CN116298227A - 一种检测吸附树脂致敏性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测吸附树脂致敏性的方法，包括如下步骤：获取待激发的RBL‑2H3细胞；将待激发的RBL‑2H3细胞分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，阳性对照组中的物质为阳性对照物，阴性对照组中的物质为缓冲液，标准品对照组中的物质为标准品吸附树脂和缓冲液，待测组中的物质为待测吸附树脂和缓冲液；分别检测各组中β‑氨基己糖苷酶的OD值；若阳性对照组中β‑氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β‑氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，则根据标准品对照组的β‑氨基己糖苷酶的OD值和待测品中β‑氨基己糖苷酶的OD值，确定待测树脂的致敏性。本发明能够对待测吸附树脂的致敏性做出精准的判定。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种检测吸附树脂致敏性的方法。
背景技术
血液净化治疗是将患者的血液引出体外，通过血液净化设备除去血液中的某些致病物质(毒素等)，并将净化后的血液回输至患者体内，以达到净化血液、治疗疾病的目的。过敏反应是血液净化治疗中最常见、危害最大的不良反应之一，其主要是吸附树脂材料中的致敏原对血液中嗜碱性粒细胞产生刺激，引起嗜碱性粒细胞脱颗粒，导致机体产生致敏反应，从而影响血液净化治疗的安全性。因此，检测吸附树脂的致敏性对提高血液净化治疗的安全性具有重要意义。
嗜碱性粒细胞是过敏反应重要的效应细胞之一，过敏反应可引起嗜碱性粒细胞脱颗粒释放过敏介质，从而引起局部或全身过敏症状。目前，根据嗜碱性粒细胞脱颗粒程度作为评估致敏原致敏程度的检测方法多应用于药物、食品等领域，而在吸附树脂领域中，致敏性检测方法不多，这和树脂本身外观的物理特性、材料的吸附特性等因素有关。若直接通过检测嗜碱性细胞脱颗粒释放过敏介质的含量来作为评价吸附树脂致敏程度的指标，可能存在部分已释放的脱颗粒物质被吸附树脂吸附，因此影响检测结果的准确性；若通过染色制片观察法计算细胞脱颗粒率来作为评价吸附树脂致敏程度的指标，会存在将树脂加入到培养皿中时会对细胞产生机械力作用，再用缓冲液冲洗，造成细胞从培养皿中脱落，从而导致计数结果不准确。
目前，尚缺乏一种适用于吸附树脂的致敏性检测方法，为了能够提高血液净化治疗的安全性，有必要提供一种能够对吸附树脂的致敏性进行准确检测的方法。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中没有对吸附树脂的致敏性进行准确检测的方法。
为解决上述问题，本发明提供一种检测吸附树脂致敏性的方法，包括如下步骤：
获取待激发的RBL-2H3细胞；
将所述待激发的RBL-2H3细胞分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，并通过加入不同的物质对各组中待激发的RBL-2H3细胞进行激发，使RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶，其中，所述阳性对照组中的物质为阳性对照物，所述阴性对照组中的物质为缓冲液，所述标准品对照组中的物质为标准品吸附树脂和缓冲液，所述待测组中的物质为待测吸附树脂和缓冲液；
分别检测各组中β-氨基己糖苷酶的OD值；
若所述阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和所述阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，则根据所述标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和所述待测品中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定所述待测树脂的致敏性。
进一步地，所述根据所述标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定所述待测树脂的致敏性，包括：
获取所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，对所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值进行差异显著性检验，获得差异显著性P值；
根据所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值、所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值以及所述差异显著性P值，确定所述待测树脂的致敏性。
进一步地，所述根据所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值、所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值以及所述差异显著性P值，确定所述待测树脂的致敏性，包括：
若所述差异显著性P值≥0.05，则所述待测树脂的致敏性低；
若所述差异显著性P值＜0.05，所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值小于所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则所述待测树脂的致敏性低；所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值大于所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则所述待测树脂的致敏性高。
进一步地，所述标准品对照组中所述标准品吸附树脂和所述缓冲液的用量比小于或者等于1：5，所述待测组中所述待测吸附树脂和所述缓冲液的用量比小于或者等于1：5。
进一步地，所述标准品对照组中所述标准品吸附树脂和所述缓冲液的用量比为1：5，所述待测组中所述待测吸附树脂和所述缓冲液的用量比为1：5。
进一步地，所述阳性对照物为吐温-80，所述缓冲液为PBS。
进一步地，所述阳性对照物中吐温-80的浓度大于或者等于0.4％。
进一步地，各组中所述待激发的RBL-2H3细胞的激发时间为60min。
进一步地，所述分别检测各组中β-氨基己糖苷酶的OD值，包括：
分别收集各组经过激发后的产物，将各组经过激发后的产物在转速为3000rpm条件下离心分离10min，取各组的上清液，检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值。
进一步地，所述获取待激发的RBL-2H3细胞，包括：
用细胞培养板接种RBL-2H3细胞，将所述RBL-2H3细胞培养45h至50h，待所述细胞培养板上所述RBL-2H3细胞长至90％至100％密度时，用缓冲液冲洗所述细胞培养板后，获得所述待激发的RBL-2H3细胞。
本发明所述的检测吸附树脂致敏性的方法，通过设立阳性对照组和阴性对照组，能够对检测过程进行质控，排除外界环境对检测结果的干扰，确保检测环境的稳定性以及检测程序的正常运行，并在检测程序正常运行的情况下，通过将待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值进行对比，以确定待测树脂的致敏性是否在允许的范围内，待测组和标准品对照组中均含有吸附树脂，能够消除吸附树脂的吸附性对检测结果的影响，从而能够提高检测结果的准确性；此外，通过检测β-氨基己糖苷酶的OD值确定待测吸附树脂激发RBL-2H3细胞发生脱颗粒反应的程度，并以此确定待测树脂的致敏性，与染色制片观察法相比，该方法能够避免吸附树脂本身的物理特性使其在加入培养板中时由于机械力作用，造成RBL-2H3细胞脱落影响RBL-2H3细胞计数的准确性，从而影响检测结果的准确性；本发明提供的检测方法，能够对待测吸附树脂的致敏性做出精准的判定，有利于提高吸附树脂在临床使用的安全性，减少血液净化治疗过程中过敏反应的发生。
具体实施方式
本发明提供了一种检测吸附树脂致敏性的方法，该方法能够对吸附树脂的致敏程度进行精确评估，以提高吸附树脂应用于血液净化治疗时的安全性。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
另外，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
此外，本发明虽然对制备中的各步骤进行了如步骤S100、步骤S200、步骤S300等形式的描述，但此描述方式仅为了便于理解，如步骤S100、步骤S200、步骤S300等形式并不表示对各步骤先后顺序的限定。
本发明实施例提供了一种检测吸附树脂致敏性的方法，包括如下步骤：
步骤S100、获取待激发的RBL-2H3细胞。
具体地，步骤S100包括如下步骤：用细胞培养板接种RBL-2H3细胞，将RBL-2H3细胞培养45h至50h，待细胞培养板上RBL-2H3细胞的密度达到90％至100％时，用缓冲液冲洗细胞培养板后，获得待激发的RBL-2H3细胞。较佳地，将RBL-2H3细胞培养48h。
作为一种可选实施方式，细胞培养板可以为12孔板，细胞培养板上RBL-2H3细胞的接种密度可以设定为5×105±10％。
本实施例中，通过在细胞培养板上接种RBL-2H3细胞并培养，能够避免待激发的RBL-2H3细胞在不同的环境下生长，影响检测结果的准确性；培养45h至50h，能保证细胞生长达到90％-100％密度，使后续细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶的含量明显，易于OD值的测定与致敏程度的判断；且将RBL-2H3细胞培养45h至50h能够降低RBL-2H3细胞自发脱颗粒的影响，以提高检测结果的准确性。
步骤S200、将待激发的RBL-2H3细胞分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，并通过加入不同的物质对各组中待激发的RBL-2H3细胞进行激发，使RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶，其中，阳性对照组中的物质为阳性对照物，阴性对照组中的物质为缓冲液，标准品对照组中的物质为标准品吸附树脂和缓冲液，待测组中的物质为待测吸附树脂和缓冲液。
本实施例中，阳性对照物为吐温-80，缓冲液为PBS(磷酸缓冲盐溶液)。
在上述实施例的基础上，阳性对照组为浓度为0.4％至2％的吐温-80，由此，采用浓度为0.4％至2％的吐温-80能够使RBL-2H3细胞脱颗粒完全；较佳地，阳性对照组为浓度为0.4％的吐温-80，在使RBL-2H3细胞脱颗粒完全的基础上，还能够降低吐温-80的用量，以降低检测的成本。
本实施例中，在检测的过程中通过设立阳性对照组和阴性对照组，能够对检测过程进行质控，以排除外界环境对检测结果的干扰，影响检测结果的准确性，从而确保检测环境的稳定性，以及检测程序的正常运行。
本实施例中，标准品吸附树脂和待测吸附树脂可以选自苯乙烯树脂、炭化树脂和纤维素球树脂中的至少一种，其中，标准品吸附树脂和待测吸附树脂的类型相同，标准品吸附树脂是指已上市且通过临床验证的不会造成致敏反应的合格的吸附树脂。
本实施例中，标准品吸附树脂和缓冲液的用量比等于待测吸附树脂和缓冲液的用量比，由此，能够确保标准品对照组和待测组中检测结果的一致性，提高检测结果的准确性。
在上述实施例的基础上，标准品对照组中标准品吸附树脂和缓冲液的用量比小于或者等于1：5，待测组中待测吸附树脂和缓冲液的用量比小于或者等于1：5，由此，吸附树脂和缓冲液的用量在该范围内，能够降低吸附树脂本身的吸附性对检测结果的准确性的影响。
在上述实施例的基础上，标准品对照组中标准品吸附树脂和缓冲液的用量比为1：5，待测组中待测吸附树脂和缓冲液的用量比为1：5，由此，能够降低吸附树脂本身的吸附性对检测结果的准确性的影响，又能够降低检测的成本。
本实施例中，各组中待激发的RBL-2H3细胞的激发时间为60min，由此，通过选择合适的激发时间激发RBL-2H3细胞脱颗粒，既能够保证RBL-2H3细胞脱颗粒完全，又能够避免RBL-2H3细胞脱颗粒不是由于致敏导致而是由于激发时间过长细胞凋亡破裂导致，影响检测结果的准确性。
作为一种可选实施方式，将待激发的RBL-2H3细胞等分为四组，并分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，并通过加入不同的物质对各组中待激发的RBL-2H3细胞进行激发，其中，阳性对照组中加入1ml浓度为0.4％的吐温-80，阴性对照组中加入1ml PBS缓冲液，标准品对照组中加入0.2ml标准品吸附树脂和1ml PBS缓冲液，待测组中加入0.2ml待测吸附树脂和1ml PBS缓冲液，将上述四组置于细胞培养箱中于37℃下培养60min。
本实施例中，在标准品吸附树脂和待测吸附树脂对待激发的RBL-2H3细胞进行激发之前，还需要用PBS缓冲液多次清洗标准品吸附树脂和待测吸附树脂，并将标准品吸附树脂和待测吸附树脂干燥，由此，能够避免标准品吸附树脂和待测吸附树脂中的杂质，影响检测结果的准确性。
步骤S300、分别检测各组中β-氨基己糖苷酶的OD值。
具体地，分别收集上述四组经过激发后的细胞液，将各组细胞液经过离心分离后，取各组的上清液，在2h内检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值，其中，β-氨基己糖苷酶的OD值代表了RBL-2H3细胞脱颗粒释放的β-氨基己糖苷酶的含量。
本实施例中，各组细胞液的离心分离条件为：转速为3000rpm，离心分离时间为10min，在该离心分离条件下进行分离，离心条件不会造成RBL-2H3细胞脱颗粒，测得的细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶不会是由于离心力导致细胞破裂产生的，即对检测结果的准确性几乎没有影响。
步骤S400、若阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，则根据标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和待测品中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定待测树脂的致敏性。
具体地，根据标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和待测品中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定待测树脂的致敏性包括：
获取标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，并对标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值进行差异显著性检验，获得差异显著性检验的结果(即差异显著性P值)，根据差异显著性检验的结果确定待测品树脂的致敏性，其中，可以对标准品对照组和待测组均设置多个(大于或者等于3个)平行样，或者对标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和待测组中β-氨基己糖苷酶的OD值重复测量多次(大于或者等于3次)，以计算标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值。
需要说明的是，差异显著性P值的计算为现有技术，具体可以参照t检验中的双总体检验(独立样本t检验统计量)计算公式计算得到，本实施例中对此不做进一步地限定。
本实施例中，差异显著性检验为t检验，并且检测结果为：
当差异显著性P值≥0.05时，则说明标准品树脂和待测树脂不存在明显的统计学差异，标准品树脂和待测树脂对嗜碱性粒细胞(即RBL-2H3细胞)刺激作用处于同一水平，待测树脂的致敏性低，判断吸附树脂合格；
若差异显著性P值＜0.05时，且待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值小于标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则说明待测树脂对嗜碱性粒细胞的刺激作用小于标准品树脂，待测树脂的致敏性低，判断吸附树脂合格；
待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值大于标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则说明待测树脂对嗜碱性粒细胞的刺激作用大于标准品树脂，待测树脂的致敏性高，判断吸附树脂不合格。
本实施例中，若阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，则说明检测过程的质控合格；若阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值或/和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值不处于预设范围，则说明检测过程的质控不合格，外界环境对检测结果有干扰，影响检测结果的准确性，需要重新进行试验，直至使阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，使检测过程的质控合格。
本实施例中，若阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值高于1.500，则阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围；若阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值低于0.200，则阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围。
本实施例中，通过设立阳性对照组和阴性对照组，能够对检测过程进行质控，排除外界环境对检测结果的干扰，确保检测环境的稳定性以及检测程序的正常运行，并在检测程序正常运行的情况下，通过将待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值进行对比，以确定待测树脂的致敏性是否在允许的范围内；通过对待测组和标准品对照组中吸附树脂与缓冲液的用量比进行限定，能够最大程度降低吸附树脂由于自身吸附特性对已发生过敏反应释放β-氨基己糖苷酶的吸附，使测得的β-氨基己糖苷酶OD值不准确，影响检测结果；并且，待测组和标准品对照组中均含有吸附树脂，能够消除吸附树脂的吸附性对检测结果的影响，从而能够提高检测结果的准确性；此外，通过检测β-氨基己糖苷酶的OD值确定待测吸附树脂激发RBL-2H3细胞发生脱颗粒反应的程度，并以此确定待测树脂的致敏性，与染色制片观察法相比，该方法能够避免吸附树脂本身的物理特性使其在加入培养板中时由于机械力作用，造成RBL-2H3细胞脱落影响RBL-2H3细胞计数的准确性，本实施例中提供的检测方法，能够对待测吸附树脂的致敏性做出精准的判定，有利于提高吸附树脂在临床使用的安全性，减少血液净化治疗过程中过敏反应的发生。
为了对本发明进行进一步详细说明，下面将结合具体实施例对本发明进行进一步说明。本发明中的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本发明中的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市场购买所得。
实施例1
本实施例提供了吐温-80的浓度对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
(1)细胞培养：用细胞培养板(12孔板)接种RBL-2H3细胞，接种密度设定为5×105±10％，将RBL-2H3细胞培养48h，待细胞培养板上RBL-2H3细胞的密度达到90％至100％时，用PBS清洗补贴壁细胞3次，获得待激发RBL-2H3细胞。
(2)将待激发的RBL-2H3细胞等分为6组试验组，设置成五组阳性对照组和一组阴性对照组，阴性对照组中加入1ml PBS缓冲液，五组阳性对照组中分别加入浓度为0.1％的TW-80(即吐温-80)、0.2％的TW-80、0.4％的TW-80、1％的TW-80、2％的TW-80各1ml，每组试验组各设置三组平行样进行检测，加样完成后将细胞培养板置于细胞培养箱中于37℃进行孵育60min。
(3)分别收集上述六组经过激发后的细胞液，将各组细胞液在转速为3000rpm下离心分离10min，取各组的上清液，在2h内检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值，其中，β-氨基己糖苷酶的OD值代表了RBL-2H3细胞脱颗粒释放的β-氨基己糖苷酶的含量。各试验组中β-氨基己糖苷酶的OD值如表1所示。
表1
由表1可以看出，阴性对照组测得的β-氨基己糖苷酶OD值极低，说明经PBS诱导RBL-2H3细胞未发生明显脱颗粒反应，阴性对照确认为良好阴性对照。而阳性对照组中采用吐温-80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶，测得的β-氨基己糖苷酶OD值显著高于阴性对照组，证明吐温-80作为阳性对照物效果良好，能激发RBL-2H3细胞发生明显脱颗粒反应。并且，在阳性对照组中，随着吐温-80的浓度增加，测得的β-氨基己糖苷酶OD值呈现先递增后不变的变化趋势，当吐温-80的浓度在0.1％-0.4％范围内，吐温-80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒产生的β-氨基己糖苷酶含量随吐温-80的浓度增大而增加且变化显著；当吐温-80的浓度在0.4％-2％范围内，吐温-80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒产生的β-氨基己糖苷酶几乎不变，说明在该试验条件下0.4％吐温-80可以使RBL-2H3细胞脱颗粒完全，若持续增加吐温-80的浓度也几乎没有未破裂的RBL-2H3细胞继续发生脱颗粒反应。因此，阳性对照组采用浓度为0.4％的吐温-80，在使RBL-2H3细胞脱颗粒完全的基础上，还能够降低吐温-80的用量，以降低检测的成本。
实施例2
本实施例提供了诱导RBL-2H3细胞脱颗粒的时间对检测结果的影响
(1)细胞培养：用细胞培养板(12孔板)接种RBL-2H3细胞，接种密度设定为5×105±10％，将RBL-2H3细胞培养48h，待细胞培养板上RBL-2H3细胞的密度达到90％至100％时，用PBS清洗补贴壁细胞3次，获得待激发RBL-2H3细胞。
(2)将待激发的RBL-2H3细胞等分为6组试验组，设置成三组阳性对照组和三组阴性对照组，阴性对照组中均加入1ml PBS缓冲液，阳性对照组中均加入1ml浓度为0.4％的TW-80，每组试验组各设置三组平行样进行检测，加样完成后将三组阳性对照组的细胞培养板置于细胞培养箱中于37℃分别孵育30min、60min和90min，并将三组阴性对照组的细胞培养板置于细胞培养箱中于37℃分别孵育30min、60min和90min。
(3)分别收集上述六组经过激发后的细胞液，将各组细胞液在转速为3000rpm下离心分离10min，取各组的上清液，在2h内检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值。各试验组中β-氨基己糖苷酶的OD值如表2所示。
表2
由表2可以看出，在阳性对照组中，30min内RBL-2H3细胞脱颗粒上清液中β-氨基己糖苷酶含量增加较小，说明在0.4％吐温-80诱导30min内RBL-2H3细胞未发生明显脱颗粒反应；30～60min RBL-2H3细胞脱颗粒上清液中β-氨基己糖苷酶含量显著增加，证明在此期间RBL-2H3细胞发生明显脱颗粒反应；60～90min RBL-2H3细胞脱颗粒上清液中β-氨基己糖苷酶含量几乎不变，说明RBL-2H3细胞脱颗粒达饱和，即已全部脱颗粒。阳性对照试验证明在一定诱导时间内，RBL-2H3细胞脱颗粒程度与诱导时间呈正相关，但随着诱导时间达到一定值，RBL-2H3细胞脱颗粒程度将保持不变。在阴性对照组中，在60min内，RBL-2H3细胞脱颗粒上清液中β-氨基己糖苷酶含量极低，证明在此期间RBL-2H3细胞未发生明显脱颗粒反应；60～90min RBL-2H3细胞脱颗粒上清液中β-氨基己糖苷酶含量显著增加，说明在此期间RBL-2H3细胞有明显脱颗粒反应。阴性对照试验证明PBS诱导RBL-2H3细胞脱颗粒作用较弱，但随着诱导时间的延长，RBL-2H3细胞会发生自身程序性死亡即细胞凋亡，从而导致RBL-2H3细胞破裂释放内容物质(包括β-氨基己糖苷酶)，因此，在检测试验中诱导时间不能过长，选择60min为较佳，否则会导致阴性对照组失效，影响检测结果的准确性。
实施例3
本实施例提供了吸附树脂加样操作对细胞的碰撞力与离心操作离心力对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
(1)细胞培养：用细胞培养板(12孔板)接种RBL-2H3细胞，接种密度设定为5×105±10％，将RBL-2H3细胞培养48h，待细胞培养板上RBL-2H3细胞的密度达到90％至100％时，用PBS清洗补贴壁细胞3次，获得待激发RBL-2H3细胞。
选取三个不同批次生产的标准品吸附树脂，依次标记为标准品吸附树脂A、标准品吸附树脂B和标准品吸附树脂C，用PBS缓冲液清洗5次各组标准品吸附树脂，离心去水后待用。
(2)将待激发的RBL-2H3细胞等分，并分别设置为阳性对照组、阴性对照组和标准品对照组，阴性对照组中加入1ml PBS缓冲液，阳性对照组中加入1ml浓度为0.4％的TW-80，标准品对照组设置三组，且三组标准品对照组中分别加入标准品吸附树脂A和PBS缓冲液，标准品吸附树脂B和PBS缓冲液，标准品吸附树脂C和PBS缓冲液，每组试验组各设置三组平行样进行检测，且每组标准品对照组中分别设置不同浴比梯度(即标准品吸附树脂和PBS缓冲液的用量比)进行试验，浴比依次为1：2.5，1：5，1：7.5和1：10，即标准品吸附树脂和PBS缓冲液的用量比依次为1：2.5，1：5，1：7.5和1：10。加样完成后将各组细胞培养板置于细胞培养箱中于37℃孵育60min。
(3)分别收集上述各组经过激发后的细胞液，将各组细胞液在转速为3000rpm下离心分离10min，取各组的上清液，在2h内检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值。各试验组中β-氨基己糖苷酶的OD值如表3所示。
表3
需要说明的是，表3中的试验A采用的是标准品吸附树脂A进行试验，试验B采用的是标准品吸附树脂B进行试验，试验C采用的是标准品吸附树脂C进行试验。
本实施例中选择标准品吸附树脂进行检测，标准品吸附树脂为已上市且通过临床验证的不会造成致敏反应的吸附树脂，其自身的致敏性低，在其它操作合格的前提下，采用标准品吸附树脂诱导RBL-2H3细胞脱颗粒60min将不会检测到明显的β-氨基己糖苷酶释放。若本实施例中在不同浴比梯度下，标准品吸附树脂诱导RBL-2H3细胞产生明显的脱颗粒反应，则说明有其他因素导致试验结果不准确，主要是离心操作离心力和吸附树脂加样操作对RBL-2H3细胞的碰撞力等使RBL-2H3细胞破裂，释放β-氨基己糖苷酶，导致试验结果不准确。
由表3可以看出，标准品对照组在不同浴比下进行试验，标准品吸附树脂A、标准品吸附树脂B和标准品吸附树脂C中检测的β-氨基己糖糖苷酶OD值相较于阴性对照组均未见显著升高。说明在转速为3000rpm下离心10min离心操作的离心力与吸附树脂加样操作对RBL-2H3细胞的碰撞力几乎不会造成RBL-2H3细胞破裂释放β-氨基己糖苷酶。
实施例4
本实施例提供了吸附树脂本身的吸附性对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
在检测过程的质控合格的条件下(即阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值均处于预设范围)，选取三个不同批次生产的待测吸附树脂，依次标记为待测吸附树脂A、待测吸附树脂B和待测吸附树脂C，用PBS缓冲液清洗5次各组待测吸附树脂，离心去水后，将各组待测吸附树脂与1ml RBL-2H3细胞脱颗粒溶液的上清液直接接触60min，其中，RBL-2H3细胞脱颗粒溶液的上清液的OD值已知，标记为吸附前OD值，将每组待测吸附树脂均设置6个不同浴比梯度(即待测吸附树脂和PBS缓冲液的用量比)进行试验，浴比依次为1：2.5，1：4，1：5，1：6，1：7.5和1：10，即每组待测吸附树脂和PBS缓冲液的用量比依次为1：2.5，1：4，1：5，1：6，1：7.5和1：10，并依次设置标记为A1～A6，B1～B6和C1～C6，并检测各组待测吸附树脂吸附之后上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值，标记为吸附后OD值，根据待测吸附树脂吸附前后β-氨基己糖苷酶的OD值变化，计算待测吸附树脂由于自身的吸附性能对试验造成的影响，结果如表4所示。
表4
由表4可以看出，当各组待测吸附树脂和PBS缓冲液的浴比不同时，待测吸附树脂对β-氨基己糖苷酶均具有一定吸附作用，且当浴比为1：2.5时，待测吸附树脂的吸附程度最大，吸附率为30％左右；当浴比为1：2.5至1：5时，随着待测吸附树脂的比例降低，待测吸附树脂对RBL-2H3细胞脱颗粒释放的β-氨基己糖苷酶的吸附量减少，且当浴比为1：5时待测吸附树脂对β-氨基己糖苷酶的吸附最少，吸附率平均值为5.5％；当浴比1：5至1：10时，随着待测吸附树脂在试验体系中的比例降低，待测吸附树脂对RBL-2H3细胞脱颗粒释放的β-氨基己糖苷酶的吸附量几乎不变，吸附率维持在5.5％左右。因此，当吸附树脂和PBS缓冲液的浴比小于等于1：5时，能够降低吸附树脂本身的吸附性对检测结果的准确性的影响。此外，在实际应用中进行检测时，吸附树脂也不是直接接触β-氨基己糖苷酶并对其直接进行吸附，吸附树脂要先与RBL-2H3细胞接触诱导其脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶，其后吸附树脂才能对已脱颗粒产生的β-氨基己糖苷酶进行吸附，诱导细胞脱颗粒本身需要一定的时间(大约为30min左右，参见实施例2)，因此实际应用过程中吸附树脂对RBL-2H3细胞脱颗粒产生β-氨基己糖苷酶的释放率检测结果影响更低，也说明了当吸附树脂和PBS缓冲液的浴比小于等于1：5时，吸附树脂本身的吸附率会低于5.5％，吸附树脂和PBS缓冲液在该浴比范围内，能够较大限度的降低吸附树脂本身的吸附性对检测结果的影响。因此，在检测试验中优选吸附树脂和缓冲溶液的浴比为1：5进行试验，在有效降低吸附树脂本身吸附性能对试验结果造成影响的同时，还能够降低缓冲液的用量，以降低检测的成本。
实施例5
实施例提供了一种检测吸附树脂致敏性的方法，包括如下步骤：
(1)细胞培养：用细胞培养板(12孔板)接种RBL-2H3细胞，接种密度设定为5×105±10％，将RBL-2H3细胞培养48h，待细胞培养板上RBL-2H3细胞的密度达到90％至100％时，用PBS清洗补贴壁细胞3次，获得待激发RBL-2H3细胞。
(2)吸附树脂样品准备：精确称取0.2ml标准品吸附树脂和待测吸附树脂，并将标准品吸附树脂和待测吸附树脂均置于扎孔软管内，软管置于烧杯中，将标准品吸附树脂和待测吸附树脂均用PBS缓冲液清洗5次，并离心去水后待用。
(3)致敏刺激：将待激发的RBL-2H3细胞等分为4组试验组，分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，阴性对照组中加入1ml PBS缓冲液，阳性对照组中加入1ml浓度为0.4％的吐温-80，标准品对照组中加入0.2ml标准品吸附树脂和1ml PBS缓冲液，待测组中加入0.2ml待测吸附树脂和1ml PBS缓冲液，标准品对照组和待测组均各自设置三组平行样进行检测，加样完成后将各组细胞培养板置于细胞培养箱中于37℃进行孵育60min。
(4)检测β-氨基己糖苷酶OD值：分别收集上述各组经过激发后的细胞液，将各组细胞液在转速为3000rpm下离心分离10min，取各组的上清液，在2h内检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值，通过β-氨基己糖苷酶的OD值可以确定待测吸附树脂的致敏性。
其中，检测阳性对照组中β-氨基己糖苷酶OD值为2.057(高于1.500)，阴性对照组中β-氨基己糖苷酶OD值为0.132(低于0.200)，即阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值均处于预设范围，说明检测过程的质控合格。再检测标准品对照组和待测组中β-氨基己糖苷酶的OD值，具体如表5所示。
表5
分别计算标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值的平均值和待测组中β-氨基己糖苷酶OD值的平均值，并对标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值的平均值和待测组中β-氨基己糖苷酶OD值的平均值进行差异显著性检验(t检验)，计算差异显著性P值，根据差异显著性P值确定待测树脂的致敏性。具体地，当差异显著性P值≥0.05时，则说明标准品树脂和待测树脂不存在明显的统计学差异，标准品树脂和待测树脂对嗜碱性粒细胞(即RBL-2H3细胞)刺激作用处于同一水平，待测树脂的致敏性低，待测树脂合格；若差异显著性P值＜0.05时，且待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值小于标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则说明待测树脂对嗜碱性粒细胞的刺激作用小于标准品树脂，待测树脂的致敏性低，待测树脂合格；待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值大于标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则说明待测树脂对嗜碱性粒细胞的刺激作用大于标准品树脂，待测树脂的致敏性高，待测树脂不合格。
由表5中的结果可知，差异显著性P值为0.371，其大于0.05，说明待测树脂的致敏性低，待测树脂的致敏性在可接受的范围内，因此待测树脂合格。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待激发的RBL-2H3细胞；
将所述待激发的RBL-2H3细胞分别设置为阳性对照组、阴性对照组、标准品对照组和待测组，并通过加入不同的物质对各组中待激发的RBL-2H3细胞进行激发，使RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶，其中，所述阳性对照组中的物质为阳性对照物，所述阴性对照组中的物质为缓冲液，所述标准品对照组中的物质为标准品吸附树脂和缓冲液，所述待测组中的物质为待测吸附树脂和缓冲液；
分别检测各组中β-氨基己糖苷酶的OD值；
若所述阳性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值和所述阴性对照组中β-氨基己糖苷酶的OD值处于预设范围，则根据所述标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和所述待测品中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定所述待测树脂的致敏性。
2.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，根据所述标准品对照组的β-氨基己糖苷酶的OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的OD值，确定所述待测树脂的致敏性，包括：
获取所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，对所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值和所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值进行差异显著性检验，获得差异显著性P值；
根据所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值、所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值以及所述差异显著性P值，确定所述待测树脂的致敏性。
3.根据权利要求2所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，根据所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值、所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值以及所述差异显著性P值，确定所述待测树脂的致敏性，包括：
若所述差异显著性P值≥0.05，则所述待测树脂的致敏性低；
若所述差异显著性P值＜0.05，所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值小于所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则所述待测树脂的致敏性低；所述待测组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值大于所述标准品对照组中β-氨基己糖苷酶的平均OD值，则所述待测树脂的致敏性高。
4.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述标准品对照组中所述标准品吸附树脂和所述缓冲液的用量比小于或者等于1：5，所述待测组中所述待测吸附树脂和所述缓冲液的用量比小于或者等于1：5。
5.根据权利要求4所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述标准品对照组中所述标准品吸附树脂和所述缓冲液的用量比为1：5，所述待测组中所述待测吸附树脂和所述缓冲液的用量比为1：5。
6.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述阳性对照物为吐温-80，所述缓冲液为PBS。
7.根据权利要求6所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述阳性对照物中吐温-80的浓度大于或者等于0.4％。
8.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，各组中所述待激发的RBL-2H3细胞的激发时间为60min。
9.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述分别检测各组中β-氨基己糖苷酶的OD值，包括：
分别收集各组经过激发后的产物，将各组经过激发后的产物在转速为3000rpm条件下离心分离10min，取各组的上清液，检测各组上清液中β-氨基己糖苷酶的OD值。
10.根据权利要求1所述的检测吸附树脂致敏性的方法，其特征在于，所述获取待激发的RBL-2H3细胞，包括：
用细胞培养板接种RBL-2H3细胞，将所述RBL-2H3细胞培养45h至50h，待所述细胞培养板上所述RBL-2H3细胞长至90％至100％密度时，用缓冲液冲洗所述细胞培养板后，获得所述待激发的RBL-2H3细胞。
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