TW202216742A - 含有靶向ＨＥＲ２合成的ｍｉＲＮＡｓ的外泌體及醫藥組合物 - Google Patents

含有靶向ＨＥＲ２合成的ｍｉＲＮＡｓ的外泌體及醫藥組合物 Download PDF

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Abstract

本發明公開一種工程化外泌體，其包含一靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA和一顯露在該外泌體膜上用於特異性結合癌細胞上表現HER2蛋白的配體。

Description

含有靶向HER2合成的miRNAs的外泌體和醫藥組合物
本發明係關於一種細胞外囊泡，其含有靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA，特別涉及一種工程化外泌體，其含有靶向HER2 mRNA的miRNA並在外泌體膜上顯露HER2結合配體。本發明還關於一種包含本文公開的細胞外囊泡的醫藥組合物及其在治療HER2陽性癌症中的治療應用。
HER2是人類表皮生長因子受體家族的成員之一。HER2蛋白在人類乳癌細胞的表面高水平表現。許多觀察結果支持其在這些細胞的致癌行為中的作用。事實上，用抗體處理HER2陽性細胞被發現能夠阻斷G1-S細胞週期進程，降低細胞週期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞週期蛋白E和CDK6的蛋白質水平，以及降低細胞週期蛋白E-CDK2相關激酶活性。抗HER2抗體的施用是人類HER2陽性乳癌患者的標準治療方法。
HER2靶向治療的進展提高了HER2陽性乳癌患者的存活。局部疾病的標準治療方法是化療和1年的輔助HER2靶向治療(通常使用抗HER2抗體曲妥珠單抗(trastuzumab))。儘管這種治療有效，但仍有一部分患者會出現疾病復發；因此，重點放在透過組合不同的HER2靶向藥物 或延長HER2靶向治療的持續時間來升級治療。事實上，雙重HER2靶向治療和延長抗HER2治療的持續時間，以及抗HER2抗體共軛藥物T-DM1的輔助治療都已被批准用於臨床。然而，新出現的證據表明，一些患者並沒有從這些額外的治療中獲得足夠益處來抵消相關的毒性及/或成本。
定義
要注意的是，術語「一」或「一個」實體是指該實體中的一個或多個；例如，「外泌體」被理解為表示一個或多個外泌體。因此，術語「一(或一個)」、「一個或多個」和「至少一個」可以在本文中互換使用。
「同源性」或「同一性」或「相似性」是指兩個胜肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。可以透過比較每個序列中為比較目的而比對的位置來確定同源性。當比較序列中的位置被相同鹼基或胺基酸佔據時，那麼分子在該位置是同源的。序列之間的同源程度與序列共有匹配或同源位置的數目相關。「不相關的」或「非同源的」序列與本文的其中一個序列共享小於40%的同一性，優選小於25%的同一性。
一個多核苷酸或多核苷酸區域(或一個多肽或多肽區域)與另一個序列具有特定百分比(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的「序列同一性」是指，當比對時，在比較的兩個序列的該鹼基(或胺基酸)的百分比是相同的。這種比對和百分比同源性或序列同一性可以使用本領域已知的軟體程式來確定。
如本文所使用的，術語「連接子」是指含有兩個或更多個相同或不同核苷酸的核苷酸序列的短片段，其中所述核苷酸選自腺嘌呤(A)、 鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
如本文所使用的，術語「治療」是指治療性治療和預防的或預防性措施，目的是預防或減緩(減輕)不希望的生理變化或病症，例如腫瘤的進展。有益的或期望的臨床結果包括，但不限於，緩解症狀、減少疾病程度、穩定(即不惡化)腫瘤狀態、抑制腫瘤生長、減小腫瘤體積、延遲或減慢腫瘤進展、改善或減輕腫瘤狀態以及症狀消失(無論是部分還是全部)，無論是可檢測的還是不可檢測的。需要治療的病人包括那些已經患有腫瘤的人，以及那些容易患有腫瘤的人。
「治療有效量」是指本發明的外泌體以足以用於如上所述「治療」的量被施用。在治療特定個體的病症或病況中治療有效的量將取決於疾病的症狀和嚴重程度，並且可以透過標準臨床技術來確定。另外，可以任選地採用體外或體內測定來幫助確定最佳劑量範圍。製劑中使用的精確劑量還取決於施用途徑以及疾病或病症的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。可以從體外或動物模型測試系統得出的劑量反應曲線中推斷有效劑量。
「對象」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」是指期望進行診斷、預後或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人、家畜、農場動物和動物園動物、競技動物或寵物，如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本文的對象優選是人。
如本文所使用的，諸如「需要治療的患者」或「需要治療的對象」等片語包括受益於施用本發明的用於例如檢測、診斷程序及/或治療的組合物的對象，例如哺乳動物對象。
本發明尤其使用反義寡聚體和類似物用於調節編碼HER2的核酸分子的功能或作用。本發明的寡聚體與其靶核酸的雜交通常稱為「反義」。因此，被認為包括在本發明的一些優選實施方式的實踐中的優選機制在本文是指「反義抑制」。此類反義抑制通常基於寡核苷酸鏈或區段的基於氫鍵的雜交，使得至少一條鏈或區段被切割、降解或以其他方式使其不可操作。在這方面，目前優選地靶向特定核酸分子及其用於這種反義抑制的功能。
被干擾的RNA功能可以包括諸如RNA易位至蛋白質翻譯位點、RNA易位至細胞內遠離RNA合成位點的位點、蛋白質從RNA翻譯、RNA的剪接產生一種或多種RNA種類、以及涉及RNA參與或由RNA促進的催化活性或複合物形成。這種干擾靶核酸功能的一個優選結果是調節HER2的表現。在本發明的上下文中，「調節」和「表現調節」意指減少(抑制)編碼基因的核酸分子(例如DNA或RNA)的量或水平。mRNA通常是優選的靶核酸。
在本發明的上下文中，「雜交」是指寡聚體的互補鏈的配對。在本發明中，優選的配對機制涉及在寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸鹼基(核鹼基)之間的氫鍵，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補的核鹼基，其透過形成氫鍵而配對。雜交可以在不同的情況下發生。
在本發明中，片語「嚴格的雜交條件」或「嚴格的條件」是指本發明化合物與其靶序列雜交但與最少數量的其他序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的並且在不同情況下是不同的，並且在本發明的上下 文中，寡聚化合物與靶序列雜交的「嚴格條件」是由寡聚體的性質和組成以及它們被研究的測定法決定。
如本文所使用的，「互補的」是指寡聚化合物的兩個核鹼基之間精確配對的能力。例如，如果寡核苷酸(寡聚化合物)的某個位置處的核鹼基能夠與靶核酸的某個位置處的核鹼基形成氫鍵，則所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，然後，寡核苷酸和靶核酸之間氫鍵的位置被認為是互補位置。當每個分子中足夠數量的互補位置被能夠彼此結合成氫鍵的核鹼基佔據時，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補。因此，「特異性雜交的」和「互補的」是用於表示足夠數量的核鹼基足夠程度的精確配對或互補性，使得在寡核苷酸和靶核酸之間穩定的和特異性的結合的術語。
應理解，在本領域中反義寡聚體的序列不需要與其靶核酸的序列100%互補即可特異性雜交。此外，寡核苷酸可以在一個或多個區段上雜交，使得插入或相鄰區段不參與雜交事件(例如環結構或髮夾結構)。優選本發明的反義化合物與靶核酸內的靶區域具有至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%的序列互補性，更優選地是它們包含至少90%的序列互補性，甚至更優選地包含它們與被靶向的靶核酸序列內的靶區域至少95%或至少99%的序列互補性。例如，反義寡聚體的20個核鹼基中的18個與靶區域互補並因此特異性雜交的反義化合物將代表90%的互補性。在該實施例中，剩餘的非互補核鹼基可以與互補的核鹼基成簇或散布，並且不需要彼此鄰接或與互補的核鹼基鄰接。因此，長度為18個核鹼基的反義寡聚體具有4個非互補核鹼基，其側翼為與靶核酸完全互補的兩個區域， 與靶核酸具有77.8%的總體互補性，因此屬於本發明的範圍。可以使用本領域已知的BLAST程式(基礎的局部比對搜索工具)和PowerBLAST程式常規地確定反義化合物與靶核酸的區域的互補百分比。
在本發明的上下文中，術語「寡核苷酸」是指核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或聚合物或其模擬物、嵌合體、類似物和同系物。該術語包括由天然存在的核鹼基、糖和共價核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸，以及具有相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。這種修飾或取代的寡核苷酸通常優於天然形式，因為其具有所需的性質，例如增強的細胞攝取、增強的對靶核酸的親和力以及在核酸酶存在下增加的穩定性。
如本文所用，術語「microRNA」、「miRNA」或者「miR」是指起轉錄後調節基因表現功能的RNA，通常透過結合靶訊息RNA(mRNA)轉錄本的3’非轉譯區(3’UTRs)的互補序列，通常導致基因靜默。miRNA通常是小的調節RNA分子，例如長度為21或22個核苷酸。術語「microRNA」、「miRNA」和「miR」可互換使用，並且包括其前體(pre-miRNA)和成熟(mature miRNA)形式。功能性miRNA研究的一個主要障礙是對miRNA靶向基因的可靠預測，因為迄今為止定義miRNA靶向識別的規則尚未完善。種子序列對於miRNA與mRNA的結合是必不可少的。種子序列或種子區域是一個保守的七元序列，主要位於從miRNA 5'端的2-8的位置。即使miRNA與其靶mRNA的鹼基配對並不完全匹配，「種子序列」也必須完全互補。
如本文所使用的，「抗體」或「抗原結合多肽」是指特異性 識別並結合一種或多種抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，術語「抗體」包括任何具有抗原結合生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白質或胜肽。這樣的實施例包括，但不限於，重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恒定區，框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。術語抗體還包括在啟動時具有抗原結合能力的多肽或多肽複合物。這些多肽或多肽複合物的實施例包括Fab、Fv、scFv和(Fab’)2。
如本文可互換使用的，「HER2陽性腫瘤」或「HER2陽性癌症」是指對促進癌細胞生長的人類表皮生長因子受體2(HER2)蛋白測試呈陽性的腫瘤或癌症。HER2正在成為各種腫瘤類型的基因體資訊療法的有希望的靶點。對於HER2，基因擴增(拷貝數增加)是迄今為止最常見的基因體改變，通常與蛋白質過量表現有關。HER2過量表現透過與其他ERBB家族成員產生自發受體同源二聚體或異源二聚體，導致啟動的致癌下游訊息傳導，如PI3K/Akt/mTOR和MAPK，促進細胞增殖、存活和血管生成，從而驅動腫瘤發生。特別是，HER2-HER3異源二聚體透過HER3和PI3K的p85次單元之間的直接結合來轉換PI3K訊息。這些異源二聚體的自發形成隨著HER2基因的擴增而增加。HER2分類的演算法一直在發展。例如，對於乳癌，透過IHC的3+ HER2蛋白過量表現或透過ISH評估的HER2擴增被認為是HER2陽性，美國臨床腫瘤學會和美國病理學家學院已經制定了詳細的解釋指南，並且定期更新，在此引入作為參考。
HER2靶向治療改變了HER2擴增/過量表現(HER2陽性) 的乳癌和胃癌/胃食管癌的結果。有幾種療法被批准用於輔助性和轉移性HER2陽性乳癌：曲妥珠單抗(轉移性和輔助性)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(轉移性和輔助性)、拉帕替尼(lapatinib)(轉移性)、曲妥珠單抗抗體-藥物偶聯物(ado-trastuzmmab emtansine)(轉移性)和來那替尼(neratinib)(輔助性)。曲妥珠單抗還被批准與順鉑(cisplatin)和氟嘧啶(凱希得平(capecitabine)或5-氟尿嘧啶)組合用於HER2陽性轉移性胃/胃食管交界處癌。此外，曲妥珠單抗生物仿製藥Trastuzumab-dkst(Ogivri；Mylan)被批准用於曲妥珠單抗標籤中包含的所有適應症。
隨著許多類型腫瘤基因體分析的增加，人們越來越認識到HER2擴增發生在幾種腫瘤類型中，包括唾液癌(3.9%)、陰道癌(3.6%)、膀胱癌(3.6%)、子宮內膜癌(3.4%)、子宮頸癌(2.2%)和結腸直腸癌(colorectal cancer)(1.3%)。
如本文所使用的，「載體」包括任何和所有溶劑、分散介質、載劑、包衣、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩衝劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。用於藥物活性物質的這樣的介質和藥劑的使用在本領域是習知的。除了與活性成分不相容的任何常規的介質或藥劑之外，預期其他介質或藥劑可以用於所述治療組合物中。補充的活性成分也可以併入組合物中。
片語「醫藥上可接受的」是指當施用於人時不產生過敏或類似的不良反應的分子實體和成分。含有蛋白質作為活性成分的水性組合物的製備是本領域習知的。典型地，這樣的組合物被製備為注射劑，無論作為液體溶液或懸浮液；也可以製備為適於在注射之前溶解或懸浮於液體中 的固體形式。
攜帶靶向HER2的miRNA的外泌體
外泌體是平均直徑為50-150nm的小的細胞外囊泡。它們作為細胞間通訊的手段。通常，它們由結構蛋白以及所選的蛋白質、miRNA、mRNA和長非編碼RNA組成。RNA包含被蛋白質識別的短核苷酸序列，所述蛋白質將其運輸至細胞質中並將其包裝進外泌體中。外泌體將有效負載從一個細胞運輸至另一個細胞。在進入受體細胞後，外泌體有效負載被釋放到細胞質中。
在本發明中，提供了一種工程化外泌體，其包含或攜帶靶向HER2的mRNA的miRNA，用於阻斷、減少或消除HER2陽性癌細胞中HER2蛋白的補充。
在一些實施方式中，靶向HER2的mRNA的miRNA的種子序列具有5’-ACTCAAG-3’(SEQ ID NO.1)、5’-GTGAGAG-3’(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列或其等效物。如上所述，種子序列與HER2的靶mRNA完全互補。種子序列的等效物包括相對於本文提供的序列具有一個或兩個核苷酸添加或缺失但仍與HER2的靶mRNA精確互補的核苷酸序列。例如，種子序列的等效物可以是在本文提供的種子序列的5’-或3’-末端缺少或添加一個核苷酸的六元(hexa-)或八元(octa-metrical)序列。靶向HER2的mRNA的miRNA可以共用相同的種子序列，例如如本文SEQ ID NO.1所示的，但在miRNA的整個長度上可以變化很大，無論是前體還是成熟的miRNA。它們都在本發明的範圍內。
在優選的實施方式中，靶向HER2的mRNA的miRNA的 種子序列可操作地連接至外泌體基序以促進或增強miRNA包裝進外泌體中。術語「可操作地連接」是指調節序列(例如外泌體基序)和核酸序列(例如miRNA的種子序列)之間的功能性連接，導致增強或促進miRNA包裝進外泌體中。例如，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。可操作地連接的RNA序列可以彼此鄰接，也可以透過連接子連接。
外泌體基序優選地位於miRNA的種子序列的下游，連續地或透過連接子。在一個實施方式中，外泌體基序透過二聚核苷酸連接子位於靶向HER2的mRNA的miRNA的種子序列的下游。適用於本發明的外泌體基序的序列沒有限制。例如，適用於本發明的外泌體基序具有-GGAG-(SEQ ID NO.11)、-GGAGGAG-(SEQ ID NO.12)的序列或其等效物。適用於本發明的示例性等效外泌體基序在WO 2020/132946中進行了描述，其透過引用整體併入本文。
除了種子序列和外泌體基序之外，本發明的miRNA還包括另外的核酸序列以促進與HER2的mRNA的靶區域的結合。這些另外的核酸通常位於外泌體基序的下游，具有幾個核苷酸的長度，例如1至10個核苷酸。另外的核酸序列優選與靶mRNA的相應區段互補，但是，如上所述，不一定是完全互補的。
每個成熟的miRNA都由前體轉錄本(pre-miRNA)產生。pre-miRNA從細胞核遷移到細胞質後，被稱為DICER的酶切割成成熟的miRNA。然後成熟的miRNA分子與RNA誘導的沉默複合物(RISC)結合，該複合物包含多種蛋白質，包括一種核糖核酸酶。miRNA核苷酸序列引導 蛋白質複合物與mRNA的互補序列結合。一旦與mRNA結合，miRNA-RISC複合物就用酵素切割mRNA分子上的靶向位點，從而抑制基因向蛋白質的轉譯，從而有效地使基因沉默。
在一些實施方式中，本發明的miRNA的成熟形式具有如本文提供的序列表中所列出的SEQ ID NO.3至6中任一個所示的核苷酸序列，或其等效物。在一些實施方式中，本發明的miRNA的成熟形式具有如SEQ ID Nos.5、6所示的核苷酸序列或其等效物。成熟的miRNA可以在成熟的miRNA的序列的3’端包括上述外泌體基序。在一些實施方式中，外泌體基序被整合到本發明的前體或成熟miRNA的序列中並形成其一部分。
在一些實施方式中，本發明的成熟miRNA的前體(pre-miRNA)具有如SEQ ID NO.7至10中任一個所示的核苷酸序列或其等效物。在一些實施方式中，本發明的miRNA的前體(pre-miRNA)具有如SEQ ID NO.9、10所示的核苷酸序列或其等效物。應當理解，如上所述，靶向HER2的pre-miRNA雖然具有相同的種子序列和/或它們被切割成相同的成熟miRNA，但它們的長度和核苷酸組成可能會有所不同。本發明設想了這些pre-miRNA。
本發明的外泌體包含靶向HER2的mRNA的pre-miRNA，以及其成熟的miRNA和種子序列。miRNA轉移到外泌體中的方法是在本領域中可獲得的，例如如實施例中所述的透過用miRNA表現載體和編碼HER2的質體共轉染細胞。外泌體的分離、鑒定或特徵在本領域中技術上是可行的。幾種蛋白質，例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜聯蛋白(Annexin)、Flotillin等能夠被用作外泌體的標記物。將miRNA包裝進外泌體中的其他 方法也適用於本發明。
HER2雙靶向外泌體
本發明的另一方面涉及一種HER2雙靶向外泌體，其攜帶在外泌體內的靶向HER2 mRNA的miRNA和顯露在外泌體膜上的靶向癌細胞表面上的HER2蛋白的配體。本發明的HER2雙靶向外泌體透過外泌體膜上顯露的配體與HER2蛋白的結合引導工程化外泌體接近或靠近表現HER2蛋白的陽性癌細胞，然後進入HER2陽性癌細胞並釋放miRNA貨物以下調癌細胞內HER2蛋白的表現。
本發明的HER2雙靶向外泌體所攜帶的靶向HER2 mRNA的miRNA參考如上文所述的攜帶靶向HER2的miRNA的外泌體。在此基礎上，外泌體被進一步工程化以顯露與HER2陽性癌細胞上表現的HER2蛋白結合的配體。
在一些實施方式中，配體是對HER2具有親和力的胜肽，優選地對HER2蛋白具有特異性。本發明的合適配體可以是例如抗HER2抗體的片段，例如抗HER2單株抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中，抗HER2抗體的片段是選自Fab、Fv、scFv和F(ab’)2所組成的群組。合適的抗HER2抗體是FDA批准的那些，即曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。此外，預期研究的抗HER2單株抗體的片段(例如MacroGenics,Inc的Margetuximab)將能夠被用於本發明。
在外泌體的膜上顯露胜肽配體的方法已經在市場上可獲得，例如由System Biosciences(SBI)開發的XStampTM技術。
方法與療法
本發明的另一方面提供一種在有此需要的對象中治療癌症的方法，其包含向所述對象施用治療有效量的本文所述的工程化外泌體。
在一些實施方式中，在本發明的方法中，外泌體的施用透過向所述對象施用包含所述外泌體的醫藥組合物來實現。
在某些實施方式中，任何醫藥組合物被腸胃外地或非胃腸外地施用，例如腫瘤內地、靜脈內地、肌肉內地、經由皮膚地或皮內地。在一些實施方式中，任何醫藥組合物優選地被腫瘤內施用。在一些實施方式中，任何醫藥組合物優選地被靜脈內施用。
考慮到本發明的方法用於治療各種HER2陽性癌症，包括具有HER2擴增和/或過量表現的癌症。在一些實施方式中，本文所述的外泌體被用於治療依賴HER2存活的癌症。能夠根據本發明治療的HER2陽性腫瘤的實施例包括但不限於乳癌、胃癌、唾液癌、陰道癌、膀胱癌、子宮內膜癌、子宮頸癌和結腸直腸癌。
醫藥組合物
本發明的另一方面提供了一種醫藥組合物，其包含本文提供的任何外泌體和醫藥上可接受的載體。所述醫藥組合物被用於預防或治療對象的HER2陽性癌症。
在常規的儲存和使用條件下，這些製劑/組合物包含防腐劑以防止微生物的生長。適用於注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，該形式必須是無菌的，並且必須具有一定的流動性，以達到易於注射的程度。該形式必須在生產和儲存條件下是穩定的，並且必須防止微生物(例如細 菌和真菌)的污染。
載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物及/或植物油。在分散的情況下，例如透過使用諸如卵磷脂的包衣維持所需的粒徑和透過使用表面活性劑來保持適當的流動性。可以透過各種抗細菌劑和抗真菌劑來預防微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，最好包括等滲劑，例如糖、氯化鈉或磷酸鹽緩衝食鹽水。透過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)，可以使可注射組合物的吸收延長。
對於腸胃外以水溶液施用，例如，溶液應適當地緩衝(如果需要的話)，並且首先用足夠的食鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腫瘤內和腹膜內施用。就此而言，根據本發明的內容，能夠使用無菌水性介質將是本領域技術人員已知的。例如，可以將一個劑量溶解在1mL的等滲NaCl溶液中，並且將其添加到1000mL的皮下灌注液中，或者在所建議的輸注位置注射。
根據所治療的對象的狀況，劑量必然會發生一些變化。無論如何，負責施用的人員將確定用於個體對象的適當劑量。此外，對於人體施用，製劑應滿足FDA所要求的無菌性、發熱性(pyrogenicity)、一般安全性和純度標準。
透過將活性化合物以需要的量與以上列舉的各種其它成分按需要合併在合適的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，透過將各種滅菌的活性成分併入含有基礎分散介質和來自上面列舉的所需 其它成分的無菌載體中來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從先前無菌過濾的溶液中產生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
序列表
以下是本發明中提到的序列的概述。序列的電子形式被製備並附在本申請中。
Figure 110139245-A0202-12-0015-1
Figure 110139245-A0202-12-0016-2
本發明的一方面涉及一種工程化外泌體，其包含一靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA。在一些實施方式中，所述工程化外泌體中所含的miRNA，其具有一含有如SEQ ID NO.1或2所示核苷酸序列的種子序列。本文的實施例表明，一種設計成靶向HER2 mRNA並透過外泌體遞送至HER2陽性細胞的miRNA來阻斷HER2的補充，並且實施例中得到的數據還表明，這種miRNA不會影響不表現HER2的細胞。
本發明的另一方面涉及一種工程化外泌體，其包含一靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA和一顯露在該外泌體膜上用於特異性結合癌細胞上表現HER2蛋白的配體。這方面的工程化外泌體透過兩步法實現了對HER2的雙重靶向。首先，外泌體膜上顯露了一種HER2結合胜肽，其能夠特異性進入HER2陽性癌細胞。在第二步中，經設計的特異性靶向HER2的miRNA被釋放以下調HER2蛋白表現。本文中示出這方面的工程化外泌體透過全身遞送表現出增加的體內抗腫瘤活性。
本發明的另一方面涉及一種治療HER2陽性癌症的方法，其包含向有此需要的對象施用一治療有效量的如本文公開的任何工程化外泌體。
本發明的另一方面涉及一種醫藥組合物，其包含本文公開的 任何工程化外泌體和醫藥上可接受的載體。
本發明的其他方面和特色從以下詳細描述中將是顯而易見的。
圖1：miR-HER2-E1和miR-HER2-E4在SK-OV-3和HEp-2細胞中下調HER2。a.用0.5μg表現miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或非靶向(NT)miRNA的質體所轉染的SK-OV-3細胞中HER2蛋白水平的免疫墨點法分析。b.相對GAPDH標準化的HER2的條帶密度表示SK-OV-3細胞中被量化的相對HER2/GAPDH表現，並被表示為來自三個獨立實驗的平均值±標準差。c.HEp-2細胞用0.5μg表現miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或NT miRNA的質體和0.2μg編碼His標籤的HER2質體共轉染。GAPDH作為加樣對照。d.相對GAPDH標準化的HER2的條帶密度表示HEp-2細胞中被量化的相對HER2/GAPDH表現，並被表示為來自三個獨立實驗的平均值±標準差。* p<0.05。
圖2：含有miR-HER2-E1的外泌體的表徵。a.使用針對外泌體標記蛋白Alix、CD9、Annexin V、Flotillin-1和TSG101的抗體對外泌體和細胞進行免疫墨點法分析。b.透過Izon的qNano技術(Izon)測量從轉染miR-HER2-E1或非靶向(NT)質體的HEK-293細胞中萃取分離的外泌體的顆粒尺寸分佈和數量。c.透過qPCR分析定量純化的外泌體中的miR-HER2-E1。外泌體miR-HER2-E1的量被量化並相對於18S rRNA的量標準化。報告的數據代表三個獨立實驗。所有定量數據均表示為平均值±標準差。
圖3：透過外泌體遞送的miR-HER2-E1抑制HER2蛋白累積。用外泌體遞送的miR-HER2-E1處理的SK-OV-3和HEp-2細胞中HER2蛋白水平的免疫墨點法分析。a.SK-OV-3細胞未經處理(Con)或與指定量的外泌體一起孵育，該外泌體從用miR-HER2-E1或非靶向(NT)miRNA轉染的HEK-293細胞中純化。b.右側顯示的條帶強度量化表示SK-OV-3細胞中的相對HER2/GAPDH表現水平。c.用HER2表現質體轉染HEp-2細胞36小時，然後不處理(Con)或與20μg純化的外泌體一起孵育，所述外泌體由用編碼miR-HER2-E1或NT miRNA的質體轉染的HEK-293細胞產生。d.右側顯示的條帶強度量化表示HEp-2細胞中的相對HER2/GAPDH表現水平。報告的數據代表三個獨立實驗。所有定量數據均表示為平均值±標準差。* p<0.05，N.S.表示無顯著差異。
圖4：透過外泌體遞送至HER2陽性癌細胞的miR-HER2-E1降低細胞活力。透過CCK8試驗測量外泌體遞送的miR-HER2-E1對HER2陽性(+)癌細胞(SK-OV-3和HCT116)和HER2陰性(-)細胞(HEp-2和MDA-MB-231)活力的影響。結果表示為與模擬處理的對照(作為100%)相比，細胞活力指數的平均值±標準差。在HER2陽性(+)組中，miR-HER2-E1外泌體和模擬處理之間的統計學顯著差異用星號表示(**，p<0.01；***，p<0.001)。N.S.表示無顯著差異。
圖5：外泌體遞送的miR-HER2-E1在體內的抗腫瘤功效。每三天對攜帶SK-OV-3(a)、HCT116(b)或MDA-MB-231(c)腫瘤(每組平均腫瘤大小為90mm3)的裸鼠進行瘤內注射，每次注射10μg純化的外泌體，共注射6次(用箭頭表示)。每三天測量一次腫瘤大小。結果顯示 為平均腫瘤體積(mm3)±標準差(n=6)。*和***代表與NT exo組相比p<0.05和p<0.001。N.S.表示無顯著差異。
圖6：293-miR-XS-HER2表現腫瘤細胞表面HER2的配體和靶向HER2的miRNA。a.miR-HER2-E1在穩定細胞株中的累積。從293-miR-XS和293-miR-XS-HER2細胞沉澱物和外泌體中分離的miR-HER2-E1被相對18S rRNA的水平標準化量化。b.293-miR-XS和293-miR-XS-HER2外泌體的相對HER2結合親和力。吸光度讀數(OD 450nm)顯示在Y軸上。每個結果表示為三個重複的平均值±標準差。** p<0.01。
圖7：黏附於HER2並表現miR-HER2-E1的外泌體的抗腫瘤功效。BALB/c衍生的裸鼠植入平均體積為80mm3的SK-OV-3腫瘤，靜脈注射從親代HEK-293細胞株(293)、表現miR-HER2-E1的穩定細胞株(293-miR-XS)或具有HER2蛋白配體和miR-HER2-E1共表現的穩定細胞株(293-miR-XS-HER2)純化的外泌體。每三天以3μg/動物(a)或30μg/動物(b)注射外泌體，總共注射8次(用箭頭表示)。每三天測量一次腫瘤大小。結果顯示為平均腫瘤體積(mm3)±標準差(n=6)。*和***代表與293-miR-XS組相比p<0.05和p<0.001。
方法和材料
購買的細胞株：HEp-2細胞株(人類喉癌細胞)購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。HEK-293細胞株(人類胎腎293細胞)和SK-OV-3細胞株(人類卵巢上皮癌細胞)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(中國上海)。HCT116細胞株(人類結腸直腸癌細胞)和 MDA-MB-231細胞株(人類乳癌細胞)由杜軍教授(中國廣州中山大學)友情提供。HEp-2細胞在補充有5%(vol/vol)胎牛血清(FBS)的DMEM(高葡萄糖)中培養。HEK-293和MDA-MB-231細胞維持在含有10%(vol/vol)FBS的DMEM(高葡萄糖)中。SK-OV-3細胞在補充有10%(vol/vol)FBS的McCoy 5A培養基中培養。所有培養基均含有100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素。細胞在37℃下在含有5% CO2的濕潤氣氛中培養。
穩定細胞株的產生：表現靶向HER2的miRNA的穩定細胞株293-miR-HER2是透過將miR-HER2-E1質體轉染到HEK-293細胞中產生的。轉染後48小時，透過添加殺稻瘟菌素(blasticidin)(Solarbio Life Sciences)至最終濃度為6μg/ml來選擇細胞。選擇具有綠色螢光蛋白(GFP)表現的細胞群落並在具有6μg/ml殺稻瘟菌素的完全培養基中培養。監測細胞株的GFP和miR-HER2-E1的表現。
為了產生能附著至HER2陽性細胞表面的外泌體的細胞株，根據製造商的說明(XStamp技術，SBI：XSTP724PA-1/XSTP710PA-1)，293-miR-HER2細胞可用慢病毒載體(lentivector)XSTP724PA-1(XStamp HER2配體外泌體HER2受體靶向慢病毒載體)感染，或用對照慢病毒載體XSTP710PA-1感染。這兩種細胞株分別更名為293-miR-XS-HER2和293-miR-XS(對照)。慢病毒載體XSTP724PA-1含有HER2配體的兩個拷貝，融合至5’ N端訊息序列前導序列並在框架內融合至3’ C端C1C2 XStamp結構域，其引導整個融合蛋白顯露在分泌的外泌體的表面。ELISA證實了從293-miR-XS-HER2細胞純化的外泌體的HER2結合能力。
抗體：抗HER2(貨號#2165S)抗體購自Cell Signaling Technology。抗GAPDH、抗Alix、抗CD9、抗膜聯蛋白V、抗Flotillin-1和抗TSG101抗體已在別處被描述了。
質體構建：靶向HER2基因的miRNA序列使用BLOCK-iTTM RNAi Designer(Life Technologies)設計並由Ige Biotechnology(中國廣州)合成。合成的miRNA片段用BamHI和XhoI限制酶消化，並克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg對照質體(Invitrogen)的相應位點。miRNA的序列如下：
miR-HER2-1：5’-AACTCAAGCAGGAAGGAAGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCTTCCTCTGCTTGAGTT-3’(SEQ ID NO.7)
miR-HER2-4：5’-TGTGAGAGCCAGCTGGTTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAACCATGGCTCTCACA-3’(SEQ ID NO.8)
miR-HER2-E1：5’-AACTCAAGCAGGAAGGAGGAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTCCTCCTCTGCTTGAGTT-3’(SEQ ID NO.9)
miR-HER2-E4：5’-TGTGAGAGCCAGCTGGAGGAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTCCTCCATGGCTCTCACA-3’(SEQ ID NO.10)
成熟miRNA的序列加了底線。miR-HER2-E1和miR-HER2-E4分別是miR-HER2-1和miR-HER2-4的經修飾版本，因為它們包含外泌體基序。
含有HER2基因的3’-UTR序列的HER2表現質體如下產生。首先，使用以下引子透過PCR擴增帶有His標籤的HER2編碼序列：正向，5’-CCCAAGCTTATGGAGCTGGCGGCCTTGTG-3’(SEQ ID NO.13)；以及反向，5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATCAGTGATGGTGATGGTGATGCACTGGCACGTCCAGACCCAG(SEQ ID NO.14)。
然後將PCR片段亞克隆到pcDNA3.1(+)中的HindIII/NotI位點以生成pHER2-His。3’-UTR序列由Ige Biotechnology(中國廣州)合成，用NotI和XbaI限制酶消化並克隆到pHER2-His中的相應位點。
外泌體分離和定量：將接種在T150燒瓶中的HEK-293細胞(1×107)模擬轉染或用10μg NT或miR-HER2-E1質體轉染。孵育4小時後，將細胞用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)徹底沖洗，並在無血清培養基中再孵育48小時。將穩定細胞株的細胞接種在T150燒瓶中24小時，用PBS徹底沖洗並在無血清培養基中再孵育48小時。透過在300×g下離心10分鐘以去除細胞，收集含有外泌體的無細胞的細胞外培養基。然後將上清液以10,000×g離心30分鐘以去除死細胞和細胞碎片。最後，將澄清的上清液以100,000×g離心70分鐘以沉澱外泌體。所有離心步驟均在4℃下進行。對於免疫墨點法，沉澱的外泌體重新懸浮在RIPA緩衝液中。為了治療細胞或小鼠，將沉澱的外泌體重新懸浮在PBS中。根據製造商的說明使用增強型BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime)透過BCA方法對外泌體進行定量。
外泌體尺寸分析：使用Izon qNano系統(Izon，基督城，紐西蘭；www.izon.com)分析外泌體的尺寸分佈，該系統使用單分子電泳檢測穿過奈米孔的細胞外囊泡。該程式產生了直徑範圍從75到300nm的外泌體的逐個粒子精確計數。具體而言，純化的外泌體在含有0.05% Tween 20的PBS中按1：10稀釋，劇烈搖晃，並根據製造商的說明使用NP200(A53942)奈米孔孔徑進行測量。使用Izon Control Suite軟體v3.3(Izon Science)分析結果。
miRNA的定量RT-PCR：根據製造商的說明，使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)和TRIzol LS試劑(Thermo Fisher Scientific)分離來自細胞和懸浮外泌體的總RNA。按照TaqMan miRNA反轉錄試劑盒說明(Applied Biosystems,Inc.)中的說明，使用特定的莖環引子從50ng總RNA中反轉錄所測試的miRNA，一式兩份。使用從Applied Biosystems,Inc購買的TaqMan Universal Master Mix II試劑盒，透過即時PCR測量miRNA表現。將miRNA拷貝數相對於細胞內18S rRNA的拷貝數標準化。對miR-HER2-E1特異性的引子由Ige Biotechnology設計並合成。序列如下：
miR-HER2-E1莖環引子，5’-GTCGGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTCCT-3’(SEQ ID NO.15)；
正向引子，5’-AACCAAGCAGGAAGGAGG-3’(SEQ ID NO.16)；
反向引子，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.17)；
探針，5’-(6-FAM)TCGCACTGGATACG(MGB)-3’(SEQ ID NO.18)。
質體轉染：SK-OV-3或HEp-2細胞以每孔2.5×105個細胞接種在12孔盤中。根據製造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑(Thermo Fisher Scientific)，用0.5μg表現miR-HER2-E1、miR-HER2-E4或非靶向(NT)miRNA的質體轉染細胞，或用0.2μg編碼His標籤的HER2的質體共轉染HEp-2細胞。在轉染後72小時收穫細胞並用於免疫墨點法分析。
外泌體孵育：SK-OV-3細胞以每孔2.5×105個細胞暴露於不同濃度(0.1μg，5μg或20μg)的攜帶miR-HER2-E1的純化的外泌體或由轉染NT的HEK-293細胞產生的純化的外泌體或保持不處理(Con)72小時。對於HEp-2細胞，每孔2.5×105的密度，用0.2μg編碼His標籤的HER2的質體轉染36小時，然後與20μg由編碼miR-HER2-E1或NT miRNA的質體轉染的HEK-293細胞產生的純化的外泌體孵育或繼續不治療36小時。然後收穫細胞用於透過免疫墨點法分析內源性和外源性HER2表現。
免疫墨點法分析：收穫細胞沉澱物或純化的外泌體，並用補充有蛋白酶抑制劑苯肼甲磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(1mM；Beyotime)和磷酸酶抑制劑(Beyotime)的RIPA裂解緩衝液(Beyotime)裂解。細胞裂解物和外泌體在100℃培養箱中加熱變性10分鐘，透過10%或8% SDS-PAGE分離並被轉移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。透過與適當的一級抗體孵育，然後與HRP共軛的二級抗體(Pierce)孵育來鑒定蛋白質。使用ECL試劑(Pierce)觀察免疫反應，使用ChemiDoc Touch成像系統(Bio-Rad)獲取圖像並使用Image Lab軟體進行分析。使用ImageJ軟 體量化相應條帶的密度。
細胞活力測試：在暴露於外泌體前一天，將SK-OV-3、HCT116、HEp-2和MDA-MB-231細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至96孔盤中。對一式三份孔中的細胞進行模擬處理(模擬)或用1μg純化的外泌體孵育，所述外泌體由用編碼miR-HER2-E1或非靶向(NT)miRNA的質體轉染的HEK-293細胞產生。孵育72小時後，根據製造商的步驟準則透過CCK8試驗確定相對細胞活力。
動物模型：6-7周齡BALB/c裸鼠購自維通利華實驗動物技術有限公司(中國北京)。分別在裸鼠側腹皮下注射5×106 SK-OV-3、HCT116或MDA-MB-231細胞。在外泌體遞送的miR-HER2-E1處理中，腫瘤平均體積為90mm3的小鼠每次注射腫瘤內注射含有10μg純化的外泌體的50μl。每隻荷瘤動物在第1、4、7、10、13和16天注射，總共注射6次。在第1、4、7、10、13、16、19和22天測量腫瘤的大小。在外泌體遞送的293-miR-XS-HER2處理中，來自BALB/c的裸鼠側腹皮下注射5×106 SK-OV-3細胞。平均80mm3的腫瘤在第1、4、7、10、13、16、19和22天靜脈內注射3μg/動物或30μg/動物從293-miR-XS-HER2、293-miR- XS或親本HEK-293細胞純化的外泌體。使用卡尺在第1、4、7、10、13、16、19、22、25和28天測量腫瘤的大小，並將體積計算為(長×寬2)×0.5。
ELISA：從293-miR-XS或293-miR-XS-HER2穩定細胞株純化的外泌體在96孔ELISA盤(Corning)的三個平行孔被包覆(1μg/孔)。去除包覆溶液後，透過與2% BSA在37℃下孵育1小時來阻斷非特異性結合位點。沖洗該盤，暴露於HER2蛋白(Sino Biological，中國)2小時， 再次沖洗，並與HRP共軛的兔抗HER2抗體(貨號1004-R205，Sino Biological)再反應1小時。然後再次沖洗該盤並暴露於TMB來顯色。透過加入終止溶液終止反應。在BioTek微盤分析儀中在450nm的波長讀取該盤。
能夠抑制HER2合成的具有外泌體基序的miRNA的設計和鑑定
第一系列實驗的目標是設計靶向HER2的miRNA。為此，我們構建了7個miRNA，並選擇了在HER2陽性癌細胞株和用編碼HER2的質體轉染的細胞株中最有效地阻斷HER2合成的miRNA。如材料和方法中所述，將miRNA序列克隆到名為pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg的miRNA表現載體中，位於編碼EGFP的開放閱讀框下游。
在最初的篩選中，用編碼miRNA的質體轉染SK-OV-3(一種高HER2表現的細胞株)和HEp-2(一種用編碼HER2的質體轉染的HER2陰性細胞株)。在測試的7種miRNA中，1號和4號miRNA最有效地抑制了HER2在蛋白質水平上的累積。在這些結果的基礎上，選擇1號和4號miRNA進行進一步研究，並分別命名為miR-HER2-1和miR-HER2-4。
接下來，我們透過添加包含外泌體包裝相關基序(外泌體基序)的序列來修飾這兩種miRNA。然後在表現HER2的SK-OV-3細胞和HEp-2細胞中重新測試了miR-HER2-E1和miR-HER2-E4的HER2抑制功效。透過免疫墨點法分析的蛋白質累積表明，miR-HER2-E1和miR-HER2-E4均能夠顯著下調SK-OV-3細胞中內源性HER2表現(圖1a，b)以及轉染HER2質體的HEp-2細胞中外源性HER2表現(圖1c，d)。基於這些結果， 我們選擇了miR-HER2-E1進行進一步研究。miR-HER2-1、miR-HER2-4、miR-HER2-E1和miR-HER2-E4的序列列於材料和方法中。
包裹miR-HER2-E1的外泌體的產生和表徵
在本發明中描述的所有實驗中，我們使用由HEK-293細胞產生的外泌體。如下文簡要描述的那樣研究了這些外泌體的特性。
為了評估外泌體的蛋白質含量，透過免疫墨點法分析來自未經處理(293)或用非靶向(NT)或miR-HER2-E1質體轉染的HEK-293細胞的純化的外泌體。Alix、CD9、Annexin V、Flotillin-1和TSG101被用作外泌體的標記蛋白。正如預期的那樣，外泌體相關蛋白存在於來自未經處理的HEK-293、NT miRNA轉染和miR-HER2-E1轉染的細胞的純化的外泌體中(圖2a)。
為了確定外泌體的尺寸分佈，如材料和方法中所述，透過Izon的qNano技術分析從轉染miR-HER2-E1的HEK-293細胞純化的外泌體。結果(圖2b)顯示，來自HEK-293細胞的外泌體與那些來自轉染NT或miR-HER2-E1的細胞的外泌體具有相似的尺寸分佈，直徑範圍為75-150nm。
圖2c示出了透過定量PCR(qPCR)測量的成熟miR-HER2-E1的表現水平。正如預期的，在來自轉染miR-HER2-E1質體的HEK-293細胞的外泌體中檢測到高水平的成熟miR-HER2-E1，這表明miR-HER2-E1中含有的外泌體基序有助於將miRNA包裝進外泌體中。相比之下，從親代HEK-293細胞和NT miRNA轉染的細胞中純化的外泌體不含有可檢測量的miR-HER2-E1。
遞送miR-HER2-E1的外泌體減少HER2的累積並降低具有高水平HER2表現的細胞的活力
在這一系列實驗中，我們檢查了在HEK-293細胞中產生並透過外泌體遞送的miR-HER2-E1是否有效地阻止了HER2的累積。我們在下面報告了2個系列的實驗。
在第一系列實驗中，SK-OV-3細胞被暴露於不同濃度的攜帶miR-HER2-E1的純化的外泌體或由NT轉染的HEK-293細胞產生的純化外泌體或不進行處理(Con)。結果表明，暴露於含有miR-HER2-E1的外泌體的SK-OV-3細胞中HER2的累積呈劑量依賴性降低。特別是，當用最高濃度(20μg)的純化的包裹miR-HER2-E1的外泌體處理時，SK-OV-3細胞中的HER2表現顯著降低，而來自NT轉染的細胞的外泌體對HER2表現沒有影響(圖3a，b)。
第二系列實驗旨在確定表現miR-HER2-E1的外泌體是否也能抑制外源性HER2的累積。用編碼HER2的質體轉染HEp-2細胞，然後將其暴露於上述純化的外泌體。圖3c和d顯示外源性HER2的表現在暴露於含有miR-HER2-E1的外泌體的細胞中降低，但在來自NT轉染的HEK-293細胞的外泌體中沒有降低。
透過外泌體傳遞的miR-HER2-E1下調HER2表現能夠抑制HER2陽性癌細胞的活力
透過阻斷HER2陽性的SK-OV-3和HCT116癌細胞以及HER2陰性的MDA-MB-231和HEp-2癌細胞中蛋白質的補充，檢驗外泌體傳遞的miR-HER2-E1對HER2依賴性細胞具有殺瘤作用的假設，四種細胞 株分別暴露於1μg從轉染miR-HER2-E1的HEK-293細胞純化的外泌體。透過CCK8試驗確定相對細胞活力。結果(圖4)如下所示：
(i)相對於用攜帶NT miRNA的外泌體處理的SK-OV-3細胞，暴露於攜帶miR-HER2-E1的外泌體的SK-OV-3細胞表現出60%的活力；
(ii)相對於用攜帶NT miRNA的外泌體處理的HCT116細胞的90%活力，暴露於攜帶miR-HER2-E1的外泌體的HCT116細胞表現出40%的活力；
(iii)HEp-2和MDA-MB-231細胞(兩種類型的HER2陰性細胞)在暴露於攜帶miR-HER2-E1的外泌體後表現出90-100%的活力。
這些結果表明：(i)由外泌體遞送的miR-HER2-E1透過阻斷蛋白質的補充，對HER2依賴性細胞具有抗腫瘤作用，以及(ii)miR-HER2-E1不影響不依賴於HER2存活的細胞的活力。
透過體內施用外泌體遞送的miR-HER2-E1的抗腫瘤功效
SK-OV-3(HER2陽性)、HCT116(HER2陽性)或MDA-MB-231(HER2陰性)細胞被用作體內研究的腫瘤模型，以評估透過瘤內施用外泌體遞送的miR-HER2-E1的抗腫瘤功效。10μg從質體轉染的HEK-293細胞純化的外泌體每三天進行一次瘤內注射，共注射6次。每三天測量一次腫瘤的大小。結果(圖5)表明，攜帶miR-HER2-E1的外泌體導致SK-OV-3腫瘤(圖5a)和HCT116腫瘤(圖5b)體積降低，但不會導致HER2陰性的MDA-MB-231腫瘤細胞誘導的腫瘤體積降低(圖5c)。這些結果表明，透過外泌體傳遞的miR-HER2-E1能夠在體內干擾HER2表現，並特異性抑制HER2陽性腫瘤生長，這與細胞培養研究中獲得的結果 一致。
產生HER2雙靶向外泌體的穩定細胞株的產生
文中上述實驗結果表明，攜帶miR-HER2-E1的外泌體同時進入HER2陽性和HER2陰性細胞，但最終僅對HER2陽性細胞顯示出殺瘤作用。腫瘤是異質的，以及可能包含HER2陽性癌細胞和HER2陰性細胞。儘管我們的研究表明攜帶靶向HER2的miRNA的外泌體不會影響HER2陰性細胞，但仍然需要增加HER2陽性腫瘤細胞對攜帶靶向HER2的miRNA的外泌體的攝取。為此，我們用表面胜肽修飾外泌體，使它們與癌細胞表面的HER2結合。下文所述研究的目的是提高外泌體進入HER2陽性細胞的效率。為了實現這一目標，我們生成了兩種旨在產生新的外泌體的細胞株。293-miR-XS-HER2外泌體的表面攜帶一種胜肽，使這些外泌體能夠黏附至HER2陽性細胞的表面上的HER2。相比之下，293-miR-XS外泌體的表面缺乏HER2黏附胜肽。miR-HER2-E1被包裝進兩種類型的外泌體中。兩個生成的細胞株的構建和特徵的細節如材料和方法中所述。
首先，我們驗證了兩種細胞株產生的外泌體中存在miR-HER2-E1。如圖6a所示，透過分析細胞沉澱物和純化的外泌體確定兩種細胞株產生的外泌體均含有成熟的miR-HER2-E1。
接下來，對兩種細胞株產生的外泌體進行純化和ELISA測試，以驗證它們黏附至HER2蛋白的能力。如圖6b所示，純化的由293-miR-XS-HER2細胞產生的外泌體優先結合HER2蛋白。結果表明雙靶向293-miR-XS-HER2外泌體包裝靶向HER2基因的miR-HER2-E1並在其表面顯露HER2定向胜肽，使293-miR-XS-HER2外泌體優先將HER2 miRNA遞送至HER2陽性細胞。
攜帶miR-HER2-E1並黏附至HER2的外泌體的抗腫瘤功效
為了驗證HER2雙靶向外泌體(293-miR-XS-HER2)與僅HER2單靶向miRNA(293-miR-XS)和非靶向外泌體(293)相比，透過靜脈施用在體內是否具有提高的抗腫瘤功效，將HER2陽性腫瘤細胞SK-OV-3移植到BALB/c裸鼠體內。結果表明，與從HEK-293或293-miR-XS細胞純化的外泌體相比，從293-miR-XS-HER2細胞純化的外泌體在減少HER2陽性腫瘤的生長方面顯著地更有效(圖7a和b)。此外，每隻小鼠注射3μg和30μg 293-miR-XS-HER2外泌體後腫瘤大小的減小幾乎相同，這表明3μg劑量接近或大於對易感細胞顯示殺瘤效果所需的劑量。因此，我們顯著增強了HER2陽性細胞對攜帶定向針對HER2的miRNA的外泌體的攝取。
應當理解，雖然本發明已經透過優選實施方案和任選的特徵被具體公開，但是對本文所呈現的內容的修改、改進和變化是本領域技術人員容易意識到的，並且這些修改、改進和變化被認為是在本發明的範圍內。本文提供的材料、方法和實施例是優選的實施方案的代表，是示例性的，並非意圖作為對本發明範圍的限制。
本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都透過引用明確地整體併入本文，其程度如同每個單獨地透過引用併入一樣。如果發生衝突，以本說明書(包括定義)為准。本文說明性描述的公開內容可以在缺少本文未具體公開的任何要素、限制的情況下適當地被實施。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應當被廣泛地閱讀而不受限制。另外，本文使用的術語和表現被用作描述性的而非限制性的術 語，並且無意使用這些術語和表現來排除所示和所述特徵的任何等效物或其部分，但應認識到，在本發明所要求保護的範圍內可以進行各種修改。
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<120> 含有靶向HER2合成的miRNAs的外泌體及醫藥組合物
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 種子序列
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<223> 種子序列
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<213> 人工序列
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<223> 成熟miRNA
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<213> 人工序列
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<223> 成熟miRNA
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<213> 人工序列
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<223> 成熟miRNA
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<223> 成熟miRNA
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<223> Pre-miRNA
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<223> Pre-miRNA
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<223> Pre-miRNA
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<223> Pre-miRNA
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<223> 外泌體基序
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<223> 用於HER2 PCR的正向引子
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<213> 人工序列
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<223> 用於HER2 PCR的反向引子
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<223> miR-HER2-E1莖環引子
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<223> miR-HER2-E1正向引子
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<223> miR-HER2-E1反向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> miR-HER2-E1探針
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<221> misc_feature
<223> 6-羧基螢光素(6-FAM)連接至5’末端並且小溝結合物(minor groove binder，MGB)連接至3’末端
<400> 18
Figure 110139245-A0202-12-0038-20

Claims (28)

  1. 一種工程化外泌體，其包含一靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA和一顯露在該外泌體膜上用於特異性結合癌細胞上表現HER2蛋白的配體。
  2. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該miRNA具有一含有如SEQ ID NO.1或2所示核苷酸序列或其等效物的種子序列。
  3. 根據請求項2所述的工程化外泌體，其中該miRNA的種子序列被操作地連接至一外泌體基序。
  4. 根據請求項3所述的工程化外泌體，其中該外泌體基序位於該種子序列的下游。
  5. 根據請求項3或4所述的工程化外泌體，其中該外泌體基序具有-GGAG-、-GGAGGAG-的序列或其等效物。
  6. 根據請求項1至5中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.3至6中任一個所示核苷酸序列或其等效物。
  7. 根據請求項1至5中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.5或6所示核苷酸序列或其等效物。
  8. 根據請求項1至5中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的前體具有如SEQ ID NO.7至10中任一個所示核苷酸序列或其等效物。
  9. 根據請求項1至5中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的前體具有如SEQ ID NO.9或10所示核苷酸序列或其等效物。
  10. 根據請求項1所述的工程化外泌體，其中該配體是對該癌細胞表面上表現的HER2蛋白具有親和力的胜肽。
  11. 根據請求項1至10中任一項所述的工程化外泌體，其中該配體是特異性結合至該癌細胞表面上表現的HER2蛋白的胜肽。
  12. 根據請求項1至10中任一項所述的工程化外泌體，其中該配體是抗HER2抗體的片段。
  13. 根據請求項12所述的工程化外泌體，其中該抗HER2抗體的片段是選自由Fab、Fv、scFv和F(ab’)2所組成的群組。
  14. 根據請求項1至13中任一項所述的工程化外泌體，其中該癌細胞的存活依賴於HER2。
  15. 根據請求項1至14中任一項所述的工程化外泌體，其中該癌細胞具有HER2過量表現或擴增。
  16. 根據請求項1至15中任一項所述的工程化外泌體，其中該癌細胞是選自由乳癌、胃癌、唾液癌、陰道癌、膀胱癌、子宮內膜癌、子宮頸癌和結腸直腸癌的細胞所組成的群組。
  17. 一種工程化外泌體，其包含一靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)合成的miRNA，其中該miRNA具有一含有如SEQ ID NO.1或2所示核苷酸序列或其等效物的種子序列。
  18. 根據請求項17所述的工程化外泌體，其中該miRNA的種子序列被操作地連接至一外泌體基序。
  19. 根據請求項18所述的工程化外泌體，其中該外泌體基序位於該種子序列的下游。
  20. 根據請求項18或19所述的工程化外泌體，其中該外泌體基序具有-GGAG-、-GGAGGAG-的序列或其等效物。
  21. 根據請求項17至20中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.3至6中任一個所示核苷酸序列或其等效物。
  22. 根據請求項17至20中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的成熟形式具有如SEQ ID NO.5或6所示核苷酸序列或其等效物。
  23. 根據請求項17至20中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的前體具有如SEQ ID NO.7至10中任一個所示核苷酸序列或其等效物。
  24. 根據請求項17至20中任一項所述的工程化外泌體，其中該miRNA的前體具有如SEQ ID NO.9或10所示核苷酸序列或其等效物。
  25. 根據請求項17至24中任一項所述的工程化外泌體，其中該外泌體源自HEK-293細胞。
  26. 一種醫藥組合物，其包含請求項1至25中任一項所述的工程化外泌體和一醫藥上可接受的載體。
  27. 根據請求項26所述的醫藥組合物，其中該醫藥組合物被配製成注射形式。
  28. 根據請求項26或27所述的醫藥組合物，其中該醫藥組合物被配製用於靜脈內施用。
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