CN116322792A - 含有靶向HER2合成的miRNA的外泌体和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种工程化外泌体，其包含靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA和显露在外泌体膜上用于特异性结合癌细胞上表达的HER2蛋白的配体。

Description

含有靶向HER2合成的miRNA的外泌体和药物组合物
技术领域
本发明涉及一种细胞外囊泡，其含有靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA，特别涉及一种工程化外泌体，其含有靶向HER2 mRNA的miRNA并在外泌体膜上显露HER2结合配体。本发明还涉及一种包含本文公开的细胞外囊泡的药物组合物及其在治疗HER2阳性癌症中的治疗应用。
背景技术
HER2是人类表皮生长因子受体家族的成员之一。HER2蛋白在人乳腺癌细胞的表面高水平表达。许多观察结果支持其在这些细胞的致癌行为中的作用。事实上，用抗体处理HER2阳性细胞被发现能够阻断G1-S细胞周期进程，降低细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E和CDK6的蛋白质水平，以及降低细胞周期蛋白E-CDK2相关激酶活性。施用抗HER2抗体是人类HER2阳性乳腺癌患者的标准治疗方法。
HER2靶向治疗的进展提高了HER2阳性乳腺癌患者的存活。局部疾病的标准治疗方法是化疗和1年的辅助HER2靶向治疗(通常使用抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab))。尽管这种治疗有效，但仍有一部分患者会出现疾病复发；因此，重点放在通过组合不同的HER2靶向药物或延长HER2靶向治疗的持续时间来升级治疗。事实上，双重HER2靶向治疗和延长抗HER2治疗的持续时间，以及抗HER2抗体偶联药物T-DM1的辅助治疗都已被批准用于临床。然而，新出现的证据表明，一些患者并没有从这些额外的治疗中获得足够的益处来抵消相关的毒性和/或成本。
概述
本发明的一方面涉及一种工程化外泌体，其包含靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA。在一些实施方案中，所述工程化外泌体中包含的miRNA的种子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本文的实施例表明，一种旨在靶向HER2 mRNA并通过外泌体递送至HER2阳性细胞的miRNA阻断了HER2的补充，并且实施例中得到的数据还表明，这种miRNA不会影响不表达HER2的细胞。
本发明的另一方面涉及一种工程化外泌体，其包含靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA和显露在外泌体膜上用于特异性结合癌细胞上表达的HER2蛋白的配体。这方面的工程化外泌体通过两步法实现了对HER2的双重靶向。首先，外泌体膜上显露了一种HER2结合肽，其能够特异性进入HER2阳性癌细胞。在第二步中，设计的特异性靶向HER2的miRNA被释放以下调HER2蛋白表达。本文中示出的这方面的工程化外泌体通过全身递送表现出增加的体内抗肿瘤活性。
本发明的另一方面涉及一种治疗HER2阳性癌症的方法，其包含向有此需要的对象施用治疗有效量的如本文公开的任何工程化外泌体。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本文公开的任何工程化外泌体和药学上可接受的载体。
本发明的其他方面和特征从以下详细描述中将是显而易见的。
附图说明
图1：miR-HER2-E1和miR-HER2-E4在SK-OV-3和HEp-2细胞中下调HER2。a.用0.5μg表达miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或非靶向(NT)miRNA的质粒转染的SK-OV-3细胞的HER2蛋白水平的免疫印迹分析。b.相对GAPDH标准化的HER2的条带密度表示SK-OV-3细胞中被量化的相对HER2/GAPDH表达，并被表示为来自三个独立实验的平均值±标准偏差。c.HEp-2细胞用0.5μg表达miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或NT miRNA的质粒和0.2μg编码His标签的HER2的质粒共转染。GAPDH作为加样对照。d.相对GAPDH标准化的HER2的条带密度表示HEp-2细胞中被量化的相对HER2/GAPDH表达，并被表示为来自三个独立实验的平均值±标准偏差。*p<0.05。
图2：含有miR-HER2-E1的外泌体的表征。a.使用针对外泌体标记蛋白Alix、CD9、Annexin V、Flotillin-1和TSG101的抗体对外泌体和细胞进行免疫印迹分析。b.通过Izon的qNano技术(Izon)测量从转染miR-HER2-E1或非靶向(NT)质粒的HEK-293细胞中提取的分离的外泌体的颗粒尺寸分布和数量。c.通过qPCR分析定量纯化的外泌体中的miR-HER2-E1。外泌体miR-HER2-E1的量被量化并相对于18S rRNA的量标准化。报告的数据代表三个独立实验。所有定量数据均表示为平均值±标准偏差。
图3：通过外泌体递送的miR-HER2-E1抑制HER2蛋白积累。用外泌体递送的miR-HER2-E1处理的SK-OV-3和HEp-2细胞中HER2蛋白水平的免疫印迹分析。a.SK-OV-3细胞未经处理(Con)或与指定量的外泌体一起孵育，该外泌体从用miR-HER2-E1或非靶向(NT)miRNA转染的HEK-293细胞中纯化。b.右侧显示的条带强度量化表示SK-OV-3细胞中的相对HER2/GAPDH表达水平。c.用HER2表达质粒转染HEp-2细胞36小时，然后不处理(Con)或与20μg纯化的外泌体一起孵育，所述外泌体由用编码miR-HER2-E1或NT miRNA的质粒转染的HEK-293细胞产生。d.右侧显示的条带强度量化表示HEp-2细胞中的相对HER2/GAPDH表达水平。报告的数据代表三个独立实验。所有定量数据均表示为平均值±标准偏差。*p<0.05，N.S.表示无显著差异。
图4：通过外泌体递送至HER2阳性癌细胞的miR-HER2-E1降低细胞活力。通过CCK8试验测量外泌体递送的miR-HER2-E1对HER2阳性(+)癌细胞(SK-OV-3和HCT116)和HER2阴性(-)细胞(HEp-2和MDA-MB-231)活力的影响。结果表示为与模拟处理的对照(作为100％)相比，细胞活力指数的平均值±标准偏差。在HER2阳性(+)组中，miR-HER2-E1外泌体和模拟处理之间的统计学显著差异用星号表示(**，p<0.01；***，p<0.001)。N.S.表示无显著差异。
图5：外泌体递送的miR-HER2-E1在体内的抗肿瘤功效。每三天对携带SK-OV-3(a)、HCT116(b)或MDA-MB-231(c)肿瘤(每组平均肿瘤大小为90mm3)的裸鼠进行瘤内注射，每次注射10μg纯化的外泌体，共注射6次(用箭头表示)。每三天测量一次肿瘤大小。结果显示为平均肿瘤体积(mm3)±标准偏差(n＝6)。*和***代表与NT exo组相比p<0.05和p<0.001。N.S.表示无显著差异。
图6：293-miR-XS-HER2表达肿瘤细胞表面HER2的配体和靶向HER2的miRNA。a.miR-HER2-E1在稳定细胞系中的积累。从293-miR-XS和293-miR-XS-HER2细胞沉淀和外泌体中分离的miR-HER2-E1被相对18S rRNA的水平标准化量化。b.293-miR-XS和293-miR-XS-HER2外泌体的相对HER2结合亲和力。吸光度读数(OD 450nm)显示在Y轴上。每个结果表示为三个重复的平均值±标准偏差。**p<0.01。
图7：粘附于HER2并表达miR-HER2-E1的外泌体的抗肿瘤功效。BALB/c衍生的裸鼠植入平均体积为80mm3的SK-OV-3肿瘤，静脉注射从亲本HEK-293细胞系(293)、表达miR-HER2-E1的稳定细胞系(293-miR-XS)或具有HER2蛋白配体和miR-HER2-E1共表达的稳定细胞系(293-miR-XS-HER2)纯化的外泌体。每三天以3μg/动物(a)或30μg/动物(b)注射外泌体，总共注射8次(用箭头表示)。每三天测量一次肿瘤大小。结果显示为平均肿瘤体积(mm3)±标准偏差(n＝6)。*和***代表与293-miR-XS组相比p<0.05和p<0.001。
详细说明
定义
要注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“外泌体”被理解为表示一个或多个外泌体。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度与序列共有的匹配或同源位置的数目相关。“不相关的”或“非同源的”序列与本文的其中一个序列共享小于40％的同一性，优选小于25％的同一性。
一个多核苷酸或多核苷酸区域(或一个多肽或多肽区域)与另一个序列具有特定百分数(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，当比对时，在比较的两个序列的该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。
如本文所使用的，术语“连接子”是指含有两个或更多个相同的或不同的核苷酸的核苷酸序列的短片段，其中所述核苷酸选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或紊乱，例如肿瘤的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，缓解症状、减少疾病程度、稳定(即不恶化)肿瘤状态、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、延迟或减慢肿瘤进展、改善或减轻肿瘤状态以及症状消失(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的病人包括那些已经患有肿瘤的人，以及那些容易患有肿瘤的人。
“治疗有效量”是指本发明的外泌体以足以用于如上所述“治疗”的量被施用。在治疗特定个体的疾病或病症中治疗有效的量将取决于疾病的症状和严重程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推断有效剂量。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文的对象优选是人。
如本文所使用的，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”等短语包括受益于施用本发明的用于例如检测、诊断程序和/或治疗的组合物的对象，例如哺乳动物对象。
本发明尤其使用反义寡聚体和类似物用于调节编码HER2的核酸分子的功能或作用。本发明的寡聚物与其靶核酸的杂交通常称为“反义”。因此，被认为包括在本发明的一些优选实施方案的实践中的优选机制在本文是指“反义抑制”。此类反义抑制通常基于寡核苷酸链或区段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或区段被切割、降解或以其他方式使其不可操作。在这方面，目前优选地靶向特定核酸分子及其用于这种反义抑制的功能。
被干扰的RNA的功能可以包括诸如RNA易位至蛋白质翻译位点、RNA易位至细胞内远离RNA合成位点的位点、蛋白质从RNA翻译、RNA的剪接产生一种或多种RNA种类、以及涉及RNA参与或由RNA促进的催化活性或复合物形成。这种干扰靶核酸功能的一个优选结果是调节HER2的表达。在本发明的上下文中，“调节”和“表达调节”意指减少(抑制)编码基因的核酸分子(例如DNA或RNA)的量或水平。mRNA通常是优选的靶核酸。
在本发明的上下文中，“杂交”是指互补的寡聚体链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及氢键，其可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键而配对。杂交可以在不同的情况下发生。
在本发明中，短语“严格的杂交条件”或“严格的条件”是指本发明化合物与其靶序列杂交但与最少数量的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的，并且在本发明的上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚体的性质和组成以及它们被研究的测定法决定。
如本文所使用的，“互补的”是指寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸(寡聚化合物)的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基形成氢键，则所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，然后，寡核苷酸和靶核酸之间氢键的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能够彼此结合成氢键的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够数量的核碱基足够程度的精确配对或互补性，使得在寡核苷酸和靶核酸之间稳定的和特异性的结合的术语。
应理解，在本领域中反义寡聚体的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补即可特异性杂交。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，使得插入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构或发夹结构)。优选本发明的反义化合物与靶核酸内的靶区域具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％的序列互补性，更优选地是它们包含至少90％的序列互补性，甚至更优选地包含它们与被靶向的靶核酸序列内的靶区域至少95％或至少99％的序列互补性。例如，反义寡聚体的20个核碱基中的18个与靶区域互补并因此特异性杂交的反义化合物将代表90％的互补性。在该实施例中，剩余的非互补核碱基可以与互补的核碱基成簇或散布，并且不需要彼此邻接或与互补的核碱基邻接。因此，长度为18个核碱基的反义寡聚体具有4个非互补核碱基，其侧翼为与靶核酸完全互补的两个区域，与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此属于本发明的范围。可以使用本领域已知的BLAST程序(基础的局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定反义化合物与靶核酸的区域的互补百分比。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)键组成的寡核苷酸，以及具有相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。这种修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为其具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力以及在核酸酶存在下增加的稳定性。
如本文所用，术语“microRNA”、“miRNA”或者“miR”是指起转录后调节基因表达的功能的RNA，通常通过结合靶信使RNA(mRNA)转录本的3’非翻译区(3’UTRs)的互补序列，通常导致基因沉默。miRNA通常是小的调节RNA分子，例如长度为21或22个核苷酸。术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用，并且包括其前体(pre-miRNA)和成熟(成熟miRNA)形式。功能miRNA研究的一个主要障碍是对miRNA靶向基因的可靠预测，因为迄今为止定义miRNA靶向识别的规则尚未完善。种子序列对于miRNA与mRNA的结合是必不可少的。种子序列或种子区域是一个保守的七元序列，主要位于miRNA 5′端的2-8位。即使miRNA与其靶mRNA的碱基配对并不完全匹配，“种子序列”也必须完全互补。
如本文所使用的，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合一种或多种抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括任何具有抗原结合生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白质或肽。这样的实施例包括，但不限于，重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。术语抗体还包括在激活时具有抗原结合能力的多肽或多肽复合物。这些多肽或多肽复合物的实施例包括Fab、Fv、scFv和(Fab’)2。
如本文可互换使用的，“HER2阳性肿瘤”或“HER2阳性癌症”是指对促进癌细胞生长的人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白测试呈阳性的肿瘤或癌症。HER2正在成为各种肿瘤类型的基因组信息疗法的有希望的靶点。对于HER2，基因扩增(拷贝数增加)是迄今为止最常见的基因组改变，通常与蛋白质过表达有关。HER2过表达通过与其他ERBB家族成员产生自发受体同源二聚体或异源二聚体，导致激活的致癌下游信号传导，如PI3K/Akt/mTOR和MAPK，促进细胞增殖、存活和血管生成，从而驱动肿瘤发生。特别是，HER2-HER3异源二聚体通过HER3和PI3K的p85亚基之间的直接结合来转导PI3K信号。这些异源二聚体的自发形成随着HER2基因的扩增而增加。HER2分类的算法一直在发展。例如，对于乳腺癌，通过IHC的3+HER2蛋白过表达或通过ISH评估的HER2扩增被认为是HER2阳性，美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院已经制定了详细的解释指南，并且定期更新，在此引入作为参考。
HER2靶向治疗改变了HER2扩增/过表达(HER2阳性)的乳腺癌和胃癌/胃食管癌的结果。有几种疗法被批准用于辅助性和转移性HER2阳性乳腺癌：曲妥珠单抗(转移性和辅助性)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(转移性和辅助性)、拉帕替尼(lapatinib)(转移性)、曲妥珠单抗抗体-药物偶联物(ado-trastuzumab emtansine)(转移性)和来那替尼(neratinib)(辅助性)。曲妥珠单抗还被批准与顺铂(cisplatin)和氟嘧啶(卡培他滨(capecitabine)或5-氟尿嘧啶)组合用于HER2阳性转移性胃/胃食管交界处癌。此外，曲妥珠单抗生物仿制药Trastuzumab-dkst(Ogivri；Mylan)被批准用于曲妥珠单抗标签中包含的所有适应症。
随着许多类型肿瘤基因组分析的增加，人们越来越认识到HER2扩增发生在几种肿瘤类型中，包括唾液癌(3.9％)、阴道癌(3.6％)、膀胱癌(3.6％)、子宫内膜癌(3.4％)、宫颈癌(2.2％)和结直肠癌(1.3％)。
如本文所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。用于药物活性物质的这样的介质和药剂的使用在本领域是公知的。除了与活性成分不相容的任何常规的介质或试剂之外，预期其他介质或试剂可以用于所述治疗组合物中。补充的活性成分也可以并入组合物中。
短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和成分。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域公知的。典型地，这样的组合物被制备为注射剂，无论作为液体溶液或混悬液；也可以制备为适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
携带靶向HER2的miRNA的外泌体
外泌体是平均直径为50-150nm的小的细胞外囊泡。它们作为细胞间通讯的手段。通常，它们由结构蛋白以及所选的蛋白质、miRNA、mRNA和长非编码RNA组成。RNA包含被蛋白质识别的短核苷酸序列，所述蛋白质将其运输至细胞质中并将其包装进外泌体中。外泌体将有效负载从一个细胞运输至另一个细胞。在进入受体细胞后，外泌体有效负载被释放到细胞质中。
在本发明中，提供了一种工程化外泌体，其包含或携带靶向HER2的mRNA的miRNA，用于阻断、减少或消除HER2阳性癌细胞中HER2蛋白的补充。
在一些实施方案中，靶向HER2的mRNA的miRNA的种子序列具有5’-ACTCAAG-3’(SEQID NO.1)、5’-GTGAGAG-3’(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列或其等效物。如上所述，种子序列与HER2的靶mRNA完全互补。种子序列的等效物包括相对于本文提供的序列具有一个或两个核苷酸添加或缺失但仍与HER2的靶mRNA精确互补的核苷酸序列。例如，种子序列的等效物可以是在本文提供的种子序列的5'-或3'-末端缺少或添加一个核苷酸的六元(hexa-)或八元(octa-metrical)序列。靶向HER2的mRNA的miRNA可以共享相同的种子序列，例如如本文SEQID NO.1所示的，但在miRNA的整个长度上可以变化很大，无论是前体还是成熟的miRNA。它们都在本发明的范围内。
在优选的实施方案中，靶向HER2的mRNA的miRNA的种子序列可操作地连接至外泌体基序以促进或增强miRNA包装进外泌体中。术语“可操作地连接”是指调节序列(例如外泌体基序)和核酸序列(例如miRNA的种子序列)之间的功能性连接，导致增强或促进miRNA包装进外泌体中。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。可操作地连接的RNA序列可以彼此邻接，也可以通过连接子连接。
外泌体基序优选地位于miRNA的种子序列的下游，连续地或通过连接子。在一个实施方案中，外泌体基序通过二聚核苷酸连接子位于靶向HER2的mRNA的miRNA的种子序列的下游。适用于本发明的外泌体基序的序列没有限制。例如，适用于本发明的外泌体基序具有-GGAG-(SEQ ID NO.11)、-GGAGGAG-(SEQ ID NO.12)的序列或其等效物。适用于本发明的示例性等效外泌体基序在WO 2020/132946中进行了描述，其通过引用整体并入本文。
除了种子序列和外泌体基序之外，本发明的miRNA还包括另外的核酸序列以促进与HER2的mRNA的靶区域的结合。这些另外的核酸通常位于外泌体基序的下游，具有几个核苷酸的长度，例如1至10个核苷酸。另外的核酸序列优选与靶mRNA的相应区段互补，但是，如上所述，不一定是完全互补的。
每个成熟的miRNA都由前体转录本(pre-miRNA)产生。pre-miRNA从细胞核迁移到细胞质后，被称为DICER的酶切割成成熟的miRNA。然后成熟的miRNA分子与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，该复合物包含多种蛋白质，包括一种核糖核酸酶。miRNA核苷酸序列指导蛋白质复合物与mRNA的互补序列结合。一旦与mRNA结合，miRNA-RISC复合物酶促地切割mRNA分子上的靶向位点，从而抑制基因向蛋白质的翻译，从而有效地使基因沉默。
在一些实施方案中，本发明的miRNA的成熟形式具有如本文提供的序列表中所列出的SEQ ID NO 3至6中任一个所示的核苷酸序列，或其等效物。在一些实施方案中，本发明的miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO 5、6所示的核苷酸序列或其等效物。成熟的miRNA可以在成熟的miRNA的序列的3'端包括上述外泌体基序。在一些实施方案中，外泌体基序被整合到本发明的前体或成熟miRNA的序列中并形成其一部分。
在一些实施方案中，本发明的成熟miRNA的前体(pre-miRNA)具有如SEQ ID NO 7至10中任一个所示的核苷酸序列或其等效物。在一些实施方案中，本发明的miRNA的前体(pre-miRNA)具有如SEQ ID NO 9、10所示的核苷酸序列或其等效物。应当理解，如上所述，靶向HER2的pre-miRNA虽然具有相同的种子序列和/或它们被切割成相同的成熟miRNA但它们的长度和核苷酸组成可能会有所不同。本发明设想了这些pre-miRNA。
本发明的外泌体包含靶向HER2的mRNA的pre-miRNA，以及其成熟的miRNA和种子序列。miRNA转移到外泌体中的方法是在本领域中可获得的，例如如实施例中所述的通过用miRNA表达载体和编码HER2的质粒共转染细胞。外泌体的分离、鉴定或表征在本领域中技术上是可行的。几种蛋白质，例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白(Annexin)、Flotillin等能够被用作外泌体的标记物。将miRNA包装进外泌体中的其他方法也适用于本发明。
HER2双靶向外泌体
本发明的另一方面涉及一种HER2双靶向外泌体，其携带在外泌体内的靶向HER2mRNA的miRNA和显露在外泌体膜上的靶向癌细胞表面上的HER2蛋白的配体。本发明的HER2双靶向外泌体通过外泌体膜上显露的配体与HER2蛋白的结合引导工程化外泌体接近或靠近表达HER2蛋白的阳性癌细胞，然后进入HER2阳性癌细胞并释放miRNA货物以下调癌细胞内HER2蛋白的表达。
本发明的HER2双靶向外泌体所携带的靶向HER2 mRNA的miRNA参考如上文所述的携带靶向HER2的miRNA的外泌体。在此基础上，外泌体被进一步工程化以显露与HER2阳性癌细胞上表达的HER2蛋白结合的配体。
在一些实施方案中，配体是对HER2具有亲和力的肽，优选地对HER2蛋白具有特异性。本发明的合适配体可以是例如抗HER2抗体的片段，例如抗HER2单克隆抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗HER2抗体的片段选自Fab、Fv、scFv和F(ab')2。合适的抗HER2抗体是FDA批准的那些，即曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。此外，预期研究的抗HER2单克隆抗体的片段(例如MacroGenics,Inc的Margetuximab)将能够被用于本发明。
在外泌体的膜上显露肽配体的方法已经在市场上可获得，例如由SystemBiosciences(SBI)开发的XStampTM技术。
方法与疗法
本发明的另一方面提供一种在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包含向所述对象施用治疗有效量的本文所述的工程化外泌体。
在一些实施方案中，在本发明的方法中，外泌体的施用通过向所述对象施用包含所述外泌体的药物组合物来实现。
在某些实施方案中，任何药物组合物被肠胃外地或非胃肠外地施用，例如肿瘤内地、静脉内地、肌肉内地、经由皮肤地或皮内地。在一些实施方案中，任何药物组合物优选地被肿瘤内施用。在一些实施方案中，任何药物组合物优选地被静脉内施用。
考虑到本发明的方法用于治疗各种HER2阳性癌症，包括具有HER2扩增和/或过表达的癌症。在一些实施方案中，本文所述的外泌体被用于治疗依赖HER2存活的癌症。能够根据本发明治疗的HER2阳性肿瘤的实施例包括但不限于乳腺癌、胃癌、唾液癌、阴道癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌和结肠直肠癌。
药物组合物
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含本文提供的任何外泌体和药学上可接受的载体。所述药物组合物被用于预防或治疗对象的HER2阳性癌症。
在常规的储存和使用条件下，这些制剂/组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的程度。该形式必须在生产和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染。
载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。在分散的情况下，例如通过使用诸如卵磷脂的包衣维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠或磷酸盐缓冲盐水。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可以使可注射组合物的吸收延长。
对于肠胃外以水溶液施用，例如，溶液应适当地缓冲(如果需要的话)，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。就此而言，根据本发明的内容，能够使用无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000mL的皮下灌注液中，或者在所建议的输注位置注射。
根据所治疗的对象的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责施用的人员将确定用于个体对象的适当剂量。此外，对于人体施用，制剂应满足FDA所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
通过将活性化合物以需要的量与以上列举的各种其它成分按需要合并在合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
序列表
以下是本发明中提到的序列的概述。序列的电子形式被制备并附在本申请中。
Figure BDA0004155559230000121
Figure BDA0004155559230000131
实施例
方法和材料
购买的细胞系：HEp-2细胞系(人喉癌细胞)购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。HEK-293细胞系(人胚肾293细胞)和SK-OV-3细胞系(人卵巢上皮癌细胞)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上海)。HCT116细胞系(人结直肠癌细胞)和MDA-MB-231细胞系(人乳腺癌细胞)由杜军教授(中国广州中山大学)友情提供。HEp-2细胞在补充有5％(vol/vol)胎牛血清(FBS)的DMEM(高葡萄糖)中培养。HEK-293和MDA-MB-231细胞维持在含有10％(vol/vol)FBS的DMEM(高葡萄糖)中。SK-OV-3细胞在补充有10％(vol/vol)FBS的McCoy 5A培养基中培养。所有培养基均含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞在37℃下在含有5％ CO2的湿润气氛中培养。
稳定细胞系的产生：表达靶向HER2的miRNA的稳定细胞系293-miR-HER2是通过将miR-HER2-E1质粒转染到HEK-293细胞中产生的。转染后48小时，通过添加杀稻瘟菌素(Solarbio Life Sciences)至终浓度为6μg/ml来选择细胞。选择具有绿色荧光蛋白(GFP)表达的细胞集落并在具有6μg/ml杀稻瘟菌素的完全培养基中培养。监测细胞系的GFP和miR-HER2-E1的表达。
为了产生能附着至HER2阳性细胞表面的外泌体的细胞系，根据制造商的说明(XStamp技术，SBI：XSTP724PA-1/XSTP710PA-1)，293-miR-HER2细胞要么用慢病毒载体XSTP724PA-1(XStamp HER2配体外泌体HER2受体靶向慢病毒载体)感染，要么用对照慢载体XSTP710PA-1感染。这两种细胞系分别更名为293-miR-XS-HER2和293-miR-XS(对照)。慢病毒载体XSTP724PA-1含有HER2配体的两个拷贝，融合至5'N端信号序列前导序列并在读框内融合至3'C端C1C2 XStamp结构域，其指导整个融合蛋白显露在分泌的外泌体的表面。ELISA证实了从293-miR-XS-HER2细胞纯化的外泌体的HER2结合能力。
抗体：抗HER2(货号#2165S)抗体购自Cell Signaling Technology。抗GAPDH、抗Alix、抗CD9、抗膜联蛋白V、抗Flotillin-1和抗TSG101抗体已在别处被描述了。
质粒构建：靶向HER2基因的miRNA序列使用BLOCK-iTTMRNAi Designer(LifeTechnologies)设计并由Ige Biotechnology(中国广州)合成。合成的miRNA片段用BamHI和XhoI限制酶消化，并克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒(Invitrogen)的相应位点。miRNA的序列如下：miR-HER2-1:5'-AACTCAAGCAGGAAGGAAGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCTTCCTCTGCTTGAGTT-3'(SEQ ID NO.7)miR-HER2-4:5'-TGTGAGAGCCAGCTGGTTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAACCATGGCTCTCACA-3'(SEQ ID NO.8)miR-HER2-E1:5'-AACTCAAGCAGGAAGG AGGAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTCCTCCTCTGCTTGAGTT-3'(SEQ ID NO.9)miR-HER2-E4:5'-TG TGAGAGCCAGCTGGAGGAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTCCTCCATGGCTCTCACA-3'(SEQ ID NO.10)
成熟miRNA的序列加了下划线。miR-HER2-E1和miR-HER2-E4分别是miR-HER2-1和miR-HER2-4的经修饰版本，因为它们包含外泌体基序。
含有HER2基因的3'-UTR序列的HER2表达质粒如下产生。首先，使用以下引物通过PCR扩增带有His标签的HER2编码序列：正向，5’-CCCAAGCTTATGGAGCTGGCGGCCTTGTG-3’(SEQID NO.13)以及反向，5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATCAGTGATGGTGATGGTGATGCACTGGCACGTCCAGACCCAG(SEQ ID NO.14)。
然后将PCR片段亚克隆到pcDNA3.1(+)中的HindIII/NotI位点以生成pHER2-His。3'-UTR序列由Ige Biotechnology(中国广州)合成，用NotI和XbaI限制性内切酶消化并克隆到pHER2-His中的相应位点。
外泌体分离和定量：将接种在T150烧瓶中的HEK-293细胞(1×107)模拟转染或用10μg NT或miR-HER2-E1质粒转染。孵育4小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底冲洗，并在无血清培养基中再孵育48小时。将稳定细胞系的细胞接种在T150烧瓶中24小时，用PBS彻底冲洗并在无血清培养基中再孵育48小时。通过在300×g下离心10分钟以去除细胞，收集含有外泌体的无细胞的细胞外培养基。然后将上清液以10,000×g离心30分钟以去除死细胞和细胞碎片。最后，将澄清的上清液以100,000×g离心70分钟以沉淀外泌体。所有离心步骤均在4℃下进行。对于免疫印迹，沉淀的外泌体重新悬浮在RIPA缓冲液中。为了治疗细胞或小鼠，将沉淀的外泌体重新悬浮在PBS中。根据制造商的说明使用增强型BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)通过BCA方法对外泌体进行定量。
外泌体尺寸分析：使用Izon qNano系统(Izon，基督城，新西兰；www.izon.com)分析外泌体的尺寸分布，该系统使用单分子电泳检测穿过纳米孔的细胞外囊泡。该程序产生了直径范围从75到300nm的外泌体的逐粒子精确计数。具体而言，纯化的外泌体在含有0.05％ Tween 20的PBS中按1：10稀释，剧烈摇晃，并根据制造商的说明使用NP200(A53942)纳米孔孔径进行测量。使用Izon Control Suite软件v3.3(Izon Science)分析结果。
miRNA的定量RT-PCR：根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Thermo FisherScientific)和TRIzol LS试剂(Thermo Fisher Scientific)分离来自细胞和悬浮外泌体的总RNA。按照TaqMan miRNA逆转录试剂盒说明(Applied Biosystems,Inc.)中的说明，使用特定的茎环引物从50ng总RNA中逆转录所测试的miRNA，一式两份。使用从AppliedBiosystems,Inc购买的TaqMan Universal Master Mix II试剂盒，通过实时PCR测量miRNA表达。将miRNA拷贝数相对于细胞内18S rRNA的拷贝数标准化。对miR-HER2-E1特异性的引物由Ige Biotechnology设计并合成。序列如下：
miR-HER2-E1茎环引物，
5’-GTCGGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTC CTCCT-3’(SEQID NO.15)；
正向引物，5’-AACCAAGCAGGAAGGAGG-3’(SEQ ID NO.16)；
反向引物，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.17)；
探针，5’-(6-FAM)TCGCACTGGATACG(MGB)-3’(SEQ ID NO.18)。
质粒转染：SK-OV-3或HEp-2细胞以每孔2.5×105个细胞接种在12孔板中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂(Thermo Fisher Scientific)，用0.5μg表达miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或非靶向(NT)miRNA的质粒转染细胞，或用0.2μg编码His标签的HER2的质粒共转染HEp-2细胞。在转染后72小时收获细胞并用于免疫印迹分析。
外泌体孵育：SK-OV-3细胞以每孔2.5×105个细胞暴露于不同浓度(0.1μg,5μg或20μg)的携带miR-HER2-E1的纯化的外泌体或由转染NT的HEK-293细胞产生的纯化的外泌体或保持不处理(Con)72小时。对于HEp-2细胞，每孔2.5×105的密度，用0.2μg编码His标签的HER2的质粒转染36小时，然后与20μg由编码miR-HER2-E1或NT miRNA的质粒转染的HEK-293细胞产生的纯化的外泌体孵育或继续不治疗36小时。然后收获细胞用于通过免疫印迹分析内源性和外源性HER2表达。
免疫印迹分析：收获细胞沉淀或纯化的外泌体，并用补充有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(1mM；Beyotime)和磷酸酶抑制剂(Beyotime)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime)裂解。细胞裂解物和外泌体在100℃培养箱中加热变性10分钟，通过10％或8％ SDS-PAGE分离并被转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。通过与适当的一抗孵育，然后与HRP偶联的二抗(Pierce)孵育来鉴定蛋白质。使用ECL试剂(Pierce)观察免疫反应，使用ChemiDoc Touch成像系统(Bio-Rad)获取图像并使用Image Lab软件进行分析。使用ImageJ软件量化相应条带的密度。
细胞活力测试：在暴露于外泌体前一天，将SK-OV-3、HCT116、HEp-2和MDA-MB-231细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至96孔板中。对一式三份孔中的细胞进行模拟处理(模拟)或用1μg纯化的外泌体孵育，所述外泌体由用编码miR-HER2-E1或非靶向(NT)miRNA的质粒转染的HEK-293细胞产生。孵育72小时后，根据制造商的方案通过CCK8试验确定相对细胞活力。
动物模型：6-7周龄BALB/c裸鼠购自维通利华实验动物技术有限公司(中国北京)。分别在裸鼠侧腹皮下注射5×106SK-OV-3、HCT116或MDA-MB-231细胞。在外泌体递送的miR-HER2-E1处理中，肿瘤平均体积为90mm3的小鼠每次注射肿瘤内注射含有10μg纯化的外泌体的50μl。每只荷瘤动物在第1、4、7、10、13和16天注射，总共注射6次。在第1、4、7、10、13、16、19和22天测量肿瘤的大小。在外泌体递送的293-miR-XS-HER2处理中，来自BALB/c的裸鼠侧腹皮下注射5×106SK-OV-3细胞。平均80mm3的肿瘤在第1、4、7、10、13、16、19和22天静脉内注射3μg/动物或30μg/动物从293-miR-XS-HER2、293-miR-XS或亲本HEK-293细胞纯化的外泌体。使用卡尺在第1、4、7、10、13、16、19、22、25和28天测量肿瘤的大小，并将体积计算为(长×宽2)×0.5。
ELISA：从293-miR-XS或293-miR-XS-HER2稳定细胞系纯化的外泌体在96孔ELISA板(Corning)的三个平行孔被包被(1μg/孔)。去除包被溶液后，通过与2％ BSA在37℃下孵育1小时来封闭非特异性结合位点。冲洗板，暴露于HER2蛋白(Sino Biological，中国)2小时，再次冲洗，并与HRP偶联的兔抗HER2抗体(货号1004-R205，Sino Biological)再反应1小时。然后再次冲洗板并暴露于TMB来显色。通过加入终止溶液终止反应。在BioTek酶标仪中在450nm的波长读取板。
能够抑制HER2合成的具有外泌体基序的miRNA的设计和鉴定
第一系列实验的目标是设计靶向HER2的miRNA。为此，我们构建了7个miRNA，并选择了在HER2阳性癌细胞系和用编码HER2的质粒转染的细胞系中最有效地阻断HER2合成的miRNA。如材料和方法中所述，将miRNA序列克隆到名为pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg的miRNA表达载体中，位于编码EGFP的开放阅读框下游。
在最初的筛选中，用编码miRNA的质粒转染SK-OV-3(一种高HER2表达的细胞系)和HEp-2(一种用编码HER2的质粒转染的HER2阴性细胞系)。在测试的7种miRNA中，1号和4号miRNA最有效地抑制了HER2在蛋白质水平上的积累。在这些结果的基础上，选择1号和4号miRNA进行进一步研究，并分别命名为miR-HER2-1和miR-HER2-4。
接下来，我们通过添加包含外泌体包装相关基序(外泌体基序)的序列来修饰这两种miRNA。然后在表达HER2的SK-OV-3细胞和HEp-2细胞中重新测试了miR-HER2-E1和miR-HER2-E4的HER2抑制功效。通过免疫印迹分析的蛋白质积累表明，miR-HER2-E1和miR-HER2-E4均能够显著下调SK-OV-3细胞中内源性HER2表达(图1a，b)以及转染HER2质粒的HEp-2细胞中外源性HER2表达(图1c，d)。基于这些结果，我们选择了miR-HER2-E1进行进一步研究。miR-HER2-1、miR-HER2-4、miR-HER2-E1和miR-HER2-E4的序列列于材料和方法中。
包裹miR-HER2-E1的外泌体的产生和表征
在本发明中描述的所有实验中，我们使用由HEK-293细胞产生的外泌体。如下文简要描述的那样研究了这些外泌体的特性。
为了评估外泌体的蛋白质含量，通过免疫印迹分析来自未经处理(293)或用非靶向(NT)或miR-HER2-E1质粒转染的HEK-293细胞的纯化的外泌体。Alix、CD9、Annexin V、Flotillin-1和TSG101被用作外泌体的标记蛋白。正如预期的那样，外泌体相关蛋白存在于来自未经处理的HEK-293、NT miRNA转染和miR-HER2-E1转染的细胞的纯化的外泌体中(图2a)。
为了确定外泌体的尺寸分布，如材料和方法中所述，通过Izon的qNano技术分析从转染miR-HER2-E1的HEK-293细胞纯化的外泌体。结果(图2b)显示，来自HEK-293细胞的外泌体与那些来自转染NT或miR-HER2-E1的细胞的外泌体具有相似的尺寸分布，直径范围为75-150nm。
图2c示出了通过定量PCR(qPCR)测量的成熟miR-HER2-E1的表达水平。正如预期的，在来自转染miR-HER2-E1质粒的HEK-293细胞的外泌体中检测到高水平的成熟miR-HER2-E1，这表明miR-HER2-E1中含有的外泌体基序有助于将miRNA包装进外泌体中。相比之下，从亲本HEK-293细胞和NT miRNA转染的细胞中纯化的外泌体不含有可检测量的miR-HER2-E1。
递送miR-HER2-E1的外泌体减少HER2的积累并降低具有高水平HER2表达的细胞的活力
在这一系列实验中，我们检查了在HEK-293细胞中产生并通过外泌体递送的miR-HER2-E1是否有效地阻止了HER2的积累。我们在下面报告了2个系列的实验。
在第一系列实验中，SK-OV-3细胞被暴露于不同浓度的携带miR-HER2-E1的纯化的外泌体或由NT转染的HEK-293细胞产生的纯化外泌体或不进行处理(Con)。结果表明，暴露于含有miR-HER2-E1的外泌体的SK-OV-3细胞中HER2的积累呈剂量依赖性降低。特别是，当用最高浓度(20μg)的纯化的包裹miR-HER2-E1的外泌体处理时，SK-OV-3细胞中的HER2表达显著降低，而来自NT转染的细胞的外泌体对HER2表达没有影响(图3a，b)。
第二系列实验旨在确定表达miR-HER2-E1的外泌体是否也能抑制外源性HER2的积累。用编码HER2的质粒转染HEp-2细胞，然后将其暴露于上述纯化的外泌体。图3c和d显示外源性HER2的表达在暴露于含有miR-HER2-E1的外泌体的细胞中降低，但在来自NT转染的HEK-293细胞的外泌体中没有降低。
通过外泌体传递的miR-HER2-E1下调HER2表达能够抑制HER2阳性癌细胞的活力
通过阻断HER2阳性的SK-OV-3和HCT116癌细胞以及HER2阴性的MDA-MB-231和HEp-2癌细胞中蛋白质的补充，检验外泌体传递的miR-HER2-E1对HER2依赖性细胞具有杀瘤作用的假设，四种细胞系分别暴露于1μg从转染miR-HER2-E1的HEK-293细胞纯化的外泌体。
通过CCK8试验确定相对细胞活力。结果(图4)如下所示：
(i)相对于用携带NT miRNA的外泌体处理的SK-OV-3细胞，暴露于携带miR-HER2-E1的外泌体的SK-OV-3细胞表现出60％的活力；
(ii)相对于用携带NT miRNA的外泌体处理的HCT116细胞的90％活力，暴露于携带miR-HER2-E1的外泌体的HCT116细胞表现出40％的活力；
(iii)HEp-2和MDA-MB-231细胞(两种类型的HER2阴性细胞)在暴露于携带miR-HER2-E1的外泌体后表现出90-100％的活力。
这些结果表明：(i)由外泌体递送的miR-HER2-E1通过阻断蛋白质的补充，对HER2依赖性细胞具有抗肿瘤作用，以及(ii)miR-HER2-E1不影响不依赖于HER2存活的细胞的活力。
通过体内施用外泌体递送的miR-HER2-E1的抗肿瘤功效
SK-OV-3(HER2阳性)、HCT116(HER2阳性)或MDA-MB-231(HER2阴性)细胞被用作体内研究的肿瘤模型，以评估通过瘤内施用外泌体递送的miR-HER2-E1的抗肿瘤功效。10μg从质粒转染的HEK-293细胞纯化的外泌体每三天进行一次瘤内注射，共注射6次。每三天测量一次肿瘤的大小。结果(图5)表明，携带miR-HER2-E1的外泌体导致SK-OV-3肿瘤(图5a)和HCT116肿瘤(图5b)体积降低，但不会导致HER2阴性的MDA-MB-231肿瘤细胞诱导的肿瘤体积降低(图5c)。这些结果表明，通过外泌体传递的miR-HER2-E1能够在体内干扰HER2表达，并特异性抑制HER2阳性肿瘤生长，这与细胞培养研究中获得的结果一致。
产生HER2双靶向外泌体的稳定细胞系的产生
文中上述实验结果表明，携带miR-HER2-E1的外泌体同时进入HER2阳性和HER2阴性细胞，但最终仅对HER2阳性细胞显示出杀瘤作用。肿瘤是异质的，以及可能包含HER2阳性癌细胞和HER2阴性细胞。尽管我们的研究表明携带靶向HER2的miRNA的外泌体不会影响HER2阴性细胞，但仍然需要增加HER2阳性肿瘤细胞对携带靶向HER2的miRNA的外泌体的摄取。为此，我们用表面肽修饰外泌体，使它们与癌细胞表面的HER2结合。下文所述研究的目的是提高外泌体进入HER2阳性细胞的效率。为了实现这一目标，我们生成了两种旨在产生新的外泌体的细胞系。293-miR-XS-HER2外泌体的表面携带一种肽，使这些外泌体能够粘附至HER2阳性细胞的表面上的HER2。相比之下，293-miR-XS外泌体的表面缺乏HER2粘附肽。miR-HER2-E1被包装进两种类型的外泌体中。两个生成的细胞系的构建和表征的细节如材料和方法中所述。
首先，我们验证了两种细胞系产生的外泌体中存在miR-HER2-E1。如图6a所示，通过分析细胞沉淀和纯化的外泌体确定两种细胞系产生的外泌体均含有成熟的miR-HER2-E1。
接下来，对两种细胞系产生的外泌体进行纯化和ELISA测试，以验证它们粘附至HER2蛋白的能力。如图6b所示，纯化的由293-miR-XS-HER2细胞产生的外泌体优先结合HER2蛋白。结果表明双靶向293-miR-XS-HER2外泌体包装靶向HER2基因的miR-HER2-E1并在其表面显露HER2定向肽，使293-miR-XS-HER2外泌体优先将HER2 miRNA递送至HER2阳性细胞。
携带miR-HER2-E1并粘附至HER2的外泌体的抗肿瘤功效
为了验证HER2双靶向外泌体(293-miR-XS-HER2)与仅HER2单靶向miRNA(293-miR-XS)和非靶向外泌体(293)相比，通过静脉施用在体内是否具有提高的抗肿瘤功效，将HER2阳性肿瘤细胞SK-OV-3移植到BALB/c裸鼠体内。结果表明，与从HEK-293或293-miR-XS细胞纯化的外泌体相比，从293-miR-XS-HER2细胞纯化的外泌体在减少HER2阳性肿瘤的生长方面显著地更有效(图7a和b)。此外，每只小鼠注射3μg和30μg 293-miR-XS-HER2外泌体后肿瘤大小的减小几乎相同，这表明3μg剂量接近或大于对易感细胞显示杀瘤效果所需的剂量。因此，我们显著增强了HER2阳性细胞对携带定向针对HER2的miRNA的外泌体的摄取。
应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选的特征被具体公开，但是对本文所呈现的内容的修改、改进和变化是本领域技术人员容易意识到的，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实施例是优选的实施方案的代表，是示例性的，并非意图作为对本发明范围的限制。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用明确地整体并入本文，其程度如同每个单独地通过引用并入一样。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。本文说明性描述的公开内容可以在缺少本文未具体公开的任何要素、限制的情况下适当地被实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文使用的术语和表达被用作描述性的而非限制性的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在本发明所要求保护的范围内可以进行各种修改。

Claims (28)

1.一种工程化外泌体，其包含靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA和显露在外泌体膜上用于特异性结合癌细胞上表达的HER2蛋白的配体。
2.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的种子序列具有如SEQ IDNO.1或2所示的核苷酸序列或其等效物。
3.根据权利要求2所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的种子序列被可操作地连接至外泌体基序。
4.根据权利要求3所述的工程化外泌体，其中所述外泌体基序位于所述种子序列的下游。
5.根据权利要求3或4所述的工程化外泌体，其中所述外泌体基序具有-GGAG-、-GGAGGAG-的序列或其等效物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.3至6中任一个所示的核苷酸序列或其等效物。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.5或6所示的核苷酸序列或其等效物。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的前体具有如SEQID NO.7至10中任一个所示的核苷酸序列或其等效物。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的前体具有如SEQID NO.9或10所示的核苷酸序列或其等效物。
10.根据权利要求1所述的工程化外泌体，其中所述配体是对所述癌细胞的表面上表达的HER2蛋白具有亲和力的肽。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化外泌体，其中所述配体是特异性结合至所述癌细胞的表面上表达的HER2蛋白的肽。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化外泌体，其中所述配体是抗HER2抗体的片段。
13.根据权利要求12所述的工程化外泌体，其中所述抗HER2抗体的片段选自Fab、Fv、scFv和F(ab')2。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的工程化外泌体，其中所述癌细胞的存活依赖于HER2。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的工程化外泌体，其中所述癌细胞具有HER2的过表达或扩增。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化外泌体，其中所述癌细胞选自乳腺癌、胃癌、唾液癌、阴道癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌和结肠直肠癌细胞。
17.一种工程化外泌体，其包含靶向人表皮生长因子受体2(HER2)合成的miRNA，其中所述miRNA的种子序列具有如SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列或其等效物。
18.根据权利要求17所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的种子序列被可操作地连接至外泌体基序。
19.根据权利要求18所述的工程化外泌体，其中所述外泌体基序位于所述种子序列的下游。
20.根据权利要求18或19所述的工程化外泌体，其中所述外泌体基序具有-GGAG-、-GGAGGAG-的序列或其等效物。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.3至6中任一个所示的核苷酸序列或其等效物。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.5或6所示的核苷酸序列或其等效物。
23.根据权利要求17至20中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的前体具有如SEQ ID NO.7至10中任一个所示的核苷酸序列或其等效物。
24.根据权利要求17至20中任一项所述的工程化外泌体，其中所述miRNA的前体具有如SEQ ID NO.9或10所示的核苷酸序列或其等效物。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的工程化外泌体，其中所述外泌体源自HEK-293细胞。
26.一种药物组合物，其包含权利要求1至25中任一项所述的工程化外泌体和药学上可接受的载体.
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成可注射形式。
28.根据权利要求26或27所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于静脉内施用。
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