF1蛋白的重组核苷酸序列。在一些实施方式中，此类核苷酸序列可操作地连接至异源启动子。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在载体(例如逆转录病毒载体)内。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在慢病毒载体内。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体内。在一些实施方式中，E4ORF1是人腺病毒5型E4ORF1。在一些实施方式中，EC不包含完整的腺病毒E4区。在一些实施方式中，EC不包含E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6编码序列或氨基酸序列。
在一些实施方式中，组合物中的EC可包含其它重组核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，组合物中的EC可包含编码和表达BMP4的重组核苷酸序列(即它们可以是BMP4+EC)。类似地，在一些实施方式中，组合物中的EC可包含编码ETS转录因子(如ETV2)的重组核苷酸序列(即它们可以是ETV2+EC)。
在一些实施方式中，组合物还包含人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方式中，组合物包含约10％至约20％的HSA。在一些实施方式中，组合物包含约10％的HAS。
在一些实施方式中，组合物可包含任何合适的冷冻保存剂。在一些实施方式中，冷冻保存剂选自由二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇和甘油组成的组。在一些实施方式中，冷冻保存剂是二甲基亚砜(DMSO)。例如，在一些实施方式中，组合物包含约5％至约10％的二甲基亚砜。在一些实施方式中，组合物包含约5％的二甲基亚砜。
在一些实施方式中，组合物可包含适合于内皮细胞冷冻保存的任何冷冻培养基。许多这样的冷冻培养基是本领域已知的和/或可商购的。在本专利公开的实施例部分中描述了一些此类培养基。在一些实施方式中，冷冻培养基是无血清的。
除了EC之外，在一些实施方式中，本发明的组合物还可以包含附加细胞类型。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含干细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含祖细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含间充质干细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含造血干细胞和/或造血祖细胞。在此类实施方式中，造血干细胞或造血祖细胞可来自骨髓、外周血、羊水或脐带血。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含实质细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含胰岛细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可包含神经细胞。在一些实施方式中，除了EC之外，组合物还可以包含神经胶质细胞。
在一些实施方式中，本文描述的各种组合物可以在适合用于冷冻细胞的容器(即冷冻容器)中提供。在一些实施方式中，组合物可以在冷冻管中提供。在一些实施方式中，组合物可以在冷冻袋中提供。特别希望在以下容器(例如冷冻管或冷冻袋)中提供组合物，该容器适于使其内容物(例如解冻的EC)可以无菌地从容器中取出、稀释以形成最终的临床治疗产品，并且在封闭系统中对患者进行给药以降低风险或污染。可使用的市售冷冻容器的实例包括但不限于由Daikyo制造的Crystal
Figure BDA0004113330440000061
冷冻管和由Pall Medical制造的BriostorTM转移/冷冻袋套装。
上文和本文别处描述的各种组合物可用于通常使用EC和/或EC需要冷冻/冷冻保存的任何情况—包括用于研究目的和/或用于治疗目的。
在一些实施方式中，本发明提供了制备适合给予受试者(例如人受试者)的治疗组合物的多种方法。在一些实施方式中，此类方法包括用生理盐水溶液稀释本文所述的组合物中的一种(例如先前已冷冻并随后解冻的组合物)，以产生包含稀释后适合在治疗性方法中给予受试者的EC细胞浓度的治疗组合物。例如，在一些此类实施方式中，用生理盐水稀释本文所述的组合物中的一种以产生约300万个细胞/ml至约500万个细胞/ml的最终EC浓度。在一些此类实施方式中，用于稀释的生理盐水可包含作为最终治疗组合物的所需组分的各种药剂。例如，此类组分可包括葡聚糖(例如葡聚糖40)和/或HSA。在一些此类实施方式中，此类药剂可以不在生理盐水中，但仍然被添加到组合物中。在一些实施方式中，添加葡聚糖和/或HSA(无论是在盐水中还是在其它情况下)，使得在稀释后，治疗组合物包含约8％的葡聚糖(例如葡聚糖40)和约4％的HSA。
在其它方面，本发明提供了用于冷冻内皮细胞的多种方法。
例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种冷冻内皮细胞的方法，该方法包括：(a)以约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml的密度将内皮细胞(EC)悬浮在冷冻培养基中，其中所述冷冻培养基包含有效量的冷冻保存剂，从而产生冷冻组合物，和(b)随后使冷冻组合物的温度逐渐降低至至少约-80℃至-90℃。在一些此类方法中，温度以约1℃/分钟的速率降低—例如使用受控速率冷冻器。在一些此类方法中，随后将冷冻组合物转移到液氮中。
在一些实施方式中，可使用任何所需的EC进行该冷冻方法。在一些实施方式中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行该冷冻方法。
在一些实施方式中，冷冻方法还可以包括将人血清白蛋白(HSA)添加到冷冻组合物中。在一些实施方式中，冷冻方法包括添加HSA以在冷冻组合物中得到约10％至约20％HSA的最终浓度。在一些实施方式中，冷冻方法包括添加HSA以在冷冻组合物中得到约10％HSA的最终浓度。
在一些实施方式中，冷冻方法可以使用任何合适的冷冻保存剂进行。在一些实施方式中，冷冻保存剂选自由二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油组成的组。在一些实施方式中，冷冻保存剂是二甲基亚砜。例如，在一些实施方式中，冷冻方法可以在冷冻组合物中使用约5％至约10％的二甲基亚砜进行。在一些实施方式中，冷冻方法可在冷冻组合物中使用约10％的二甲基亚砜进行。
在一些实施方式中，冷冻方法可使用适合内皮细胞冷冻保存的任何冷冻培养基进行。
在一些实施方式中，冷冻方法可以使用为E4ORF1+的EC进行。在此类实施方式中，EC通常包含编码腺病毒E4ORF1蛋白的重组核苷酸序列。在一些实施方式中，此类核苷酸序列可操作地连接至异源启动子。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在载体(例如逆转录病毒载体)内。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在慢病毒载体内。在一些实施方式中，此类核苷酸序列在莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体内。在一些实施方式中，E4ORF1是人腺病毒5型E4ORF1。在一些实施方式中，EC不包含完整的腺病毒E4区。在一些实施方式中，EC不包含E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6编码序列或氨基酸序列。
在一些实施方式中，除了EC之外，冷冻方法还可以使用附加细胞类型进行。例如，在一些实施方式中，除了EC之外，冷冻方法还可以使用造血干细胞和/或造血祖细胞进行。在此类实施方式中，造血干细胞或造血祖细胞可来自骨髓、外周血、羊水或脐带血。
在一些实施方式中，冷冻方法使用适用于冷冻细胞的容器(即冷冻容器)进行—在各种方法步骤期间EC保持在该容器中。在一些实施方式中，冷冻方法使用冷冻管进行。在一些实施方式中，冷冻方法使用冷冻袋进行。特别希望使用以下容器(例如冷冻管或冷冻袋)进行冷冻方法，该容器适于使其内容物(例如解冻的EC)可以无菌地从容器中取出、稀释以形成最终的临床治疗产品，并在封闭系统中给予患者以降低风险或污染。
在本专利公开的其它部分中进一步描述了本发明的这些和其它实施方式。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文描述的各种实施方式的某些修改和组合落入本发明的范围内。
附图说明
图1.图示了在解冻后0、2、4、6、24、48和72小时E4ORF1+HUVEC的总细胞计数。使用实施例1中描述的速率受控冷冻程序，将细胞以1x108(即1亿)个细胞/ml的浓度冷冻在2ml冷冻管中。“初始”是指冷冻前的数据。
图2.图示了在解冻后0、2、4、6、24、48和72小时E4ORF1+HUVEC的活力。使用实施例1中描述的速率受控冷冻程序，将细胞以1x108个细胞/ml的浓度冷冻在2ml冷冻管中。“初始”是指冷冻前的数据。
图3.图示了解冻后0、2、4、6、24、48和72小时E4ORF1+HUVEC的活细胞计数。使用实施例1中描述的速率受控冷冻程序，将细胞以1x108个细胞/ml的浓度冷冻在2ml冷冻管中。“初始”是指冷冻前的数据。
图4.图示了解冻后0、2、4、6、24、48和72小时E4ORF1+HUVEC的活细胞复苏。使用实施例1中描述的速率受控冷冻程序，将细胞以1x108个细胞/ml的浓度冷冻在2ml冷冻管中。
图5.条形图显示了使用实施例1中描述的HUVEC冷冻程序在2mL冷冻管中在包含5％ DMSO和20％人血清白蛋白(HSA)的冷冻培养基中，以如图所示的1.3x107(即1300万)个细胞/ml或1x108(即1亿)个细胞/ml冷冻的E4ORF1+HUVEC的百分比存活力(左图)和百分比复苏(右图)。解冻前，细胞在液氮中冷冻保存至少24小时，在含有8.3％葡聚糖和4.2％ HSA的稀释缓冲液中以1:20的比例稀释，无需任何离心/成粒或漂洗以去除冷冻保存剂。
具体实施方式
本专利公开的“发明内容”和“权利要求”部分描述了本发明的主要实施方式。本“具体实施方式”部分提供了与本发明的组合物和方法相关的某些附加描述，并且旨在与本专利公开的所有其它部分一起阅读。此外，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，贯穿本专利公开描述的不同实施方式可以并且旨在以各种不同的方式组合。本文描述的特定实施方式的此类组合旨在落入本发明的范围内。
定义和缩写
下面提供了某些定义和缩写。其它术语或短语可以在本专利公开的其它地方定义，或者可以具有从使用它们的上下文中清楚得知的含义。除非本文另有定义，或者除非一些其它含义从它们在本文上下文中的使用是清楚的，否则本文使用的所有技术和科学术语以及缩写具有与本发明相关领域普通技术人员普遍理解的相同含义。例如，TheDictionary of Cell and Molecular Biology(5th ed.J.M.Lackie ed.,2013)、OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology(2d ed.R.Cammack et al.eds.,2008)和The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(2d ed.P-S.Juo,2002)可以为技术人员提供本文使用的一些术语的一般定义。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。术语“一(a)”(或“一种(an)”)以及术语“一种或多种”和“至少一种”可以互换使用。
此外，“和/或”应被视为两个指定特征或组分中的每一个的具体公开，有或没有另一个。因此，在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B、A或B、A(单独的)和B(单独的)。同样，在诸如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括定义该范围的数字，并且本文提供的任何单个值可以用作包括本文提供的其它单个值的范围的端点。例如，一组值，诸如1、2、3、8、9和10，也公开了1-10的数字范围。
在用语言“包含”描述实施方式的任何情况下，包括以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方式。
如本文所用，当与数值相关使用时，术语“约”和“大约”表示在规定值的+或-10％以内。
如本文所用，缩写“EC”是指内皮细胞。
如本文所用，缩写“E4ORF1”是指腺病毒基因组的早期4(E4)区的开放阅读框(ORF)1，或由该ORF编码的多肽/蛋白质(是指基因还是蛋白质，从使用的上下文中会清楚得知)。
如本文所用，缩写“E4ORF1+”用于指代经工程化以表达E4ORF1的细胞。例如，缩写“E4ORF1+HUVEC”用于指代经工程化以表达E4ORF1的人脐带内皮细胞(HUVEC)。E4ORF1+细胞含有重组E4ORF1核酸分子并表达E4ORF1蛋白。
本文所用的术语“培养”是指细胞在各种培养基上或中的繁殖。“共培养”是指两种或多种不同类型的细胞在各种培养基上或中的繁殖。
如本文所用，术语“有效量”是指特定药剂(例如冷冻保存剂)或特定细胞群(例如E4ORF1+HUVEC)的量，其足以实现本文描述结果的一个或多个。例如，冷冻保存剂的有效量是导致有效细胞冷冻和冷冻后有效细胞复苏的量。在任何个案中适当的“有效量”可以凭经验确定，例如使用本领域已知的标准技术。此外，“有效量”可以使用诸如本专利公开的实施例部分中描述的那些测定来确定，以评估对细胞冷冻和/或对从细胞冷冻复苏的影响。对于本文所述的所有涉及包含指定药剂或指定细胞群的组合物或者使用指定药剂或指定细胞群的方法的实施方式，在一些实施方式中，药剂或细胞群的量是任何有效量。例如，如果没有指定具体量，则该量可以是任何有效量。
当与细胞(通常是内皮细胞，如HUVEC)关联使用时，术语“工程化”指的是已经被人为工程化以产生所列举表型(例如E4ORF1+)或表达所列举核酸分子或多肽的细胞。术语“工程化细胞”无意涵盖天然存在的细胞，而是意在涵盖例如包含重组核酸分子的细胞，或以其它方式人工改变(例如通过基因修饰)的细胞，例如以使它们表达它们本来不会表达的多肽。
术语“冷冻”和“冷冻保存”(及其语法变型)在本文中可互换使用，并根据其在本领域中的通常含义使用。
术语“基因修饰”和/或“基因修饰的”和/或“基因改变的”是指对核苷酸序列或细胞基因组或细胞遗传物质内容物的任何添加、缺失、改变或破坏。在一些实施方式中，除了被基因修饰以提供编码E4ORF1的核酸分子外，本文所述的内皮细胞还可根据需要包含一种或多种其它基因修饰。术语“基因修饰”和上述相关术语涵盖了瞬时和稳定的基因修饰，并涵盖各种不同基因递送载体(vehicles)和方法的使用，包括但不限于转导(体内或体外病毒介导的核酸转移至接受者)、转染(细胞摄取分离的核酸)、脂质体介导的转移和本领域众所周知的其它基因递送方式。
如本文所用，术语“分离的”是指细胞群、产品、化合物或组合物，其已与在其通常状态下(例如活受试者体内自然发生状态下)与之相关的至少一种其它细胞群、产品、化合物或组合物相分离。
如本文所用，术语“重组”是指以下核酸分子，其是由人(包括由机器)使用分子生物学和基因工程(例如分子克隆)的方法分离、生成和/或设计的，并且其包含不天然存在的核苷酸序列，或包含在不天然存在的核苷酸序列中，或与它们不天然相关联的核苷酸序列相关联提供，或在不存在通常天然与之相关联的核苷酸序列的情况下提供。因此，重组核酸分子应与天然存在—例如存在于生物体的基因组中的核酸分子区分开来。例如，包含mRNA序列的互补DNA或“cDNA”拷贝而没有任何插入的内含子序列(例如在相应的基因组DNA序列中会发现的内含子序列)的核酸分子将因此被认为是重组核酸分子。作为进一步的实例，重组E4ORF1核酸分子可包含E4ORF1编码序列，该编码序列可操作地连接到该编码序列在天然存在的腺病毒基因组中通常不相关联的启动子和/或其它遗传元件，或不存在通常在腺病毒基因组中与之相关联的核苷酸序列。
术语“受试者”包括哺乳动物—例如人和非人类灵长类动物，以及其它哺乳动物物种，包括兔、大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人类灵长类动物。
术语“患者”和“人受试者”在本文中可互换使用。
E4ORF1
本文描述的本发明的多个实施方式涉及工程化内皮细胞(EC)，其为E4ORF1+。“E4ORF1”多肽由腺病毒基因组早期4(E4)区的开放阅读框(ORF)1编码。用于根据本发明使用的E4ORF1+EC通常包含含有E4ORF1编码序列的重组核酸分子，该E4ORF1编码序列可操作地连接到适合在内皮细胞中表达该E4ORF1编码序列的启动子。
E4ORF1氨基酸序列和核苷酸序列是本领域已知的。根据本发明可以使用任何此类序列。在一些实施方式中，E4ORF1多肽可以来自任何合适的腺病毒类型或毒株，例如人腺病毒2、3、5、7、9、11、12、14、34、35、46、50或52型。在一些实施方式中，所使用的多肽序列来自人腺病毒5型。此类腺病毒多肽的氨基酸序列和编码此类多肽的核酸序列是本领域众所周知的，并且可在众所周知的公开可获得的数据库(例如Genbank数据库)中获得。例如，合适的序列包括以下：人腺病毒9(Genbank登录号CAI05991)、人腺病毒7(Genbank登录号AAR89977)、人腺病毒46(Genbank登录号AAX70946)、人腺病毒52(Genbank登录号ABK35065)、人腺病毒34(Genbank登录号AAW33508)、人腺病毒14(Genbank登录号AAW33146)、人腺病毒50(Genbank登录号AAW33554)、人腺病毒2(Genbank登录号AP.sub.--000196)、人腺病毒12(Genbank登录号AP.sub.--000141)、人腺病毒35(Genbank登录号AP.sub.--000607)、人腺病毒7(Genbank登录号AP.sub.--000570)、人腺病毒1(Genbank登录号AP.sub.--000533)、人腺病毒11(Genbank登录号AP.sub.--000474)、人腺病毒3(Genbank登录号ABB 17792)和人腺病毒5型(Genbank登录号D12587)。在一个实施方式中，所使用的E4ORF1序列是具有NCBI登录号AZR66741.1的序列。在一个实施方式中，所使用的E4ORF1序列是具有NCBI登录号AP_000232.1的序列。在一个实施方式中，所使用的E4ORF1序列具有氨基酸序列MAAAVEALFVVLEREGAILPRQEGFSGVYVFFSPINFVIPPMGAVMLSLRLRVCIPPGYFGRFLALTDVNQPDVFTESYIMTPDMTEELSVVLFNHGDQFFYGHAGMAVVRLMLIRVVFPVVRQASNV(SEQ IDNO.1)。
在一些实施方式中，E4ORF1多肽可以具有氨基酸序列或者可以由核酸序列编码，该氨基酸序列或核酸序列是本文提供的或本领域已知的任何特定序列的变体、衍生物、突变体或片段，前提条件是此类变体、衍生物、突变体或片段是或编码具有本领域已知(例如美国专利号8,465,732中所述)或本文所述的腺病毒E4ORF1的一种或多种功能特性的多肽。在一些实施方式中，该变体、衍生物、突变体或片段与已知序列具有约85％的同一性，或与已知序列具有约88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方式中，使用已知核苷酸序列的变体、衍生物、突变体或片段，其长度相对于该已知核苷酸序列相差约50个核苷酸、或约45个核苷酸、或约40个核苷酸、或约35个核苷酸、或约30个核苷酸、或约28个核苷酸、26个核苷酸、24个核苷酸、22个核苷酸、20个核苷酸、18个核苷酸、16个核苷酸、14个核苷酸、12个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸、6个核苷酸、5个核苷酸、4个核苷酸、3个核苷酸、2个核苷酸或1个核苷酸。在一些实施方式中，使用已知氨基酸序列的变体、衍生物、突变体或片段，其长度相对于该已知氨基酸序列相差约50个氨基酸、或约45个氨基酸、或约40个氨基酸、或约35个氨基酸、或约30个氨基酸、或约28个氨基酸、26个氨基酸、24个氨基酸、22个氨基酸、20个氨基酸、18个氨基酸、16个氨基酸、14个氨基酸、12个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸。
在一些实施方式中，在没有来自腺病毒E4区的其它序列的情况下使用E4ORF1序列—例如不在整个E4区的背景下或不与E4区中的其它ORF一起。然而，在其它实施方式中，E4ORF1可与来自E4区的一个或多个其它ORF结合使用，例如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6/7序列。例如，尽管E4ORF1序列可用于含有其它序列、基因或编码区(诸如启动子、标志物基因、抗生素抗性基因等)的构建体(例如病毒载体)中，但在某些实施方式中，将E4ORF1序列用于不含有整个E4区或不含有来自整个E4区的其它ORF(诸如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4和/或E4ORF5)的构建体中。
E4ORF1编码序列可以存在于含有各种其它序列、基因或编码区(例如启动子、增强子、抗生素抗性基因、报告基因或表达标签(诸如编码GFP的核苷酸序列)或可能需要的任何其它核苷酸序列或基因)的构建体或载体中。
E4ORF1-编码核酸分子可以在一个或多个启动子的控制下以允许表达。可以使用能够在内皮细胞中驱动E4ORF1核酸序列表达的任何启动子。合适启动子的实例包括但不限于CMV、SV40、RSV、HIV-Ltr和MML启动子。启动子也可以是来自腺病毒基因组的启动子或其变体。例如，在一些实施方式中，启动子可以是在腺病毒基因组中天然驱动E4ORF1表达的启动子。然而，在其它实施方式中，启动子不是在腺病毒基因组中天然驱动E4ORF1表达的启动子。
E4ORF1-编码序列可包含天然存在的核苷酸、合成核苷酸或其组合。例如，在一些实施方式中，本发明的核酸分子可包含RNA，例如在细胞内稳定并可用于直接在细胞内指导蛋白质表达/生产的合成修饰RNA。在其它实施方式中，E4ORF1-编码序列可包含DNA。在使用DNA的实施方式中，DNA序列可以可操作地连接到一种或多种合适的启动子和/或调控元件以允许(和/或促进、增强或调节)细胞内的表达，并且可以存在于一种或多种合适的载体或构建体中。
可以使用本领域已知的任何合适的系统，包括但不限于转染技术和病毒介导的转导技术，将E4ORF1-编码序列引入内皮细胞。可根据本发明使用的转染方法包括但不限于脂质体介导的转染、聚凝胺介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射和微粒轰击。可以使用的病毒介导的转导方法包括但不限于慢病毒介导的转导、腺病毒介导的转导、逆转录病毒介导的转导、腺相关病毒介导的转导和疱疹病毒介导的转导。
在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于病毒载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于慢病毒载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于腺病毒载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于腺相关病毒载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于逆转录病毒载体中。在一些实施方式中，E4ORF1-编码序列位于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体(一种逆转录病毒载体)中。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含E4ORF1+和E4ORF1-阴性内皮细胞。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约75％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约80％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约85％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约90％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约95％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约98％为E4ORF1+。在一些实施方式中，该组合物中的内皮细胞的至少约99％为E4ORF1+。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含少于一个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约一个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含多于一个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约0.7个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约0.8个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约0.9个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.0个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.1个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.2个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.3个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.4个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。在一些实施方式中，本发明的组合物包含内皮细胞，在该组合物中的所有内皮细胞中平均每个细胞包含约1.5个拷贝的基因组整合的E4ORF1编码序列。
在一些实施方式中，可以使用本领域已知的标准核酸检测和/或定量测定，诸如基于PCR的技术(例如定量PCR)和基于测序的技术(例如，基于下一代定量测序的技术)，确认和/或定量E4ORF1编码序列的存在。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的标准蛋白质检测和/或定量测定，例如基于抗体的技术，确认和/或定量E4ORF1多肽的存在。在一些实施方式中，可以使用本领域已知用于E4ORF1-表达内皮细胞的任何功能特性的功能测定(例如体外或体内测定)(例如美国专利号8,465,732中描述的那些中的任一种)，确认和/或定量功能性E4ORF1多肽(或适量的功能性E4ORF1多肽)的表达。在一些此类实施方式中，可以在E4ORF1+内皮细胞批次之间(例如在测试批次和具有已知E4ORF1特性的对照批次之间)比较任何此类测定的结果，例如基于此评估一致性和/或进行任何调整。
可以使用分子生物学和细胞生物学的常规技术进行内皮细胞中E4ORF1序列的处理、操作和表达。此类技术在本领域中是众所周知的。例如，可以参考Sambrook,Fritschand Maniatis eds.,“Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold SpringsHarbor Laboratory Press,1989；系列Methods of Enzymology(Academic Press,Inc.)或用于指导处理、操作和表达核苷酸和/或氨基酸序列的合适技术的任何其它标准文本的教导。美国专利号8,465,732中描述了与在内皮细胞中处理和表达E4ORF1序列相关的附加方面，其内容通过引用并入本文。
内皮细胞
在一些实施方式中，本文所述的内皮细胞(EC)可源自本领域已知的任何合适的血管内皮细胞源。在一些实施方式中，内皮细胞是原代内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是哺乳动物细胞，例如人或非人灵长类动物细胞，或兔、大鼠、小鼠、山羊、猪或其它哺乳动物细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是原代人类内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是脐静脉内皮细胞(UVEC)，例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在一些实施方式中，内皮细胞是脂肪EC。在一些实施方式中，内皮细胞是皮肤EC。在一些实施方式中，内皮细胞是心脏EC。在一些实施方式中，内皮细胞是肾EC。在一些实施方式中，内皮细胞是肺EC。在一些实施方式中，内皮细胞是肝EC。在一些实施方式中，内皮细胞是骨髓EC。可以使用的其它合适的内皮细胞包括先前在美国专利号8,465,732中描述为适合E4ORF1-表达的那些，该美国专利的内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，内皮细胞经基因修饰以使得它们包含一种或多种基因修饰。例如，在一些实施方式中，内皮细胞被工程化以表达E4ORF1。在一些实施方式中，内皮细胞也可以被工程化以表达ETV2。事实上，在本专利公开的EC表达E4ORF1的每个实施方式中，EC也可以表达ETV2。类似地，在一些实施方式中，内皮细胞也可以被工程化以表达BMP4。事实上，在本专利公开的EC表达E4OR1的每个实施方式中，EC也可以表达BMP4。
此外，在一些实施方式中，本文所述的EC可包含已知参与或疑似参与影响内皮细胞的疾病或病症的基因的校正版本，或任何其它基因(例如治疗上有用的基因)，可以期望在内皮细胞中提供或使用工程化的内皮细胞给予或递送这些其它基因。
使用方法
在一些实施方式中，本文所述的组合物可用于各种治疗方法，或可用于制备治疗组合物，而该治疗组合物又可用于各种治疗方法。此类治疗方法可以包含可期望或有益于将EC(例如HUVEC)给予受试者的任何方法。在进行此类治疗方法时，可以使用本领域已知的任何合适的方式，例如通过注射(例如静脉内注射、肌内注射、皮下注射、局部注射)、通过输注(例如通过静脉输注、皮下输注、局部输液)或通过手术植入，将本文所述的治疗组合物给予受试者。治疗组合物可以以单剂量或多剂量给药。本领域技术人员将能够根据具体情况选择合适的给药途径和合适的给药时间表。
在一些实施方式中，本文所述的治疗组合物可包含含有一种或多种附加细胞类型的组合物，或者与含有一种或多种附加细胞类型的组合物一起给药。此类附加细胞类型可以是例如干细胞或祖细胞，例如造血干细胞、造血祖细胞、c-kit+Sca1+造血干细胞、淋巴祖细胞、CD4-CD8-CD44+CD25-ckit+细胞、早期胸腺祖细胞、CD4-CD8-CD44+CD25-ckit-细胞或DN1细胞。
细胞培养和冷冻保存方法
培养细胞的方法是本领域众所周知的并且可以使用任何合适的细胞培养方法。例如，可以使用已知有用于培养其它内皮细胞的方法或已知有用于培养E4ORF1-表达内皮细胞的方法来培养EC，例如美国专利号8,465,732中所述，其内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，可以在不存在血清、或不存在外源生长因子、或不存在血清和外源生长因子两者的情况下培养EC。
本文描述了示例性冷冻保存方案—包括在本专利公开的实施例部分中。此外，用于EC(包括HUVEC)冷冻保存的多种方法在本领域中是已知的并且可以与本发明结合使用。具体而言，参考Lehle et al.,“Cryopreservation of human endothelial cells forvascular tissue engineering.”Cryobiology 50(2005)154–161；Lehle et al.,“Identification and Reduction of Cryoinjury in Endothelial Cells:A First Steptoward Establishing a Cell Bank for Vascular Tissue Engineering.”TissueEngineering Volume 12,Number 12,2006；Lonza；“CloneticsTM Endothelial CellSystem-Technical Information&Instructions,”www.lonza.com；2018,TechnicalInformation&Instructions；Marquez-Curtis et al.,“Beyond membrane integrity:Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells aftercryopreservation.”Cryobiology 72(2016)183-190；Pegg.,“Cryopreservation ofvascular endothelial cells as isolated cells and as monolayers.”Cryobiology44(2002)46–53；Polchow et al.,“Cryopreservation of human vascular umbilicalcord cells under good manufacturing practice conditions for future cellbanks.”Journal of Translational Medicine 2012 10:98；Puzanov et al.,“NewApproach to Cryopreservation of Primary Noncultivated Human Umbilical VeinEndothelium in Biobanking.”Biopreservation And Biobanking；Volume 16,Number 2,2018；Sultani,A.B.et al.“Improved Cryopreservation of Human Umbilical VeinEndothelial Cells:A Systematic Approach.”Sci.Rep.6,34393；(2016)；Reardon etal.“Investigating membrane and mitochondrial cryobiological responses ofHUVEC using interrupted cooling protocols.”Cryobiology 71(2015)306–317；和vonBomhard A.et al.,(2016)Cryopreservation of Endothelial Cells in VariousCryoprotective Agents and Media–Vitrification versus Slow FreezingMethods.PLoS ONE 11(2)中描述的EC/HUVEC冷冻保存方法，它们的每一篇的内容均通过引用并入本文。
试剂盒
本发明还涵盖包含本文所述组合物或用于制备本文所述组合物和/或用于进行本文所述任何方法的试剂盒。此类试剂盒可含有任何本文所述的部分，包括但不限于核苷酸序列(例如编码E4ORF1的那些)、EC(例如HUVEC)、E4ORF1+EC的群(例如E4ORF1+HUVEC)、用于检测EC(例如HUVEC)或其中表达的蛋白质或核酸分子的装置或组合物(如核酸探针、抗体等)、冷冻培养基、冷冻保存剂、HSA、葡聚糖(例如葡聚糖40)、冷冻管、冷冻袋或其任何组合。所有此类试剂盒均可任选地包含使用说明。标签可以伴随试剂盒并且可以包括任何书面或记录的材料(其可以是电子形式或计算机可读的形式)，提供使用试剂盒内容物的说明或其它信息。例如，在一些实施方式中，此类试剂盒可包含组合物，该组合物包含在冷冻管或冷冻袋中的冷冻培养基中的E4ORF1+HUVEC，以及关于其解冻、稀释和/或临床使用的说明。
可以参照以下非限制性实施例进一步描述本发明的某些方面。
实施例
实施例1
E4ORF1+HUVEC的高密度冷冻
进行实验以评估已经使用受控速率冷冻程序和使用各种不同冷冻容器(包括适于直接稀释并且在封闭系统中将细胞无菌递送至患者的一些容器)冷冻保存的E4ORF1+HUVEC的复苏和活力。
将E4ORF1+HUVEC粒化，然后以约1300万(1.3x107)个细胞/ml或1亿(1.0x108)个细胞/ml的浓度悬浮在包含5％ DMSO和20％人血清白蛋白(HSA)的冷冻培养基中。
在一些实验中，将约0.5ml(0.57ml)这种细胞悬浮液转移到多个2ml冷冻管中的每一个中。在一些实验中，将约1ml这种细胞悬浮液转移到多个2ml或5ml冷冻管或冷冻袋的每一个中。在这些实验的一些中，使用了由Daikyo制造的“Crystal Zenith”冷冻管或由PallMedical制造的BriostorTM转移/冷冻袋套装—其每一个都适于在封闭系统中将解冻的细胞产品无菌递送至患者。
使用速率受控冷冻程序将E4ORF1+HUVEC冷冻在冷冻培养基中—下表1中提供了其详细信息。
表1-受控速率冷冻程序
Figure BDA0004113330440000191
Figure BDA0004113330440000201
在进行速率受控冷冻程序后，将冷冻细胞储存在液氮(LN2)中至少24小时(1天)至96小时(4天)。
然后将E4ORF1+HUVEC解冻并在含有葡聚糖和HSA的稀释缓冲液(包含葡聚糖408.3％、HSA 4.2％)中稀释，以得到约340万个细胞/ml的稀释细胞浓度。
在解冻后立即(即在解冻后0小时)或在解冻后细胞在室温下保持2、4、6、24、48或72小时后，使用包括用台盼蓝染色细胞和用血细胞计数器计数细胞的标准方法评估活细胞的复苏。
图1-4以图形形式显示了当使用速率受控冷冻程序在2ml冷冻管中冷冻细胞时，在解冻后0、2、4、6、24、48和72小时E4ORF1+HUVEC的总细胞计数(图1)、活力(图2)、绝对活细胞计数(图3)和活细胞复苏百分比(图4)(图中的“初始”指冷冻前的活力)。解冻后的活力是稳定的(参见图2)，出人意料地表明在整个实验过程中活力几乎没有下降。
确定了在2-mL或5-mL大小的HUVEC冷冻程序中，在标准螺旋盖冷冻管、CZ冷冻管、或冷冻袋(
Figure BDA0004113330440000202
转移/冷冻袋套装)中，在包含5％DMSO和20％人血清白蛋白(HAS)的冷冻培养基中，以1.3x107个细胞/ml或1x108个细胞/ml冷冻的E4ORF1+HUVEC的存活力百分比和复苏百分比。细胞在液氮中冷冻保存至少24小时，然后解冻，在含有8.3％葡聚糖和4.2％ HSA的稀释缓冲液中以1:20的比例稀释，无需任何离心或冲洗以去除冷冻保存剂(如上所述)，随后评估细胞数量/存活力(如上所述)。
结果如图5A-B和表2所示。
表2
Figure BDA0004113330440000211
这些研究的数据表明：
(a)即使当E4ORF1+HUVEC以超高细胞密度冷冻时，也可以实现令人惊讶的高水平存活力和活细胞复苏(使用任一冷冻方案)，当细胞密度从约1000万个细胞/ml增加至约1亿个细胞/ml时，未观察到存活力/复苏下降，
(b)可以直接稀释以超高密度冷冻的E4ORF1+HUVEC，无需去除冷冻保存剂，以生成可用的细胞疗法产品，其在适于向人受试者给药的缓冲液中含有适当量和浓度的E4ORF1+HUVEC—均没有存活力的任何显著损失，和
(c)我们描述的HUVEC冷冻程序可用于维持E4ORF1+HUVEC的解冻后存活力。
实施例2
以高密度冷冻的E4ORF1+HUVEC可以解冻、稀释并安全地给予人受试者
进行了I期临床试验，以评估将E4ORF1+HUVEC给予人受试者的安全性。纳入患有符合高剂量疗法-自体造血细胞移植(HDT-AHCT)资格的化学敏感淋巴瘤的受试者。
将临床试验中使用的E4ORF1+HUVEC提供给临床试验地点，其(使用本文所述的方法)以1亿个细胞/ml(1x108个细胞/ml)的浓度在补充有人血清白蛋白(HSA)和DMSO的无血清、CGMP制造的冷冻培养基(
Figure BDA0004113330440000212
CS5)中冷冻，使得HSA的终浓度为10％且DMSO的终浓度为5％。
在临床试验地点，将细胞解冻并在稀释培养基中稀释(使用本文所述的方法)—不去除冷冻保存剂—以产生在盐水中包含E4ORF1+HUVEC细胞(约5x106个细胞/ml)、葡聚糖40(约8.3％)、HSA(约4.3％)和DMSO(约0.25％)的治疗组合物。
然后，在AHCT之后，将治疗组合物静脉内给予人受试者，其方式是作为单一剂量或分次剂量(在分次给药的情况下，在第0天给予细胞和两天后再次给予细胞)，以剂量递增分组接受5x106、10x106或20x106个细胞/kg。按照现场机构指南进行支持性护理疗法。
临床试验的主要目的是评估给予治疗组合物的安全性。次要目的包括评估等级≥3的不良事件—使用NCI-CTCAEv5.0分级系统。参见Common Terminology Criteria forAdverse Events(CTCAE)Version 5.0,Published:November 27,2017,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health,National CancerInstitute，和Freites-Martinez et al.,Using the Common Terminology Criteria forAdverse Events(CTCAE-Version 5.0)to Evaluate the Severity of Adverse Eventsof Anticancer Therapies.Actas Dermosifiliogr(Engl Ed).2021Jan；112(1):90-92。在该系统下，1级表示不良事件(AE)为轻度，2级为中度，3级为严重，4级为危及生命，且5级为致命(与AE相关的死亡)。评估的等级≥3的口腔/胃肠道不良事件包括口腔粘膜炎、恶心、呕吐或腹泻。
对29名患有全身性淋巴瘤的人受试者进行了治疗，中位随访时间为271天(范围179、566)。不良事件通常是轻度/中度，与HDT-AHCT预期的类型和程度相同。通过高达20x106个细胞/kg的剂量确定了无最大耐受剂量，因为该治疗具有良好的耐受性。
该I期研究的结果表明，这些治疗组合物—使用本文所述的方法和组合物由高密度冷冻E4ORF1+HUVEC制备—可以安全地给予人受试者。
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***
所附权利要求进一步描述了本发明。
序列表
<110> 安吉克莱茵生物科学有限公司（ANGIOCRINE BIOSCIENCE, INC.）
<120> 冷冻保存的内皮细胞组合物（CRYOPRESERVED ENDOTHELIAL CELLCOMPOSITIONS）
<130> ANGIOCRINE.027.WO1
<140>
<141>
<150> 63/063,668
<151> 2021-08-10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> 非已知
<220>
<223> 非已知序列的描述:
腺病毒序列
<400> 1
Met Ala Ala Ala Val Glu Ala Leu Phe Val Val Leu Glu Arg Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Leu Pro Arg Gln Glu Gly Phe Ser Gly Val Tyr Val Phe Phe
20 25 30
Ser Pro Ile Asn Phe Val Ile Pro Pro Met Gly Ala Val Met Leu Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Arg Val Cys Ile Pro Pro Gly Tyr Phe Gly Arg Phe Leu
50 55 60
Ala Leu Thr Asp Val Asn Gln Pro Asp Val Phe Thr Glu Ser Tyr Ile
65 70 75 80
Met Thr Pro Asp Met Thr Glu Glu Leu Ser Val Val Leu Phe Asn His
85 90 95
Gly Asp Gln Phe Phe Tyr Gly His Ala Gly Met Ala Val Val Arg Leu
100 105 110
Met Leu Ile Arg Val Val Phe Pro Val Val Arg Gln Ala Ser Asn Val
115 120 125

Claims (69)

1.一种组合物，在包含有效量的冷冻保存剂的冷冻培养基中包含密度为约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml的E4ORF1+内皮细胞(EC)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述EC是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约7500万个细胞/ml至约1.25亿个细胞/ml。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约1亿个细胞/ml。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含人血清白蛋白(HSA)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含约10％的人血清白蛋白(HSA)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存剂选自由二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油组成的组。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存剂是二甲基亚砜。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含约5％至约10％的二甲基亚砜。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含约10％的二甲基亚砜。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻培养基包含内皮生长培养基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC包含编码腺病毒E4ORF1蛋白的重组核苷酸序列，所述腺病毒E4ORF1蛋白可操作地连接至异源启动子。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述核苷酸序列处于载体内。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体是逆转录病毒载体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中E4ORF1是人腺病毒5型E4ORF1。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC不包含整个腺病毒E4区。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述EC不包含E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6编码序列或氨基酸序列。
20.一种组合物，包含(a)密度为约1亿个细胞/ml的E4ORF1+EC、(b)内皮生长培养基、(c)约5％至约10％的DMSO和(d)约10％的HSA。
21.一种组合物，包含(a)密度为约1亿个细胞/ml的E4ORF1+HUVEC、(b)内皮生长培养基、(c)约5％至约10％的DMSO和(d)约10％的HSA。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包含造血干细胞或造血祖细胞。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自骨髓。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自外周血。
25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自羊水。
26.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自脐带血。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物处于冷冻容器中。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器是冷冻管。
29.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器是冷冻袋。
30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述冷冻容器适于在封闭系统中将其内容物无菌转移至患者。
31.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于在制备给予人受试者的治疗组合物中使用。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物在制备用于给予人受试者的治疗组合物中的用途。
33.一种制备用于给予人受试者的治疗组合物的方法，所述方法包括用生理盐水溶液稀释根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中稀释后的EC细胞浓度为约300万个细胞/ml至约500万个细胞/ml，从而制备用于给予人受试者的治疗组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生理盐水包含葡聚糖40和HSA，其量使得在稀释后，所述治疗组合物包含约8％的葡聚糖和约4％的HSA。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法不包括任何离心步骤。
36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述方法不包括去除冷冻培养基或冷冻保存剂。
37.一种冷冻内皮细胞的方法，所述方法包括：
a.以约5000万个细胞/ml至约1.5亿个细胞/ml的密度将内皮细胞(EC)悬浮在冷冻培养基中，其中所述冷冻培养基包含有效量的冷冻保存剂，从而产生冷冻组合物，和
b.使所述冷冻组合物的温度逐渐降低至约-80℃至-90℃。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在步骤(b)中，所述温度以约1℃/分钟的速率降低。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，包括随后将所述冷冻组合物转移到液氮中。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约7500万个细胞/ml至约1.25亿个细胞/ml。
41.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞(EC)的密度为约1亿个细胞/ml。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述EC是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含人血清白蛋白(HSA)。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含约10％的人血清白蛋白(HSA)。
45.根据权利要求37-44中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存剂选自由二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油组成的组。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存剂是二甲基亚砜。
47.根据权利要求37-46中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含约5％至约10％的二甲基亚砜。
48.根据权利要求37-47中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含约10％的二甲基亚砜。
49.根据权利要求37-48中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含细胞培养基。
50.根据权利要求37-49中任一项所述的方法，其中所述冷冻培养基包含内皮生长培养基。
51.根据权利要求37-50中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞(EC)是腺病毒E4ORF1+EC。
52.根据权利要求37-51中任一项所述的方法，其中所述EC包含编码腺病毒E4ORF1蛋白的重组核苷酸序列。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述核苷酸序列可操作地连接至异源启动子。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述核苷酸序列处于载体内。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体。
58.根据权利要求51-57中任一项的方法，其中E4ORF1是人腺病毒5型E4ORF1。
59.根据权利要求51-58中任一项的方法，其中所述EC不包含整个腺病毒E4区。
60.根据权利要求51-59中任一项的方法，其中所述EC不包含E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5或E4ORF6编码序列或氨基酸序列。
61.根据权利要求37-60中任一项所述的方法，其中所述冷冻组合物进一步包含造血干细胞或造血祖细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自骨髓。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自外周血。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自羊水。
65.根据权利要求61所述的方法，其中所述造血干细胞或造血祖细胞来自脐带血。
66.根据权利要求37-65中任一项所述的方法，其中所述冷冻组合物处于冷冻容器中。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述冷冻容器是冷冻管。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述冷冻容器是冷冻袋。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述冷冻容器适于在封闭系统中将其内容物无菌转移给患者。
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