CN116323660A - 包含乳蛋白的融合蛋白及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性涉及重组蛋白、包含此类重组蛋白的组合物以及产生此类重组蛋白和组合物的方法。

Description

包含乳蛋白的融合蛋白及其组合物
相关申请
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时专利申请序列号63/061,656的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明一般性涉及重组蛋白、包含此类重组蛋白的组合物以及用于产生此类重组蛋白和组合物的方法。
发明背景
石油基聚合物广泛用于现代社会，例如用于工业和消费品。然而，石油基聚合物的产生、使用和处置会留下巨大的环境足迹：这些聚合物是由来源于不可再生石油或天然气的单体产生的，可浸出有害化合物，抱歉通常在垃圾填埋场进行处置。近年来，通过回收进行的处置有所增加，但回收率仍然很低。此外，包含不同类型的石油基聚合物和/或加工添加剂(例如，填料、着色剂、增塑剂)的产品的回收是复杂且不经济的。这些问题并没有被新开发的可光降解聚合物解决，这些聚合物也是由石油衍生成分制成的，抱歉通常只能被阳光降解成更小的塑料颗粒，而不是完全分解。
使用生物聚合物产生消费品可以追溯到古代。生物聚合物来源于可再生材料(例如，农业副产品)，通常是安全的，并且在许多情况下是完全可生物降解的(即，可被细菌、真菌或其他微生物降解)。用于产生生物聚合物的传统起始材料包括乳蛋白、淀粉和纤维素。
尽管它们具有有利的特性，但由于通过从哺乳期成熟动物获得的乳汁中提取它们的昂贵生产，乳蛋白作为生物聚合物的起始材料不再受欢迎。此外，这种生产产生混合蛋白质的部分(例如，乳清或酪蛋白分离物或分别包含乳清蛋白或酪蛋白混合物的蛋白质浓缩物，以及乳汁的其他成分(例如，碳水化合物、矿物质、脂质)，使得研究和预测聚合反应中的行为和/或所得聚合物的性质很困难。最后，化学产生的单体比整个生物体产生的乳蛋白更容易在反应容器中被修饰，与生物聚合物相比，增加了石油基聚合物的多功能性。
由于包含重组乳蛋白的生物聚合物可以在产生成本和预测和/或控制聚合反应的能力方面更好地与基于石油的聚合物竞争，因此此类缺陷通过乳蛋白的重组产生得到克服。此外，乳蛋白的重组产生为改性乳蛋白的重组产生以及从其产生具有新属性的生物聚合物提供了机会。
因此，需要由重组产生的乳蛋白制成的生物聚合物。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物和其他参考文献通过引用整体并入，其程度与每个单独的出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物或其他参考文献被具体地和单独地通过引用并入相同。在通过引用并入的材料与本公开内容相矛盾或不一致的程度上，本公开内容，包括定义，将取代任何此类材料。
发明概述
第1段：在各个方面，本文提供了一种蛋白质，其中该蛋白质是具有以下结构的重组蛋白：
(A)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)，
或
(B)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)，或
(C)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)-(连接肽3)-(乳蛋白4)；
其中：
(i)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4、连接肽1、连接肽2和连接肽3通过肽键连接；和
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是包含游离硫醇基的乳蛋白(例如，包含游离硫醇基的β-乳球蛋白、包含游离硫醇基的血清白蛋白，或包含游离硫醇基的乳过氧化物酶)。
第2段：第1段的重组蛋白可以具有结构(A)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第3段：第1段的重组蛋白可以具有结构(B)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白2和乳蛋白3各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第4段：第1段的重组蛋白可以具有结构(B)，其中乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白1和乳蛋白3各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第5段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第6段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白1、乳蛋白3和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第7段：第1段的重组蛋白可以具有结构(A)，其中乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白。
第8段：第1段的重组蛋白可具有结构(B)，其中乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第9段：第1段的重组蛋白可具有结构(B)，其中乳蛋白1和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第10段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3和乳蛋白4各自是不含游离硫醇基的乳蛋白。
第11段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，而乳蛋白2和乳蛋白4各自是不含游离硫醇基的乳蛋白。
第12段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1和乳蛋白4各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白2和乳蛋白3各自是不含游离硫醇基的乳蛋白。
第13段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白1和乳蛋白4各自是不含游离硫醇基的乳蛋白。
第14段：第1段的重组蛋白可以具有结构(B)，其中乳蛋白1、乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白。
第15段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1、乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白4是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第16段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白4各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白质3是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
第17段：第1段的重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4各自是包含游离硫醇基。
第18段：在各个方面，本文提供了一种重组表达构建体，其由包含启动子序列的多核苷酸、任选的分泌信号序列、编码第1段至第17段中任一项的重组蛋白的多核苷酸序列和终止序列的多核苷酸组成；其中启动子序列在有义方向上可操作地连接到任选的分泌信号序列和编码重组蛋白的多核苷酸序列，任选的分泌信号序列在有义方向上可操作地连接到编码重组蛋白的多核苷酸序列，并且一个或多个终止子序列可操作地连接到编码重组蛋白的多核苷酸序列。
第19段：在各个方面，本文提供包含第18段的重组表达构建体的重组载体。
第20段：在各个方面，本文提供了一种重组宿主细胞，其包含一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多种)第18段的重组表达构建体。重组宿主细胞可来源于细菌、真菌(例如，酵母、丝状真菌[例如，曲霉属、木霉属、毁丝霉属的成员])、古细菌、原生生物、动物、植物、藻类、原生动物或色藻界(chromista)。
第21段：在各个方面，本文提供了一种用于获得第20段的重组宿主细胞的方法，其中该方法包括获得编码重组蛋白的多核苷酸，或获得第18段的重组表达构建体，或获得第19段的重组载体；和将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞。
第22段：在各个方面，本文提供了一种用于产生第1段至第17段中任一项的重组蛋白的方法，其中该方法包括在适合于产生重组蛋白的培养基中发酵第20段的重组宿主细胞。该方法还可以包括纯化重组蛋白以获得包含重组蛋白的制剂(例如，制剂具有按质量计大于总蛋白的50％的重组蛋白纯度)和/或后处理重组蛋白。
第23段：在各个方面，本文提供了一种产生酪蛋白(例如，κ-酪蛋白、β-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白)的方法，其中该方法包括：发酵重组宿主细胞，其能够产生具有以下结构的重组蛋白：
(A)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)，
或
(B)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)，
或
(C)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)-(连接肽3)-(乳蛋白4)；
其中：
(i)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4、连接肽1、连接肽2和连接肽3通过肽键连接，
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是酪蛋白，并且
(iv)其中酪蛋白与一种或多种包含蛋白酶识别或切割序列的连接肽相邻。
第24段：在第23段的方法中，重组蛋白可以具有结构(A)，其中乳蛋白1为β-乳球蛋白，乳蛋白2为酪蛋白，连接肽1包含蛋白酶的识别或切割序列。
第25段：在第23段的方法中，重组蛋白可以具有结构(B)，其中乳蛋白1和乳蛋白2中的至少一种是β-乳球蛋白，乳蛋白2是酪蛋白，连接肽1和连接肽2包含蛋白酶的识别或切割序列。
第26段：在第23段的方法中，重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1和乳蛋白4中的至少一种是β-乳球蛋白；乳蛋白2和乳蛋白3为酪蛋白；连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶的识别或切割序列。
第27段：在第23段的方法中，重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1和乳蛋白3中的至少一种是β-乳球蛋白；乳蛋白2和乳蛋白4为酪蛋白；连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶的识别或切割序列。
第28段：在第23段的方法中，重组蛋白可以具有结构(C)，其中乳蛋白1是β-乳球蛋白；乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4为酪蛋白；连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶(例如凝乳酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶、GI蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、kex2内切蛋白酶、TEV蛋白酶)的识别或切割序列。
第29段：第23段的方法可以进一步包括用蛋白酶切割包含蛋白酶的识别或切割序列的一种或多种连接肽，从而释放酪蛋白。
第30段：在各个方面，本文提供了一种聚合物，其中该聚合物包含蛋白质聚合物，其中该蛋白质聚合物包含通过二硫键连接的蛋白质单体，并且其中该蛋白质单体包括一种或多种第1至17段中任一项的重组蛋白(例如，一种重组蛋白、两种或更多种重组蛋白)。
第31段：在各个方面，本文提供了一种用于产生第30段的聚合物的方法，其中该方法包括：获得一种或多种第1至17段中任一项的重组蛋白(例如，使用第22段的方法)，并且使一种或多种重组蛋白温和地变性(例如，通过在一种或多种重组蛋白的构象相对稳定或略微不稳定或不稳定的pH下将一种或多种重组蛋白加热至一定温度[例如，低于重组蛋白的Tm 10-30℃])，使得一种或多种重组蛋白中包含的一个或多个游离硫醇基形成一个或多个分子内和/或分子间二硫键。
第32段：在各个方面，本文提供了一种组合物(例如，食品[例如，补充食品(例如，补充乳制品、补充动物肉或动物肉制品、补充蛋或蛋制品)，替代食品(例如，替代乳制品、替代动物肉或动物肉制品、替代蛋或蛋制品)]、化妆品或个人护理组合物)，其包含第1至17段中任一项的重组蛋白和/或第30段中任何一项的聚合物。
附图的简要说明
示例性实施方案将通过使用附图以额外的特异性和细节来描述和解释，其中：
图1是根据本发明的代表性实施方案，用于产生本文提供的重组乳蛋白的靶向载体的图谱。
图2是描绘根据本发明的代表性实施方案，通过包含编码β-酪蛋白或编码具有(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-酪蛋白)的结构的重组蛋白的表达构建体的重组真菌宿主细胞产生β-酪蛋白的图。
发明详述
本发明的后续讨论是出于说明和描述的目的而提出的，并不旨在将本发明的范围限制于本文所公开的实施方案。同样地，所公开的实施方案的变化和修改在本发明的范围内，例如，在理解本公开内容之后，可能在本领域技术人员的技术和知识内。旨在获得包括在允许范围内的替代实施方案的权利，包括替代的、与本文公开的结构、功能、范围或步骤可互换的和/或等效的结构、功能、范围或步骤，并且不打算公开奉献任何可专利的主题。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
定义
本文使用的术语“a”和“an”和“the”以及类似的提及指的是单数和复数(例如，意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。例如，术语“一种化合物”与术语“至少一种化合物”和“一种或多种化合物”同义，可以指单一化合物或多种化合物，包括它们的混合物。
如本文所用，术语“和/或”是指相互组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“(x和z)或y”、“(y和z)或x”、单独的“x和y”、单独的“x和z”、单独的“y和z”或“x或y或z”。
如本文所用，术语“至少”或“一个或多个”是指随后列出的元素的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、至少一个、至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个或全部。
如本文所用，术语“酪蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的酪蛋白(即，对于哺乳动物产生的乳汁是天然的酪蛋白；例如，天然酪蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。酪蛋白的实例包括β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。因此，本文使用的术语“β-酪蛋白”、“κ-酪蛋白”、“α-S1-酪蛋白”和“α-S2-酪蛋白”是指包含分别与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白(例如，分别地家牛(Bos taurus)β-酪蛋白(UniProt序列P02666的氨基酸16至224)、家牛κ-酪蛋白(UniProt序列P02668的氨基酸22至190)、家牛α-S1-酪蛋白(UniProt序列P02662的第16至214位氨基酸)和家牛α-S2-酪蛋白(UniProt序列P02663的第16至222位氨基酸))中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。酪蛋白的氨基酸序列与哺乳动物产生的乳汁中天然发现的酪蛋白的氨基酸序列之间的差异可能是由于保守氨基酸取代(即，用化学相似的氨基酸取代氨基酸；提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的)、非保守性氨基酸取代以及氨基酸插入、氨基酸缺失和多肽截短(例如，提供酪蛋白的片段)，其不会实质上改变酪蛋白的结构和/或一种或多种功能。此类氨基酸取代/缺失/插入可以使用本领域已知的方法来鉴定，其涉及产生包含通过分子建模方法(使用例如PyMol[
Figure BDA0004153207000000091
NewYork,NY])或多序列比对(例如，天然酪蛋白的直向同源物；使用，例如MUSCLE[Edgar,2004,Nucleic Acids Res 32:1792–1797])鉴定为不会实质性改变蛋白质结构和/或功能的候选氨基酸取代/缺失/插入的酪蛋白，并使用用于确定蛋白质结构和/或功能的众所周知的方法测试这种酪蛋白。此类方法也可用于确定酪蛋白是否可用于本发明，并鉴定在特定应用中具有改进功能的酪蛋白。
如本文在多核苷酸的上下文中所用的术语“编码”是指包含编码序列的多核苷酸，当置于适当调节序列的控制下时，该编码序列被转录成可翻译成多肽的mRNA。编码序列通常开始于起始密码子(例如ATG)并结束于终止密码子(例如UAA、UAG和UGA)。编码序列可以包含单个开放阅读框，或几个开放阅读框(例如，由内含子分隔)。
如本文所用，术语“基本上不含”是指指示的组分在指示的组合物中不能通过常用的分析方法检测到，或者指指示的组分以没有功能的痕量存在。在此上下文中使用的术语“功能”是指对包含痕量的指示组分的组合物的性质没有实质贡献，或在包含痕量的指示组分的指示组合物中不具有实质活性(例如，化学活性、酶活性)，或在使用或消费包含痕量指示组分的组合物时不会对健康产生不利影响。如本文所用，术语“实质贡献”是指指示的组分对组合物的属性的贡献程度为在不存在该组分的情况下(例如，在除了缺少指示的组分之外与该组合物相同的参考组合物中)该属性的存在/活性/可测量性减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
如本文所用，术语“丝状真菌”指真菌门和卵菌门的任何丝状形式(如由Hawksworth等人,In,Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK定义的)。丝状真菌与酵母的区别在于其在营养生长期间的菌丝伸长。
如本文所用，术语“食品”是指可以被人类或动物(包括驯养动物(例如狗、猫)、农场动物(例如牛、猪、马)和野生动物(例如非驯养的食肉动物))摄取以用于饮食目的的组合物(即，没有不良健康影响，但由于消化的物质在胃肠道中的摄取而具有显著的营养和/或热量摄取)。该术语包括可以与一种或多种其他成分组合或添加到一种或多种其他成分中以制备可以被人或动物摄取的食品的组合物。
本文所用的术语“游离硫醇基”是指半胱氨酸残基的含硫醇侧链，其中硫醇基中的氢原子未被另一个原子取代。例如，包含奇数个半胱氨酸残基的乳蛋白可以在还原和非还原条件下均包含游离硫醇基。
如本文所用，术语“真菌”是指子囊菌门、担子菌门、接合菌门和壶菌门、卵菌门和球囊菌门的生物体。然而，将理解，真菌分类学在不断发展，因此真菌界的这一具体定义可能会在未来进行调整。如本文所用，术语“真菌宿主细胞”是指从真菌获得的宿主细胞。
如本文所用，术语“同源物”是指包含与包含在参考蛋白中的相似长度(即，长度在查询氨基酸序列长度的+/-20％范围内)的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％)相同的氨基酸序列，并且具有与参考蛋白质的功能性质相似(例如，在50％以内、40％以内、30％以内、20％以内或10％以内)的功能性质的蛋白质。该术语包括蛋白质的多态变体、种间同源物(例如直系同源物)、旁系同源物和等位基因。
如本文所用，术语“宿主细胞”不仅指特定的主题细胞，而且指此类细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代实际上可能与主题细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，在两个或更多个多核苷酸或多肽的上下文中的术语“同一性”或“相同”是指当两个或更多个多核苷酸或多肽分别对齐以实现最大对应时相同的核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“同一性”可以存在于被比较的序列区域上(例如，在功能结构域的长度上)或序列的全长上。“区域”被认为是至少9、14、19、24、29、34、39或更多个核苷酸或至少6、10、14、18、22、26、30或更多个氨基酸的连续区段。为了比较，通常一个序列充当一个或多个测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性方法搜索，通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(GCG)的序列分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，可以以默认参数使用)，或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，下文)。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法(参见例如Altschul等人[1990]J.Mol.Biol.215:403-410；Gish&States.[1993]NatureGenet.3:266-272；Madden等人[1996]Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等人[1997]Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang 7Madden.[1997]Genome Res.7:649-656)。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
本文使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“有”或其变体旨在以类似于术语“包含”的方式而是包含性的。
如本文所用，术语“连接肽”是指位于本文提供的重组蛋白的单独结构域(即，乳蛋白)之间的氨基酸序列。连接肽可包括1至80个氨基酸。
如本文所用，术语“哺乳动物产生的乳汁”是指由哺乳动物产生的乳汁。
如本文所用，术语“乳蛋白”是指乳清蛋白或酪蛋白。乳蛋白可以来源于任何哺乳动物物种，包括但不限于牛、人、绵羊、欧洲盘羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、羊驼、牦牛、美洲驼、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、山羊、猴、猿、猫、狗、小袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔子、鲸、狒狒、长臂猿、红毛猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、虎和针鼹。
如本文所用，术语“天然的”是指在自然界中以其未修饰状态发现的(例如，未经人类遗传修饰，并且在不是由人类定义的条件[例如，氧合水平、pH、盐浓度、温度和营养物质(例如碳、氮、硫)可用性]下维持的细胞)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指允许它们在功能上相关的元件布置。例如，如果启动子序列控制蛋白质编码序列的转录，则启动子序列与蛋白质编码序列可操作地连接，如果分泌信号序列引导蛋白质通过细胞的分泌系统，则分泌信号序列与蛋白质可操作地连接。“可操作地连接”的元件可以与另一个元件连续连接，或以反式作用或与另一个元件相距一定距离。可以可操作地连接的功能的非限制性例子包括转录控制、翻译控制、蛋白质折叠和蛋白质分泌。
如本文所用，术语“一个或多个”是指随后列出的元素中的一个、至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个或所有元素。
如本文所用的术语“任选的”或“任选地”是指特征或结构存在或不存在，或事件或情况发生或不发生。该描述包括存在特征或结构的实例、不存在特征或结构的实例、发生事件或情况的实例以及不发生事件或情况的实例。
如本文所用，术语“肽键”是指顺肽键(eupeptide bond)(即，酰胺类型的共价化学键，其沿着多肽或蛋白质链从一个α-氨基酸的C1到另一个α-氨基酸的N2连接两个连续的α-氨基酸)。
术语“聚合物”是指通过聚合相同或不同类型的蛋白质单体制备的聚合化合物。因此，通用术语聚合物包括术语“均聚物”，通常用于指代仅由一种蛋白质单体制备的聚合物，以及“共聚物”，其是指由两种或更多种不同单体制备的聚合物。“聚合物”可以是具有或不具有支链的直链，并且可以包括聚合物基质(例如，相互连接的聚合物链)。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指至少2个(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1,000个)核苷酸的聚合形式。该术语包括DNA分子(例如cDNA、基因组DNA、合成DNA)和RNA分子(例如mRNA、合成RNA)的有义链和反义链，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键和/或化学修饰的DNA或RNA的类似物。多核苷酸可以进行化学或生物化学修饰，或者可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记；甲基化；用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)、带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)、悬垂的部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键联(例如，α异头核酸)。本领域中描述了修饰核苷酸的实例(参见，例如，Malyshev等人2014.Nature 509:385；Li等人2014.J.Am.Chem.Soc.136:826)。还包括模拟多核苷酸通过氢键合或其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。此类分子是本领域已知的并且包括例如其中肽键替代分子骨架中的磷酸键的分子。其他修饰可以包括例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构的类似物，例如在“锁定”多核苷酸中发现的修饰。多核苷酸可以是任何拓扑构象。例如，多核苷酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、分支的、发夹的、环状的或锁式构象。如本文所用，术语“多核苷酸序列”是指包含在多核苷酸中或组成多核苷酸的核苷酸序列。
如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可以互换，并且指至少2(例如，至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100)个氨基酸。“多肽”或“蛋白质”可具有活性结构或缺乏功能结构，包含编码和/或非编码氨基酸，包含自然界中存在的氨基酸和/或自然界中不存在的氨基酸，包含化学修饰和/或生物化学修饰和/或衍生的氨基酸，包含未修饰和/或修饰的肽主链，和/或是单体的(即具有单链)或聚合的(即具有两条或更多条链，其可以共价或非共价缔合)。如本文所用，术语“氨基酸序列”是指包含在“多肽”或“蛋白质”中或组成“多肽”或“蛋白质”的氨基酸序列。
如本文所用，术语“翻译后修饰”或其首字母缩写词“PTM”是指生物合成后化学基团与多肽的共价连接。PTM可出现在多肽的氨基酸侧链或其C-或N-末端。PTM的非限制性实例包括糖基化(即，聚糖基团(例如，单糖、二糖、多糖、线性聚糖、支链聚糖、具有半胱氨酸残基的聚糖、具有硫酸盐和/或磷酸盐残基的聚糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-神经氨酸、呋喃半乳糖、磷酸二酯、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸及其组合；参见，例如，Deshpande等人2008.Glycobiology 18(8):626)与蛋白质通过C-连接(即C-糖基化)、N-连接(即N-糖基化)或O-连接(即O-糖基化)或通过糖基磷脂酰肌醇化(即，添加糖基磷脂酰肌醇锚)或磷酸糖基化(即，通过磷酸丝氨酸的磷酸酯连接)的共价附接)，磷酸化(即，磷酸基团共价附接到蛋白质)，烷基化(即，烷烃基团(例如甲基化中的甲烷基团)共价附接于蛋白质)，脂质化(即脂质基团的共价附接(例如，在异戊烯基化和异戊二烯基化中的类异戊二烯基团(例如，在法尼基化中的法尼醇基团，在香叶基化中香叶醇基团，在香叶基香叶基化中的香叶基香叶醇基团)，在脂肪酰化中的脂肪酸基团(例如，在肉豆蔻酰化中的肉豆蔻酸，在棕榈酰化中的棕榈酸)，糖基磷脂酰肌醇锚固基化))、羟基化(即羟基的共价附接)、苏木化(即连接到小泛素样修饰物(或SUMO)蛋白附接到蛋白质)、亚硝基化(即NO基团附接到蛋白质；例如，S-亚硝基化)，亚硝基硫醇化(即NO基团附接到蛋白质中的半胱氨酸硫醇(例如，S-亚硝基硫醇))，谷胱甘肽化(即谷胱甘肽基团连接到蛋白质中的半胱氨酸硫醇(例如，S-谷胱甘肽化))和酪氨酸硝化(即硝酸盐基团附接在蛋白质的酪氨酸残基上)。
本文所用的术语“启动子序列”是指指导下游多核苷酸在细胞中转录的多核苷酸。启动子序列可以包括靠近转录起始位点的必需核苷酸，例如，在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子序列还可以任选地包括远端增强子或阻抑物元件，它们可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。
本文所用的术语“蛋白酶”是指可以水解(即，裂解)肽键的蛋白质(例如，酶分类组EC3.4的成员)。蛋白酶的非限制性实例包括凝乳酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶、GI蛋白酶(例如，存在于人或其他动物胃肠道中并且是人或微生物来源的蛋白酶)、枯草杆菌蛋白酶(UniProt#P00782)、kex2内切蛋白酶(UniProt#P13134)和TEV蛋白酶(UniProt#P04517)。
如本文所用，术语“蛋白酶识别或切割序列”或“蛋白酶的识别或切割序列”是指被蛋白酶识别并且其中肽键被蛋白酶切割的氨基酸序列。
如本文所用，术语“蛋白质浓缩物”是指在去除碳水化合物、脂质、灰分和其他次要成分中的一种或多种的至少一部分(或实质部分)后获得的蛋白质材料。它通常包含按质量计约30％至约80％(例如,30％至80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、或35％；35％至80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％；40％至80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％；45％至80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％；50％至80％、75％、70％、65％、60％或55％；55％至80％、75％、70％、65％或60％；60％至80％、75％、70％或65％；65％至80％、75％或70％；70％至80％或75％；或75％至80％的蛋白质。
本文所用的术语“蛋白质分离物”是指在去除多糖、可溶性碳水化合物、灰分和其他次要成分中的一种或多种的至少一部分(或实质部分)后获得的蛋白质材料。它通常包含按质量计至少80％(即，至少80％、至少85％、至少95％、至少99％)的蛋白质。
如本文所用，术语“纯化”或“纯化的”或“分离”或“分离的”是指组分与该组分源自的来源中的化学物质、细胞组分和细胞(例如，细胞壁、膜脂、染色体、其他蛋白质、生物体中的其他细胞)基本上分离。该组分可以是至少60％纯的，例如大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％纯。该术语不要求(尽管允许)将组分与所有化学物质、细胞组分和细胞分开。
如本文所用的关于蛋白质(例如，乳蛋白)的术语“重组”是指在重组宿主细胞中产生的蛋白质，或从重组多核苷酸合成的蛋白质。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”是指包含重组多核苷酸的宿主细胞。因此，例如，重组宿主细胞可以产生在宿主细胞的天然(非重组)形式中不存在的多核苷酸或多肽，或者重组宿主细胞可以以不同于该宿主细胞的天然(非重组)形式的水平产生多核苷酸或多肽。应当理解，这样的术语不仅意指特定的受试细胞，而且意指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响，可能会在后代中发生某些修饰，所以这种后代可能与受试细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语“重组宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或者可以是存在于活组织或生物体中的细胞。
如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指从其天然存在的环境中移除的多核苷酸，或不与在自然界中发现时邻接或接近该多核苷酸的多核苷酸的全部或部分缔合的多核苷酸，或与在自然界中未连接的多核苷酸可操作地连接的多核苷酸，或含有在自然界中未在该多核苷酸中发现的修饰(例如、插入、缺失或人工引入的点突变，例如通过人为干预)的多核苷酸，或在异源位点整合到染色体中的多核苷酸。该术语可用于，例如，描述克隆的DNA分离物，或包含化学合成的核苷酸类似物的多核苷酸。如果多核苷酸包含非自然发生的遗传修饰，它也被认为是“重组的”。例如，如果内源性多核苷酸包含人工引入(例如，通过人为干预)的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，则它被认为是“重组多核苷酸”。这种修饰可以将点突变、取代突变、缺失突变、插入突变、错义突变、移码突变、重复突变、扩增突变、易位突变或倒位突变引入多核苷酸。该术语包括宿主细胞染色体中的多核苷酸，以及不在宿主细胞染色体中的多核苷酸(例如，包含在附加体中的多核苷酸)。宿主细胞或生物体中的重组多核苷酸可以使用宿主细胞的体内细胞机制进行复制；然而，虽然随后在细胞内复制，但出于本发明的目的这种重组多核苷酸仍被认为是重组的。
如本文所用，术语“调节元件”是指介导、调控或调节与调节元件可操作地连接的多核苷酸的表达(例如，转录、转录后事件、翻译)的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“分泌信号”是指可操作地连接至蛋白质的N-末端并且介导经由其中产生(即合成)蛋白质的宿主细胞的细胞内分泌途径将蛋白质递送到宿主细胞的外部的肽。通常，重组蛋白与分泌信号的可操作的连接需要去除编码重组蛋白的多核苷酸序列的起始密码子。
我们在本文中使用的术语“相似”指的是关于指定属性在大约+/-15％之内。该术语包括关于指定属性在+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％或+/-1％之内。
如本文所用，术语“两个或更多个”是指随后列出的元素的两个、至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个或全部。
如本文所用，术语“乳清蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的乳清蛋白(即，对于哺乳动物产生的乳汁是天然的乳清蛋白；例如，天然乳清蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。乳清蛋白的实例包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳转铁蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶蛋白和糖巨肽。因此，本文使用的术语“α-乳清蛋白”、“β-乳球蛋白”、“乳转铁蛋白”、“乳铁蛋白”、“血清白蛋白”、“乳过氧化物酶”和“糖巨肽”是指包含分别与天然存在于哺乳动物产生的乳汁中的α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳转铁蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶和糖巨肽(GMP)(例如，分别地家牛α-乳清蛋白(UniProt序列P00711的氨基酸20-142)、家牛β-乳球蛋白(UniProt序列P02754的氨基酸17-178)、家牛乳转铁蛋白(UniProt序列P24627的第20至708位氨基酸)、家牛乳铁蛋白(UniProt序列P24627的第36至60位氨基酸)、家牛血清白蛋白(UniProt序列P02769的第25至607位氨基酸)、家牛乳过氧化物酶(UniProt序列P80025的第101至712位氨基酸)和家牛糖巨肽(GMP；UniProt序列P02668的氨基酸127至190))中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150)个氨基酸的序列的多肽。乳清蛋白的氨基酸序列与哺乳动物产生的乳汁中天然发现的乳清蛋白的氨基酸序列之间的差异可能是由于保守氨基酸取代(即，用化学相似的氨基酸取代氨基酸；提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的)、非保守性氨基酸取代以及氨基酸插入、氨基酸缺失和多肽截短(例如，提供乳清蛋白的片段)，其不会实质上改变乳清蛋白的结构和/或一种或多种功能。此类氨基酸取代/缺失/插入可以使用本领域已知的方法来鉴定，其涉及产生包含通过分子建模方法(使用例如PyMol[
Figure BDA0004153207000000191
New York,NY])或多序列比对(例如，天然乳清蛋白的直向同源物；使用，例如MUSCLE[Edgar,2004,Nucleic Acids Res32:1792–1797])鉴定为不会实质性改变蛋白质结构和/或功能的候选氨基酸取代/缺失/插入的乳清蛋白，并使用用于确定蛋白质结构和/或功能的众所周知的方法测试这种乳清蛋白。此类方法也可用于确定乳清蛋白是否可用于本发明，并鉴定在特定应用中具有改进功能的乳清蛋白。
如本文所用，术语“载体”是指可以携带待引入宿主细胞的多核苷酸序列的核酸。载体的非限制性实例包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒颗粒(例如，包含异源多核苷酸)、DNA构建体(例如，通过克隆或PCR扩增产生)和线性双链分子(例如，PCR片段)。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
如本文所用，术语“酵母”是指酵母目的生物体。酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽/起泡，并且碳分解代谢可能是发酵的。
本文所用的术语“按质量计的％”是指在水合组合物中测定的质量的百分比值，使得该组合物包括粉末质量以及水合剂质量，其中100％固定为整个水合组合物的百分比值。在组合物为粉末形式的实施方案中(稍后将向其中加入水合剂的质量)，该术语是指相对于最终的整个水合组合物测定的质量的百分比值(100％固定为整个最终水合组合物的百分比值)。
除非本文另有说明，本文对数值范围的列举仅旨在用作单独指代落在包括所列举的最小值和最大值的范围内的每个单独值(分数或整数)的速记方法，并且每个单独的值被合并到说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。此外，应当理解，本文中列举的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包括在所列举的最小值1和所列举的最大值10之间(并且包括端值)的所有子范围，即其具有等于或大于1的最小值和小于或等于10的最大值。还应当理解，下文描述的所有范围和量都是近似值并且不旨在限制本发明。
应当理解，在本文公开的任何方法中，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
还应当理解，本文公开的重组蛋白的任何结构可以从重组蛋白的C-末端到N-末端阅读，或可以从重组蛋白的N-末端到C-末端阅读。例如，具有结构(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白)的重组蛋白的公开内容可以理解为在其C末端具有β-乳球蛋白和在其N末端具有酪蛋白的重组蛋白，或可以理解为在其C末端具有酪蛋白和在其N末端具有β-乳球蛋白。
重组蛋白
在各个方面，本文提供了具有以下结构的重组蛋白：
(A)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)，
或
(B)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)，或
(C)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)-(连接肽3)-(乳蛋白4)；
其中：
-乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4、连接肽1、连接肽2和连接肽3通过肽键连接；和
-乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是包含游离硫醇基的乳蛋白。
在根据上述任一项的重组蛋白中，乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和/或乳蛋白4可以在长度和/或氨基酸序列上彼此相同或彼此不同；和/或连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以在长度和/或氨基酸序列上彼此相同或彼此不同。
包含游离硫醇基的乳蛋白包括某些β-乳球蛋白(例如，家牛β-乳球蛋白[UniProt序列P02754的氨基酸17-178)，除了下面提到的其中硫醇基团从蛋白质中去除的那些，某些血清白蛋白(例如，家牛血清白蛋白[UniProt序列P02769的氨基酸25至607])，除了下面提到的其中从蛋白质中去除了硫醇基团的那些，以及某些乳过氧化物酶(例如，家牛乳过氧化物酶[UniProt序列P80025的氨基酸101至712])，除了下面提到的其中从蛋白质中去除了硫醇基团的那些。不包含游离硫醇基的乳蛋白包括某些α-乳清蛋白(例如家牛α-乳清蛋白[UniProt序列P00711的氨基酸20-142])，某些乳转铁蛋白(例如家牛乳转铁蛋白[UniProt序列P24627的氨基酸20至708])，某些乳铁蛋白(例如，家牛乳铁蛋白[UniProt序列P24627的氨基酸36至60])，某些糖巨肽(GMP；例如，家牛GMP[UniProt序列P02668的氨基酸127至190])，某些β-酪蛋白(例如，家牛β-酪蛋白[UniProt序列P02666的氨基酸16至224])，某些κ-酪蛋白(例如，家牛κ-酪蛋白[UniProt序列P02668的氨基酸22至190])，某些α-S1-酪蛋白(例如，家牛α-S1-酪蛋白[UniProt序列P02662的氨基酸16至214])，某些α-S2-酪蛋白(例如，家牛α-S2-酪蛋白[UniProt序列P02663的氨基酸16至222])，某些β-乳球蛋白(例如家牛β-乳球蛋白[UniProt序列P02754的氨基酸17-178]，其包含在第137位从半胱氨酸到丝氨酸的氨基酸取代，从而从蛋白质中去除硫醇基团)，某些血清白蛋白(例如家牛血清白蛋白[UniProt序列P02769的氨基酸25至607]，其包含在第58位从半胱氨酸到丝氨酸的氨基酸取代，从而从蛋白质中去除硫醇基团)和某些乳过氧化物酶(例如家牛乳过氧化物酶[UniProt序列P80025的氨基酸101到712]，其包含在位置558处从半胱氨酸到丝氨酸的氨基酸取代，从而从蛋白质中去除硫醇基团)。本领域技术人员可以容易地确定乳蛋白是否包含游离硫醇基或不包含游离硫醇基(例如，通过确定乳蛋白是否包含奇数个半胱氨酸残基，和/或通过使用本领域已知的方法(例如在部分还原或非还原条件下对蛋白质进行蛋白水解消化后进行质谱(MS)分析，以及蛋白质晶体结构的分析)关于游离的、非二硫键结合的硫醇基团的存在分析乳蛋白的结构)。
不希望受理论的束缚，在非还原条件下(例如，存在的分子内二硫键保持不变的条件)，根据上文任一项所述的重组蛋白可以通过可用的游离硫醇基与根据上文任一项所述的另一种重组蛋白形成共价键(即二硫键)，从而形成多种聚合物，其在使用呈未连接(即，未通过肽键彼此共价连接)形式的乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和/或乳蛋白4时不能形成或不能形成至相同程度或相同纯度，并且可能促成具有各种属性的包含重组蛋白和/或由重组蛋白形成的聚合物或基本上由其组成的组合物。
乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4
在具有根据上文所述的结构(A)、(B)或(C)的重组蛋白中，乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3或乳蛋白4中的仅一种可以是包含游离硫醇基的乳蛋白(即，重组蛋白包含单价游离硫醇基)。
因此，重组蛋白可以具有：
-根据上文所述的结构(A)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白并且乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(B)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(B)，其中乳蛋白1是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为不包含游离硫醇基的乳蛋白；或
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为不包含游离硫醇基的乳蛋白。
此类重组蛋白的非限制性实例包括：
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)。
在具有根据上文所述的结构(A)、(B)或(C)的重组蛋白中，仅乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的两种可以是包含游离硫醇基的乳蛋白(即，重组蛋白包含二价游离硫醇基)。
因此，重组蛋白可以具有：
-根据上文所述的结构(A)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白并且乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(B)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(B)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3是包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为不包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为包含游离硫醇基的乳蛋白；或
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1不包含游离硫醇基，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为不含游离硫醇基的乳蛋白。
此类重组蛋白的非限制性实例包括：
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(β-乳球蛋白)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(α-乳清蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(α-乳清蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)。
在具有根据上文所述的结构(B)或(C)的重组蛋白中，乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的仅三个可以是包含游离硫醇基的乳蛋白(即，重组蛋白包含三价游离硫醇基)。
因此，重组蛋白可以具有：
-根据上文所述的结构(B)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，并且乳蛋白3是包含游离硫醇基的乳蛋白；
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是包含游离硫醇基的乳蛋白硫醇基，乳蛋白4为不包含游离硫醇基的乳蛋白；或
-根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白4为包含游离硫醇基的乳蛋白。
此类重组蛋白的非限制性实例包括：
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(α-乳清蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(α-乳清蛋白)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)。
在具有根据上文所述的结构(C)的重组蛋白中，乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的所有(即四种)可以是包含游离硫醇基的乳蛋白(即，重组蛋白包含四价游离硫醇基)。
因此，重组蛋白可具有根据上文所述的结构(C)，其中乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，乳蛋白蛋白3为包含游离硫醇基的乳蛋白，和乳蛋白4为包含游离硫醇基的乳蛋白。
此类重组蛋白的非限制性实例包括：
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(牛血清白蛋白)-(连接肽1)-(牛血清白蛋白)-(连接肽2)-(牛血清白蛋白)-(连接肽3)-(牛血清白蛋白)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(乳过氧化物酶)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(乳过氧化物酶)-(连接肽2)-(乳过氧化物酶)-(连接肽3)-(乳过氧化物酶)；和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(β-乳球蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(牛血清白蛋白)。
在具有根据上文所述的结构(A)、(B)或(C)的重组蛋白中，乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和/或乳蛋白4可以具有天然PTM(例如哺乳动物PTM)、非天然PTM(例如非哺乳动物PTM)或至少一个天然PTM和至少一个非天然PTM的混合物。如本文所用，术语“非天然PTM”是指与其自然界中存在于其中的蛋白质(例如，在哺乳动物来源的乳汁中；即具有“天然PTM”的蛋白质)相比，蛋白质中一个或多个PTM(例如，糖基化、磷酸化)的一个或多个位置的差异，和/或一个或多个位置处的一个或多个PTM的类型的差异。
连接肽
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3的长度可以介于0和约80个氨基酸之间(例如，介于0和80、70、60、50、40、30、20、10或5个氨基酸之间；5至80、70、60、50、40、30、20或10个氨基酸；10至80、70、60、50、40、30或20个氨基酸；20至80、70、60、50、40或30个氨基酸；30至80、70、60、50或40个氨基酸；40至80、70、60或50个氨基酸；50至80、70或60个氨基酸；60至80或70个氨基酸；或70至80个氨基酸)。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以包含一个或多个游离硫醇基。一种或多种连接肽可包含一个或多个半胱氨酸残基。或者，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可不含任何半胱氨酸残基，或可不含任何游离硫醇基。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可包含蛋白酶识别或切割序列。合适的蛋白酶识别或切割序列的非限制性实例包括本文公开的任何蛋白酶的识别或切割序列。或者，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可包含在糖基化时提供针对蛋白质降解的保护的一个或多个氨基酸(例如，丝氨酸残基，苏氨酸残基)。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以使乳液稳定。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以包含促进结构柔性的一个或多个氨基酸(例如甘油残基)，或可包含促进结构刚性的一个或多个氨基酸。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以是合成的接头(即，在自然界中不存在的接头)。合成接头是本领域已知的(参见，例如，ReddyChichili等人2013Protein Sci22:153-67,Zou等人2012Microb Cell Fact 11:21,Gustavsson等人2001Protein engineering 14(9):711–715,Adlakha等人2011ApplEnviron Microbiol 77(14):4859-4866,和Adlakha等人2011Appl Environ Microbiol 77(14):4859-4866)。
在根据上文任一项所述的重组蛋白中，连接肽1、连接肽2和/或连接肽3可以是天然接头(即，在自然界中发现的接头)。天然接头是本领域已知的(参见，例如，Beckham等人2010Biophysical Journal99(11):3773–3781,Levasseur等人2005Applied&Environmental Microbiology 71(12):8132–8140,Tan等人2015Nat Commun 6:7542,Brunecky等人2013Science 342(6165):1513-1516,Kahn等人2019Biotechnol Biofuels12:44,Conesa等人2001FEBS Lett.503(2-3):117-120)。
重组蛋白的性质
根据上文任一项所述的重组蛋白可具有多种性质。性质的非限制性实例包括溶解度(即，在给定条件下和在各种溶剂中分散和胶体稳定的蛋白质的量；例如，类似于或大于乳清蛋白或马铃薯蛋白的溶解度)，发泡/发酵能力(即形成泡沫的能力，其中本文所用的术语“泡沫”是指分散在固体或水性连续相中的气泡)，泡沫稳定性(即泡沫响应于物理和/或化学条件半衰期)，乳化能力(即稳定乳液的能力或给定质量的样品在没有去稳定的情况下可以乳化的油的量)，胶凝/增稠/凝结能力(即形成凝胶的能力，其中本文所用的术语“凝胶”是指一种蛋白质网络，其空间填充有通过氢键连接到蛋白质分子的溶剂并具有确定的粘弹性)，胶凝特征谱(例如，胶凝/增稠/凝结能力随时间变化的曲线，作为温度函数的粘弹性参数)，凝胶强度(即破坏限定区域的凝胶表面所需的机械力))(例如，类似于明胶的胶凝/增稠/凝固行为)，水结合能力(即，限定质量的蛋白质结合的水量)，热稳定性(即，在各种pH值和离子强度下在高温下的结构稳定性；例如，类似于β乳球蛋白的热稳定性，至少为80℃的热稳定性)，货架稳定性，冷冻/解冻稳定性，健康特征谱(例如，基本上不含过敏原表位[即，在人或其他动物中引起过敏反应的氨基酸序列]，基本上不含炎性T细胞表位)，胃肠道消化率(即药剂在人或其他动物胃肠道(即口腔、食道、胃、小肠、大肠和肛门)中降解的速率，发酵液中的热稳定性(即发酵液中全长蛋白质产物的百分比)，和味道(例如，淡淡的味道，缺乏风味)。例如，具有根据上文所述的结构(A)、(B)或(C)的重组蛋白(其中乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是包含游离硫醇基的β-乳球蛋白，并且乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是酪蛋白(例如，κ-酪蛋白、β-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白))与没有与β-乳球蛋白共价连接的酪蛋白相比，可以以更高的滴度由重组宿主细胞产生和/或分泌，或具有更高的稳定性(在重组宿主细胞的发酵中的蛋白质稳定性)。
重组表达构建体
在各个方面，本文提供了一种由多核苷酸组成的重组表达构建体，所述多核苷酸包含：
-启动子序列(例如，本文公开的任何启动子的多核苷酸序列)，
-可选的分泌信号序列(即，编码肽的序列，该肽介导附接于肽的新生蛋白质递送至合成新生蛋白质的细胞的外部；例如，编码本文公开的任何分泌信号的多核苷酸序列)，
-重组蛋白编码序列(即，编码根据上述任一项所述的重组蛋白的多核苷酸序列，任选地包含标签多肽(例如，本文公开的任何标签多肽))，和
-终止序列(例如，本文公开的任何终止子的多核苷酸序列)；
其中：
-启动子序列在有义方向上可操作地连接到可选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列(即，启动子序列和可选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列的位置使得启动子序列有效地介导或调节任选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列的转录)，
-可选的分泌信号序列在有义方向上可操作地连接到重组蛋白编码序列(即，可选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列的位置使得转录和翻译产生包含可选的分泌信号的重组蛋白)，和
-一个或多个终止子序列可操作地连接到重组蛋白编码序列(即，重组蛋白编码序列和一个或多个终止子序列的位置使得一个或多个终止子序列有效地终止重组蛋白编码序列的转录)。
重组表达构建体还可包含编码亲和纯化标签的可操作连接的序列，使得表达的重组蛋白包含用于亲和纯化的肽序列。此类亲和纯化标签可以可操作地连接，使得当表达时亲和纯化标签存在于或朝向氨基末端、羧基末端或两者。此类亲和纯化标签可包含麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、聚(His)标签、六(His)标签、FLAG-标签、V5-标签、VSV标签、E标签、NE标签、血凝素(Ha)标签和Myc标签。
重组表达构建体可以进一步包含用于通过同源(即靶向整合)或非同源重组整合到宿主细胞基因组中的序列。重组表达构建体可以包含与宿主细胞基因组中的靶序列具有足够同一性以提高重组表达构建体的同源重组的可能性的至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1,000个或至少10,000个碱基对。这种同源序列可以是非编码的或编码的。
包含在根据上文任一项所述的重组表达构建体中的任选的分泌信号序列和/或重组蛋白编码序列可以针对在根据上文任一项所述的重组宿主细胞中的表达进行密码子优化。
可以分离根据上文任一项所述的重组表达构建体。
可以在将重组表达构建体的片段整合到宿主细胞的基因组(例如，根据上文任一项所述的重组宿主细胞的基因组)中后产生根据上文任一项所述的重组表达构建体。例如，包含重组蛋白编码序列(任选可操作地连接到分泌信号序列)的多核苷酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，使得内源基因座的一个或多个调节元件变得可操作地连接到重组蛋白编码序列，从而产生根据上文任一项所述的重组表达构建体。
启动子序列
根据上文任一项所述的重组表达构建体可以包含在根据下文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何启动子序列。
启动子序列可以是组成型启动子序列(即，在大多数环境和发育条件下有活性的启动子序列)，或诱导型或阻抑型启动子序列(即，仅在某些环境或发育条件[例如，在存在或不存在某些因素的情况下，例如但不限于碳(例如，葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、纤维素、槐糖、龙胆二糖、山梨糖、诱导纤维素酶启动子的二糖、淀粉、色氨酸、硫胺素、甲醇)、磷酸盐、氮或其他营养物质；温度；pH；渗透压；重金属或重金属离子；抑制剂；应激；分解代谢物；以及它们的组合]下有活性的启动子序列)。
启动子序列可以由单个启动子序列组成，或由两个或更多个启动子序列组成(例如，按顺序排列的两个或更多个启动子或其功能部分的组合，诱导型和组成型启动子的组合)。两个或更多个启动子序列可以相同，或者两个或更多个启动子序列中的至少两个可能不相同。
启动子序列可以包含双向启动子序列或由其组成(即，通过募集转录因子以两个方向启动转录的多核苷酸，例如通过在相反方向融合两个相同或不同启动子而产生)。
合适的启动子序列的非限制性实例包括在细菌宿主细胞中起作用的启动子序列，包括T7启动子、T5启动子、Tac启动子、pL/pR启动子、phoA启动子、lacUV5启动子、trc启动子、trp启动子、cstA启动子、xylA启动子、manP启动子、malA启动子、lacA启动子、aprE启动子、ΔaprE启动子、srfA启动子、p43启动子、ylbA启动子、σB启动子、veg启动子、PG1启动子、PG6启动子、λPL启动子、λPR启动子和spa启动子，以及它们的功能部分和组合。
合适的启动子序列的非限制性实例包括在真菌宿主细胞中起作用的启动子序列，包括xlnA启动子、xyn1启动子、xyn2启动子、xyn3启动子、xyn4启动子、bxl1启动子、cbh1启动子、cbh2启动子、egl1启动子、egl2启动子、egl3启动子、egl4启动子、egl5启动子、glaA启动子、agdA启动子、gpdA启动子、gpd1启动子、AOX1启动子、GAP1启动子、MET3启动子、ENO1启动子、GPD1启动子、PDC1启动子、TEF1启动子、AXE1启动子、CIP1启动子、GH61启动子、PKI1启动子、RP2启动子、ADH1启动子、CUP1启动子、GAL1启动子、PGK1启动子、YPT1启动子、LAC4启动子、LAC4-PB1启动子、FLD1启动子、MOX启动子、DAS1启动子、DAS2启动子、GAP1启动子、STR3启动子、ADH3启动子、GUT2启动子、CYC1启动子、TDH3启动子、PGL1启动子、ADH2启动子、HXT7启动子、CLB1启动子和PHO5启动子，以及它们的功能部分和组合。
分泌信号序列
根据上文任一项所述的重组表达构建体可以任选地包含在根据下文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何分泌信号序列。
任选的分泌信号序列可以编码分泌信号，该分泌信号介导新生重组蛋白在翻译后(即，蛋白质合成先于易位，使得新生重组蛋白在易位到ER中之前存在于细胞胞质溶胶中)或在翻译同时(即蛋白质合成和易位到ER中同时发生)易位到ER中。
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在细菌宿主细胞中起作用的分泌信号序列，包括编码以下蛋白质中任一项的基因的分泌信号序列：PelB、OmpA、Bla、PhoA、PhoS、MalE、LivK、LivJ、MglB、AraF、AmpC、RbsB、MerP、CpdB、Lpp、LamB、OmpC、PhoE、OmpF、TolC、BtuB和LutA，以及它们的功能部分和组合。
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在真菌宿主细胞中起作用的分泌信号序列，包括编码以下蛋白质中任一项的基因的分泌信号序列：CBH1、CBH2、EGL1、EGL2、XYN1、XYN2、BXL1、HFB1、HFB2、GLAA、AMYA、AMYC、AAMA、α交配因子、SUC2、PHO5、INV、AMY、LIP、PIR、OST1和β-葡萄糖苷酶，以及它们的功能部分和组合。
终止序列
根据上文任一项所述的重组表达构建体可以包含在根据下文任一项的重组宿主细胞中具有活性的任何终止序列。
合适的终止序列的非限制性实例包括adh1、amaA、amdS、amyA、aox1、cbh1、cbh2、cyc1、egl1、egl2、gal1、gap1、glaA、gpd1、gpdA、pdc1、pgk1 tef1、tps1、trpC、xyn1、xyn2、xyn3和xyn4基因的终止序列以及它们的功能部分和组合的终止序列。
终止序列可以由单个终止序列组成，或者由两个或更多个终止序列组成，其中两个或更多个终止序列可以相同，或者两个或更多个终止序列中的至少两个可以不相同。终止序列可以由双向终止序列组成。
其他调节元件
根据上文任一项所述的重组表达构建体可以进一步包含额外的调节元件。
调节元件的非限制性实例包括启动子序列、终止序列、转录起始序列、翻译起始序列、翻译终止序列、增强子序列、激活子序列、响应元件、蛋白质识别位点、诱导性元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(例如包含多聚腺苷酸化信号的3'非翻译区)、上游激活序列(UAS)、内含子、操纵子(即与启动子相邻的核酸序列，其包含蛋白质结合结构域，其中阻抑蛋白可以结合并降低或消除启动子的活性)、有效的RNA加工信号(例如，剪接信号、多聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、提高翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点[例如，Shine-Dalgarno序列])、提高蛋白质稳定性的序列、增强蛋白质分泌的序列及其组合。
重组载体
在各个方面，本文提供了一种重组载体，其包含根据上文任一项所述的重组表达构建体或其片段(例如，包含重组蛋白编码序列和任选的分泌信号序列的多核苷酸，其在整合进入宿主细胞的基因组后产生根据上文任一项所述的重组表达构建体)。
重组载体可以包含根据上述任何一种的单一重组表达构建体，或根据上述任何一种的两个或更多个重组表达构建体，它们可以是相同的或其中的至少两个可以是不相同的(例如，在启动子序列、分泌信号、蛋白质编码序列、终止序列和/或附加调节元件方面彼此不同)。在重组载体包含两种或更多种重组表达构建体的实施方案中，两种或更多种重组表达构建体可以编码相同的重组蛋白。在一些此类实施方案中，编码相同重组蛋白的两种或更多种重组表达构建体在启动子序列、分泌信号序列、终止序列和/或额外的调节元件方面彼此不同。
重组载体可以进一步包含一种或多种适合于在重组宿主细胞中繁殖重组载体的其他元件。此类其他元件的非限制性实例包括复制起点和选择标记。复制起点和选择标记是本领域已知的，并且包括细菌和真菌复制起点(例如，AMA1、ANSI)。选择标记可以是抗性基因(即编码使宿主细胞能够解毒外源添加的化合物[例如抗生素化合物]的蛋白质的多核苷酸)、营养缺陷型标记(即编码允许宿主细胞合成必需的组分(通常是氨基酸)而在缺乏该必需组分的培养基中生长的蛋白质的多核苷酸)，或颜色标记(即编码可以产生颜色的蛋白质的基因)。合适的选择标记的非限制性实例包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)和ble(博来霉素类抗生素抗性)及其衍生物。选择标记可包含减少选择标记产生的改变，从而增加允许包含重组载体的重组宿主细胞在选择下存活所需的拷贝数。选择也可以通过共转化来完成，其中转化是用两种载体的混合物进行的，并且只对一种载体进行选择。
重组载体可以进一步包含用于通过同源(即靶向整合)或非同源重组整合到宿主细胞基因组中的序列。重组表达构建体可以包含与宿主细胞基因组中的靶序列具有足够同一性以提高重组表达构建体同源重组的可能性的至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1,000个或至少10,000个碱基对。这种同源序列可以是非编码的或编码的。
可以分离根据上文任一项所述的重组载体。
重组宿主细胞
在各个方面，本文提供了一种重组宿主细胞，其能够产生根据上文任一项所述的重组蛋白，其中该重组宿主细胞包含根据上文任一项所述的重组表达构建体。
重组宿主细胞可包含根据上文任一项所述的单一重组表达构建体，或包含根据上文任一项所述的两种或更多种重组表达构建体。在重组宿主细胞包含两种或更多种重组表达构建体的实施方案中，两种或更多种重组表达构建体可以相同，或两种或更多种重组表达构建体中的至少两种可以彼此不同(例如，在启动子中序列、蛋白质编码序列、分泌信号序列、终止序列和/或额外的调控元件中不同)。
重组宿主细胞可包含稳定整合到重组宿主细胞的基因组内(例如，通过靶向(例如，通过同源重组)或随机(即，非靶向)整合)的重组表达构建体，和/或未稳定整合而是保持在染色体外(例如，在本文提供的自主复制重组载体上)的重组表达构建体。
根据上文任一项所述的重组宿主细胞可以来源于任何生物体，包括任何细菌、真菌(例如，酵母、丝状真菌)、古细菌、原生生物、动物(包括任何单细胞动物)、植物(包括任何单细胞植物)、藻类、原生动物和色藻界，或其遗传变异体(例如，突变体)，以及来源于任何公认安全(GRAS)的工业宿主细胞。
合适植物的非限制性实例包括苏铁、银杏、针叶树、柏树、杜松、金钟柏、雪松、松树、当归、葛缕子、芫荽、小茴香、茴香、欧芹、莳萝、蒲公英、蜡菊、金盏花、艾蒿、红花、甘菊、生菜、苦艾、金盏花、香茅、鼠尾草、百里香、野鼠尾草籽、芥末、橄榄、咖啡、辣椒、茄子、红辣椒、蔓越莓、猕猴桃、蔬菜(例如胡萝卜、芹菜)、万寿菊、艾菊、龙蒿、向日葵、冬青树、罗勒、牛膝草、熏衣草、柠檬马鞭草、马郁兰、蜜蜂花、广霍香、薄荷油、薄荷、迷迭香、芝麻、留兰香、报春花、翅果、胡椒、甘椒树、马铃薯、甘薯、番茄、蓝莓、茄科植物、矮牵牛花、牵牛花、丁香、茉莉、金银花、金鱼草、欧车前、土荆芥属植物、荞麦、苋菜、莙荙菜、藜麦、菠菜、大黄、荷荷巴油、cypselea、小球藻、马鲁拉树、榛子、芥花、羽衣甘蓝、白菜、芜菁甘蓝、乳香、没药、榄香脂、汉麻、南瓜、西葫芦、葫芦、树薯、黄檀、豆类植物(例如苜蓿、扁豆、黄豆、三叶草、豌豆、蚕豆、frijole bola roja、frijole negro、胡枝子、甘草、羽扇豆、牧豆树、角豆树、大豆、花生、罗望子树、紫藤、决明子、鸡心豆/鹰嘴豆、胡卢巴、绿豌豆、黄豌豆、糖荚豌豆、利马豆、蚕豆)、天竺葵、亚麻、石榴、棉花、秋葵、印度楝、无花果、桑树、丁香、桉树、茶树、绿花白千层、结果类植物(例如苹果、杏、桃、李、梨、油桃)、草莓、黑莓、覆盆子、樱桃、洋李、玫瑰、橘、柑橘类(例如葡萄柚、柠檬、酸橙、橙子、苦橙、柑橘、柑桔)、芒果、佛手柑、布枯、葡萄、西兰花、抱子甘蓝、亚麻荠、花椰菜、油菜、油菜籽(芥花)、萝卜、卷心菜、黄瓜、西瓜、蜜瓜、绿皮西葫芦、桦木、胡桃、木薯、猴面包树、多香果、杏仁、面包果、檀香木、澳洲坚果、芋头、晚香玉、芦荟、大蒜、洋葱、葱、香草、丝兰、香根草、高良姜、大麦、玉米、郁金、生姜、柠檬草、燕麦、棕榈、菠萝、大米、黑麦、高粱、小黑麦、姜黄、山药、竹子、大麦、白千层、美人蕉、小豆蔻、玉米、燕麦、小麦、肉桂、黄樟、桂皮钓樟、月桂树、鳄梨、依兰、肉豆蔻干皮、肉豆蔻、辣木、马尾、牛至、香菜、山萝卜、细香葱、聚合果、谷物植物、草药植物、叶类蔬菜、非谷物豆类植物、坚果植物、肉质植物、陆生植物、水生植物、黄檀(delbergia)、小米、核果、裂果、开花植物、非开花植物、栽培植物、野生植物、树木、灌木、花卉、草、草本植物、灌木丛、藤本植物、仙人掌、热带植物、亚热带植物、温带植物以及苔藓(例如小立碗藓(Physcomitrella patens))。
合适的酵母的非限制性实例包括以下任何属的成员，及其衍生物和杂交体：念珠菌属(例如白色念珠菌(Candida albicans)、埃切假丝酵母(Candida etchellsii)、高里假丝酵母(Candida guilliermondii)、丝酵母(Candida humilis)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、棕榈油假丝酵母(Candidapalmioleophila)、伪热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)、念珠菌属物种、产朊假丝酵母(Candida utilis)、多变假丝酵母(Candida versatilis))，芽枝霉属(Cladosporium)，隐球菌属(Cryptococcus)(例如陆生隐球菌(Cryptococcusterricolus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus))，德巴利氏酵母属(Debaryomyces)(例如汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii))，内孢霉属(Endomyces)(例如产脂内孢霉(Endomyces vernalis))，拟内孢霉属(Endomycopsis)(例如产脂拟内孢霉(Endomycopsis vernalis))，假囊酵母属(Eremothecium)(例如阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii))，汉逊酵母属(Hansenula)(例如汉逊酵母属物种、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)(例如克鲁维酵母菌属物种、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans))，油脂酵母属(Lipomyces)(例如斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、产油油脂酵母(Lipomyecs lipofer))，甲醇酵母属(Ogataea)(例如微小甲醇酵母(Ogataea minuta))，毕赤酵母属(Pichia)(例如毕赤酵母属物种、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(法夫驹形氏酵母(Komagataellaphaffii))、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)、林氏毕赤酵母(Pichialindneri))、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)(例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))，红酵母属(Rhodotorula)(例如红酵母属物种、纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis))，酵母属(例如酵母属物种、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、Saccharomyces beticus、酿酒酵母、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、啤酒酵母(Saccharomyces exiguus)、Saccharomycesflorentinus、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、清酒酵母(Saccharomyces sake)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))，掷孢酵母属(例如玫瑰掷孢酵母(Sporobolomycesroseus))，锁掷酵母属(例如约汉逊氏锁掷酵母(Sporidiobolus johnsonii)、鲑色锁掷酵母(Sporidiobolus salmonicolor))，毛孢子菌属(例如似可可脂毛孢子菌(Trichosporoncacaoliposimilis)、油脂毛孢子菌新种(Trichosporon oleaginosus sp.nov.)、似可可脂毛孢子菌新种(Trichosporon cacaoliposimilis sp.nov.)、细小毛孢子菌(Trichosporongracile)、Trichosporon dulcitum、耶氏毛孢子菌(Trichosporon jirovecii)、昆虫毛孢子菌(Trichosporon insectorum))、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(例如红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous))，耶氏酵母属(Yarrowia)(例如解脂耶氏酵母)，以及接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii))。
合适的丝状真菌的非限制性实例包括真菌的任何全型、有性型和无性型形式，包括以下任何属的成员，及其衍生物和杂交体：支顶孢属(例如亚拉巴马枝顶孢(Acremoniumalabamense))、曲霉属(例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、以及翘孢霉属、新萨托菌属(Neosartorya)和石座菌属(Petromyces)物种)、短梗霉属(Aureobasidium)、加那利菌属(Canariomyces)、毛壳菌属、毛壳属(Chaetomidium)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(例如葡萄串金孢子菌(Chrysosporium botryoides)、卡米克里金孢子菌(Chrysosporium carmichaeli)、加厚壁金孢子菌(Chrysosporiumcrassitunicatum)、欧罗巴金孢子菌(Chrysosporium europae)、Chrysosporium evolceannui、面粉状金孢子菌(Chrysosporium farinicola)、Chrysosporium fastidium、丝状金孢子菌(Chrysosporium filiforme)、乔氏金孢子菌(Chrysosporium georgiae)、球形金孢子菌(Chrysosporium globiferum)、球形金孢子菌节变种(Chrysosporium globiferum var.articulatum)、球形金孢子菌雪白变种(Chrysosporium globiferumvar.niveum)、燕球形金孢子菌(Chrysosporium hirundo)、西班牙金孢子菌(Chrysosporium hispanicum)、霍氏金孢子菌(Chrysosporium holmii)、印度金孢子菌(Chrysosporium indicum)、拟金孢子菌(Chrysosporium iops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium kreiselii、Chrysosporiumkuzurovianum、木质金孢子菌(Chrysosporium lignorum)、裂叶金孢子菌(Chrysosporiumobatum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium lucknowense Garg 27K、媒介金孢子菌(Chrysosporium medium)、媒介金孢子菌密形变种(Chrysosporiummediumvar.spissescens)、臭味金孢子菌(Chrysosporium mephiticum)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、粪状金孢子菌玫瑰色变种(Chrysosporium merdariumvar.roseum)、小金孢子菌(Chrysosporiumminor)、膜金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、细小金孢子菌(Chrysosporium parvum)、金孢子菌新月变种(Chrysosporium parvum var.crescens)、多毛金孢子菌(Chrysosporium pilosum)、假粪状金孢子菌(Chrysosporiumpseudomerdarium)、梨形金孢子菌(Chrysosporium pyriformis)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、Chrysosporium sigleri、硫色金孢子菌(Chrysosporium sulfureum)、同步金孢子菌(Chrysosporium synchronum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、波形金孢子菌(Chrysosporium undulatum)、Chrysosporiumvallenarense、蝙蝠金孢子菌(Chrysosporium vespertilium)、带状金孢子菌(Chrysosporium zonatum))、Coonemeria、小克银汉霉属(Cunninghamella)(例如刺孢小克银汉霉(Cunninghamella ehinulata))、指酶属(Dactylomyces)、翘孢霉属(Emericella)、丝担菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)(例如串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、威尼斯镰刀菌(Fusarium venenatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticiollioides)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、拟分枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambuccinum)、茄腐镰刀菌(Fusariumtorulosum)以及其相关的赤霉菌属有性型形式)、赤霉菌属、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinula)、畸枝霉属(Malbranchea)(例如丝状畸枝霉(Malbranchea filamentosa))、间座壳属(Magnaporthe)、畸枝霉属(Malbranchium)、热白丝菌属(Melanocarpus)、被孢霉属(Mortierella)(例如高山被孢霉1S-4(Mortierellaalpina 1S-4)、灰黄色被孢霉(Mortieralla isabelline)、葡酒色被孢霉(Mortierrla vinacea)、葡酒色被孢霉棉子糖利用变种(Mortieralla vinaceaevar.raffinoseutilizer))、毛霉属(Mucor)(例如米黑毛霉(Mucor miehei Cooney etEmerson)(米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)(Cooney&R.Emerson))Schipper、微小毛霉(Mucor pusillus Lindt)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)高大毛霉(Mucor mucedo))、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)(例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)(例如产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、薄青霉(Pennicillium iilacinum)、娄地青霉(Penicillium roquefortii))、Phenerochaete、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、腐霉属(Pythium)、根霉属菌(Rhizopus)(例如雪白根霉(Rhizopusniveus))、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、孢子丝菌属(Sporotrichum)(例如嗜细胞孢子丝菌(Sporotrichumcellulophilum))、韧革菌属(Stereum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)(例如太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris))、弯颈霉属(Tolypocladium)以及木霉属(Trichoderma)(例如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、绿木霉(Trichodermavirens)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、绿色木霉(Trichodermaviride))。
合适的细菌的非限制性实例包括厚壁菌门、蓝细菌(蓝绿藻)、颤藻亚科、芽孢杆菌目、乳杆菌目、颤藻目、芽孢杆菌科、乳杆菌科和以下任何属的成员，及其衍生物和杂交体：不动杆菌属、醋菌属(例如弱氧化醋菌(Acetobacter suboxydans)、木醋杆菌(Acetobacterxylinum))、游动放线菌属(Actinoplane)(例如密苏里游动放线菌(Actinoplanemissouriensis))、节螺菌属(Arthrospira)(例如平节螺菌(Arthrospira platensis)、最大节螺菌(Arthrospira maxima))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、乳酸杆菌属(例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus))、乳球菌属(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌兰斯菲尔德N组(Lactococcuslactis Lancefield Group N)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))、明串珠菌属(例如柠胶明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))、微球菌属(Micrococcus)(例如溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus))、红球菌属(Rhodococcus)(例如混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、混浊红球菌PD630株)、螺旋藻属、链球菌属(例如乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌、乳酸链球菌双醋酸亚种(Streptococcus lactissubspecies diacetylactis)、嗜热链球菌)、链霉菌属(例如恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)、橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、锈赤链霉菌(Streptomycesrubiginosus))、四膜虫属(Tetrahymena)(例如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophile)、Tetrahymena hegewischi、Tetrahymena hyperangularis、马尾松四膜虫(Tetrahymenamalaccensis)、Tetrahymena pigmentosa、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)、Tetrahymena vorax)以及黄单胞菌属(例如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris))。
合适的藻类的非限制性实例包括以下任何属的成员，及其衍生物和杂交体：红藻、褐藻、绿藻、微藻、曲壳藻属(Achnanthes)(例如东方曲壳藻(Achnanthes orientalis))、阿格门氏藻(Agmenellum)、翅藻属(Alaria)(例如Alaria marginata)、茧形藻属(Amphiprora)(例如透明茧形藻(Amphiprora hyaline))、双眉藻属(Amphora)(例如咖啡形双眉藻(Amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线性变种(Amphora coffeiformislinea)、咖啡形双眉藻斑点变种(Amphora coffeiformis punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphora coffeiformis taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(Amphoracoffeiformistenuis)、优美双眉藻(Amphora delicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphora delicatissima capitata)、双眉藻属物种)、鱼腥藻属(Anabaena)、Analipus(例如Analipus japonicus)、纤维藻属(Ankistrodesmus)(例如镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus))、泡叶藻属(Ascophyllum)(例如泡叶藻)、Boekelovia(例如Boekeloviahooglandii)、包特氏菌属(Borodinella)(例如包特氏菌属物种)、葡萄藻属(Botryococcus)(例如布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、Botryococcus sudeticus)、卡特藻属(Carteria)、角毛藻属(Chaetoceros)(例如纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻subsalsum变种(Chaetoceros muelleri subsalsum)、角毛藻属物种)、小球藻属(Chlorella)(例如无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极小球藻(Chlorella Antarctica)、金绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、Chlorella candida、包囊小球藻(Chlorella capsulate)、脱水小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻Vacuolata变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、Chlorella glucotropha、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、水溪小球藻actophila变种(Chlorella infusionum var.actophila)、水溪小球藻auxenophila变种(Chlorella infusionum var.auxenophila)、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、匍扇小球藻(Chlorella lobophora)(SAG37.88株)、黄绿小球藻(Chlorella luteoviridis)、黄绿小球藻aureoviridis变种(Chlorella luteoviridisvar.aureoviridis)、黄绿小球藻lutescens变种(Chlorella luteoviridisvar.lutescens)、Chlorella miniata、微小小球藻(Chlorella minutissima)、Chlorellamutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、嗜光小球藻(Chlorellaphotophila)、Chlorella pringsheimii、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、原始小球藻酸居变种(Chlorella protothecoides var.acidicola)、Chlorealla、规则小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻小型变种(Chlorella regularis var.minima)、规则小球藻umbricata变种(Chlorella regularis var.umbricata)、Chlorella reisiglii、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、嗜糖小球藻椭圆变种(Chlorella saccharophilavar.ellipsoidea)、海水小球藻(Chlorella salina)、简单小球藻(Chlorella simplex)、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、球形小球藻(Chlorella sphaerica)、Chlorellastigmatophora、Chlorella vanniellii、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻粗皮变种(Chlorella vulgaris f.tertia)、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorellavulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、普通小球藻普通粗皮变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia)、普通小球藻普通绿色变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis)、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、普通小球藻(Chlorellavulgaris))、绿球藻属(Chlorococcum)(例如水溪绿球藻(Chlorococcum infusionum)、绿球藻属物种)、绿梭藻属(Chlorogonium)、角叉菜属(Chondrus)(例如皱波角叉菜(Chondruscrispus)、红藻角叉菜(Chondrus ocellatus))、蓝隐藻属(Chroomonas)(例如蓝隐藻属物种)、金球藻属(Chrysosphaera)(例如金球藻属物种)、球钙板藻属(Cricosphaera)(例如球钙板藻属物种)、隐藻属(Cryptomonas)(例如隐藻属物种)、小环藻属(Cyclotella)(例如隐蔽小环藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属物种)、杜氏藻属(Dunaliella)(例如杜氏藻属物种、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、Dunaliella bioculata、颗粒状杜氏藻(Dunaliella granulate)、海洋杜氏藻(Dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(Dunaliella minuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、Dunaliella tertiolecta)、昆布属(例如昆布属物种)、爱胜蚓属(例如Eiseniabicyclis)、椭球藻属(Ellipsoidon)(例如椭球藻属物种)、独球藻属(Eremosphaera)(例如绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属物种)、麒麟菜属(例如耳突麒麟菜(Eucheuma cottonii)、刺麒麟菜(Eucheuma spinosum))、眼虫属、脆杆藻属(例如巴豆叶脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属物种)、被刺藻属(Franceia)(例如被刺藻属物种)、帚叉藻属(Furcellaria)(例如锥形帚叉藻(Furcellaria fastigiate))、杉藻属(Gigartina)(例如Gigartina acicularis、Gigartina bursa-pastoris、Gigartinapistillata、Gigartina radula、Gigartina skottsbergii、星状杉藻(Gigartinastellate))、粘球藻属(Gleocapsa)(例如粘球藻属物种)、Gloeothamnion(例如Gloeothamnion物种)、海萝属(例如海萝(Gloiopeltis furcate))、江蓠属(例如脆江蓠(Gracilaria bursa-pastoris)、菊花心江蓠(Gracilaria lichenoides))、羊栖菜属(Hizikia)(例如羊栖菜(Hizikia fusiforme))、膜胞藻属(例如膜胞藻属物种)、等鞭金藻属(Isochrysis)(例如Isochrysis aff.galbana、球等鞭金藻(Isochrysis galbana))、环形解氏藻(Kjellmaniella)(例如Kjellmaniella gyrate)、海带属(例如狭叶海带(Laminaria angustata)、Laminaria longirruris、日本长海带(Laminaria Longissima)、Laminaria ochotensis、Laminaria claustonia、阔叶巨藻(Laminaria saccharina)、掌状海带(Laminaria digitata)、Laminaria japonica)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、巨藻属(Macrocystis)(例如巨藻(Macrocystis pyrifera))、微星藻属(Micractinium)、单针藻属(Monoraphidium)(例如微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属物种)、微绿球藻属(Nannochloris)(例如微绿球藻属物种)、微拟球藻属(Nannochloropsis)(例如盐生微小绿藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻属物种)、舟形藻属(Navicula)(例如Naviculaacceptata、毕氏舟形藻(Navicula biskanterae)、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、嗜腐舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属物种)、肾鞭藻属(Nephrochloris)(例如肾鞭藻属物种)、肾藻属(Nephroselmis)(例如肾藻属物种)、菱形藻属(Nitzschia)(例如普通菱形藻(Nitzschia communis)、Nitzschia alexandrina、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻(Nitzschia dissipata)、Nitzschiafrustulum、汉氏菱形藻(Nitzschia hantzschiana)、Nitzschia inconspicua、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属物种)、棕鞭藻属(Ochromonas)(例如棕鞭藻属物种)、卵囊藻属(Oocystis)(例如Oocystis parva、Oocystis pusilla、卵囊藻属物种)、颤藻属(例如沼泽颤藻(Oscillatoria limnetica)、颤藻属物种、拟短形颤藻(Oscillatoriasubbrevis))、掌形藻属(Palmaria)(例如掌形藻(Palmaria palmata))、帕氏藻属(Pascheria)(例如嗜酸帕氏藻(Pascheria acidophila))、巴夫藻属(Pavlova)(例如巴夫藻属物种)、幅叶藻属(Petalonia)(例如幅叶藻(Petalonia fascia))、噬菌体属(Phagus)、席藻属、扁藻属(Platymonas)(例如扁藻属物种)、颗石藻(Pleurochrysis)(例如Pleurochrysis carterae、齿状颗石藻(Pleurochrysis dentate)、颗石藻物种)、紫菜属(例如Porphyra columbina、皱紫菜(Porphyra crispata)、Porhyra deutata、Porhyraperforata、Porhyra suborbiculata、甘紫菜(Porphyra tenera))、紫球藻属(例如Porphyridium cruentum、紫球藻(Porphyridium purpureum)、铜绿紫球藻(Porphyridiumaerugineum))、原壁菌属(Prototheca)(例如魏氏原壁菌(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、佐氏原壁菌(Prototheca zopfii))、塔胞藻属(Pyramimonas)(例如塔胞藻属物种)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、蔷薇藻属(Rhodella)(例如Rhodella maculate、蔷薇藻(Rhodellareticulata)、Rhodella violacea)、红皮藻属(例如掌状红皮藻(Rhodymenia palmata))、Sarcinoid(例如囊状金藻(Sarcinoid chrysophyte))、栅列藻属(例如被甲栅列藻(Scenedesmus armatus))、萱藻属(Scytosiphon)(例如Scytosiphon lome)、水棉属(Spirogyra)、螺旋藻属(例如钝顶螺旋藻(Spirulina platensis))、裂丝藻属(Stichococcus)(例如裂丝藻属物种)、聚球藻属(例如聚球藻属物种)、四角藻属、扁藻属(Tetraselmis)(例如扁藻属物种、干扁藻(Tetraselmis suecica))、海链藻属(例如威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii))以及Viridiella(例如Viridiella fridericiana)。
根据上文任一项所述的重组宿主细胞可以包含改进重组乳蛋白的生产的遗传修饰。合适的遗传修饰的非限制性实例包括改变的激酶活性、改变的磷酸酶活性、改变的蛋白酶活性、改变的基因表达诱导途径、改变的参与蛋白质折叠的蛋白质的产生和/或活性，以及改变的参与蛋白质分泌(例如，囊泡运输)的蛋白质的产生和/或活性。
获得重组宿主细胞的方法
在各个方面，本文提供了一种用于获得根据上文任一项所述的重组宿主细胞的方法，其中该方法包括：获得编码根据上文任一项所述的重组蛋白(和任选的分泌信号)的多核苷酸，或根据上文任一项所述的重组表达构建体，或根据上文任一项所述的重组载体；以及将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞(例如，本文公开的任何宿主细胞)以获得根据上文任一项所述的重组宿主细胞。
多核苷酸、重组表达构建体和/或重组载体可以通过本领域已知的任何合适的方法获得，包括但不限于直接化学合成和克隆。
用于将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞的方法是本领域众所周知的。此类方法的非限制性实例包括磷酸钙转染、树枝状大分子转染、脂质体转染(例如阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、DEAE-葡聚糖转染、细胞挤压、声穿孔、光学转染、原生质体融合、原生质体转化、穿刺转染、流体动力学递送、基因枪、磁转染、病毒转导、电穿孔和化学转化(例如，使用PEG)。
用于鉴定重组宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且包括筛选由多核苷酸、重组表达构建体或重组载体编码的允许对于或针对细胞的生长进行选择的药物抗性或营养缺陷型标记物的表达，或通过其他方式(例如，检测包含在多核苷酸、重组表达构建体或重组载体中的发光肽，个体重组宿主细胞集落的分子分析[例如，通过限制酶作图、PCR扩增、Southern分析，或分离的染色体外载体或染色体整合位点的序列分析])。
可以使用本领域已知的任何合适的方法，例如在RNA水平上最合适的是在蛋白质水平上进行的测定，或通过使用测量重组蛋白质的产生或活性的功能性生物测定，来评估根据上文任一项所述的重组宿主细胞的重组乳蛋白产生。这种测定的非限制性实例包括Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)、RNA-Seq、原位杂交、Southern印迹、酶活性测定、免疫测定(例如，免疫组织化学染色、免疫测定、Western印迹、ELISA)和游离硫醇测定(例如，用于测量包含游离半胱氨酸残基的蛋白质的产生)。
生产重组蛋白的方法
在各个方面，本文提供了生产根据上文任一项所述的重组蛋白的方法，其中该方法包括在培养基中在适合生产重组蛋白的条件下发酵根据上文任一项所述的重组宿主细胞。
该方法可以进一步包括：从发酵液中纯化重组蛋白以获得包含重组蛋白的制剂；和/或对重组蛋白进行后处理。
或者，可以使用体外方法(例如，使用无细胞转录和/或翻译系统)获得重组蛋白。
发酵
用于产生重组蛋白的合适条件通常是根据上文任一项所述的重组宿主细胞可以生长和/或保持活力并产生重组蛋白的那些条件。
合适条件的非限制性实例包括合适的培养基(例如，具有合适的营养含量[例如，合适的碳含量、合适的氮含量、合适的磷含量]、合适的补充剂含量、合适的痕量金属含量、合适的pH的培养基)、合适的温度、合适的进料速率、合适的压力、合适的氧化水平、合适的发酵持续时间(即包含重组宿主细胞的培养基的体积)、合适的发酵体积(即包含重组宿主细胞的培养基的体积)和合适的发酵容器。
合适的培养基包括重组宿主细胞可以在其中生长和/或保持活力并产生重组乳蛋白的所有培养基。通常，培养基是包含碳源、可同化氮源(即，能够以适合重组宿主细胞的代谢利用的形式释放氮的含氮化合物)和磷酸盐源的水性培养基。
碳源的非限制性实例包括单糖、二糖、多糖、乙酸盐、乙醇、甲醇、甘油、甲烷及其组合。单糖的非限制性实例包括右旋糖(葡萄糖)、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及其组合。二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、直链淀粉、半纤维素、麦芽糖糊精及其组合。
可同化氮源的非限制性实例包括无水氨、硫酸铵、氢氧化铵、硝酸铵、磷酸二铵、磷酸一铵、焦磷酸铵、氯化铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨、蛋白质水解物、玉米浆、玉米浆固体、酒糟、酒糟提取物和酵母提取物。使用氨气便于大规模操作，并且可通过适当量的水性发酵液(发酵培养基)鼓泡使用。同时，这种氨也可用于辅助pH控制。
培养基可以进一步包含无机盐、矿物质(例如，镁、钙、钾、钠；例如，以合适的可溶性可同化离子和组合形式)、金属或过渡金属(例如，铜、锰、钼、锌、铁、硼、碘；例如，以合适的可溶可同化形式)、维生素和任何其他营养或功能成分(例如，可以防止重组乳蛋白降解的蛋白酶[例如，基于植物的蛋白酶]、可降低可降解重组乳蛋白的蛋白酶的活性的蛋白酶抑制剂和/或可虹吸掉蛋白酶活性的牺牲蛋白、消泡剂、抗微生物剂、表面活性剂，乳化油)。
合适的培养基可从商业供应商处获得或可根据公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。
合适的pH值可以是约2至约8的pH(例如，2至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5、3或2.5；2.5至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5或3；3至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4或3.5；3.5至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5或4；4至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5；4.5至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7或4.6；4.6至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8或4.7；4.7至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9或4.8；4.8至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5或4.9；4.9至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5；5至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2或5.1；5.1至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3或5.2；5.2至8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4或5.3；5.3至8、7.5、7、6.5、6、5.5或5.4；5.4至8、7.5、7、6.5、6或5.5；5.5至8、7.5、7、6.5或6；6至8、7.5、7或6.5；6.5至8、7.5或7；7至8或7.5；或7.5至8的pH)。
合适的温度可以是约20℃至约46℃(例如，20℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃、24℃或22℃；22℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃或24℃；24℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃或26℃；26℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃或28℃；28℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃或30℃；30℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃或32℃；32℃至46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃或34℃；36℃至46℃、44℃、42℃、40℃或38℃；38℃至46℃、44℃、42℃或40℃；40℃至46℃、44℃或42℃、42℃至46℃或44℃；或44℃至46℃)的温度。
合适的进料速率可以是每小时每克细胞干重(DCW)约0.01g至约0.2g葡萄糖当量的进料速率。
合适的压力可以是0psig至约50psig(例如，0psig至50psig、40psig、30psig、20psig或10psig；10psig至50psig、40psig、30psig或20psig；20psig至50psig、40psig或30psig；30psig至50psig或40psig；或40psig至50psig)的压力。
合适的氧合可以是每分钟每发酵罐中液体体积0.1体积氧气(vvm)至约2.1vvm(例如，0.1vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm、0.5vvm或0.3vvm；0.3vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm或0.5vvm；0.5vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm或0.7vvm；0.7vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm或0.9vvm；0.9vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm或1.1vvm；1.1vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm或1.3vvm；1.3vvm至2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm或1.5vvm；1.5vvm至2.1vvm、1.9vvm或1.7vvm；1.7vvm至2.1vvm或1.9vvm；或1.9vvm至2.1vvm)的通气速率。
合适的发酵持续时间可以是约10小时至约500小时(例如，10小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时、30小时或20小时；20小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时或30小时；30小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时或40小时；40小时至500小时、400小时、300小时、200小时、100小时或50小时；50小时至500小时、400小时、300小时、200小时或100小时；100小时至500小时、400小时、300小时或200小时；200小时至500小时、400小时或300小时；300小时至500小时或400小时；或400小时至500小时)的发酵持续时间。
合适的发酵体积可以是约1L至约10,000,000L(例如，1L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L、100L、50L或10L；10L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L、100L或50L；50L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L或100L；100L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L或500L；500L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L或1,000L；1,000L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10,000L或5,000L；5,000L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L或10,000L；10,000L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L或50,000L；50,000L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L或100,000L；100,000L至10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L或500,000L；500,000L至10,000,000L、5,000,000L或1,000,000L；1,000,000L至10,000,000L或5,000,000L；或5,000,000L至10,000,000L)。
合适的发酵容器可以是本领域已知的任何发酵容器。合适的发酵容器的非限制性实例包括培养板、摇瓶、发酵罐(例如，搅拌罐发酵罐、气升式发酵罐、气泡柱发酵罐、固定床生物反应器、实验室发酵罐、工业发酵罐或它们的任何组合)，以任何合适的规模(例如，小规模、大规模)和在任何过程中(例如，固体培养、浸没培养、分批、补料分批或连续流)使用。
纯化
用于纯化重组蛋白(例如，从发酵液)以获得包含重组蛋白的制剂的方法是本领域众所周知的，并且可以经调适以纯化根据上文任一项所述的重组乳蛋白。
根据上文任一项所述的重组蛋白可以基于其分子量进行纯化，例如，通过尺寸排阻/交换色谱法、通过膜的超滤、凝胶渗透色谱法(例如，制备盘-凝胶电泳)或密度离心。
根据上文任一项所述的重组蛋白还可以基于其表面电荷或疏水性/亲水性进行纯化，例如通过等电沉淀、阴离子/阳离子交换色谱、等电聚焦(IEF)或反向相色谱。
根据上文任一项所述的重组蛋白也可以基于其溶解度进行纯化，例如通过硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、去污剂或溶剂萃取。
根据上文任一项所述的重组蛋白也可以基于其对另一分子的亲和力进行纯化，例如通过亲和层析、活性染料或羟基磷灰石。亲和层析可包括使用对重组蛋白具有特异性结合亲和性的抗体，或与重组蛋白上的糖部分结合的凝集素，或与重组蛋白特异性结合的任何其他分子。重组蛋白可包含与其C-末端、N-末端或两者可操作连接的纯化标签，以促进重组蛋白的基于亲和性的纯化。合适的纯化标签的非限制性实例包括亲和标签(即，与某些试剂或基质结合的肽或多肽)、增溶标签(即，有助于蛋白质正确折叠和防止沉淀的肽或多肽)、色谱标签(即改变蛋白质色谱特性以在特定分离技术中提供不同分辨率的肽或多肽)、表位标签(即与抗体结合的肽或多肽)、荧光标签、显色标签、酶底物标签(即，作为特定酶促反应底物的肽或多肽)、化学底物标签(即，作为特定化学修饰底物的肽或多肽)、自切割标签(具有可诱导蛋白水解活性的肽或多肽；例如，分选酶标签、Npro标签、FrpC模块、CPD)、疏水标签(高度疏水并引导蛋白质用于包涵体形成的蛋白质或多肽；例如，KSI标签、TrpE标签)或其组合。合适的亲和标签的非限制性实例包括麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、聚(His)标签、六(His)标签、SBP-标签、Strep-标签和钙调蛋白-标签。合适的溶解度标签的非限制性例子包括硫氧还蛋白(TRX)标签、聚(NANP)标签、MBP标签、SUMO标签、GB1标签、NUSA CBD标签和GST标签。色谱标签的非限制性实例包括聚阴离子氨基酸标签(例如，FLAG-标签)和聚谷氨酸标签。表位标签的非限制性实例包括V5-标签、VSV-标签、E-标签、NE-标签、血凝素(Ha)-标签、Myc-标签和FLAG-标签。荧光标签的非限制性例子包括绿色荧光蛋白(GFP)标签、蓝色荧光蛋白(BFP)标签、青色荧光蛋白(CFP)标签、黄色荧光蛋白(YFP)标签、橙色荧光蛋白(OFP)标签、红色荧光蛋白质(RFP)标签及其衍生物。酶底物标签的非限制性实例包括在适合生物素化的序列内包含赖氨酸的肽或多肽(例如，AviTag、生物素羧基载体蛋白[BCCP])。化学底物标签的非限制性例子包括适合与FIAsH-EDT2反应的底物。可以在分离重组蛋白后去除标签肽或多肽(例如，通过蛋白酶切割)。
在根据上文任一项所述的重组乳蛋白由根据上文任一项所述的重组宿主细胞分泌的实施方案中，可以直接从培养基中纯化重组蛋白。在其他实施方案中，重组蛋白可以从细胞裂解物中纯化。
重组蛋白可以被纯化以获得包含重组蛋白的制剂，所述重组蛋白相对于发酵液中包含的其他组分具有大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度，或相对于发酵液中包含的其他组分具有至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍更高的丰度，或按总蛋白质量计具有大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度。
重组蛋白的身份可以通过高效液相色谱(HPLC)、蛋白质印迹分析、Western印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失和二维质谱(2D-MS/MS)序列鉴定来确认和/或定量。
后处理
后处理可以改变重组蛋白的某些化学和/或物理性质，包括但不限于大小、电荷、疏水性、亲水性、溶剂化、蛋白质折叠和化学反应性。
后处理可以包括重组蛋白的再折叠(例如，通过去除变性剂)；重组蛋白的片段化(例如，通过化学方法或通过暴露于蛋白酶[例如，胰蛋白酶，胃蛋白酶])；加热重组蛋白(例如，去除蛋白聚集体)；去除重组蛋白的反应位点(例如，通过氧化去除甲硫氨酸和/或色氨酸残基的反应位点)；重组蛋白的调节(例如，通过化学、光化学和/或酶促策略)；使包含重组蛋白的制剂脱矿质(通过例如透析、超滤、反渗透、离子交换层析)；从重组蛋白中去除标签和/或融合多肽(例如，通过暴露于位点特异性蛋白酶)；重组蛋白的生物素化(即附接生物素)；和/或将重组蛋白与其他元件(例如，聚乙二醇、抗体、脂质体、磷脂、DNA、RNA、多核苷酸、糖、二糖、多糖、淀粉、纤维素、洗涤剂、细胞壁)缀合。
后处理可以以随机方式或以位点特异性方式发生(例如，在半胱氨酸残基的巯基处[例如，用于氨乙基化、碘乙酰胺的形成、马来酰亚胺的形成、Dha的形成、通过二硫键的共价连接和脱硫]、在赖氨酸残基的伯胺基处[例如，用于连接活化酯、磺酰氯、异硫氰酸酯、不饱和醛酯和醛]、在酪氨酸残基的酚羟基处、在特定的变应原表位处[例如，聚糖基团])。
可以将重组蛋白干燥(例如，通过喷雾干燥或冻干)或浓缩(例如，通过沉淀或蒸发)(例如，以获得粉末)。
产生酪蛋白的方法
在各个方面，本文提供了一种用于产生酪蛋白(例如，κ-酪蛋白、β-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白)的方法，其中该方法包括发酵根据上文任一项所述的重组宿主细胞；其中重组宿主细胞能够产生具有根据上文任一项所述的结构(A)、(B)或(C)的重组蛋白；其中，重组蛋白的乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种为β-乳球蛋白；其中，重组蛋白的乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种为酪蛋白；并且其中酪蛋白与至少一种连接肽相邻，所述连接肽包含蛋白酶的识别或切割序列(例如，本文公开的任何蛋白酶识别或切割序列)。
不希望受理论限制，据信酪蛋白与β-乳球蛋白的共价连接可防止酪蛋白聚集，从而提供重组宿主细胞的更高滴度的重组酪蛋白产生。
适用于上述方法的重组蛋白的非限制性实例包括以下任何一种：
-具有以下形式的根据上文所述的结构(A)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白)，
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)，
-具有以下形式的根据上文所述的结构(B)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白1)-(连接肽2)-(酪蛋白2)，
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白1)-(连接肽2)-(酪蛋白2)-(连接肽3)-(β-乳球蛋白)，
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白1)-(连接肽2)-(β-乳球蛋白)-(连接肽3)-(酪蛋白2),和
-具有以下形式的根据上文所述的结构(C)：(β-乳球蛋白)-(连接肽1)-(酪蛋白1)-(连接肽2)-(酪蛋白2)-(连接肽3)-(酪蛋白3)；
其中
-连接肽1、连接肽2和连接肽3可包含蛋白酶的识别或切割序列(例如，本文公开的任何蛋白酶识别或切割序列)，
-连接肽1、连接肽2和连接肽3可以在长度和/或氨基酸序列上彼此相同或彼此不同，和
-酪蛋白1、酪蛋白2和酪蛋白3可以在长度和/或氨基酸序列上彼此相同或彼此不同。
该方法可以进一步包括用蛋白酶裂解连接肽，从而释放酪蛋白。
包含重组蛋白的聚合物
在各个方面，本文提供聚合物。
聚合物可以包括蛋白质聚合物，其中蛋白质聚合物包括通过二硫键连接的蛋白质单体。蛋白质单体可以是根据上文任一项所述的一种或多种重组蛋白。例如，蛋白质单体可以是单一的重组蛋白。或者，蛋白质单体可以是至少两种不同的重组蛋白。
该聚合物在生产、使用和处理方面具有优势，包括但不限于由于使用可再生自然资源进行生产和生物降解潜力以及石油资源独立性而对环境产生的负面影响较小。此外，该聚合物可包含来源于乳蛋白子集的单体(即，该聚合物基本上不含不包含在重组蛋白中的其他乳蛋白，以及基本上不含包含在来源于哺乳动物的乳汁中的杂质)。此外，聚合物可以从纯化的重组蛋白制备物中产生，从而更好地控制聚合过程和定制聚合物特性。具体而言，与从包含各种蛋白质、脂质和可影响过程和聚合过程的结果(例如，影响聚合物的稳定性和/或其他属性)的其他成分的混合物的哺乳动物来源的乳汁产生聚合物相比，从根据上文任一项所述的重组蛋白产生聚合物构成可提供对过程和结果的更好控制的有限组分系统。
聚合物可包含按质量计约0.001％至约100％(例如,0.001％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.1％或0.01％；0.01％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％或0.1％；0.1％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或1％；1％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％；10％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％；20％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；30％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或40％；40％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％或50％；50％至100％、99％、95％、90％、80％、70％或60％；60％至100％、99％、95％、90％、80％或70％；70％至100％、99％、95％、90％或80％；80％至100％、99％、95％或90％；90％至100％、99％或95％；95％至100％或99％；或99％至100％)的蛋白质聚合物。
蛋白质聚合物可以包含按质量计约0.001％至约100％(例如,0.001％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.1％或0.01％；0.01％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％或0.1％；0.1％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或1％；1％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％；10％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％；20％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；30％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或40％；40％至100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％或50％；50％至100％、99％、95％、90％、80％、70％或60％；60％至100％、99％、95％、90％、80％或70％；70％至100％、99％、95％、90％或80％；80％至100％、99％、95％或90％；90％至100％、99％或95％；95％至100％或99％；或99％至100％)的一种或多种重组蛋白。
重复的蛋白质单体可以进一步通过中间分子和/或通过其他共价键(例如，酰胺键[例如，内酰胺桥、天然化学连接键、施陶丁格连接键])和/或通过非共价键相互作用(例如，静电相互作用、氢键、空间相互作用、范德华相互作用)连接。
根据上文任一项所述的聚合物可以是聚合物共混物，其通过将根据上文任一项所述的重组蛋白与一种或多种能够与重组蛋白相互作用的其他组分(例如石油衍生化合物[例如，乙烯、丙烯、氯乙烯]、碳水化合物[例如，藻酸盐、壳聚糖、纤维素]、非乳蛋白[例如，植物蛋白(例如，本文公开的任何植物蛋白)、动物蛋白(例如，胶原蛋白、明胶、丝心蛋白、角蛋白、卵清蛋白)、真菌蛋白(例如，本文公开的任何真菌蛋白)及其组合]))混合而产生。重组蛋白与一种或多种其他组分的质量比可以为约1比100至约100比1(例如,约100比1,约90比1,约80比1,约70比1,约60比1,约50比1,约40比1,约30比1,约20比1,约10比1,约9比1,约8比1,约7比1,约6比1,约5比1,约4比1,约3比1,约2比1,约1比1,约1比2,约1比3,约1比4,约1比5,约1比6,约1比7,约1比8,约1比9,约1比10,约1比20,约1比30,约1比40,约1比50,约1比60,约1比70,约1比80,约1比90,或约1比100)。
根据上文任一项所述的聚合物可以类似于常规的石油衍生聚合物。这种相似性可能是由于本文公开的属性中的任何一种或两种或更多种的任何组合。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何蛋白质。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何重组蛋白。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何重组乳蛋白。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含哺乳动物产生的乳汁(例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶、水牛奶、牦牛奶、骆驼奶、美洲驼奶、羊驼奶、马奶、驴奶)中发现的组分，或可能包含较低浓度的在哺乳动物产生的乳汁中发现的至少一种成分。在哺乳动物来源的乳汁中发现的成分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂。聚合物可以基本上不含除包含在根据上文任一项所述的重组蛋白中的乳蛋白之外的任何乳蛋白。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含从动物获得的组分(即，对于动物是天然的组分，包括动物产品[即，可食用的或通常制备用于人类食用的动物部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血液]、动物副产品[即通常本身不可食用但为屠宰动物以用于食用的副产品；例如动物骨头、动物尸体和从中分离的成分]，由动物产生的产品[例如，哺乳动物来源的乳汁、鸡蛋、蜂蜜]，以及由其产生的消费品[例如，明胶、凝乳酶、从哺乳动物源性乳汁中提取的乳清蛋白、从哺乳动物源性提取物中提取的酪蛋白乳、从哺乳动物来源的乳汁中提取的乳脂、动物脂类、动物蛋白])，或含有按质量计2％或更少的此类成分。
根据上文任一项所述的聚合物可以基本上不含来源于石油的组分，或包含按质量计2％或更少的来源于石油的组分
产生聚合物的方法
在各个方面，本文提供了一种产生根据上文任一项所述的聚合物的方法，其中该方法包括：
a)获得一种或多种根据上文任一项所述的重组蛋白(例如，通过根据上文任一项所述的重组宿主细胞产生)，以及
b)使一种或多种重组蛋白温和变性，使得一种或多种重组蛋白中包含的一个或多个游离硫醇基形成一个或多个分子内和/或分子间二硫键。
温和变性重组蛋白(例如，使少于20％的重组蛋白变性)可以在暴露重组蛋白中包含的游离硫醇基但不破坏重组蛋白中现有的分子内二硫键的条件下实现。此类条件可包括在重组蛋白构象相对稳定的pH(即低于10％的重组蛋白变性的pH)下将重组蛋白加热至一定温度(例如低于重组蛋白的Tm 10-20℃)，或在重组蛋白构象稍微不稳定的pH(即10％至50％的重组蛋白变性的pH)下将重组蛋白加热至一定温度(例如低于重组蛋白的Tm 15-25℃)，或在重组蛋白构象不稳定(即超过50％的重组蛋白变性的pH)下将重组蛋白加热至一定温度(例如，低于重组蛋白的Tm 20-30℃)。温和的变性条件也可以通过加热的持续时间来调节。
二硫键形成可以在非还原条件下在合适的pH和合适的离子强度、合适的温度和合适的加热时间下发生(参见，例如，Ramos等人2017Crit Rev Food Sci Nutr.57(7):1377-1393,Tavares等人2014Trends in Food Science和Technology 37:5-20,Teng等人2015RSC Adv.5:35138,Bourbon等人2019Gels 5:9,Ahmed等人2016Colloids和SurfacesB:Biointerfaces 143:371–381,Remondetto和Subirade 2003Biopolymers 69:461–469,Gunasekaran等人2007Journal of Food Engineering 83:31–40)。合适温度的非限制性实例包括低于重组蛋白的Tm约0℃至约30℃的温度(例如，35℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,65℃,60℃,55℃,50℃,45℃,或40℃；40℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,65℃,60℃,55℃,50℃,或45℃；45℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,65℃,60℃,55℃,或50℃；50℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,65℃,60℃,或55℃；55℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,65℃,或60℃；60℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,70℃,或65℃；65℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,75℃,或70℃；70℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,80℃,或75℃；75℃至105℃,100℃,95℃,90℃,85℃,或80℃；80℃至105℃,100℃,95℃,90℃,或85℃；85℃至105℃,100℃,95℃,或90℃；90℃至105℃,100℃,或95℃；95℃至105℃或100℃；或100℃至105℃的温度)。合适的pH的非限制性实例包括小于11、小于10.5、小于10、小于9.5、小于9、小于8.5、小于8、小于7.5、小于7、小于6.5、少于6、少于5.5、少于5、少于4.5或少于4；或约3.5至约11的pH(例如，3.5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,5,4.5,或4；4至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,5,或4.5；4.5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,或5；5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,或5.5；5.5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,或6；6至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,或6.5；6.5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,7.5,或7；7至11,10.5,10,9.5,9,8.5,8,或7.5；7.5至11,10.5,10,9.5,9,8.5,或8；8至11,10.5,10,9.5,9,或8.5；8.5至11,10.5,10,9.5,或9；9至11,10.5,10,或9.5；9.5至11,10.5,或10；10至11,或10.5；或10.5至11的pH)。合适的加热时间的非限制性实例包括5min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,60min,50min,40min,30min,20min,或10min；或10min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,60min,50min,40min,30min,或20min；20min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,60min,50min,40min,或30min；30min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,60min,50min,或40min；40min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,60min,或50min；50min至120min,110min,100min,90min,80min,70min,或60min；60min至120min,110min,100min,90min,80min,或70min；70min至120min,110min,100min,90min,或80min；80min至120min,110min,100min,或90min；90min至120min,110min,或100min；100min至120min,或110min；或110min至120min的加热时间。
此外，可以使用本领域已知的用于聚合蛋白质单体的多种其他方法来修饰聚合，例如重组蛋白的挤出(参见，例如，Tavares等人2014Trends in Food Science至Technology 37:5-20,Teng等人2015RSC Adv.5,35138)；封装活性剂(参见，例如，Tavares等人2014Trends in Food Science至Technology 37:5-20)；静电纺丝(例如，参见Stie等人2020ACS Appl.Nano Mater.3:1910-1921,Sullivan,等人2014Food Hydrocolloids 35:36-50,Akhmetova&Heinz 2021Pharmaceutics 13:4,Ahmed等人2016Colloids至SurfacesB:Biointerfaces 143:371–381)；加工成水凝胶、氢化纳米凝胶、纳米纤丝、纳米颗粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶珠、生物聚合物颗粒或微球(参见，例如，Ramos等人2017Crit RevFood Sci Nutr.57(7):1377-1393,Gunasekaran等人2007Journal of Food Engineering83:31–40,McClements 2017Advances in Colloid至Interface Science 240:31–59)，以及加工成薄膜和/或涂层(例如，用于产生可食用薄膜和涂层，和/或用于递送封装的纳米粒子、纳米乳液和凝胶；(参见，例如，Ramos等人2012Critical Reviews in Food Science至Nutrition,52(6):533-552)，加工成泡沫(参见，例如，Ye等人2021Adv.SustainableSyst.2100063)，使用交联剂(即激活蛋白质上的功能基团的化学物质，从而在不并入间隔基的情况下连接蛋白质)、交联酶(例如，转移酶[酶委员会编号(EC)2；例如，转谷氨酰胺酶]、水解酶(EC3))、氧化(例如，使用氧化剂)、辐射(例如，使用紫外线、伽马、电子束)、机械搅拌、电场、压力(例如，挤压)、湍流、摩擦、光氧化处理(例如，使用光反应性氨基酸类似物)、3D打印、静电纺丝及其组合的方法。
如本领域技术人员所熟悉的，可以以各种方式共混组分，例如干混或熔融共混组分。例如，可以将聚乙烯树脂和蛋白质聚合物干混，例如通过在挤出机中将组分作为粒料加入，其中将组分加热并混合在一起。或者，可以将聚乙烯树脂和蛋白质聚合物熔融共混，其中将各组分在配料机或挤出机中熔融并混合，然后造粒。本文考虑了用于混合组分的其他混合方法。
包含重组蛋白的组合物
在各个方面，本文提供了一种组合物，其包含根据上文任一项所述的重组蛋白和/或根据上文任一项所述的聚合物或基本上由其组成。
该组合物可包含按质量计约0.1％至约100％(例如,0.1％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％或0.2％；0.2％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％或0.3％；0.3％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.4％；0.4％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％；0.5％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％或0.6％；0.6％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％或0.7％；0.7％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％或0.8％；0.8％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.9％；0.9％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％；1％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％；2％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％；3％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或4％；4％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％；5％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％；6％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％或7％；7％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％或8％；8％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或9％；9％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％或10％；10％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％或11％；11％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％或12％；12％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％或13％；13％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或14％；14％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％；15％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％；20％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或25％；25％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％；30％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％或35％；35％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％；40％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％；45％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％；50％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或55％；55％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％；60％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％；65％至100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％；70％至100％、95％、90％、85％、80％或75％；75％至100％、95％、90％、85％或80％；80％至100％、95％、90％或85％；或85％至100％、95％、90％；90％至100％或95％或95％至100％)的重组蛋白和/或聚合物。
在标准环境温度和条件下(即20-30℃和0.95-1.05大气压)，根据上文任一项所述的组合物可以是流体、半固体(例如凝胶状)、固体或粉末。粉末可包含小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％或小于1％；或约0.1％至约20％(例如,0.1％至20％、15％、10％、5％或1％；1％至20％、15％、10％或5％；5％至20％、15％或10％；10％至20％或15％；或15％至20％)的水分含量。粉末可以以粉末形式使用，或粉末可以在使用前用水合剂重构，或在将水合剂添加到混合物中之前，可以将粉末与其他干燥成分(例如，面粉、糖、矿物质、pH或离子强度调节剂)混合。
根据上文任一项所述的组合物还可以包含其他成分(例如，本文公开的任何其他成分)。例如，组合物可包含按质量计约0.001％至约50％(例如,0.001％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％；0.01％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％；0.1％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％；0.5％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％；1％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％；2％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％；3％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或4％；4％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或5％；5％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％或6％；6％至50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％或7％；7％至50％、25％、20％、15％、10％、9％或8％；8％至50％、25％、20％、15％、10％或9％；9％至50％、25％、20％、15％或10％；10％至50％、25％、20％或15％；15％至50％、25％或20％；20％至50％或25％；或25％至50％)的任何一种此类其他成分、两种或多种此类其他成分的任何组合或所有此类其他成分。
根据上文任一项所述的组合物可以是多种产品，包括例如包封物(例如包封治疗剂或营养剂以用于递送的产品[例如微粒或纳米颗粒(例如，珠子、胶束、胶囊、水凝胶)、具有工业实用性的组合物(例如电介质)、粘合剂(即形成粘合结合的材料；例如胶水、墙纸粘合剂、木材粘合剂、纸粘合剂、软木粘合剂、硬纸板粘合剂、手术/医用胶水、水泥、粘液、糊状物)，涂层或饰面(例如，光泽涂层、保护涂层、清漆、药片涂层、纸张涂层、油漆、皮革涂饰、纺织品涂层)、喷漆、油漆或油墨或油墨的颜料粘合剂、硬塑料(例如瓶子、纽扣、窗户、钢笔)、中硬塑料(例如瓶子、纤维[例如纱线])、软塑料(例如袋子、包裹物、可食用薄膜、防水薄膜、隐形眼镜、包装材料)、织物(例如纺织品、地毯、窗帘、衣服)、工业聚合物(即用于制造合成工业材料的化合物)、医学诊断物(分别参见，例如，J.Berger等人2004.Europ J of Pharmand Biopharm 57:19)、凝胶(例如，用于控制释放治疗剂的水凝胶、用于固定蛋白质(例如，酶)的水凝胶)、植入物(例如，骨替代复合物，支持神经修复的材料，用于生长细胞的支架，假体植入物)、衣着类物品(例如鞋子)、润滑剂、一件家具、纸(例如纸张，纸标签，包装纸，照相纸)、家居用品(例如锅、碗、盘子、杯子)和生物支架(即模仿生物基质的结构、缝合线、骨替代材料、支持神经修复的材料、用于生长细胞的支架、假体植入物、用于促进伤口愈合的膜、伤口敷料、组织工程支架)。
其他成分
任选地包含在根据上文任一项所述的组合物中的其他成分可以是任何其他成分。
合适的其他成分的非限制性实例包括其他蛋白质、生物活性剂、营养剂和功能剂。
任选的其他蛋白质可以基本上由一种或多种来源于任何来源的天然和/或重组其他蛋白质，以及来源于各种来源的天然和/或重组其他蛋白质的混合物组成。合适来源的非限制性实例包括动物、植物、藻类、真菌或细菌。动物蛋白的非限制性实例包括结构性动物蛋白(例如，胶原蛋白、原弹性蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白；参见，例如，Akhmetova&Heinz,2021Pharmaceutics 13:4)、乳蛋白(例如，任何非聚合形式的乳清蛋白或酪蛋白)、卵蛋白(例如，卵粘蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白、G162M F167A卵粘蛋白、卵球蛋白G2、卵球蛋白G3、α-卵粘蛋白、β-卵粘蛋白、溶菌酶、卵抑制剂、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、卵抑素、胱抑素、抗生物素蛋白、卵清蛋白相关蛋白X、卵清蛋白相关蛋白Y、)、丝心蛋白、生长因子(例如，血管内皮生长因子)、生物活性肽、治疗肽(例如，抗菌肽[例如，爪蟾抗菌肽、天蚕素]，来源于细胞凋亡介质Bcl-2家族的成孔肽；参见，例如，Boohaker等人2012Curr MedChem.19(22):3794-804)和球状蛋白(例如白蛋白)。植物蛋白的非限制性实例包括豌豆蛋白(例如豆球蛋白、豌豆球蛋白、covicillin)、大豆蛋白、马铃薯蛋白(例如马铃薯球蛋白、蛋白酶抑制剂notateII)、小麦蛋白和玉米胶蛋白。真菌蛋白的非限制性实例包括葡糖淀粉酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、SUN家族成员(Sim1p、Uth1p、Nca3p、Sun4p)、延伸因子1-α、线粒体亮氨酰-tRNA合成酶、α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纤维素酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切-1,4-β-木糖苷酶、葡糖淀粉酶、肽酶、酸性蛋白酶-1,1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、α-半乳糖苷酶A、α-半乳糖苷酶B、α-半乳糖苷酶D、α-葡萄糖醛酸酶A、β-半乳糖苷酶C、葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶A、疏水蛋白和葡聚糖内切1,3-β-葡萄糖苷酶eglC。任选的其他蛋白质可以包括重组其他蛋白质(例如，重组其他蛋白质，其具有哺乳动物PTM、非哺乳动物PTM或其混合物，和/或缺乏哺乳动物PTM，和/或缺乏可引起人或动物中的免疫反应的表位)。
生物活性剂的非限制性实例包括营养制品(即，具有生理益处或提供针对疾病的保护的化合物)和治疗剂(即，治疗疾病的化合物)。
营养剂的非限制性实例包括营养补充剂、益生元、益生菌、维生素原、维生素、矿物质、抗氧化剂、碳水化合物、脂质以及必需和半必需氨基酸。
维生素的非限制性实例包括脂溶性维生素、水溶性维生素、硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(分别为维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、钴胺素(维生素B12)、维生素C、叶酸、维生素A、维生素D2、维生素D3、维生素D、维生素E、维生素K及其衍生物和混合物。
矿物质的非限制性实例包括钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐、氯化物、磷酸盐、硫酸盐、镁、钾、锌、铁、钼、锰、铜及其混合物。
抗氧化剂的非限制性实例包括α-生育酚(例如，包含在牛乳中的生育酚)、低分子量硫醇(例如，包含在牛乳中的低分子量硫醇)、视黄醇(例如，包含在牛乳中的视黄醇)、类胡萝卜素(例如，包含在牛奶中的类胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、虾青素)、维生素E、印楝提取物、核黄素、迷迭香提取物、迷迭香提取物中包含的酚类二萜(例如，鼠尾草酚、鼠尾草酸)、鼠尾草提取物、抗坏血酸(维生素C)及其盐、乳酸及其盐、葡萄渣青贮饲料、葡萄渣青贮饲料中包含的酚类化合物(例如阿魏酸)、大豆(Glycine max)提取物、大豆提取物中包含的异黄酮或多酚化合物、大蒜(Allium sativum)提取物、酚类或黄酮类化合物或大蒜提取物中包含的萜类化合物、茴香(Foeniculumvulgare Mill.)提取物、洋甘菊(Matricaria recutita L.)提取物、脂肪酸(例如α-硫辛酸)、褐藻(例如泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、墨角藻(Fucusvesiculosus))、绿粉红辣椒的精油(GEO)、成熟粉红辣椒的精油(MEO)、绿茶提取物、丁基化羟基茴香醚(E320)、丁基化羟基甲苯(E321)、多酚类(例如姜黄素、类姜黄素、去甲氧基姜黄素(hydroxycirmamoyl feruloylmethane)、双-去甲氧基姜黄素)、儿茶素(例如,包含在绿茶提取物中的表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素、C儿茶素、儿茶素)及其衍生物和混合物。
碳水化合物的非限制性实例包括：单糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖及其混合物；二糖，例如麦芽糖、乳糖、蔗糖及其混合物；多糖，例如淀粉(例如，果胶、玉米(玉蜀黍)淀粉、燕麦淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、大米淀粉、豌豆淀粉、小麦淀粉、小豆淀粉、绿豆淀粉、葛根淀粉、片栗淀粉、竹芋淀粉、绿豆淀粉、西米淀粉、木薯淀粉、植物淀粉(例如，从本文公开的任何植物获得的淀粉)、藻酸盐、壳聚糖及其衍生物，以及它们中的两种或更多种的混合物。在一些实施方案中，淀粉是改性淀粉(例如，预糊化淀粉(例如，玉米、小麦、木薯)、预糊化高直链淀粉含量淀粉、预糊化水解淀粉(例如，麦芽糖糊精、玉米糖浆固体、大米糖浆固体、木薯糖浆固体)、化学改性淀粉，例如预糊化取代淀粉(例如辛烯基琥珀酸改性淀粉)、碱性改性淀粉、漂白淀粉、氧化淀粉、磷酸单淀粉、磷酸二淀粉、磷酸二淀粉磷酸、乙酰化磷酸二淀粉、乙酰化淀粉，醋酸单淀粉，乙酰化淀粉，醋酸单淀粉，乙酰化己二酸二淀粉，甘油二淀粉，羟丙基淀粉，羟丙基二淀粉甘油，羟丙基二淀粉磷酸酯，淀粉辛烯基琥珀酸钠，乙酰化氧化淀粉，糊精，辛烯基琥珀酸钠淀粉，及其衍生物，以及其中两种或更多种的混合物)、面粉(例如，橡子粉、杏仁粉、苋菜粉、阿塔粉、大麦粉、豆粉、荞麦粉、木薯粉、栗子粉、粉、椰子粉、玉米(玉蜀黎)粉、硬粒小麦粉、单粒小麦粉、二粒小麦粉、蚕豆粉、鹰嘴豆粉、磨碎的奇亚籽、磨碎的亚麻籽、大麻粉、呼罗珊粉、扁豆粉、麦达粉、大麦麦芽粉、马萨粉、牧豆树粉,小米粉、坚果粉、燕麦粉、豌豆粉、花生粉、马铃薯粉、藜麦粉、大米粉、黑麦粉、高粱粉、大豆粉、斯佩尔特小麦粉、甜米粉、芋头粉、苔麸粉、小麦粉、活性小麦面筋、磨碎的奇亚籽、磨碎的亚麻籽及其衍生物，以及其中两种或更多种的混合物)、树胶(例如葛粉、黄原胶、阿拉伯树胶(阿拉伯胶)、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶(角豆胶)、黄蓍胶、角叉菜胶、塔拉胶、小麦胶、魔芋胶、琼脂胶、刺梧桐胶、兰茎粉、改性纤维素(例如甲基纤维素、甲氧基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素)及其衍生物和混合物。在一些实施方案中，树胶是改性树胶(例如，脱乙酰基、脱乙酰基澄清的、部分脱乙酰基、部分脱乙酰基澄清的及其衍生物，以及其两种或更多种的混合物))、可食用纤维(例如，阿拉伯胶纤维、竹纤维、大麦麸、胡萝卜纤维、纤维素(例如木浆纤维素)、柑橘纤维、玉米麸、可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维、燕麦麸、豌豆纤维、米麸、头壳、洋车前子壳、魔芋、大豆纤维、大豆多糖、小麦麸、菊粉和它们的衍生物，以及它们的两种或更多种的混合物)，以及它们的两种或更多种的混合物；以及其两种或多种的混合物。
脂质的非限制性实例包括脂肪、油、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸。
油的非限制性实例包括植物油(例如，向日葵油、椰子油、芥菜籽油、花生油、亚麻荠油、菜籽油、玉米油、棉籽油、萼距花油、亚麻籽油、橄榄油、棕榈油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、杏仁油、山毛榉坚果油、巴西坚果油、腰果油、榛子油、澳洲坚果油、蒙刚果油、山核桃油、松子油、开心果油、核桃油、鳄梨油、葡萄油)、微生物衍生的油、藻衍生的油、真菌衍生的油、海洋动物油(例如，大西洋鱼油、太平洋鱼油、地中海鱼油、轻压鱼油、碱处理鱼油、热处理鱼油、轻和重棕色鱼油、鲣鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲈鱼油、大比目鱼油、矛鱼油、梭鱼油、鳕鱼油、鲱鱼油、日本沙丁鱼油、鳀鱼油、毛鳞鱼油、大西洋鳕鱼油、大西洋鲱鱼油、大西洋鲭鱼油、大西洋步鱼油、鲑鱼油和鲨鱼油、枪乌贼油、墨鱼油、章鱼油、磷虾油、海豹油、鲸油)、非精油、精油、天然油、非氢化油、部分氢化油、氢化油(例如氢化椰子油)、原油、半精炼(也称为碱精炼)油、酯交换油和精炼油。在一些实施方案中，长链油(例如，向日葵油、玉米油、橄榄油、豆油、花生油、核桃油、杏仁油、芝麻油、棉籽油、菜籽油、红花油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈果油、椰子油、巴巴苏油、乳木果油、芒果油、可可油、小麦胚芽油、米糠油、过量表达油酸400％的工程化葵花油)与短链甘油三酯组合以生产酯交换脂肪酸酯(例如，以产生特定的风味特征)。
甘油单酯和甘油二酯的非限制性实例包括植物来源的甘油单酯和甘油二酯(例如，源自向日葵、椰子、花生、棉籽、橄榄、棕榈、油菜籽、红花、芝麻、大豆、杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、蒙刚果、山核桃、松子、开心果、核桃和鳄梨的甘油单酯和甘油二酯)。甘油单酯和甘油二酯可包含本领域已知的任何游离脂肪酸的酰基链，包括本文公开的任何游离脂肪酸的酰基链。
游离脂肪酸的非限制性实例包括丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十二烷酸、蜡酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、杉皮酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、ω-脂肪酸(例如,花生四烯酸、ω-3-脂肪酸、ω-6-脂肪酸、ω-7-脂肪酸、ω-9-脂肪酸)、4-16个碳长度的偶数碳脂肪酸、单饱和酸(特别是具有18个碳)、具有低界面张力的脂肪酸(例如，小于20、小于15、小于11、小于9、小于7、小于5、小于3、小于2、小于1或小于0.5达因/厘米，从0.1到20，从1到15，从2到9，从3到9，从4到9，从5到9，从2到7，从0.1到5，从0.3至2，或从0.5至1达因/厘米、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0)、在sn-3处酯化的丁酸(4:0)酸或己酸(6:0)，中链脂肪酸(8:0-14:0)以及在位置sn-1和sn-2处酯化的16:0，其中硬脂酸(18:0)位于位置sn-1的脂肪酸，其中油酸(18:1)位于位置sn-1和sn-3的脂肪酸，具有一系列碳原子(例如，8至40、10至38、12至36、14至34、16至32、18至30或20至28个碳原子)的脂肪酸，包含至少一个不饱和键(即碳碳双键或三键；例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个碳-碳双键和/或三键)的脂肪酸，具有缀合的不饱和键(即，至少一对碳-碳双键和/或三键键合在一起，它们之间没有亚甲基(CH2)基团(例如4CH:CHi CH:CHi)的脂肪酸，和上述脂肪酸的衍生物(例如酯(例如甲酯和乙酯)、盐(例如钠盐和钾盐)、甘油三酯衍生物、甘油二酯衍生物、甘油单酯衍生物)。游离脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。在一些实施方案中，游离脂肪酸不是来源于哺乳动物或由哺乳动物产生。
磷脂的非限制性实例包括卵磷脂(例如，大豆卵磷脂、向日葵卵磷脂、棉花卵磷脂、油菜籽卵磷脂、米糠卵磷脂、玉米卵磷脂、面粉卵磷脂)、心磷脂、神经酰胺磷酸胆碱、神经酰胺磷酸乙醇胺、甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷鞘脂和磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，磷脂不是来源于哺乳动物或由哺乳动物产生。
甘油三酯的非限制性实例包括三丁酸甘油酯、短链甘油三酯、包含三种油酸的短链甘油三酯；包含己酸的短链甘油三酯；包含己酸和丁酸的短链甘油三酯；包含己酸和癸酸的短链甘油三酯；以及包含一种丁酸、一种己酸和一种辛酸的短链甘油三酯。
必需和半必需氨基酸的非限制性实例包括半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。
功能性试剂的非限制性实例包括酸化剂、缓冲剂、保质期延长剂、pH和/或离子强度调节剂、抗微生物剂、抗氧化剂、防腐剂、乳化剂、增塑剂、质地/口感剂、着色剂、调味剂/风味剂、芳香剂、膨松剂和流动剂。
保质期延长剂的非限制性实例包括一氧化碳、亚硝酸盐、焦亚硫酸钠、Bombal及其衍生物和混合物。
防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸酯衍生物、山梨酸、苯甲酸、乳链菌肽、游霉素及其衍生物和混合物。
乳化剂的非限制性实例包括阴离子乳化剂、非离子乳化剂、阳离子乳化剂、两性乳化剂、生物乳化剂、空间乳化剂、Pickering乳化剂、糖脂(例如海藻糖脂、槐糖脂、鼠李糖脂、甘露糖基赤藓糖醇脂)、寡肽(例如短杆菌肽S,多粘菌素)、脂肽(例如,表面活性素)、磷脂、脂肪酸、中性脂质、聚合生物表面活性剂、两亲性多糖、脂多糖、蛋白质(例如,豌豆蛋白、大豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、藻类蛋白、酵母蛋白、马铃薯蛋白、扁豆蛋白)、甘露糖蛋白、磷酸钠、硬脂酰乳酸钙、甘油单酯的单乙酰和双乙酰酒石酸酯、磷脂、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸镁、脂肪酸的钠/钾/钙盐、硬脂酰二乳酸钙、聚-甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油单酯的乙酸酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的柠檬酸酯、脂肪酸的聚甘油酯、聚甘油聚蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙烷-1,2-二醇酯、糖酯、脂肪酸的蔗糖酯、甘油单酯、乙酰化甘油单酯、乳酰化甘油单酯、甘油二酯、磷酸单甘油酯、二乙酰酒石酸酯、硬脂酰-2-乳酸钠/钙、磷脂铵、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯-80、羧甲基纤维素(CMC)、调制纤维素、柠檬酸酯、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、甲壳素、emulsan、卵磷脂(例如，植物基卵磷脂、鹰嘴豆卵磷脂、蚕豆卵磷脂、大豆卵磷脂、向日葵卵磷脂、芥花卵磷脂)、表面活性剂(例如，山梨糖醇三油酸酯(分别为Span 85)、山梨糖醇三硬脂酸酯(分别为Span65)、山梨糖醇倍半油酸酯(Arlacel 83)，甘油单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯(Span 80)、失水山梨糖醇单硬脂酸酯(Span 60)、失水山梨糖醇单棕榈酸酯(Span 40)、失水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20)、聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯(分别为Tween 65)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(分别为Tween 85)、聚乙二醇400单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60(Tween 60)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80(Tween80)、聚山梨醇酯40(Tween 40)、聚山梨醇酯20(Tween 20)、PEG 20三硬脂酸酯、PEG20三油酸酯、PEG 20单硬脂酸酯、PEG 20单油酸酯、PEG 20单棕榈酸酯和PEG 20单月桂酸酯脱水山梨糖醇)及其衍生物和混合物。
增塑剂的非限制性实例包括二乙醇胺、三乙醇胺、甘油、山梨糖醇、PEG-300、PEG-600、尿素、辛酸、棕榈酸、酒石酸二丁酯和邻苯二甲酸酯、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、果糖、己酸、氢己酸、二-、三-或四-乙二醇、甘油、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、蔗糖及其衍生物和混合物。
质地/口感剂的非限制性实例包括树胶(例如，瓜尔胶、角豆树胶、小麦胶、黄原胶)、膨松剂、填充剂、抗粘附化合物、分散剂、吸湿化合物、化学合成剂(chemestheticagent)、成膜剂、增稠剂、硬化剂、软化剂、稳定剂、抗结块剂、消泡剂及其衍生物和混合物。
风味剂/芳香剂的非限制性实例包括丁酸乙酯、2-呋喃甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯、δ-十一内酯、丙二醇、甘油、乙醇、二甲硫醚、2-甲基丁醇、4-顺-庚烯醛2-反式壬烯醛、丙酮、2-十一酮、2-丁酮、戊醇、δ-癸内酯、2-庚酮、δ-十二内酯、2-壬酮、δ-十四内酯、硫化氢、二甲基砜、苯并噻唑、2-戊酮、2-十三酮、δ-辛内酯、2-十五酮、天然香料、人工香料(例如，巧克力调味料、咖啡调味料、草莓调味料、杏仁调味料、榛子调味料、香草调味料、绿茶调味料、爱尔兰奶油调味料、椰子调味料)、甜味剂(例如，非蛋白质甜味剂、蛋白质基甜味剂)及其衍生物和混合物。
非蛋白质甜味剂的非限制性实例包括糖、改性糖、天然甜味剂、甜蛋白、人造甜味剂、糖醇、糖纤维、糖提取物，包括：蔗糖、甘蔗汁、玉米糖、高果糖玉米糖浆、玉米甜味剂、龙舌兰糖浆、大麦麦芽糖浆、桦木糖浆、黑糖浆、糙米糖浆、焦糖、玉米糖、葡萄糖、douxmatok糖浆、椰子糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖果糖糖浆、金糖浆,乙酰磺胺酸钾、糖精、阿力糖、阿斯巴甜、阿斯巴甜-安赛蜜盐、环己基氨基磺酸盐(例如环己基氨基磺酸钠)、赤藓糖醇、低聚果糖、阿洛酮糖、葡萄糖醇(山梨糖醇)、甘油(丙三醇)、甘草甜素、金糖浆、HFCS-42、HFCS-55、HFCS-90、高麦芽糖玉米糖浆、蜂蜜、椰枣糖浆、HSH、氢化淀粉水解物(HSH)、异麦芽酮糖、异麦芽寡糖(IMO)、异葡萄糖、菊粉、转化糖、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、乳糖、左旋糖(果糖)、罗汉果(又名罗汉果)、麦芽糖醇、麦芽糊精、麦芽糖、甘露醇、枫糖浆、糖蜜、莫纳甜、莫奈林、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、低聚果糖、棕榈糖、聚葡萄糖、rapadura、精炼糖浆、糖精、蔗糖、高粱糖浆、甜叶菊、RebM、RebA、RebD、甜菊苷、三氯蔗糖、蔗糖、塔格糖、欧亚水龙骨甜素(osladin)、甘素、甜素、阿磺胺钾(asulfame potassium)、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸、P-4000、罗汉果苷、海藻糖、木糖醇、雪莲果糖浆及其衍生物和混合物。
基于蛋白质的甜味剂的非限制性实例包括brazzein(UniProt序列P56552)、仙茅素(分别地UniProt序列P19667氨基酸23至136、Q6F495氨基酸23至135)、马槟榔甜蛋白(UniProt序列P80351氨基酸1至32、P80351氨基酸33至104、P30233氨基酸36至68、P30233氨基酸83至154、P80352氨基酸1至32、P80352氨基酸33至104、P80353氨基酸1至28、P80353氨基酸29至100)、神秘果蛋白(UniProt序列P13087氨基酸30至220)、monelin(UniProt序列P02881、P02882)、培它丁和奇异果甜蛋白(分别地UniProt序列P02883氨基酸23至229、P02884氨基酸23至229)，以及其同源物和片段及混合物。
食品
根据上文任一项所述的组合物可以是食品。
食品可以是补充食品(即，补充有根据上文任一项所述的重组蛋白的传统食品)，或可以是替代食品(即，类似于传统食品并且可用于替代传统食品的食品)，选自国家健康和营养检查调查(NHANES)定义的任何食品类别。
NHANES食品类别的非限制性实例包括零食和口香糖(例如，零食棒、饼干、来自谷物产品的咸味零食、口香糖)；面包、谷物和意大利面(例如，燕麦面包和面包卷、玉米面包、玉米松饼、墨西哥面饼、面粉和干混合物、饼干、杂粮面包和面包卷、全麦面包和面包卷、意大利面、黑麦面包和面包卷、碎小麦面包和面包卷、白面包和面包卷)；饮料(例如啤酒和麦芽酒、浓缩饮料、饮料、能量饮料、运动饮料、液体替代品、软饮料、碳酸饮料、果汁、葡萄酒、啤酒、鸡尾酒、营养饮料、营养粉、富含蛋白质的饮料、咖啡、茶)；糖果和甜点(例如蛋糕、糖果、薯片、饼干、果馅饼、糕点、冰或冰棒、松饼、馅饼、糖替代品或取代品、糖浆、蜂蜜、果冻、果酱、蜜饯、沙拉、薄饼、丹麦酥、早餐糕点、甜甜圈)；早餐食品(例如谷物、麦片、大米、法式吐司、煎饼、华夫饼、咖啡蛋糕)；沙拉酱、油、酱汁、调味品(例如，烹调用脂肪、植物油、沙拉酱、番茄酱、肉汁)；土豆(例如土豆沙拉、土豆汤、薯片和薯条、炸土豆、土豆泥、填馅土豆、泡芙)；和汤(例如蔬菜汤、蔬菜肉汤)、膳食、主菜、蛋白质(例如肉类替代品)和海鲜。
根据上文任一项所述的食品可以是补充乳制品(即，补充有根据上文任一项所述的重组蛋白的常规乳制品)或替代乳制品(即类似于常规乳制品的食品)。如本文所用，术语“乳制品”是指乳(例如，全脂奶[至少3.25％乳脂]、部分脱脂奶[1％至2％乳脂]、脱脂奶[少于0.2％乳脂],煮乳、炼乳、调味奶、山羊奶、绵羊奶、奶粉、淡奶、奶泡)，以及从乳中提取的产品，包括但不限于酸奶(例如,全脂酸奶[每170克至少6克脂肪]、低脂酸奶[每170克2至5克脂肪]、脱脂酸奶[每170克0.5克或更少脂肪]、希腊酸奶[去除乳清的过滤酸奶]、生酸奶、山羊奶酸奶、脱乳清酸奶(Labneh)[labne]、羊奶酸奶、酸奶饮料[例如，全脂牛奶Kefir、低脂牛奶Kefir]、Lassi)、奶酪(例如乳清奶酪，例如乳清干酪；帕斯特干酪，例如马苏里拉奶酪；半-软奶酪，例如哈瓦蒂干酪和门斯特干酪；中等硬度奶酪，例如瑞士乳酪和亚尔斯贝格奶酪和哈罗米奶酪；硬奶酪，例如切达干酪和帕尔马干酪；水洗凝乳奶酪，例如科尔比氏干酪和蒙特里杰克乳酪；柔软的成熟奶酪，例如布里干酪和卡门培尔干酪；新鲜奶酪，例如白软干酪、菲达奶酪、奶油奶酪、印度奶酪和凝乳)、加工奶酪、加工奶酪食品、加工奶酪产品、加工奶酪涂抹酱、酶调制奶酪；冷包装奶酪)、乳基酱汁(例如沙拉酱、白色调味酱、新鲜酱汁、冷冻酱汁、冷藏酱汁、货架稳定酱汁)、乳制品涂抹酱(例如低脂涂抹酱、低脂黄油)、奶油(例如，干奶油、浓奶油、淡奶油、鲜奶油、稀奶油、咖啡增白剂、咖啡奶精、酸奶油、鲜奶油)、冷冻甜点(例如，冰淇淋、冰沙、奶昔、冷冻酸奶、圣代冰淇淋、意式冰淇淋、奶油冻)、乳制甜点(例如新鲜、冷藏或冷冻)、黄油(例如搅打黄油、培养黄油)、乳粉(例如全脂奶粉、脱脂奶粉、加脂奶粉(即，包含植物脂肪代替全部或部分动物脂肪的奶粉)、婴儿配方奶粉、乳蛋白浓缩物(例如，乳蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、去矿物质乳清蛋白浓缩物、β-乳球蛋白浓缩物、α-乳清蛋白浓缩物、糖巨肽浓缩物、酪蛋白浓缩物)、乳蛋白分离物(例如，乳蛋白分离物、乳清蛋白分离物、去矿物质乳清蛋白分离物、β-乳球蛋白分离物、α-乳清蛋白分离物、糖巨肽分离物、酪蛋白分离物)、营养补充剂、质地混合物、调味混合物、着色混合物、即饮或即食产品(例如新鲜、冷藏或货架稳定的乳蛋白饮料、减肥饮料、营养饮料、运动恢复饮料和能量饮料)、布丁、凝胶、咀嚼片、薯片、棒(例如营养棒、蛋白质棒)和发酵乳制品(例如酸奶、奶酪、酸奶油、发酵酪乳、发酵黄油、发酵乳脂肪)。
根据上文任一项所述的食品可以是补充的动物肉或动物肉制品(即补充有由根据上文任一项所述的重组宿主细胞和/或根据上文任一项所述的方法产生的上文任一项的重组蛋白的常规动物肉或动物肉制品)，或替代动物肉或动物肉制品(即，类似于常规动物肉或动物肉制品的食品)。动物肉和动物肉制品的非限制性例子包括从获自动物的骨骼肌或其他器官(例如，肾、心、肝、胆囊、肠、胃、骨髓、脑、胸腺、肺、舌)或部分获得的肉。动物肉可以是黑肉或白肉。可从中获得动物肉或动物肉制品的动物的非限制性实例包括牛、羔羊、羊、马、家禽(例如鸡、鸭、鹅、火鸡)、飞禽(例如野鸽、鸽子、松鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸸鹋、雉鸡、鹌鹑)、淡水或咸水鱼(例如，鲶鱼、金枪鱼、旗鱼、鲨鱼、大比目鱼、鲟鱼、三文鱼、鲈鱼、北美狗鱼、梭子鱼、弓鳍鱼、颌针鱼、鳗鱼、白鲟、鲷、鲤鱼、鳟鱼、大眼鱼、黑鱼、莓鲈、姐妹鱼、贻贝、扇贝、鲍鱼、鱿鱼、章鱼、海胆、鱿鱼、被囊动物)、甲壳类动物(如螃蟹、龙虾、虾、藤壶)、野生动物(如鹿、狐狸、野猪、麋鹿、驼鹿、驯鹿、北美驯鹿、羚羊、斑马、松鼠、土拨鼠、兔子、熊、海狸、麝鼠、负鼠、浣熊、犰狳、豪猪、野牛、水牛、野猪、猞猁、山猫、蝙蝠)、爬行动物(例如，蛇、乌龟、蜥蜴、短吻鳄、鳄鱼)、任何昆虫或其他节肢动物、啮齿动物(海狸鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、田鼠、土拨鼠、水豚)、袋鼠、鲸鱼和海豹。动物肉或动物肉制品可以被磨碎、切碎、切丝或以其他方式加工以及未经烹调、正在烹调或已经烹调。
根据上文任一项所述的食品可以是补充蛋制品(即，补充有根据上文任一项所述的重组蛋白的常规蛋或蛋制品)，或替代蛋或蛋制品(即类似于常规蛋或蛋制品的食品)。蛋或蛋制品的非限制性实例包括全蛋(例如，液体全蛋、喷雾干燥全蛋、冷冻全蛋)、蛋清(例如，液体蛋清、喷雾干燥蛋清、冷冻蛋清)、蛋黄、蛋盘、蛋汤、用蛋清制成的混合物、用蛋替代品制成的混合物、蛋黄酱、蛋奶沙司和沙拉酱。
根据上文任一项所述的食品可以是宠物食品或动物饲料。
根据上文任一项所述的食品可以基本上不含除根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的组合物中的重组蛋白之外的任何蛋白质。
根据上文任一项所述的食品可以基本上不含除根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的组合物中的重组蛋白之外的任何重组蛋白。
根据上文任一项所述的食品可以基本上不含除根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的组合物中的重组蛋白之外的任何重组乳蛋白。
根据上文任一项所述的食品可以基本上不含哺乳动物产生的乳汁(例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶、水牛奶、牦牛奶、骆驼奶、美洲驼奶、羊驼奶、马奶、驴奶)中发现的组分，或可能包含较低浓度的在哺乳动物产生的乳汁中发现的至少一种成分。在哺乳动物来源的乳汁中发现的成分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂。食品可以基本上不含除了包含在根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的组合物中的重组蛋白中的乳蛋白之外的任何乳蛋白。
根据上文任一项所述的食品可以基本上不含从动物获得的成分(即，对于动物是天然的组分，包括动物产品[即，可食用的或通常制备用于人类食用的动物部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血液]、动物副产品[即通常本身不可食用但为屠宰动物以用于食用的副产品；例如动物骨头、动物尸体和从中分离的成分]，由动物产生的产品[例如，哺乳动物来源的乳汁、鸡蛋、蜂蜜]，以及由其产生的消费品[例如，明胶、凝乳酶、从哺乳动物源性乳汁中提取的乳清蛋白、从哺乳动物源性提取物中提取的酪蛋白乳、从哺乳动物来源的乳汁中提取的乳脂、动物脂类、动物蛋白])，或含有按质量计2％或更少的此类成分。
化妆品或个人护理产品
根据上文任一项所述的组合物可以是化妆品或个人护理组合物。
如本文所用，术语“化妆品或个人护理组合物”是指一种组合物，其在施用于体表(即，人体的暴露区域，例如皮肤、毛发、指甲、牙齿和口腔组织[例如，牙龈])后赋予感知或实际的美化或卫生效果。化妆品或个人护理组合物的非限制性实例包括抗皱处理(即，用于拉紧[例如，抚平皮肤、减少皮肤皱纹、去除皮肤细纹]的组合物)、抗衰老处理(即，用于去除衰老迹象[例如皱纹、细纹、光损伤表现(例如太阳斑)]的组合物)、防晒(即用于防止紫外线照射的组合物)、抗灼伤处理(即用于舒缓烧伤[例如，晒伤]的组合物)、抗痤疮处理(即有效治疗痤疮和/或与之相关的症状的组合物)、皮肤清洁剂(即用于清洁皮肤和/或皮肤毛孔的组合物[例如，用于毛孔清洁的鼻贴])、去头皮屑处理(即，用于减少或消除头皮屑的组合物)、抗体味处理(即，用于减少或消除体味的组合物)、美黑处理(即，用于使皮肤颜色变黑的组合物)、皮肤美白处理(即，用于漂白/脱色皮肤颜色的组合物)、染发处理(即，用于染发的组合物)、洗剂(例如，皮肤洗剂、身体护理洗剂、洗涤洗剂、保湿洗剂、剃须前乳液、须后乳液)、糊剂(例如洗涤膏)、软膏、香脂、药膏、面膜、霜剂(例如油包水面霜、水包油面霜、日霜、晚霜、眼霜、护肤霜、面霜、抗皱霜、防晒霜、保湿霜、须后霜、皮肤漂白霜、美黑霜、维他命霜、保湿霜、按摩霜)、乳(例如身体乳，洁面乳)，凝胶(例如，无水凝胶，沐浴乳)，淡香水，香皂(例如，透明香皂，奢华香皂，除臭香皂，膏状香皂，婴儿香皂，皮肤保护香皂，研磨香皂，合成洗涤剂，膏状香皂、软皂、去角质皂)、去角质护理、液体洗涤、淋浴和沐浴前制剂(例如洗液、沐浴露、沐浴乳、泡沫浴、油浴、磨砂制剂)、泡沫(例如剃须泡沫、泡沫浴)、除臭剂、护发产品(例如洗发水、护发素、摩丝、头发着色剂、喷发剂、冲洗液、发胶、发乳、发蜡、生发剂)、唇彩、喷雾剂(例如喷发剂、泵喷剂、含有发泡剂的喷雾剂)、治疗皮肤缺陷(例如皮炎、伤口、龟裂、瑕疵、裂缝、疤痕、雀斑、痣、皮疹、水泡、脓疱)、爽肤水、清洁纸巾、卫生巾、卫生棉条、尿布、驱虫剂、彩妆产品(例如工作室颜料、睫毛膏、眼影、眼线膏、眼线笔、胭脂、粉饼、眉笔、口红、粉底、有色霜、遮瑕棒、淡斑棒、腮红)、棒状物(例如口红、遮瑕棒、淡斑棒)、脱毛剂、洗手液产品、私密卫生用品、足部护理用品、婴儿护理用品和口腔卫生用品(例如，口香糖、漱口水、牙膏、牙龈清洁剂、假牙粘合剂、假牙固定剂)。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何蛋白。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何重组蛋白。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含除了根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的聚合物中的重组蛋白之外的任何重组乳蛋白。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含哺乳动物产生的乳汁(例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶、水牛奶、牦牛奶、骆驼奶、美洲驼奶、羊驼奶、马奶、驴奶)中发现的组分，或可能包含较低浓度的在哺乳动物产生的乳汁中发现的至少一种成分。在哺乳动物来源的乳汁中发现的成分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂。化妆品或个人护理组合物可以基本上不含除了包含在根据上文任一项所述的重组蛋白或包含在根据上文任一项所述的组合物中的重组蛋白中的乳蛋白之外的任何乳蛋白。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含从动物获得的成分(即，对于动物是天然的组分，包括动物产品[即，可食用的或通常制备用于人类食用的动物部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血液]、动物副产品[即通常本身不可食用但为屠宰动物以用于食用的副产品；例如动物骨头、动物尸体和从中分离的成分]，由动物产生的产品[例如，哺乳动物来源的乳汁、鸡蛋、蜂蜜]，以及由其产生的消费品[例如，明胶、凝乳酶、从哺乳动物源性乳汁中提取的乳清蛋白、从哺乳动物源性提取物中提取的酪蛋白乳、从哺乳动物来源的乳汁中提取的乳脂、动物脂类、动物蛋白])，或含有按质量计2％或更少的此类成分。
根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物可以基本上不含来源于石油的组分。
产生组合物的方法
在各个方面，本文提供了一种用于产生根据上文任一项所述的组合物(例如，根据上文任一项所述的食品、根据上文任一项所述的化妆品或个人护理组合物)的方法，其中该方法包括：获得根据上文任一项所述的重组蛋白。
当组合物是食品(例如，根据上文任一项所述的食品)时，可以使用本领域已知的多种食谱来制备食品。根据上文任一项所述的重组蛋白可以以纯化形式用于此类食谱中或包含在根据上文任一项所述的方法获得的发酵液或制剂中。
属性
根据上文任一项所述的重组蛋白、聚合物或组合物可以具有多种属性。
该属性可以是结晶度(例如，提供特定半透明性、不透明性或透明度的结晶度)。例如，较高的结晶度通常允许较少的光穿过聚合物，影响聚合物的半透明或不透明性，以及机械强度、刚度、耐化学性和稳定性。用于测量结晶度的方法是本领域已知的，并且包括差示扫描量热法(DSC)(参见，例如，B.Wunderlich,Thermal Analysis,Academic Press,1990,pp.417-431.；TN 48,“Polymer Heats of Fusion”,TA Instruments,New Castle,DE；Ramos等人2012Critical Reviews in Food Science and Nutrition 52(6):533-552)。
该属性可以是粘度和/或密度。用于测量粘度和密度的方法是本领域已知的，并且包括粘度计方法、旋转粘度计方法、毛细管粘度计方法、振动粘度计方法、超声脉冲回波方法、比重瓶法、密度计法和等量法(参见，例如，Kazys&Rekuviene 2011Ultragarsas(Ultrasound)66(4):20-25)。
该属性可以是溶解度(即，在给定条件下和在各种溶剂中分散和胶体稳定的聚合物的量)。用于测量溶解度的方法是本领域已知的，并且包括随时间推移的去稳定化的光学测量、沉降层厚度的测量和重量分析分离后分散蛋白质的定量的测量。
该属性可以是发泡/发酵能力。测量发泡能力的方法是本领域已知的，并且包括测量在规定条件(例如，温度、pH、离子强度、蛋白质浓度、碳水化合物浓度)下以特定速度快速移动特定时间量后形成的泡沫中掺入的空气的百分比，测量给定质量的泡沫以排出或渗出的液体的形式去稳定化需要的时间，以及测量剪切下的屈服应力或样品中开始流动所需的应力量(参见，例如，PCT公开WO2020219595，2020年10月29日公布)。
该属性可以是胶凝/增稠/凝结能力。用于测量胶凝/增稠能力的方法是本领域已知的，并且包括测量在规定条件(例如，温度、pH、离子强度、蛋白质浓度、碳水化合物浓度)下形成凝胶所需的时间、测量在流变仪上的频率扫描中获得的储存和弹性模量和相位角，以及凝胶对物理力和/或化学条件(例如，搅拌、温度、pH、离子强度、蛋白质浓度、糖浓度)的抵抗力的测量(参见，例如，PCT公开WO2020219595，2020年10月29日公布)。
该属性可以是胶凝特性。用于测量胶凝特性的方法是本领域已知的(参见，例如Stable Micro Systems Ltd.2020.How to Measure the Physical Properties of Gels&Films.AZoM,https://www.azom.com/article.aspx？ArticleID＝19349)。
该属性可以是水结合能力。水结合能力可以是酪蛋白的水结合能力的约80％至约120％。用于测量水结合能力的方法是本领域已知的，并且包括毛细管粘度法、离心后渗出的水量的测量，或基于每质量蛋白质结合的水的质量作为蒸汽压的函数的吸湿等温线的开发。
该属性可以是乳化能力。用于测量乳化能力的方法是本领域已知的，并且包括测量表面过量浓度，测量使用重量分析法来确定的由给定质量的蛋白质乳化的油的量，测量脂质和水的混合物中相分离随时间的稳定性，乳化或沉降速率的测量，不透明度随时间变化的测量，分散相粒径随时间变化的测量，以及界面性质的测量。
该属性可以是保质期(即，颜色和外观随时间的维持/稳定性[例如，2年])。测量颜色和外观维持能力的方法是本领域已知的(参见，例如，Ramos等人2012Critical Reviewsin Food Science and Nutrition52(6):533-552)。
该属性可以是热稳定性。热稳定性可以是至少80℃的热稳定性，和/或类似于乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3或乳蛋白4的热稳定性的热稳定性，单位最低熔融温度(Tm)。测量稳定性的方法是本领域已知的，并且包括测量加热期间/之后的变化，例如粒度变化、颗粒性质变化、光学性质变化(例如不透明度、浊度、透明度)、溶解度变化、对重力分离的阻力的变化、粘度的变化和/或对结垢/成膜的阻力的变化。可以研究用于测量泡沫的热稳定性的方法是本领域已知的(参见，例如，Ye等人2021Adv.Sustainable Syst.2100063)
该属性可以是弹性(即，由于施加力而在拉伸或其他改变之后恢复到原始形状的能力)。测量弹性的方法是本领域已知的(参见，例如，Cao and Mezzenga,2020Nat Food 1:106–118)。
该属性可以是拉伸强度(即，材料在被拉伸时可以支撑而不断裂的最大载荷除以材料的原始横截面积)。方法或测量拉伸强度是本领域已知的(参见，例如，Ramos等人2012Critical Reviews in Food Science and Nutrition 52(6):533-552,Mundada等人2011Iran J Pharm Res.10(1):35-42)。
该属性可以是伸长率(即，断裂前长度的最大变化，表示为材料原始长度的百分比变化)。测量伸长率的方法是本领域已知的(参见，例如，Olivas and Barbosa-Canovas,2005Crit Rev Food Sci Nutr.45(7-8):657-670)。
该属性可以是杨氏模量(即，应力与应变的比率，在应力/应变曲线的初始线性部分)。方法或测量杨氏模量是本领域已知的(参见，例如，McHugh and Krochta,1994J.Agric.Food Chem.42:41–45)。
该属性可以是抗撕裂性(即，承受撕裂影响的能力)。方法或测量抗撕裂性是本领域已知的(参见，例如，Krochta 2002Protein-based Films and Coatings,pp.1–41)。
该属性可以是生物降解性(即，能够代谢成无害产物)。用于测量生物降解性的方法是本领域已知的，并且包括OECD 306在海水中的生物降解性、OECD 311(ASTM E2170)厌氧生物降解性/生化甲烷潜能、ASTM D5338需氧生物降解性/堆肥化验、ASTM D5511厌氧生物降解性/“垃圾填埋场模拟”，ASTM D5988(ISO17556)土壤中的生物降解。
当组合物是食品时，该属性可以是食用质量(例如，风味、口感、脂肪性、乳脂状、丰富性、油腻性、厚度、硬度/坚固性、松脆性、易碎性、松脆性、咀嚼性、耐嚼性、柔软性、致密性、内聚性、粘附性、颗粒感、光滑度、多汁性、湿润度、黏附感、在舌头上光滑度、粗糙度、磨蚀性、咬合和/或咀嚼的均匀性、弹性、质地、空气感、从舌头上用勺子抽取样品所需的力)，营养素含量(例如蛋白质的类型和/或量、氨基酸的类型和/或量[例如支链氨基酸]、PDCAAS、BV、脂质的类型和/或量、矿物质的类型和/或量、维生素的类型和/或量)、涂抹性、赋予味道的能力、胃肠吸收、胃肠消化率、氧化稳定性、形成胶束的能力(即，通常或大致呈球形的超分子结构，其作为分散体存在于一种组合物内，并且可以封装一种或多种生物分子(例如，水、矿物质、维生素))，与其他蛋白质的相互作用，调节饥饿和/或饱腹感的能力，以及用途的多样性(即，多种用途和产生多种食品的潜力；例如，产生类似于替代乳制品的食品的能力[例如，本文公开的任何替代乳制品])。
当组合物是膜或涂层时，该属性可以是表面形态的内聚性和/或对表面(例如食品的表面)的粘附性。用于测量内聚性和粘附性的方法是本领域已知的，并且包括扫描电子显微镜(参见，例如，Choi等人2002J.Food.Sci.66:2668–2672)和共焦拉曼显微光谱法、表面增强拉曼散射，以及傅里叶变换拉曼光谱法(参见例如，Hsu等人2005Mat.Sci.Eng.25:282–290)。
当组合物是膜或涂层时，属性可以是脆性和/或刚度(例如落镖强度、抗穿刺性、剥离强度)。用于测量脆性和/或刚度的方法是本领域已知的(参见，例如，Krochta,2002Protein-based Films and Coatings,pp.1–41)。
当组合物是膜或涂层时，该属性可以是气体渗透率(即，在指定的温度和湿度条件下，由材料两侧之间的单位压力差引起的气体通过单位厚度的平坦材料的单位面积的传输速率)。用于测量气体渗透率的方法在本领域中是已知的，并且包括用于测量氧气渗透率的ASTM，1988，以及用于测量水蒸汽渗透率的方法的修改以用于测量CO2渗透率(参见，例如，Ayranci等人,1999J.Sci.Food Agric.79:1033–1037)。
当组合物是膜或涂层时，该属性可以是水蒸气渗透性(即，在指定的温度和湿度条件下，由材料两侧之间的单位压力差引起的水蒸气通过单位厚度的平坦材料的单位面积的传输速率)。用于测量水蒸气渗透率的方法在本领域中是已知的，并且包括ASTM E96-95(ASTM，1996)。
当组合物是膜或涂层时，属性可以是芳香化合物渗透性(即，在指定的温度和湿度条件下，由材料两侧之间的单位压力差引起的芳香化合物通过单位厚度的平坦材料的单位面积的传输速率(例如，δ-柠檬烯传输))。用于测量芳香化合物渗透性的方法是本领域已知的(参见，例如，Chalier等人2006Developments Food Science 43:437–440,Perez-Gagoand Krochta 2002Protein-Based Films and Coatings,pp.159–180)。
当组合物是膜或涂层时，属性可以是光学性质，例如颜色或透明度(即，％透光率、雾度和/或透明度)。用于测量光学性质的方法是本领域已知的(参见，例如，Abbot1999Postharvest Biol.Technol.15:207–225,Sakai 1998Konica Minolta Sensing,pp.3–91)。薄膜的透明度通常根据ASTM D1746(ASTM,1997,Annual Book of ASTMStandards,pp.389–391)确定。
当组合物是凝胶时，属性可以是溶胀率(例如，在浸入液体中时)。测量溶胀率的方法是本领域已知的(参见，例如，Gunasekaran等人2007Journal of Food Engineering 83:31–40)。
当组合物是凝胶时，属性可以是凝胶流变学。凝胶流变性可为明胶流变性的约80％至约120％。用于测量凝胶流变学的方法是本领域已知的，并且包括测量粘弹性、储能模量、复数模量、相角、损耗模量、时间依赖性行为、蠕变、松弛和恢复(参见，例如，Tien等人2000J.Agric.Food Chem.48:5566-5575,Mundada等人2011Iran J Pharm Res.10(1):35-42)。
当组合物是凝胶时，属性可以是凝胶强度。用于测量凝胶强度的方法是本领域已知的，并且包括针入度法(penetrometry)和振荡流变学。
当组合物是泡沫时，属性可以是泡沫密度/孔隙率和/或泡沫热稳定性。用于测量泡沫密度/孔隙率和/或热稳定性的方法是本领域已知的(参见，例如，Ye等人2021Adv.Sustainable Syst.2100063,Gunasekaran等人2007Journal of FoodEngineering 83:31–40)。
当组合物是泡沫时，属性可以是泡沫稳定性。测量泡沫稳定性的方法是本领域已知的，并且包括测量给定质量的泡沫以排出或渗出的液体形式去稳定化需要的时间，以及测量剪切下的屈服应力或在样品中启动流动需要的应力量(参见，例如，PCT公开WO2020219595，2020年10月29日公布)。
当组合物是乳液时，属性可以是乳液稳定性(即，在给定条件(例如给定的蛋白质浓度、脂质浓度、pH、离子强度或制备方法)下产生的乳液的半衰期)。用于测量乳液稳定性的方法是本领域已知的，并且包括随时间推移的目视检查、随时间推移的粒度测量、重量法(随时间推移的乳化或沉降)和光学方法(例如，随时间推移的光透射或反向散射的测量)。
属性也可以选自颜色、形状(例如，长度、宽度、均匀性)、形状保持、结构(例如，分子结构[例如，蛋白质折叠/构象]、气室平均尺寸、气室尺寸分布、气泡壁厚)、可塑性、过敏性、质地、厚度、光滑度、化学反应性、熔化温度、韧性、蠕变或冷流、孔隙率、抗冲击性、导电性、导热性、柔韧性、表面活性(例如，表面暴露的官能团、表面疏水性、表面电荷、表面张力)、断裂强度、玻璃化转变温度、缔合/结合的化合物的释放、无毒性和/或成型温度。
实施例
包括以下实施例以说明本公开内容的具体实施方案。实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的方法和过程中发挥良好作用的技术；然而，本领域的技术人员根据本公开应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。因此，实施例中列出或显示的所有内容都应解释为说明性的，而不是限制性的。
实施例1：重组蛋白的产生
对于在木霉属(例如，里氏木霉)、曲霉属(例如，黑曲霉)和毕赤酵母属(例如，毕赤酵母[法夫驹形氏酵母]，菌株BG12[(Biogrammatics,Carlsbad,CA])宿主细胞中的重组蛋白表达，使用本领域已知的基因工程方法构建图1中所示的重组载体。该重组载体包含重组表达构建体，该构建体包含编码根据上文任一项所述的重组蛋白的蛋白编码序列(“重组蛋白ORF”)，针对在宿主细胞中的表达进行了密码子优化，并可操作地连接到N末端分泌信号序列(例如，用于木霉属宿主细胞的蛋白质CBH1或XYN1的前信号肽或前原信号肽；用于曲霉属宿主细胞的蛋白质GLAA的前信号肽或前原信号肽；用于毕赤酵母属宿主细胞的酿酒酵母α交配因子的前信号肽或前原信号肽；以及在合适的启动子的控制下(例如，用于木霉属宿主细胞的cbh1、xyn1或tef1基因的启动子序列；用于曲霉属宿主细胞的glaA或gpdA基因的启动子序列；用于毕赤酵母属宿主细胞的gap或aox1基因的启动子序列)和终止子(例如，用于木霉属宿主细胞的pdc1基因的终止子序列；用于曲霉属宿主细胞的glaA或gpdA基因的终止子序列；用于毕赤酵母属宿主细胞的aox1基因的终止子序列)。重组载体进一步包含多核苷酸，其可以指导表达构建体整合到宿主细胞的基因组中(例如，整合到木霉属宿主细胞的cbh1或egl1基因座中；整合到曲霉属宿主细胞的glaA基因座中；整合到毕赤酵母属宿主细胞的aox1基因座中)，用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记，以及细菌复制起点。在将重组载体转化到宿主细胞中之前，通过限制酶消化从重组载体中去除细菌选择标记和复制起点。
将重组载体转化到木霉属、曲霉属或毕赤酵母属宿主细胞中，并通过在基本培养基或抗生素上生长以进行阳性选择来选择转化体。转化体在24孔板中培养，收获培养物上清液用于通过SDS-PAGE凝胶分析鉴定包含表达构建体的整合拷贝并分泌重组蛋白的重组宿主细胞。
在允许细胞生长和产生重组蛋白的条件下，在搅拌发酵容器中发酵重组宿主细胞。至少100小时后收获发酵物，生物质浓度为每升约20克至约50克干细胞重量(DCW)。通过以5,000xg离心从发酵液中除去生物质。
将培养物上清液在具有合适截留分子量的膜上浓缩。浓缩物滞留物在5kda MWCO膜上渗滤到50mM咪唑，pH6.8中。将浓缩的滞留物通过Q sepharose FF柱。流动相是50mM咪唑，pH6.8，重组蛋白在2M NaCl梯度上洗脱。梯度从0-30％运行超过30个柱体积。收集峰级分并在RP-HPLC上进行分析。汇集含有纯度大于85％的重组蛋白的峰用于最终渗滤到水中。
实施例2：重组酪蛋白的产生
使用本领域已知的基因工程方法构建图1所示的重组载体。重组载体包含表达构建体，该表达构建体包含编码家牛β-酪蛋白(UniProt序列P02666的氨基酸16至224)或编码具有根据上文所述的结构(A)的重组蛋白的蛋白质编码序列，其中乳蛋白1为家牛β-乳球蛋白(UniProt序列P02754的氨基酸17-178)，连接肽1具有NVISKR的氨基酸序列(包含kex2内切蛋白酶识别或切割位点)，和乳蛋白2为家牛β-酪蛋白(UniProt序列P02666的第16至224位氨基酸)，针对在黑曲霉中的表达进行了密码子优化，可操作地连接到N末端分泌信号(例如，蛋白GLAA的前信号肽或前原信号肽)；并且在合适的启动子(例如，glaA或gpdA基因的启动子序列)和合适的终止子(例如，glaA或gpdA基因的终止子序列)的控制下。重组载体还包含可指导表达构建体整合到黑曲霉宿主细胞基因组中(例如，在glaA基因座处)的多核苷酸、用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记，以及细菌复制起点。在将重组载体转化到宿主细胞中之前，通过限制酶消化从重组载体中去除细菌选择标记和复制起点。将重组载体转化到黑曲霉宿主细胞中，通过在基本培养基或抗生素上生长以进行阳性选择来选择转化体。转化体在深孔板中培养，培养上清液使用抗β-酪蛋白抗体的ELISA进行分析。如图2所示，当与β-乳球蛋白一起产生为重组融合蛋白时，β-酪蛋白的产量和/或稳定性增加。
实施例3：重组蛋白熔融温度(Tm)的测定
实施例1的重组蛋白的熔融温度(Tm)通过差示扫描量热法(DSC)测定。为此，加热包含重组蛋白的细胞，并将其热分析图与参考样品的热分析图进行比较，以推断对重组蛋白热稳定性的洞察(因为在重组蛋白中的键相互作用(例如非共价键、离子键、范德华力、静水力键)在最终断裂之前会吸收一定量的能量)，并定义重组蛋白的Tm(即热中点转变)。
实施例4：包含重组蛋白单体的聚合物的产生
将实施例1中任一项的重组蛋白与单独的或与其他成分(例如，本文公开的任何其他成分)组合的弱酸(例如，5％乙酸)或碱(例如，5％碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)组合至按质量计量约2％至约18％的重组蛋白最终浓度，约4至约11的最终pH，和大约10ms/cm至大约300mS/cm的最终电导率。将混合物在重组蛋白温和变性(例如，少于20％的重组蛋白变性)的温度和pH下加热20分钟，使得重组蛋白的游离硫醇基蛋白质暴露但现有的分子内二硫键未断裂(例如，在重组蛋白的Tm[如实施例3中所确定]以下10℃至20℃)。然后将混合物冷却至21℃或环境温度。通过离心(例如，以4,000g离心20分钟)、过滤、溶剂萃取、色谱法或其他方法捕获聚合物。将聚合物干燥至仍允许成型的水分含量。成型后，将聚合物进一步干燥以固定最终形状。
实施例5：重组蛋白的挤出
如实施例4中所述加热实施例1中任一项的重组蛋白以获得温和变性的重组蛋白。然后在同向旋转双螺杆挤出机(例如BerstorffZE 25(CL)40D)中，在按重量计10％的甘油和30％的水的存在下，将重组蛋白与按质量计0％、10％或30％的Al2O3复合。其他成分包括TCP和/或偶联剂NZ12(例如，按重量计1％)。在经过调理(60℃ 24小时)直到各自的水分含量达到10-12％之后，将挤出的化合物(以丸剂形式)模塑成ASTM拉伸试验棒(24mm^2横截面)。样品是在优化的加工条件下使用例如DEMAG D25 NC4成型的。注塑样品在23℃和60％相对湿度(RH)下调理至少1周。
实施例6：包含重组蛋白的凝胶的产生
圆柱形(10-mm内径，40-mm长)不锈钢管填充包含按质量计约2％至约18％的重组蛋白的最终pH值为约4至约11的溶液。用橡皮塞塞住管子，用乙烯电工胶带密封，垂直放置在水浴中。如实施例4所述加热溶液以获得温和变性的重组蛋白。将凝胶冷却至室温，然后在4℃下放置过夜，然后从管中取出并切成直径10毫米、厚2毫米的片剂，并在封闭的干燥器中干燥直至片剂达到恒定质量(即在±0.001g以内)。
实施例7：包含重组蛋白的薄膜/片材的产生
如实施例4中所述加热包含按重量计约20％至约40％的实施例1的重组蛋白的溶液以获得轻度变性的重组蛋白。轻度变性的重组蛋白任选地与合成共聚物(例如，聚乙酸乙烯酯[PVAC]、聚乙烯醇[PVA]、聚乙烯吡咯烷酮[PVP])组合。然后将溶液在冰水浴中快速冷却。将溶液在4℃下放置过夜以除去气泡。最后，将溶液浇铸在27x27 cm2玻璃板的中心，然后在环境条件(25℃)下干燥72小时。

Claims (77)

1.一种蛋白质，其中所述蛋白质是具有以下结构的重组蛋白：
(D)(乳蛋白1)-(连接肽1)6-(乳蛋白2)，
或
(E)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)，
或
(F)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)-(连接肽3)-(乳蛋白4)；
其中：
(i)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4、连接肽1、连接肽2和连接肽3通过肽键连接；和
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是包含游离硫醇基的乳蛋白。
2.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(A)，
(ii)乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
3.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(B)，
(ii)乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2和乳蛋白3各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
4.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(B)，
(ii)乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白1和乳蛋白3各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
5.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
6.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白2是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白1、乳蛋白3和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
7.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(A)，和
(ii)乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白。
8.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(B)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
9.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(B)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
10.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白2各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白3和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
11.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
12.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白4各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白2和乳蛋白3各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
13.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，以及
(iii)乳蛋白1和乳蛋白4各自是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
14.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(B)，和
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白。
15.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2和乳蛋白3各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，和
(iii)乳蛋白4是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
16.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白4各自是包含游离硫醇基的乳蛋白，以及
(iii)乳蛋白3是不包含游离硫醇基的乳蛋白。
17.权利要求1的重组蛋白，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，和
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4各自是包含游离硫醇基的乳蛋白。
18.一种重组表达构建体，其由包含启动子序列、任选的分泌信号序列、编码权利要求1至17中任一项的重组蛋白的多核苷酸序列和终止序列的多核苷酸组成；其中所述启动子序列在有义方向上可操作地连接到任选的分泌信号序列和编码重组蛋白的多核苷酸序列，所述任选的分泌信号序列在有义方向上可操作地连接到编码重组蛋白的多核苷酸序列，和一个或多个终止子序列可操作地连接到编码重组蛋白的多核苷酸序列。
19.一种重组载体，其包含权利要求18的重组表达构建体。
20.一种重组宿主细胞，其包含权利要求18的重组表达构建体。
21.权利要求20的重组宿主细胞，其包含两种或更多种权利要求18的重组表达构建体。
22.权利要求20的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞来源于细菌。
23.权利要求20的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞来源于真菌。
24.权利要求23的重组宿主细胞，其中所述真菌是酵母。
25.权利要求23的重组宿主细胞，其中所述真菌是丝状真菌。
26.权利要求20的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞来源于植物。
27.一种用于获得权利要求20的重组宿主细胞的方法，其中所述方法包括获得编码重组蛋白的多核苷酸，或获得权利要求18的重组表达构建体，或获得权利要求19的重组载体；和将所述多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞。
28.一种用于产生权利要求1至17中任一项的重组蛋白的方法，其中所述方法包括在适合产生重组蛋白的条件下在培养基中发酵权利要求20的重组宿主细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述方法还包括纯化所述重组蛋白以获得包含所述重组蛋白的制剂。
30.权利要求29的方法，其中所述制剂包含按质量计纯度大于总蛋白的50％的重组蛋白。
31.一种产生酪蛋白的方法，其中所述方法包括：
a)发酵重组宿主细胞，其能够产生具有以下结构的重组蛋白：
(D)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)，
或
(E)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)，
或
(F)(乳蛋白1)-(连接肽1)-(乳蛋白2)-(连接肽2)-(乳蛋白3)-(连接肽3)-(乳蛋白4)；
其中：
(i)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3、乳蛋白4、连接肽1、连接肽2和连接肽3通过肽键连接，
(ii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白1、乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4中的至少一种是酪蛋白，和
(iv)其中酪蛋白与一种或多种包含蛋白酶的乳蛋白识别或切割序列的连接肽相邻。
32.权利要求31的方法，其中
(i)重组蛋白具有结构(A)，
(ii)乳蛋白1是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白2是酪蛋白，和
(iv)连接肽1包含蛋白酶的识别或切割序列。
33.权利要求31的方法，其中
(v)重组蛋白具有结构(B)，
(vi)乳蛋白1和乳蛋白2中的至少一种是β-乳球蛋白，
(vii)乳蛋白2是酪蛋白，和
(viii)连接肽1和连接肽2包含蛋白酶的识别或切割序列。
34.权利要求31的方法，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白4中的至少一种是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白2和乳蛋白3是酪蛋白，和
(iv)连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶的识别或切割序列。
35.权利要求31的方法，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1和乳蛋白3中的至少一种是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白2和乳蛋白4是酪蛋白，和
(iv)连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶的识别或切割序列。
36.权利要求31的方法，其中
(i)重组蛋白具有结构(C)，
(ii)乳蛋白1是β-乳球蛋白，
(iii)乳蛋白2、乳蛋白3和乳蛋白4为酪蛋白，和
(iv)连接肽1、连接肽2和连接肽3包含蛋白酶的识别或切割序列。
37.权利要求31的方法，其中所述酪蛋白是k-酪蛋白。
38.权利要求31的方法，其中所述酪蛋白是b-酪蛋白。
39.权利要求31的方法，其中所述酪蛋白是α-S1-酪蛋白。
40.权利要求31的方法，其中所述酪蛋白是α-S2-酪蛋白。
41.权利要求31的方法，其中所述蛋白酶选自凝乳酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶、GI蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、kex2内切蛋白酶和TEV蛋白酶。
42.权利要求31的方法，其中所述方法还包括用所述蛋白酶切割所述一种或多种包含蛋白酶的识别或切割序列的连接肽，从而释放酪蛋白。
43.权利要求31的方法，其中所述重组宿主细胞来源于细菌。
44.权利要求31的方法，其中所述重组宿主细胞来源于真菌。
45.权利要求31的方法，其中所述真菌是酵母。
46.权利要求31的方法，其中所述真菌是丝状真菌。
47.权利要求31的方法，其中所述重组宿主细胞来源于植物。
48.权利要求47的方法，其中所述植物是大豆。
49.一种聚合物，其中所述聚合物包含蛋白质聚合物，其中所述蛋白质聚合物包含通过二硫键连接的蛋白质单体，和其中所述蛋白质单体包含一种或多种权利要求1至17中任一项的重组蛋白。
50.权利要求49的聚合物，其中所述蛋白质单体包含一种重组蛋白。
51.权利要求49的聚合物，其中所述蛋白质单体包含两种或更多种不同的重组蛋白。
52.权利要求49的聚合物，其中所述聚合物基本上不含重组蛋白中包含的乳蛋白以外的任何乳蛋白。
53.权利要求49的聚合物，其中所述聚合物基本上不含来源于石油的组分。
54.一种产生权利要求49的聚合物的方法，其中所述方法包括：
(i)获得一种或多种重组蛋白，和
(ii)使一种或多种重组蛋白温和变性，使得一种或多种重组蛋白中包含的一个或多个游离硫醇基形成一个或多个分子内和/或分子间二硫键。
55.一种组合物，其包含权利要求1至17中任一项的重组蛋白和/或权利要求49至53中任一项的聚合物。
56.权利要求55的组合物，其中所述组合物是食品。
57.权利要求56的组合物，其中所述食品是补充食品。
58.权利要求57的组合物，其中所述补充食品是补充乳制品。
59.权利要求57的组合物，其中所述补充食品是补充动物肉或动物肉制品。
60.权利要求57的组合物，其中所述补充食品是补充蛋或蛋制品。
61.权利要求56的组合物，其中所述食品是替代食品。
62.权利要求61的组合物，其中所述替代食品是替代乳制品。
63.权利要求61的组合物，其中所述替代食品是替代动物肉或动物肉制品。
64.权利要求61的组合物，其中所述替代食品是替代蛋或蛋制品。
65.权利要求55的组合物，其中所述组合物是化妆品或个人护理组合物。
66.权利要求56的组合物，其中所述组合物是薄膜。
67.权利要求56的组合物，其中所述组合物是涂层。
68.权利要求56的组合物，其中所述组合物是喷雾剂。
69.权利要求56的组合物，其中所述组合物是凝胶、纳米凝胶、水凝胶、水纳米凝胶或水凝胶珠。
70.权利要求56的组合物，其中所述组合物是包封物。
71.权利要求56的组合物，其中所述组合物是微球、纳米颗粒、纳米纤丝或纳米管。
72.权利要求56的组合物，其中所述组合物是纳米原纤维。
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