CN116298327A - 用于诊断脓毒症的标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地说，公开用于诊断脓毒症的标志物及其用途。本发明首次发现血清METRNL可以预测脓毒症患者生存情况，可将METRNL作为预测脓毒症患者生存情况的标志物。将METRNL与PCT联合诊断脓毒症的AUC可达到1，与单独的标志诊断效果相比，METRNL与PCT联合的AUC值和特异性都有显著提高，可完全区分脓毒症患者，是一个理想的脓毒症诊断指标。

Description

用于诊断脓毒症的标志物及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是用于诊断脓毒症的标志物及其用途，涉及检测METRNL蛋白水平的试剂的用途，以及检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂的联合诊断用途。
背景技术
脓毒症是因感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，尽管脓毒症已经得到足够的重视，但其死亡率依然很高。主要原因之一目前并没有快速准确诊断脓毒症的依据，临床缺乏在疾病早期诊断并预测病情的手段。目前脓毒症的诊断仍依据2016年美国重症医学会和欧洲重症医学会共同发布的脓毒症3.0版的诊断标准：感染合并贯续器官衰竭估计(Sequential Organ Failure Assessment，SOFA)评分≥2。疑似的感染需要通过微生物培养确认，非常耗时且存在一定比例的假阴性结果，而SOFA评分涉及6个系统的12个项目，不仅需要实验室检查结果，还需要对临床用药剂量和神经系统进行专科评分。目前脓毒症诊断所需的感染确认和SOFA评分都造成了诊断的困难。疾病的优秀生物标志物用作诊断依据有其天然优势，为了给临床提供准确及时的诊断及病情预测依据，脓毒症的生物标志物一直是研究热点，希望找到一种具有较好敏感性和特异性的生物标志物，能够独立诊断脓毒症，并对脓毒症患者的病情做出预测。数以千计的候选生物标志物被提出并研究，可惜的是，到目前为止并没有任何一种生物标志物具有独立诊断脓毒症的能力。被广泛研究的降钙素原(Procalcitonin，PCT)，作为唯一纳入临床脓毒症诊疗指南的生物标志物，可用于指导抗生素的使用，但并不具有独立诊断的能力。C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)作为传统的炎症筛查指标，其诊断特异性较差。
Meteorin-like(METRNL)是一种脂肪因子，与神经营养因子Meteorin属同一分泌蛋白家族，又名Meteorin-β、Cometin、Subfatin、白细胞介素-41，其氨基酸序列在不同种属间具有较高相似性。METRNL广泛分布于全身各组织器官，尤其在白色脂肪组织和屏障组织例如皮肤、肠道和呼吸道上皮高表达。METRNL从被发现至今，已有多项功能被报道，涉及脂质代谢、动脉粥样硬化、神经营养、损伤修复以及免疫炎症等多个领域。发明人课题组近年来围绕METRNL也开展了多项研究，其中2016年申请的专利：METRNL蛋白或基因在防治脓毒血症方面的应用(申请号2016101431102)，公开在脓毒症模型中，造模小鼠的存活率低于WT小鼠，造模后小鼠的血清METRNL水平显著升高，因此METRNL可做为脓毒症的诊断生物标志物。然而该专利并没有公开METRNL的诊断效能，没有涉及METRNL可否用于预测脓毒症患者生存情况。
现有技术中，关于本发明的将METRNL作为预测脓毒症患者生存情况的标志物，以及将METRNL与PCT联合用于脓毒症的诊断还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供检测METRNL蛋白水平的试剂的用途。
本发明的第二个目的是，提供一种预测脓毒症患者生存情况的试剂盒。
本发明的第三个目的是，提供检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂的用途。
本发明的第四个目的是，提供一种用于诊断脓毒症的试剂盒。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
检测METRNL蛋白水平的试剂的用途，用于制备预测脓毒症患者生存情况的试剂盒或检测试剂。
优选的，所述检测是血清检测。
优选的，所述检测METRNL蛋白水平的试剂是METRNL蛋白的特异性抗体。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种预测脓毒症患者生存情况的试剂盒，所述的试剂盒包含检测METRNL蛋白水平的试剂。
优选的，所述检测是血清检测。
优选的，所述检测METRNL蛋白水平的试剂是METRNL蛋白的特异性抗体。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂的用途，用于制备脓毒症诊断试剂盒或诊断试剂。
优选的，所述检测是血清检测。
优选的，所述检测METRNL蛋白水平的试剂是METRNL蛋白的特异性抗体，所述检测PCT水平的试剂是PCT的特异性抗体。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于诊断脓毒症的试剂盒，包括检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂。
优选的，所述检测METRNL蛋白水平的试剂是METRNL蛋白的特异性抗体，所述检测PCT水平的试剂是PCT的特异性抗体。
本发明优点在于：
1、METRNL与PCT联合诊断脓毒症的AUC可达到1，与单独的标志诊断效果相比，METRNL与PCT联合的AUC值和特异性都有显著提高，可完全区分脓毒症患者。两个标志物联合使用可以有效提高脓毒症的诊断效能，是一个理想的脓毒症诊断指标。
2、首次发现血清METRNL可以预测脓毒症患者生存情况。
附图说明
附图1.脓毒症患者与对照组患者血清METRNL、PCT、CRP水平对比。
附图2.METRNL、PCT、CRP诊断脓毒症的ROC曲线图。
附图3.METRN与PCT联合诊断脓毒症的ROC曲线图。
附图4.脓毒症患者3种标志物与SOFA评分相关性散点图。
附图5.METRNL预测脓毒症患者28天生存情况的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
发明人首先验证脓毒症经典标志物PCT和CRP以及课题组前期探索的标志物METRNL对于脓毒症的诊断效能，显示METRNL、PCT和CRP具有较高的AUC值，但诊断特异性小于或等于0.9，无法完全区分脓毒症患者。在探索血清METRNL对脓毒症患者生存情况的预测能力中，显示血清PCT和CRP标志物无法预测脓毒症患者生存情况。在探索血清METRNL对各类型脓毒症患者的诊断及病情预测效能的过程中，发明人意外发现血清METRNL具有预测脓毒症患者生存情况的潜能，AUC值为0.934，敏感性为1，特异性为0.793。基于此，发明人提出检测METRNL蛋白水平的试剂的用途，用于制备预测脓毒症患者生存情况的试剂盒或检测试剂。依据本发明，可以通过测定患者初诊血清中METRNL蛋白含量来预测脓毒症患者生存情况，任何可以测定血清中METRNL蛋白含量的试剂均可用作检测试剂。血清中METRNL蛋白水平的测定方法包括现有常用的紫外分光光度法、凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝染色法、银染法、免疫学方法等。例如以常规方法制备抗METRNL蛋白的抗体，建立检测METRNL蛋白的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。常规的方法可以是用外源表达的METRNL蛋白或化学合成的METRNL蛋白多肽作为抗原免疫动物试验制备的抗体。所述的抗METRNL蛋白的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。检测METRNL蛋白的定性或定量的方法及配套的试剂或试剂盒，具体是体外检测样本组织中METRNL蛋白的含量是否异常，首先检测待测样本METRNL蛋白的含量，其次是与标准样本的METRNL蛋白的含量进行比较，最后判待测样本中是否存在上调。检测试剂或试剂盒，可以是联酶免疫ELISA试剂盒、化学发光法试剂盒、固态或液态芯片试剂盒，或者根据抗体包被检测抗原的方法制备的其它试剂盒。
此外，发现将标志物METRNL与PCT联合用于脓毒症的诊断可以显著提高诊断效能。将标志物METRNL与PCT联合用于脓毒症的诊断，METRNL与PCT联合诊断脓毒症的AUC可达到1，与单独的标志诊断效果相比，METRNL与PCT联合的AUC值和特异性都有显著提高，可完全区分脓毒症患者。这2个标志物联合使用可以有效提高脓毒症的诊断效能，是一个理想的脓毒症诊断指标。基于此，提出检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂的用途，用于制备脓毒症诊断试剂盒或诊断试剂。
发明人还对临床大型腹部外科手术后的脓毒症数据进行了验证，显示了相同的结果。在诊断脓毒症方面，METRNL的AUC略低于PCT但高于CRP；将METRNL与PCT联合用于脓毒症的诊断，METRNL与PCT联合的AUC值和特异性都有显著提高，可完全区分脓毒症患者。在预测脓毒症患者生存情况方面，血清PCT和CRP无法预测术后脓毒症患者生存情况，血清METRNL具有预测术后脓毒症患者生存情况的潜能，AUC值大于0.9，具有较好的预测效果。
以下结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例METRNL对脓毒症的诊断与病情预测潜能
一、实验方法
(1)研究人群
ICU内脓毒症患者及对照组非脓毒症患者。
(2)纳入及排出标准：
脓毒症组纳入标准：ICU内各类型脓毒症患者。
脓毒症组排除标准：近期发生过脑卒中以及患有溃疡性结肠炎等疾病的患者。
对照组纳入标准：ICU内非脓毒症患者。
对照组排除标准：近期发生过脑卒中以及患有溃疡性结肠炎等疾病的患者。
(3)观察指标：
基本资料：年龄、性别。
主要观察指标：脓毒症组及对照组患者血清METRNL水平。
次要观察指标：脓毒症组患者血清PCT、CRP水平、SOFA评分及28天生存情况，对照组患者血清PCT、CRP水平。
(4)实施过程：
脓毒症组患者样本收集：在诊断为脓毒症后的24h内静脉采血2mL，与患者常规采血同时进行或从已经建立的深静脉导管采血，避免患者接受额外穿刺。采血当日进行SOFA评分，记录28天生存情况。
对照组患者样本收集：在入ICU的24h内静脉采血2mL，与患者常规采血同时进行或从已经建立的深静脉导管采血，避免患者接受额外穿刺。
(5)样本处理：
采血后常温静置2h，2000rpm离心15min获得血清，-80℃保存，血清METRNL水平通过ELISA试剂盒实验室检测，PCT及CRP水平从医院系统中直接获取。
(6)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)
采用各自种属特异性的ELISA试剂盒(Human-DY7867/Mouse-DY6679)检测,实验操作依照说明书进行。标准曲线需满足R2≥0.99。简要操作流程如下所述：将捕获抗体铺于专用96孔板，孵育过夜(12-16h)。洗涤缓冲液洗板3次。加入试剂稀释剂铺板，孵育1h。洗涤缓冲液洗板3次。加入标准品及样品，孵育2h。洗涤缓冲液洗板3次。加入检测抗体，孵育2h。洗涤缓冲液洗板3次。加入链霉亲和素辣根过氧化物酶，避光孵育20min。洗涤缓冲液洗板3次。加入底物溶液铺板，避光孵育20min。加入终止液终止反应。使用酶标仪检测标准品及样品吸光度，检测波长450nm，校正波长540nm。绘制标准曲线，计算样品浓度。
(7)数据的分析与处理
所有的数据都表示为平均值±标准误。数据统计分析软件为SPSS 21。两组数据进行比较：先对数据进行正态性检验，对于符合正态分布的，两独立样本使用独立样本T检验，两相关样本使用配对样本T检验。对于不符合正态分布的，使用非参数检验。使用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)得出的曲线下面积(Area Under ROC Curve，AUC)评估标志物诊断效能，根据约登指数得出截断值及相应敏感性和特异性。使用肯德尔检验和斯皮尔曼检验评估标志物与SOFA评分的相关性。使用Logistic回归分析标志物影响28天生存情况的统计学意义。根据显著性判断标准：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
二、实验结果
(1)脓毒症患者血清METRNL水平升高
脓毒症组共收集35名患者血样，对照组共收集40名患者血样，脓毒症组及对照组患者人口统计学特征如表1所示。为了探索METRNL作为脓毒症诊断标志物的潜能，我们将脓毒症组与对照组的样本进行对比，同时纳入脓毒症经典标志物PCT和CRP以评估标志物效能，3种标志物数值整体分布如表1所示。结果如图1所示，脓毒症患者血清METRNL、PCT、CRP水平均出现升高。
表1脓毒症患者与对照组患者人口统计学信息及3种标志物数值整体分布
Figure BDA0004212946510000071
(2)血清METRNL具有诊断脓毒症的潜能
我们将脓毒症组与对照组样本对比，绘制METRNL、PCT、CRP的ROC曲线(图2)并得出AUC，根据约登指数得出截断值及相应敏感性和特异性，结果如表2所示。METRNL的AUC稍低于PCT但高于CRP(AUC＝0973:0.99:0.926)，表明METRNL诊断效能略逊色于PCT但优于CRP。METRNL、PCT、CRP虽然具有较高的AUC值，但其诊断特异性小于或等于0.9，仍然无法完全区分脓毒症患者。
表2三种标志物诊断脓毒症的AUC、截断值、敏感性、特异性
Figure BDA0004212946510000072
进一步将标志物METRNL与PCT联合，用于脓毒症的诊断，并绘制ROC曲线(图3)并得出AUC，如表3所示。当METRNL与PCT联合诊断脓毒症的AUC可达到1，与单独的标志诊断效果相比，METRNL与PCT联合的AUC值和特异性都有显著提高，可完全区分脓毒症患者。表明这2个标志物联合使用可以有效提高脓毒症的诊断效能，是一个理想的脓毒症诊断指标。
表3联合标志物诊断脓毒症的AUC、敏感性、特异性
Figure BDA0004212946510000081
(3)血清METRNL具有预测脓毒症严重程度
为探索METRNL对脓毒症严重程度的预测潜能，我们将收集到的35名脓毒症患者的临床样本指标与代表疾病严重程度的SOFA评分相关性进行检验。正态性检验结果如表4所示，SOFA评分、METRNL、PCT不符合正态分布，CRP符合正态分布，只能进行非参数检验，3种标志物与SOFA评分的相关性散点图如图4所示，2种非参数检验结果如表5所示，METRNL和PCT与SOFA评分具有相关性，而CRP与SOFA评分无显著相关性，这提示了在本部分临床研究中，METRNL和PCT具有对脓毒症严重程度的预测潜能，而CRP无法预测脓毒症的严重程度。
表4脓毒症样本SOFA评分、血清METRNL、PCT、CRP正态性检验结果
Figure BDA0004212946510000082
表5脓毒症样本METRNL、PCT、CRP与SOFA评分的相关性检验结果
Figure BDA0004212946510000083
(4)血清METRNL具有预测脓毒症28天生存情况的潜能
为探索血清METRNL对脓毒症患者28天生存情况的预测能力，我们将35名脓毒症患者的血清METRNL、PCT、CRP水平与28天生存情况进行Logistic回归分析，结果如表6所示，血清METRNL对脓毒症患者28天生存情况的影响具有统计学意义，提示血清METRNL具有预测脓毒症患者28天生存情况的潜能。血清PCT和CRP对脓毒症患者28天生存情况的影响不具有统计学意义，提示血清PCT和CRP无法预测脓毒症患者28天生存情况。
表6 3种标志物与脓毒症患者28天生存情况的Logistic回归分析结果。
Figure BDA0004212946510000091
将METRNL作为预测脓毒症28天生存情况的指标，绘制METRNL的ROC曲线(图5)并得出AUC，根据约登指数得出截断值及相应敏感性和特异性，结果如表7所示。ROC曲线下的面积AUC取值范围为0.5-1，AUC取值越大代表诊断效果越好，图中的结果显示METRNL作为预测脓毒症28天生存情况的AUC值为0.934,表明METRNL对脓毒症患者生存情况(28天临床结局)的预测具有较高价值。
表7METRNL预测脓毒症患者28天生存情况的AUC、敏感性、特异性
Figure BDA0004212946510000092
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.检测METRNL蛋白水平的试剂的用途，其特征在于，用于制备预测脓毒症患者生存情况的试剂盒或检测试剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测是血清检测。
3.一种预测脓毒症患者生存情况的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测METRNL蛋白水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测是血清检测。
5.检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂的用途，其特征在于，用于制备脓毒症诊断试剂盒或诊断试剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述检测是血清检测。
7.一种用于诊断脓毒症的试剂盒，其特征在于，包括检测METRNL蛋白水平的试剂和检测PCT水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测是血清检测。
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