CN116287416A - 基于时珍法的真菌物种鉴定方法、靶标核苷酸、引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

基于时珍法的真菌物种鉴定方法、靶标核苷酸、引物对、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于时珍法的真菌物种鉴定方法及利用该方法开发的用于真菌物种鉴定的物种特异性靶标核苷酸、引物对或试剂盒。本发明能够用于对真菌样品或者含真菌的材料进行物种鉴定、区分真菌近缘物种、区分致病真菌及其易混淆真菌、区分真菌不同株系、或者用于药材或食品的安全监测或临床检测。采用本发明所述的方法或试剂盒进行物种鉴定时，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、可不需要依靠大型专业仪器来实现真菌样品的物种的快速鉴定等优点，因此可具有广阔的应用前景。

Description

基于时珍法的真菌物种鉴定方法、靶标核苷酸、引物对、试剂 盒及其应用
技术领域
本申请涉及真菌界物种鉴定领域，具体涉及一种基于时珍法(Analysis ofwhole-GEnome，AGE，又称全基因组分析法或阿哥法)的真菌物种鉴定方法，以及用于真菌物种鉴定的物种特异性靶标序列、引物对、试剂盒及它们的应用。
背景技术
真菌是真核生物的重要组成部分，在世界范围内广泛存在，对农业、人类和动物的生活有着深远的影响。因此，快速而准确的鉴定对于理解真菌的基本影响及其如何塑造生态系统至关重要。考虑到真菌体积小，种类繁多，难以培养，有时甚至不可能培养，而且往往缺乏具有区别性的形态特征，传统的形态学特征很难成为真菌物种鉴定的通用方法。
目前，现有技术也尝试采用分子生物学手段进行真菌物种鉴定，但现有技术主要是在通过对特定基因功能区域筛选能够满足区分一定物种的序列，由于可供筛选的基因数据库较小，能够获得的靶标序列极其有限，导致靶标序列的特异性不足，容易发生脱靶等失误，不能很好地满足不同真菌物种鉴定的需求。尤其是很难满足在特定区域内序列极其相似甚至相同的近缘物种鉴定的需求。
时珍法是从物种全基因组出发寻找并精准识别特异性序列，实现物种准确鉴定的分子诊断方法。时珍法作为一种基于物种全基因组分析的鉴定方法，利用包含生物特有遗传信息的核基因组、线粒体基因组，通过基因组比对筛选物种特异性序列并对该序列进行检测识别是该方法的主要特点，同时，时珍法联合多种多样的序列识别手段可以满足更多的检测需求以适应不同的应用场景。目前，NCBI公开的真菌全基因组数量已达到12,598个，因此有必要基于时珍法寻找用于真菌界物种鉴定的特异性序列并设计相应的引物对，同时开发相应的试剂盒以满足日益增加的真菌物种快速鉴定的需求。
发明内容
为此，本申请提出一种基于包括核基因组和线粒体基因组在内的基因组分析的真菌物种鉴定方法，本申请的方法以基因组分析为基础，寻找能够准确鉴定真菌物种、尤其是能够区分指定物种与近缘物种或者区分真菌不同株系的特异性靶标序列，并通过利用包括但不限于基因组编辑在内的各种检测手段对上述特异性靶标序列进行精准识别，从而实现真菌物种的准确鉴定。同时，在此基础上开发的试剂盒能够实现真菌物种的快速准确鉴定。与现有技术相比，时珍法因其突出的特异性(就单个物种的鉴定而言)和通用性(就真菌界物种鉴定的普适性而言)而具有更广泛的应用前景。
在一个方面，本申请提出一种基于时珍法的真菌物种鉴定方法，包括：
(1)获得指定真菌物种的全基因组序列并构建相应的小片段基因组文库，并利用所述指定真菌物种的近缘物种的基因组序列构建相应的小片段基因组文库；
(2)选择性地对所述小片段基因组文库中的序列进行筛选，获得指定真菌物种的候选靶标序列库和近缘物种的候选靶标序列库；
(3)按如下筛选条件中的至少一种，从所述指定真菌物种的候选靶标序列库中选择候选序列，将所述候选序列与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选出能够与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述指定真菌物种的保守候选靶标序列库，将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对来构建特异性靶标序列库：(i)候选序列的GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不与crRNA重复序列形成互补；以及(iv)候选序列5′端前6个碱基GC含量为30％-80％；
(4)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列库中的一条或多条特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
在本文中，所述指定真菌物种及其近缘物种的基因组序列可获取自已知的公共数据库或者可通过常规方法进行全基因组测序获得。其中，全基因组序列不仅涵盖物种的完整基因组序列，也包括细胞器基因组序列。
在一些实施方式中，所述全基因组包括核基因组和线粒体基因组。
在一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，将所述指定真菌物种的全基因组序列分成L-K+1个长度为K的片段以构建所述小片段基因组文库，其中L表示全基因组序列长度，K表示所述文库中的片段长度，优选地，K为20-30bp，例如25bp。
在步骤(2)中，对所述小片段基因组文库内的序列进行筛选，这就使得能够从待鉴定物种的全基因组范围内、而非局限于特定区域来提取广泛候选靶标序列，从而使得到的靶标序列分布程度广泛，有助于后续消除脱靶等风险。在本文中，基于后续检测方法不同或根据基因组注释文件和数据库收录的物种序列信息等，可选择性地对所述小片段基因组文库中的序列进行筛选，获得候选靶标序列库。
在一些实施方式中，对所述小片段基因组文库中的每一个片段检测PAM基序，并提取带有PAM的序列构建候选靶标序列库。在本文中可选择5'端带有TTTV或3'端带有VAAA的PAM。
在一些优选的实施方式中，在步骤(3)中，可将所述候选序列与所述指定真菌物种的所有已知的基因组序列进行比对。在一些优选的实施方式中，通过将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对，可筛选出与近缘物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列。当采用基因编辑方法识别序列时，可通过严格靶标序列筛选条件获得高效率、高特异性靶标序列。
在本文中，所述指定真菌物种和所述待检测的真菌样品可分别来自单个真菌或者批量的多个真菌。在本文中，所述待检测的真菌样品可以是任何真菌样品。在一些实施方式中，所述待检测的真菌样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。
作为示例，本文所述的真菌可以来自子囊菌门或担子菌门。在一些实施方式中，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌。例如，所述真菌包括但不限于：赤芝(Ganoderma lucidum)、双孢蘑菇(Agaricusbisporus)、链格孢菌(Alternaria alternata)、Apiotrichum laibachii、黑木耳(Auricularia heimuer)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、香菇(Lentinula edodes)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、茯苓(Wolfiporia cocos)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)和日本曲霉(Aspergillusjaponicus)。在一些实施方式中，在步骤(4)中，所述特异性靶标序列为选自以SEQ ID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种。
对所述基因组DNA的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列可采取包含但不限于如下的检测手段进行：测序或CRISPR/Cas12a系统。在一些优选的实施方式中，所述测序可选自第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术。例如测序的示例性方法可包括但不限于Sanger测序、双脱氧链终止、高通量测序、下一代测序、454测序、SOLiD测序、polony测序、Illumina测序、离子激流测序、杂交测序、纳米孔测序、Helioscope测序、单分子实时测序、RNAP测序等。
在一些实施方式中，在步骤(4)中，进行所述检测之前，还预先构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库(例如crRNA库)。例如，采用CRISPR/Cas12a系统时，本领域技术人员可根据所述特异性靶标序列合成相应的crRNA，用于后续检测；如果使用测序等手段，则不需要crRNA。在一些优选的实施方式中，所述引物对为选自如下的至少一种：(1)SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21；(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；(3)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；(4)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；(6)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；(7)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者(9)SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在进一步优选的实施方式中，可以选择例如对引物序列的两端进行硫代修饰或改变引物长度，从而进一步提高扩增效率和检测灵敏度。
在本文所述的方法中，首先利用特异性引物来对基因组DNA中可能存在的靶标序列进行扩增，随后可选择测序手段对靶标序列进行检测识别，或者也可以利用CRISPR/Cas12a系统对靶标序列进行精准识别，并利用包括但不限于酶标仪、可视荧光和试纸条方法对鉴定结果进行呈现。如果从扩增产物中检测到所述特异性靶标序列，则确定所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之，则不具有同一性。
在另一方面，本发明提供了一种用于真菌物种鉴定的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述物种特异性靶标核苷酸为选自以SEQ ID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种。
在另一方面，本发明提供了一种用于真菌物种鉴定的引物对，所述引物对为选自如下的至少一种：
(1)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
(3)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；
(4)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；
(6)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；
(7)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；
(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者
(9)SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在一些实施方式中，所述真菌可以是来自子囊菌门或担子菌门的任何真菌。在一些实施方式中，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌。例如，所述真菌包括但不限于：赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉。
在本文中，例如，可采用以SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21示出的引物对来进行如下的物种鉴定：赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母。可采用以SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23示出的引物对来进行黄曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25示出的引物对来进行烟曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27示出的引物对来进行黑曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29示出的引物对来进行构巢曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31示出的引物对来进行土曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33示出的引物对来进行寄生曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35示出的引物对来进行塔宾曲霉的物种鉴定。可采用以SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37示出的引物对来进行日本曲霉的物种鉴定。
本发明提供了一种对真菌样品或者含真菌的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述的引物对。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含：室温扩增反应液(例如ERA扩增试剂)和CRISPR/Cas12a体系反应液。在一些优选的实施方式中，所述室温扩增反应液含有用于进行靶序列扩增的扩增缓冲液、扩增用酶以及无菌超纯水。在一些优选的实施方式中，所述CRISPR/Cas12a体系反应液包括：用于进行基因编辑的缓冲液、crRNA、Cas蛋白、无核酸酶水(nuclease-free water)和荧光信号分子(例如ssDNA荧光报告基因)。
本文的试剂盒中包含的引物对及crRNA可根据选定的特异性序列获得。
在一些实施方式中，所述crRNA为以SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:56示出的crRNA中的任一者。
本公开中，可将试剂盒用于上述的真菌物种鉴定方法中进行所述检测。例如，以所述待检测的真菌样品的基因组DNA作为底物，利用特异性引物进行扩增，并基于特异性靶标序列合成crRNA，采用所述试剂盒来进行检测时，如果识别到所述靶标序列，则反应体系产生荧光，当测定的荧光值与空白对照存在显著差异时，确定所述待检测样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之，所述待检测样品与所述指定真菌物种不具有同一性。
在本文中，本领域技术人员可根据实际情况选择任意已知的扩增试剂，荧光信号分子可通过不同的终端检测手段确定。具体地，当使用荧光酶标仪或可视荧光检测靶点时，荧光信号分子可选择Poly_C_FQ(5’-FAM-CCCCCCCCCC-BHQ-3’)；当使用试纸条检测靶点时，荧光信号分子可选择Poly_C_FB(5’-FAM-CCCCCCCCCC-Biotin-3’)；向检测体系中加入crRNA、无核酸酶水和待检测样品的基因组DNA和特异性引物或其扩增产物后，扩增反应在管底进行，检测试剂(NEBuffer 2.1、Cas12a、crRNA和无核酸酶水)在管盖反应。
本发明提供了上述的物种特异性靶标核苷酸、引物对或试剂盒在对真菌样品或者含真菌的材料进行物种鉴定、区分真菌近缘物种、区分致病真菌及其易混淆真菌、或者用于药材或食品的安全监测或临床检测中的应用。
本发明所述的方法涉及基于时珍法鉴定原理构建指定真菌物种的特异性靶标序列库；然后基于选定的特异性靶标序列来鉴定待检测真菌样品。
关于对所述基因组DNA进行的检测，作为示例，以如下表1中示出的反应体系进行荧光酶标仪检测，将所述反应体系在37℃-40℃孵育20分钟后，通过短暂离心使管盖检测试剂沉降于底部，并将所有试剂充分混合，室温孵育10分钟。将4μL Poly_C_FQ(400nM)与上述体系混合，随后在37℃孵育并在0、3、6、9、12、15、25、35、45、60分钟时用酶标仪在λex 483nm/λem 535nm(该波长可根据所选的荧光信号分子确定)分别检测荧光值。如检测结果与空白对照存在显著性差异(P＜0.01)则可判定待检测的样品与指定物种具有同一性，反之则与指定物种不具有同一性。当采用可视荧光检测时，待完成试剂充分混合，孵育10分钟后，将4μLPoly_C_FB(400nM)与上述体系混合，37℃孵育5分钟后进行荧光的可视化检测。
表1用于真菌物种鉴定的CRISPR/Cas12a反应体系
Figure BDA0004166145760000061
上文所述的方法可用于不同应用场景下的真菌物种鉴定，其包括：对于指定真菌物种执行上文所述的方法，根据所述荧光检测结果判定待检测样品与指定真菌物种的同一性。
将本文中涉及的示例性的特异性靶标序列和用于物种鉴定的引物对在如下的表2和表3中列出。
表2本发明的示例性的真菌物种的特异性靶标序列
指定真菌物种 特异性靶标序列 序列编号
赤芝 TTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTT SEQ ID NO:1
双孢蘑菇 TTACTTGGGGTCAGCTCCTCTGAAA SEQ ID NO:2
链格孢菌 ACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAA SEQ ID NO:3
Apiotrichum laibachii TTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGG SEQ ID NO:4
黑木耳 TGCCGGTAATCGGCTCGTCTTGAAA SEQ ID NO:5
灰霉菌 TATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAA SEQ ID NO:6
尖孢镰刀菌 TGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAA SEQ ID NO:7
香菇 TCAATCTGTTCTATTCATTGGAGAAA SEQ ID NO:8
酿酒酵母 TTTAAGAACATTGTTCGCCTAGACG SEQ ID NO:9
茯苓 CGCCGTTGAACGGGAACCCTAGAAA SEQ ID NO:10
胶红酵母 TTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATG SEQ ID NO:11
黄曲霉 TTTACTGCAGCGAGGAGATCATCGT SEQ ID NO:12
烟曲霉 TTTGTGAAAGCAGCGACTTGGGTTA SEQ ID NO:13
黑曲霉 TTTAGCATCGCTGGATTTGTATACT SEQ ID NO:14
构巢曲霉 TTTCCCAGTCTTAAGCTGGAATCTG SEQ ID NO:15
土曲霉 TTTCAGTGGCAGTAAGAGTAGTCTC SEQ ID NO:16
寄生曲霉 TTTAAAAAGATTCTCACCTTTGGCG SEQ ID NO:17
塔宾曲霉 TATAGTAACTTGTTAGTAACCGAAA SEQ ID NO:18
日本曲霉 CCTCTACGTGCAGGGTCATAGCAAA SEQ ID NO:19
表3本发明的示例性的用于物种鉴定的引物对
Figure BDA0004166145760000071
Figure BDA0004166145760000081
在一个实施方式中，本申请涉及一种构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库的方法，包括：
a)选择指定真菌物种，按照上文所述的物种鉴定方法筛选得到所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列；
b)将所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列组合，构建所述特异性靶标序列库。
或者，本申请涉及一种构建用于对物种特异性靶标核苷酸进行检测的工具库的方法，包括：
A)选择指定真菌物种，按照上文所述的方法来构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库；
B)基于用于所述检测的技术(根据序列检测方法的多样性，可包括但不限于基因编辑、测序技术等)，构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库(包括但不限于crRNA库、引物库等)。
或者，本申请涉及一种区分致病真菌及其易混淆真菌的方法，包括：
I)将所述致病真菌或其易混淆真菌用作指定真菌物种，按照上文所述的物种鉴定方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
或者，本申请涉及一种用于药材或食品的安全监测或临床检测的方法，包括：
1)将与药材或食品的安全相关或临床易感染的真菌用作指定真菌物种，按照上文所述的物种鉴定方法筛选得到特异性靶标序列；
2)获得待检测样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。通过这一检测，可以发现由于真菌污染而存在安全隐患的药材和食品，从而保证药材和食品安全；并且还可以及早在临床上发现是否存在真菌感染，使得能够及时实现对症治疗。
或者，本申请涉及一种区分真菌不同株系的方法，包括：
I)将一种真菌的多个不同株系分别用作指定真菌物种，按照上文所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列设计引物对并将所述引物对用于扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种为同一株系，反之则不是。
或者，本申请涉及一种用于真菌物种鉴定的特异性crRNA分子，包括其序列以SEQID NOs:38-56示出的crRNA分子中的至少一种：
Figure BDA0004166145760000091
Figure BDA0004166145760000101
采用本文所述的试剂盒或方法进行物种鉴定时，能够区分指定真菌物种与其近缘物种，从而准确实现真菌生物在物种水平上的准确鉴定。该方法可以在包括中药材、食品安全及临床检测方面能够发挥出积极的作用。所述方法特异性强、灵敏度高、重复性好、可不需要依靠大型专业仪器来实现真菌样品的物种的快速鉴定，因此可具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要具体方法作简单地介绍，以下附图仅仅是本公开的示例，本申请的保护范围不限于此。
图1为示出了实施例2中的临床致病真菌物种的鉴定结果。
图2示出了实施例4中的不同的食用真菌的荧光检测结果。
图3示出了实施例6中的不同的药用真菌荧光检测结果。
图4示出了实施例8中的易致植物病害的致病真菌的荧光检测结果。
图5示出了实施例10中的模式真菌或功能菌的荧光检测结果。
图6示出了实施例12中的同门不同纲的真菌物种的荧光检测结果。
图7示出了实施例14中的曲霉属的不同真菌物种的荧光检测结果。
图8示出了实施例16中的黄曲霉及其近缘物种米曲霉的鉴定结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本申请进行详细描述，但并不意味着存在对本申请而言任何不利的限制。对本领域的技术人员而言，在不脱离本申请精神和范围的情况下针对本申请具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor，NY 1989)；Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocolsin Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)。
在本文中，除非上下文另有明确指示，术语“或”意在包括“和”，反之亦然。在本文中，除非另有说明，否则单数术语涵盖复数指代物，反之亦然。
在本文中，除非另有说明，术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(例如contain、containing、include、including)为开放式表述，应理解为“包括但不限于”，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
在本文中，除非另有说明，术语“全基因组”不仅涵盖生物的整个基因组序列，而且还涵盖了细胞器基因组(例如线粒体基因组)。
本发明的示例性的技术方案可通过如下的编号段落加以说明：
1.一种基于时珍法的真菌物种鉴定方法，包括：
(1)获得指定真菌物种的全基因组序列并构建相应的小片段基因组文库，并利用所述指定真菌物种的近缘物种的基因组序列构建相应的小片段基因组文库；
(2)选择性地对所述小片段基因组文库中的序列进行筛选，获得指定真菌物种的候选靶标序列库和近缘物种的候选靶标序列库；
(3)按如下筛选条件中的至少一种，从所述指定真菌物种的候选靶标序列库中选择候选序列，将所述候选序列与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选出能够与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述指定真菌物种的保守候选靶标序列库，将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对来构建特异性靶标序列库：(i)候选序列的GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不与crRNA重复序列形成互补；以及(iv)候选序列5'端前6个碱基GC含量为30％-80％；
(4)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列库中的一条或多条特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
2.如段落1所述的方法，其中，所述全基因组包括核基因组和线粒体基因组。
3.如段落1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，将所述指定真菌物种的全基因组序列分成L-K+1个长度为K的片段以构建所述小片段基因组文库，其中L表示全基因组序列长度，K表示所述文库中的片段长度。
4.如段落3所述的方法，其中，K为20-30bp。
5.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，对所述小片段基因组文库中的每一个片段检测PAM基序，并提取带有PAM的序列构建候选靶标序列库。
6.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，在步骤(3)中，将所述候选序列与所述指定真菌物种的所有已知的基因组序列进行比对。
7.如段落1-6中任一段所述的方法，其中，通过将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对，筛选出与所述近缘物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列。
8.如段落1-7中任一段所述的方法，其中，所述指定真菌物种和所述待检测的真菌样品分别来自单个真菌或者批量的多个真菌。
9.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述待检测的真菌样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物。
10.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述真菌来自子囊菌门或担子菌门。
11.如段落1-10中任一段所述的方法，其中，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌。
12.如段落1-11中任一段所述的方法，其中，所述真菌选自赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉。
13.如段落12所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述特异性靶标序列为选自以SEQID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种。
14.如段落12或13所述的方法，其中，所述引物对为选自如下的至少一种：(1)SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；(3)SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25；(4)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；(6)SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31；(7)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者(9)SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
15.如段落14所述的方法，其中，对引物序列的两端进行硫代修饰或改变引物长度。
16.如段落1-15中任一段所述的方法，其中，在步骤(4)中，对所述基因组DNA的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列采取如下的检测手段进行：测序或CRISPR/Cas12a系统。
17.如段落16所述的方法，其中，所述测序选自第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术。
18.如段落1-17中任一段所述的方法，其中，在步骤(4)中，进行所述检测之前，还预先构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库。
19.如段落18所述的方法，其中，所述工具库为crRNA库。
20.一种用于真菌物种鉴定的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述物种特异性靶标核苷酸为选自以SEQ ID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种。
21.一种用于真菌物种鉴定的引物对，其中，所述引物对为选自如下的至少一种：
(1)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
(3)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；
(4)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；
(6)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；
(7)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；
(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者
(9)SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
22.如段落20所述的物种特异性靶标核苷酸或段落21所述的引物对，其中，所述真菌是来自子囊菌门或担子菌门的任何真菌。
23.如段落20所述的物种特异性靶标核苷酸或段落21所述的引物对，其中，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌。
24.如段落20所述的物种特异性靶标核苷酸或段落21所述的引物对，其中，所述真菌选自赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉。
25.一种对真菌样品或者含真菌的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含段落21所述的引物对。
26.如段落25所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：室温扩增反应液和CRISPR/Cas12a体系反应液。
27.如段落26所述的试剂盒，其中，所述室温扩增反应液含有用于进行靶序列扩增的扩增缓冲液、扩增用酶以及无菌超纯水。
28.如段落26或27所述的试剂盒，其中，所述CRISPR/Cas12a体系反应液包括：用于进行基因编辑的缓冲液、crRNA、Cas蛋白、无核酸酶水和荧光信号分子。
29.如段落28所述的试剂盒，其中，所述crRNA为以SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:56示出的crRNA中的任一者。
30.一种构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库的方法，包括：
a)选择指定真菌物种，按照段落1-19中任一段所述的方法筛选得到所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列；
b)将所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列组合，构建所述特异性靶标序列库。
31.一种构建用于对物种特异性靶标核苷酸进行检测的工具库的方法，包括：
A)选择指定真菌物种，按照段落30所述的方法来构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库；
B)基于用于所述检测的技术，构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库。
32.一种区分致病真菌及其易混淆真菌的方法，包括：
I)将所述致病真菌或其易混淆真菌用作指定真菌物种，按照段落1-19中任一段所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
33.一种用于药材或食品的安全监测或临床检测的方法，包括：
1)将与药材或食品的安全相关或临床易感染的真菌用作指定真菌物种，按照段落1-19中任一段所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
2)获得待检测样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
34.一种区分真菌不同株系的方法，包括：
I)将一种真菌的多个不同株系分别用作指定真菌物种，按照段落1-19中任一段所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列设计引物对并将所述引物对用于扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种为同一株系，反之则不是。
35.一种用于真菌物种鉴定的特异性crRNA分子，其中，所述crRNA分子包括其序列以SEQ ID NOs:38-56示出的crRNA分子中的至少一种。
实施例
下面结合不同物种的鉴定过程，通过实施例进一步阐述基于时珍法开发的真菌物种鉴定方法，但本申请的范围不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件实施。除非另外说明，下述实施例中所用试剂、材料或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：构建临床致病真菌物种的小片段基因组文库并获得特异性靶标序列
1.1构建临床致病真菌物种的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载临床常见的致病真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus；版本号：GCF_000002655.1)和土曲霉(Aspergillusterreus；版本号：GCF_000149615.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取临床致病真菌物种的初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得临床致病真菌物种的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的烟曲霉和土曲霉候选序列与数据库下载的各自所有已公布的该物种的基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选出能够与各自所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对(即，当指定真菌物种为烟曲霉时，在土曲霉的初步候选靶标序列库中进行比对)，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，烟曲霉的特异性靶标序列为(5′-TTTGTGAAAGCAGCGACTTGGGTTA-3′；SEQ ID NO:13)；土曲霉的特异性靶标序列为(5′-TTTCAGTGGCAGTAAGAGTAGTCTC-3′；SEQID NO:16)。
实施例2：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例1筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Afu_target的crRNA，命名为Afu_crRN A(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAAAGCAGCGACUUGGGUUA；SEQ ID NO：50)；设计匹配Ate_target的crRNA，命名为Ate_crRNA(UAA UUUCUACUAAGUGUAGAUAGUGGCAGUAAGAGUAGUCUC；SEQ ID NO：53)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
基于实施例1获得的各真菌物种的特异性靶标序列设计特异性引物对，其序列信息如下：
Afu_1F：5’-GGTTGCAGCCAGCAGCAACATTCTT-3’(SEQ ID NO：24)；Afu_1R：5’-GCCTTAACCTGCAGCAGCAGCGTTT-3’(SEQ ID NO：25)；Ate_1F：5’-ACCGCCAGTTTGTCGTCTCCACACC-3’(SEQ ID NO：30)；Ate_1R：5’-TCGAAAGGCATTCGAGAAGAGACGC-3’(SEQ ID NO：31)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
表4用于真菌物种鉴定的试剂盒反应体系
Figure BDA0004166145760000171
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图1示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。此外，烟曲霉作为诱发烟曲霉病的主要原因，图1中的子图C示出了烟曲霉组的可视荧光检测结果。如子图C所示，烟曲霉样品组可以观察到明显荧光，而CK组没有观察到荧光。图1中的子图D示出了烟曲霉样品组的试纸条检测结果。如子图D所示，烟曲霉样品组可以同时观察到质控线和检测线，而CK组仅仅显示质控线。由此可以看出，本发明所述的方法能够特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种是否具有同一性。
实施例3：构建食用真菌的小片段基因组文库并获得特异性靶标序列
1.1构建食用真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载临床常见的食用真菌双孢蘑菇(Agaricus bisporus；版本号：GCA_001682475.1)、黑木耳(Auricularia heimuer；版本号：GCA_002287115.1)和香菇(Lentinula edodes；版本号：GCA_015476405.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取食用真菌的初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得食用真菌的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的双孢蘑菇、黑木耳和香菇候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种的基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，双孢蘑菇的特异性靶标序列为(5'-TTACTTGGGGTCAGCTCCTCTGAAA-3′；SEQ ID NO:2)；黑木耳的特异性靶标序列为(5′-TGCCGGTAATCGGCTCGTCTTGAAA-3′；SEQ ID NO:5)；香菇的特异性靶标序列为(5'-TCAATCTGTTCTATTCATTGGAGAAA-3'；SEQ ID NO:8)。
实施例4：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例3筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Abi_target的crRNA，命名为Abi_crRN A(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAGGAGCUGACCCCAAGUAA；SE Q ID NO：39)；设计匹配Ahe_target的crRNA，命名为Ahe_crRNA(UAA UUUCUACUAAGUGUAGAUAAGACGAGCCGAUUACCGGCA；SEQ ID NO：42)；设计匹配Le_target的crRNA，命名为Le_crRNA(UAAUUUCUAC UAAGUGUAGAUUCCAAUGAAUAGAACAGAUUG；SEQID NO：45)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的干燥制品，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
实施例3获得的各食用真菌物种的特异性靶标序列均在ITS区域，ITS通用引物能够用于食用真菌的特异性靶标序列的扩增，其序列信息如下：
ITS4F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQ ID NO:20)；
ITS5R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO:21)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系的总体积为100μL：10μL10×NEBuffer 2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μLDNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图2示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B、子图C所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例5：构建药用真菌的小片段基因组文库并获得特异性靶标序列
1.1构建药用真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载临床常见的药用真菌赤芝(Ganoderma lucidum；版本号：GCA_019426095.1)和茯苓(Wolfiporia cocos；版本号：GCA_000344635.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取药用真菌的初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得药用真菌的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5′端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的赤芝和茯苓候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，赤芝的特异性靶标序列为(5′-TTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTT-3'；SEQ ID NO:1)；茯苓的特异性靶标序列为(5'-CGCCGTTGAACGGGAACCCTAGAAA-3′；SEQ ID NO:10)。
实施例6：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例5筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Glu_target的crRNA，命名为Glu_crRN A(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAGGCUUGGACUUGGAGGCUU；SEQ ID NO：38)；设计匹配Wco_target的crRNA，命名为Wco_crRNA(UA AUUUCUACUAAGUGUAGAUUAGGGUUCCCGUUCAACGGCG；SEQ ID NO：47)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的干燥制品，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
实施例5获得的药用真菌物种的特异性靶标序列均在ITS区域，ITS通用引物能够用于药用真菌的特异性靶标序列的扩增，其序列信息如下：
ITS4F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'(SEQ ID NO:20)；
ITS5R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO:21)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系的总体积为100μL：10μL10×NEBuffer 2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μLDNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图3示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例7：构建易致植物病害的致病真菌小片段基因组文库并获得特异性靶标序列
1.1构建易致植物病害的致病真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载常见的能够引起植物真菌病害的真菌种类，即，链格孢菌(Alternaria alternata；版本号：GCA_014751505.1)、灰霉菌(Botrytis cinerea；版本号：GCF_000143535.2)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum；版本号：GCA_013085055.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取易致植物病害的致病真菌的初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得易致植物病害的致病真菌的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的链格孢菌、灰霉菌和尖孢镰刀菌候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，链格孢菌的特异性靶标序列为(5'-ACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAA-3'；SEQ ID NO:3)；灰霉菌的特异性靶标序列为(5'-TATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAA-3'；SEQ ID NO:6)；尖孢镰刀菌的特异性靶标序列为(5'-TGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAA-3'；SEQ ID NO:7)。
实施例8：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例7筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Aal_target的crRNA，命名为Aal_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGAUAGAGAGUGCGACUUGU；SEQ ID NO：40)；设计匹配Bci_target的crRNA，命名为Bci_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGCCUGCCAUUACUGACAUA；SEQ ID NO：43)；设计匹配Fox_target的crRNA，命名为Fox_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCUGCGUUCUUCAUCGAUGCCA；SEQID NO：44)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
实施例7获得的易致植物病害的致病真菌的特异性靶标序列均在ITS区域，ITS通用引物能够用于易致植物病害的致病真菌的特异性靶标序列的扩增，其序列信息如下：
ITS4F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'(SEQ ID NO:20)；
ITS5R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO:21)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图4示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B、子图C所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例9：构建模式真菌或功能菌的小片段基因组文库并获得特异性靶标序列
1.1构建模式真菌或功能菌的致病真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载模式真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae；版本号：GCA_016858175.1)和功能菌黑曲霉(Aspergillusniger；版本号：GCA_019288275.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取模式真菌或功能菌的初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得模式真菌或功能菌的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的酿酒酵母和黑曲霉候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，酿酒酵母的特异性靶标序列为(5'-TTTAAGAACATTGTTCGCCTAGACG-3'；SEQ ID NO:9)；黑曲霉的特异性靶标序列为(5'-TTTAGCATCGCTGGATTTGTATACT-3'；SEQ ID NO:14)。
实施例10：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例9筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Sce_target的crRNA，命名为Sce_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAACAUUGUUCGCCUAGACG；SEQ ID NO：46)；设计匹配Anig_target的crRNA，命名为Anig_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUCGCUGGAUUUGUAUACU；SEQ ID NO：51)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
基于实施例9获得的模式真菌或功能菌的特异性靶标序列，设计特异性引物对用于靶标序列的扩增，其序列信息如下：
ITS4F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'(SEQ ID NO:20)；
ITS5R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO:21)；
A.nig_1F：5’-TGCCGGAGTATTCACCCTCGGTGTT-3’(SEQ ID NO:26)；
A.nig_1R：5’-GGCGTTGTTGACATTATGTGTCCTG-3’(SEQ ID NO:27)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图5示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例11：基于时珍法获取区分来自同门不同纲的真菌物种的特异性靶标序列
1.1构建不同真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中分别下载担子菌门伞菌纲(Tremellomycetes)的Apiotrichum laibachii(版本号：GCA_001600735.1)和微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa；版本号：GCA_003055205.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取待鉴定初步候选靶标序列库
从上述构建的两种真菌的小片段基因组文库中分别提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得各自的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5′端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的Apiotrichum laibachii和胶红酵母候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，Apiotrichum laibachii的特异性靶标序列为(5′-TTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGG-3'；SEQ ID NO:4)；胶红酵母的特异性靶标序列为(5'-TTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATG-3'；SEQ ID NO:11)。
实施例12：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例11筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Ala_target的crRNA，命名为Ala_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAACGCAACUUGCGCUCUCUGG；SEQ ID NO：41)；设计匹配Rmu_target的crRNA，命名为Rmu_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUCUAGCUCGUUCGUAAUG；SEQ ID NO：48)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
实施例11获得的特异性靶标序列均在ITS区域，ITS通用引物能够用于该两种真菌特异性靶标序列的扩增，其序列信息如下：
ITS4F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQ ID NO:20)；
ITS5R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO:21)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer 2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图6示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A、子图B所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例13：基于时珍法获取区分曲霉属的不同真菌物种的特异性靶标序列
1.1构建曲霉属不同真菌的小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中分别下载来自曲霉属的构巢曲霉(Aspergillus nidulans；版本号：GCA_000011425.1)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus；版本号：GCA_013145995.1)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis；版本号：GCA_001890745.1)和日本曲霉(Aspergillus japonicus；版本号：GCF_003184785.1)的基因组数据作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取待鉴定初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中分别提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成各自的初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得各自的候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5'端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的构巢曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉候选序列与数据库下载的各自的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库；
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，构巢曲霉的特异性靶标序列为(5'-TTTCCCAGTCTTAAGCTGGAATCTG-3'；SEQ ID NO:15)；寄生曲霉的特异性靶标序列为(5'-TTTAAAAAGATTCTCACCTTTGGCG-3'；SEQ ID NO:17)；塔宾曲霉的特异性靶标序列为(5'-TATAGTAACTTGTTAGTAACCGAAA-3'；SEQ ID NO:18)；日本曲霉的特异性靶标序列为(5'-CCTCTACGTGCAGGGTCATAGCAAA-3'；SEQ ID NO:19)。
实施例14：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例13筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Anid_target的crRNA，命名为Anid_crR NA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAGUCUUAAGCUGGAAUCUG；SEQ ID NO：52)；设计匹配Apa_target的crRNA，命名为Apa_crRNA(UA AUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAAGAUUCUCACCUUUGGCG；SEQ ID NO：54)；设计匹配Atu_target的crRNA，命名为Atu_crRNA(UAAUUUC UACUAAGUGUAGAUGGUUACUAACAAGUUACUAUA；SEQID NO：55)；设计匹配Aja_target的crRNA，命名为Aja_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAUGACCCUGCACGUAGAGG；SEQ ID NO：56)。
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
基于实施例13获得的特异性靶标序列设计特异性引物,其序列信息如下：
A.nid_1F：5’-AGCCTCTCCTGAGTATGTTATTCGG-3’(SEQ ID NO:28)；
A.nid_1R：5’-GTCGCCTAGGTACATGTCTCATAGC-3’(SEQ ID NO:29)；
A.pa_1F：5’-TCCGGAATATCAGGTGCGCCAGGAT-3’(SEQ ID NO:32)；
A.pa_1R：5’-ACCAGGAACCAACGGCTGCATTTCC-3’(SEQ ID NO:33)；
A.tu_1F：5’-GAGCACCCTTGCTGACAACG-3’(SEQ ID NO:34)；
A.tu_1R：5’-CATCGATGACCTCGAGCAGG-3’(SEQ ID NO:35)；
A.ja_1F：5’-ACGTCTTCGATTGGACCGTC-3’(SEQ ID NO:36)；
A.ja_1R：5’-ACCAGTATCGTCGATAAGCC-3’(SEQ ID NO:37)。
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对每一个待检测样品，分别设置样品组和CK(空白对照)组。使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer 2.1、2μL Lba Cas12a(20nM)、3.3μLcrRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μL Poly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex483nm/λem 535nm分别检测荧光。
图7示出了上述各待检测样品组的酶标仪荧光测定结果。如其中的子图A至子图D所示，各待检测样品组与CK组相比，均产生明显荧光信号，并且与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。
实施例15：基于时珍法获取区分黄曲霉(Aspergillus flavus)及其近缘物种米曲霉(Aspergillus oryzae)的特异性靶标序列
为了进一步确认该方法能够实现物种水平的精准鉴定，选择曲霉属的黄曲霉和它的近缘物种米曲霉。
1.1构建黄曲霉小片段基因组文库
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载黄曲霉(版本号：GCA_014784225.2)作为指定真菌物种的全基因组数据，将所述真菌的全基因组序列用Jellyfish(v1.1.12)分成(L-25+1，L＝全基因组序列长度)个长度为25bp的片段，构建各自的小片段基因组文库。
1.2获取待鉴定初步候选靶标序列库
从上述构建的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(所述PAM的5’端带有TTTV或3’端带有VAAA)，构成初步候选靶标序列库。
1.3分析初步候选靶标序列，基于包括如下的候选序列筛选条件对所述的初步候选靶标序列库中的序列进行进一步筛选，获得候选序列：
1.3.1候选序列的GC含量为40％-60％。
1.3.2候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基。
1.3.3候选序列不能与crRNA重复序列互补。
1.3.4候选序列5′端6个碱基GC含量为30％-80％。
1.4使用Bowtie(v1.1.0)将上述1.3中得到的黄曲霉候选序列与数据库下载的所有已公布的该物种基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选能够与各自的所有已公布的基因组序列完全匹配的序列，分别构建各自的保守候选靶标序列库。
1.5将指定真菌物种的保守候选靶标序列库中每一条序列在除它之外的真菌物种的初步候选靶标序列库中进行比对，筛选出与其他真菌物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列，具体地，黄曲霉的特异性靶标序列为(5'-TTTACTGCAGCGAGGAGATCATCGT-3'；SEQ ID NO:12)；
实施例16：利用基因组编辑系统精准识别待检测样品的特异性靶标序列
为了确定实施例15筛选出的指定真菌物种的特异性靶标序列是否能够特异性地、准确地反映出待检测样品与指定真菌物种的同一性，接下来基于其基因组DNA进行待检测样品的物种鉴定。
2.1设计与特异性靶标序列匹配的crRNA
根据后续的检测操作中采用的基因组编辑系统(CRISPR/Cas12a系统)和crRNA设计原则，具体地，设计匹配Afl_target的crRNA，命名为Afl_crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAGUUCACCGGCAUCAGUGC；SEQ ID NO：49)；
2.2待检测样品的基因组DNA提取
分别取适量待检测样品黄曲霉的新鲜菌丝，加入液氮充分研磨为粉末，然后分别按照TIANGEN公司提供的试剂盒使用说明书采用TIANamp Genomic DNA kit提取各样品的总DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所得到的各样品总DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。
基于实施例15获得的特异性靶标序列设计特异性引物,其序列信息如下：
A.fl_1F:5’-TCCTGTGGATATCTGTCTGGGTACG-3’(SEQ ID NO:22)；
A.fl_1R：5’-CTCTATCGCCATCACCTCGTTCATC-3’(SEQ ID NO:23)；
2.3基于时珍法采用试剂盒反应体系进行待检测样品的鉴定
使用上述设计好的特异性引物对来扩增上述提取得到的待检测样品黄曲霉的基因组DNA，得到的扩增产物(即，DNA底物)随后按照上文的表4准备试剂盒所需组分进行待检测样品的物种鉴定。
针对待检测样品黄曲霉，分别设置Aspergillus fllavus组(黄曲霉组)、Aspergillus oryzae组(米曲霉组)、A.flavus+A.oryzae组(黄曲霉样品+米曲霉样品组)和CK(空白对照)组。
使用常规的室温扩增方法和NEB公司的EnGen Lba Cas12a(Cpf1)进行实验，并采用酶标仪方法对结果进行判定。该反应体系总体积为100μL：10μL 10×NEBuffer 2.1、2μLLba Cas12a(20nM)、3.3μL crRNA(300nM)、2μL DNA底物(10ng/μL)、48μL ERA扩增试剂、4μLPoly_C_FQ(400nM)和30.7μL无核酸酶H2O。在1.5mL离心管管底先加入上述反应体系中的ERA扩增试剂和DNA底物；在管盖内侧加入NEBuffer 2.1、Lba Cas12a、crRNA和无核酸酶H2O并在37℃下孵育20分钟，之后迅速通过简易离心或者重力作用将管盖中的试剂转移至管底，然后在37℃继续孵育10分钟；随后加入Poly_C_FQ，在37℃孵育并在0、5、10、15、20、25、30分钟时用酶标仪在λex 483nm/λem 535nm分别检测荧光；此外，当采取可视荧光法对鉴定结果进行判定时，加入Poly_C_FQ后，在37℃孵育3分钟时，放入蓝光投射仪检测荧光。
图8中的子图A示出了上述各待检测的样品组的荧光测定结果，其中，黄曲霉组产生了荧光信号，与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)，而CK组没有荧光信号产生。图8中的子图B示出了上述各待检测的样品组的荧光测定结果，其中，黄曲霉组产生了荧光信号，与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)；而米曲霉组与CK组一致，都没有荧光信号产生，荧光值与CK组无显著性差异(P>0.01)；同时，混合样品组(即，A.flavus+A.oryzae组)，由于包含黄曲霉样品也能够产生较强的荧光信号，荧光值与CK组存在统计学上显著的差异(P<0.01)。图8中的子图C示出了上述各待检测的样品组的可视荧光检测结果。如子图B所示，黄曲霉样品组可以观察到明显荧光，而米曲霉组与CK组一致，都没有观察到荧光。同时，混合样品组(即，A.flavus+A.oryzae组)，由于包含黄曲霉样品也能够产生较强的荧光。由此可以看出，本发明所述的方法能够特异性地、准确地反映出待检测样品与待鉴定物种是否具有同一性。
所属领域的普通技术人员应理解，凡在本公开实施例的精神和原则之内所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围内。

Claims (11)

1.一种基于时珍法的真菌物种鉴定方法，包括：
(1)获得指定真菌物种的全基因组序列并构建相应的小片段基因组文库，并利用所述指定真菌物种的近缘物种的基因组序列构建相应的小片段基因组文库；
(2)选择性地对所述小片段基因组文库中的序列进行筛选，获得指定真菌物种的候选靶标序列库和近缘物种的候选靶标序列库；
(3)按如下筛选条件中的至少一种，从所述指定真菌物种的候选靶标序列库中选择候选序列，将所述候选序列与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列进行比对，从所述候选序列中筛选出能够与所述指定真菌物种的多个已知的基因组序列完全匹配的序列，构建所述指定真菌物种的保守候选靶标序列库，将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对来构建特异性靶标序列库：(i)候选序列的GC含量为40％-60％；(ii)候选序列不能含有出现连续4连及以上的重复碱基、连续的3连重复碱基、不连续的3个及以上的3连重复碱基；(iii)候选序列不与crRNA重复序列形成互补；以及(iv)候选序列5′端前6个碱基GC含量为30％-80％；
(4)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列库中的一条或多条特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述全基因组包括核基因组和线粒体基因组；
优选地，在步骤(1)中，将所述指定真菌物种的全基因组序列分成L-K+1个长度为K的片段以构建所述小片段基因组文库，其中L表示全基因组序列长度，K表示所述文库中的片段长度；优选地，K为20-30bp；
优选地，对所述小片段基因组文库中的每一个片段检测PAM基序，并提取带有PAM的序列构建候选靶标序列库；
优选地，在步骤(3)中，将所述候选序列与所述指定真菌物种的所有已知的基因组序列进行比对；
优选地，通过将所述保守候选靶标序列库中的每一条序列与所述近缘物种的候选靶标序列库进行比对，筛选出与所述近缘物种不存在3个以内碱基错配的一条序列作为特异性靶标序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述指定真菌物种和所述待检测的真菌样品分别来自单个真菌或者批量的多个真菌；
优选地，所述待检测的真菌样品是单一物种来源的样品或者是多个物种来源的样品的混合物；
优选地，所述真菌来自子囊菌门或担子菌门；
优选地，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌；
优选地，所述真菌选自赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉；
优选地，在步骤(4)中，所述特异性靶标序列为选自以SEQ ID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种；
优选地，所述引物对为选自如下的至少一种：(1)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；(3)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；(4)SEQ ID NO:26和SEQID NO:27；(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；(6)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；(7)SEQID NO:32和SEQ ID NO:33；(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者(9)SEQ ID NO:36和SEQID NO:37；
优选地，对引物序列的两端进行硫代修饰或改变引物长度；
优选地，在步骤(4)中，对所述基因组DNA的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列采取如下的检测手段进行：测序或CRISPR/Cas12a系统；
优选地，所述测序选自第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术。
优选地，在步骤(4)中，进行所述检测之前，还预先构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库；优选地，所述工具库为crRNA库。
4.一种用于真菌物种鉴定的物种特异性靶标核苷酸，其中，所述物种特异性靶标核苷酸为选自以SEQ ID NOs:1-19示出的核苷酸中的至少一种；
或者，一种用于真菌物种鉴定的引物对，其中，所述引物对为选自如下的至少一种：
(1)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
(2)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
(3)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；
(4)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
(5)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；
(6)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；
(7)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；
(8)SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；或者
(9)SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；
优选地，所述真菌是来自子囊菌门或担子菌门的任何真菌；
优选地，所述真菌选自灵芝属真菌、蘑菇属真菌、链格孢属真菌、Apiotrichum属真菌、木耳属真菌、葡萄孢属真菌、镰刀菌属真菌、香菇属真菌、酵母菌属真菌、茯苓属真菌、红酵母属真菌或曲霉属真菌；
优选地，所述真菌选自赤芝、双孢蘑菇、链格孢菌、Apiotrichum laibachii、黑木耳、灰霉菌、尖孢镰刀菌、香菇、酿酒酵母、茯苓、胶红酵母、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、寄生曲霉、塔宾曲霉和日本曲霉。
5.一种对真菌样品或者含真菌的材料进行物种鉴定的试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求4所述的引物对；
优选地，所述试剂盒还包含：室温扩增反应液和CRISPR/Cas12a体系反应液；
优选地，所述室温扩增反应液含有用于进行靶序列扩增的扩增缓冲液、扩增用酶以及无菌超纯水；
优选地，所述CRISPR/Cas12a体系反应液包括：用于进行基因编辑的缓冲液、crRNA、Cas蛋白、无核酸酶水和荧光信号分子；
优选地，所述crRNA为以SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:56示出的crRNA中的任一者。
6.一种构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库的方法，包括：
a)选择指定真菌物种，按照权利要求1-3中任一项所述的方法筛选得到所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列；
b)将所述指定真菌物种的1个或多个特异性靶标序列组合，构建所述特异性靶标序列库。
7.一种构建用于对物种特异性靶标核苷酸进行检测的工具库的方法，包括：
A)选择指定真菌物种，按照权利要求6所述的方法来构建用于真菌物种鉴定的特异性靶标序列库；
B)基于用于所述检测的技术，构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库。
8.一种区分致病真菌及其易混淆真菌的方法，包括：
I)将所述致病真菌或其易混淆真菌用作指定真菌物种，按照权利要求1-3中任一项所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
9.一种用于药材或食品的安全监测或临床检测的方法，包括：
1)将与药材或食品的安全相关或临床易感染的真菌用作指定真菌物种，按照权利要求1-3中任一项所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
2)获得待检测样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列来设计引物对并将所述引物对用来扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测样品与所述指定真菌物种具有同一性，反之则没有。
10.一种区分真菌不同株系的方法，包括：
I)将一种真菌的多个不同株系分别用作指定真菌物种，按照权利要求1-3中任一项所述的方法筛选得到特异性靶标序列；
II)获得待检测的真菌样品的基因组DNA，基于所述特异性靶标序列设计引物对并将所述引物对用于扩增所述基因组DNA，对得到的扩增产物检测是否存在所述特异性靶标序列，若存在所述特异性靶标序列，则所述待检测的真菌样品与所述指定真菌物种为同一株系，反之则不是。
11.一种用于真菌物种鉴定的特异性crRNA分子，其中，所述crRNA分子包括其序列以SEQ ID NOs:38-56示出的crRNA分子中的至少一种。
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