CN116287110A - 一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用。所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；所述制备方法包括：以与待测cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；以5‑甲基‑dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，利用引物对2进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到甲基化对照品。本发明的对照品成本低、便于制备，能够用于同时检测重亚硫酸盐处理cfDNA样品的胞嘧啶的转化率和5‑甲基胞嘧啶检出率，且利于简化DNA甲基化NGS检测过程、降低检测成本。
Description
技术领域
本发明属于DNA甲基化检测技术领域，涉及一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用。
背景技术
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，参与了生物体生长发育、细胞功能调控以及疾病发生发展和转归等过程。DNA异常甲基化导致其功能异常，与多种疾病尤其是癌症的发生和发展密切相关。深入研究DNA甲基化有助于揭示生命活动过程和人类疾病发生的分子机制，对恶性肿瘤等疾病的精准早期诊断和早期干预治疗具有重要的理论价值和临床意义。在DNA甲基化研究中，全基因组甲基化(Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)被誉为检测DNA甲基化的“金标准”，重亚硫酸盐处理DNA是一种较为常见的检测技术，重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不受影响，重亚硫酸盐转化率影响DNA甲基化检测的准确性，未能转化的DNA会在之后检测中产生假阳性，因此，评估重亚硫酸转化DNA效率对于甲基化检测非常必要。
目前，为了评估重亚硫酸盐对胞嘧啶的转化效率，一般会在重亚硫酸盐转化处理中加入1％内参对照品：常见的是甲基化酶缺陷型的大肠杆菌所生产的完全未甲基化的λDNA或从甲基化阴性的细菌中分离出来的pUC19来统计转化效率，同样也可以通过用甲基化酶处理过的CpG岛完全被甲基化的DNA或pUC19来追踪5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)对重亚硫酸盐转化的抵抗效果。这种使用完整的λDNA基因组或pUC19内参对照品在重盐硫酸盐处理人血浆游离核酸(cfDNA)建库过程中，还需提前将其打断成与cfDNA片段大小接近，这样实验成本较高，且后续生信数据分析较为繁琐。此外，也有通过梯度稀释重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品，使用qPCR建立转化与未转化的DNACt值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线，进而定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本来评估转化效率，若在DNA甲基化NGS建库过程中使用该方法，需要预留重亚硫酸盐转化后的样本，会造成珍贵的cfDNA样本损失。而且额外进行qPCR检测，会增加试剂成本和时间成本。
综上所述，提供一种低成本、易于制备且能够快速评估重亚硫酸盐对人血浆cfDNA样本胞嘧啶的转化效率和检出率的内参对照品，对于cfDNA甲基化NGS检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用，本发明能够快速制备价格便宜的未甲基化和甲基化内参对照品，所制备内参对照品易于稳定保存，能够快速、方便和准确地检测cfDNA样本经过重盐硫酸盐转化后的胞嘧啶转化效率和5-甲基胞嘧啶检出率。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；所述制备方法包括：以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以5-甲基-dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，利用引物对2进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到甲基化对照品。
本发明通过设计和合成与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA序列的引物，以与待测cfDNA样本无同源性的DNA为模板，分别以dNTP和5-甲基化-dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，所扩增的DNA产物经纯化获得与待测cfDNA片段大小接近的未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品，能用于同时评估重亚硫酸盐处理cfDNA样品的胞嘧啶的转化率和5-甲基胞嘧啶检出率。
优选地，所述与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA可选自大肠杆菌噬菌体或质粒，包括但不限于λDNA、质粒pUC19、pUC18和pUC57等。
本发明中，所述引物对1和引物对2可以各自独立地为根据待测cfDNA样本无同源性的DNA的序列设计的引物，不作特殊限制。
优选地，所述引物扩增目标片段大小应与人血浆cfDNA片段大小接近，如166bp。
优选地，本发明可选择λDNA为模板设计引物对1和引物对2，进一步优选地，所述引物对1的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述引物对2的核酸序列包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。
SEQ ID NO.1：5’-cggataaactattacaacccc-3’。
SEQ ID NO.2：5’-catattcaggccagttatctgg-3’。
SEQ ID NO.3：5’-ttataatctgctggccggaac-3’。
SEQ ID NO.4：5’-cttcaacgagatgccacgatg-3’。
所述未甲基化对照品和甲基化对照品的长度分别为163bp和167bp。
本发明中，可将所述未甲基化对照品和甲基化对照品DNA溶液梯度稀释，然后混合配置成的未甲基化对照品和甲基化对照品的混合DNA溶液。
第二方面，本发明提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品，所述对照品由第一方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在制备检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的产品中的应用。
第四方面，本发明提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的对照品。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
第五方面，本发明提供第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率中的应用。
第六方面，本发明提供一种重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，所述检测方法包括：
将待测人血浆cfDNA样本与第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品混合，进行重亚硫酸盐转化，将转化后的产物进行文库构建并测序，对测序数据进行分析，计算重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率和重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率。
本发明通过设计和合成与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA序列的引物，以待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，分别以dNTP和5-甲基化-dCTP/dATP/dGTP/dTTP为原料，所扩增的DNA产物经纯化获得与待测cfDNA片段大小接近的未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品，同时设计基于测序分析的重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率检测方法，能够有效地同时评估DNA样品重亚硫酸盐处理的胞嘧啶转化率和5-甲基胞嘧啶检出率，流程示意图如图1所示，为cfDNA甲基化准确分析提供了一种低成本、操作简单、分析准确的可靠参考方法。
本发明所述方法适用于包括人源在内的其它物种基因组的重亚硫酸盐转化胞嘧啶转化率和5-甲基胞嘧啶检出率的检测。
优选地，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率的计算方法包括：
统计测序Reads中未甲基化对照品的Reads数目，统计所有未甲基化对照品的Reads中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率的计算公式如式(1)所示。
优选地，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率的计算方法包括：
统计测序Reads中甲基化对照品的Reads数目，统计所有甲基化对照品的Reads中5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率的计算公式如式(2)所示。
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将待测人血浆cfDNA样本与第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品混合，进行重亚硫酸盐转化，将转化后的产物进行文库构建并测序；
(2)对测序数据进行分析，统计测序Reads中未甲基化对照品的Reads数目和甲基化对照品的Reads数目，统计所有未甲基化对照品的Reads中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，统计所有甲基化对照品的Reads中5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，分别按式(1)和式(2)计算重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率和重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种评估重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA样本后胞嘧啶转化率和5-甲基胞嘧啶检出率的内参对照品制备方法，所制备内参对照品易于稳定保存，能够应用于检测cfDNA样本经过重盐硫酸盐转化后的胞嘧啶转化效率和5-甲基胞嘧啶检出率；
(2)本发明的重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，能够有效地同时评估DNA样品重亚硫酸盐处理的胞嘧啶转化率和5-甲基胞嘧啶检出率，为cfDNA甲基化NGS检测提供了一种低成本、操作简单、分析准确的可靠参考方法。
附图说明
图1为重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法流程示意图；
图2为引物对1(No-5mC Primer)和引物对2(5mC Primer)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图3为未甲基化内参对照品经LabChip检测的片段分布结果图；
图4为甲基化内参对照品经LabChip检测的片段分布结果图；
图5为未甲基化内参对照品序列(No-5mC SEQ)图，下划线标注的碱基为引物对1序列，竖线连接的碱基表示胞嘧啶转化前与转化后；
图6为甲基化内参对照品序列(5mC SEQ)图，下划线标注的碱基为引物对2序列，竖线连接的碱基表示5甲基胞嘧啶转化前与转化后(理论上不转化)。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中以λDNA作为与待测cfDNA样本无同源性的DNA为例验证本发明的对照品的制备方法及重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的检测方法，主要试验试剂包括：
Unmethylated Lambda DNA(λDNA，Cat：D1521)购于Promega；
Structural Multiplex cfDNA References Standard(Cat：HD786)购于Horizon；
DNA Polymerase(Cat：KE2502)购于KAPA Biosystems；
KAPA HiFi Fidelity Buffer(Cat：KB2500)购于KAPA Biosystems；
dNTP Mix、dATP、dTTP、dGTP、5-methyl-dCTP(d5mCTP)(Cat：D1000/D1005/D1010/D1015/D1035)购于Zymo Research；
EZ DNA Methylation-lightning Kit(D5031)购于Zymo Research；
Agencourt AMPure XP(Cat：A63881)购于贝克曼库尔特；
QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Cat：32854)购于Thermo Fisher Scientific；
人血浆cfDNA标准品购于Horizon，片段大小160bp，浓度20ng/μL；
内参对照品制备所用的扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1
本实施例制备用于检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品，包括以下步骤：
(1)设计引物序列
引物对1：来源λDNA序列，用于未甲基化内参对照品制备
No-5mC Primer-F：5’-cggataaactattacaacccc-3’
No-5mC Primer-R：5’-catattcaggccagttatctgg-3’
引物对2：来源λDNA序列，用于甲基化内参对照品制备
5mC Primer-F：5’-ttataatctgctggccggaac-3’
5mC Primer-R：5’-cttcaacgagatgccacgatg-3’；
(2)未甲基化内参对照品制备
以Unmethylated Lambda DNA(λDNA)基因组为模板，以dNTP Mix为原料，根据所述引物对1在PCR热循环仪中扩增目的片段，扩增体系如表1所示，反应条件：95℃、3min，35个循环(98℃20s，65℃15s，72℃30s)，72℃、1min，4℃保持；
表1
| Unmethylated Lambda DNA(1ng/μL) | 1μL |
| KAPA HiFi Hotstart DNA Polymerase | 0.5μL |
| KAPA HiFi Fidelity Buffer(5×) | 4μL |
| dNTP Mix(5nM) | 1.2μL |
| No-5mC Primer-F(10μM) | 0.6μL |
| No-5mC Primer-R(10μM) | 0.6μL |
| DNase/RNase-Free ddH2O | 12.1μL |
PCR反应结束后，取1.5μL产物，用2％琼脂糖胶检测片段大小(～166bp)，目的片段大小约为170bp，剩余反应产物先用0.6×Agencourt AMPure XP磁珠纯化，取上清后再用2×Agencourt AMPure XP磁珠回收产物，使用20μL EB洗脱液洗脱，使用QubitTM dsDNA HSAssayKit测定纯化产物的浓度，并按梯度稀释至200pg/μL；
(3)甲基化内参对照品制备
以Unmethylated Lambda DNA(λDNA)基因组为模板，以dATP、dTTP、dGTP、d5mCTP为原料，根据所述引物对2在PCR热循环仪中扩增目的片段，扩增体系如表2所示，反应条件：95℃、3min，35个循环(98℃、20s，65℃、15s，72℃、30s)，72℃、1min，4℃保持；
表2
PCR反应结束后，取1.5μL产物，用2％琼脂糖胶检测片段大小，扩增产物片段大小约为170bp，且无非特异性条带(如图2所示)，剩余反应产物用0.6×Agencourt AMPure XP磁珠纯化，取上清后再用2×Agencourt AMPure XP磁珠回收产物，使用20μLEB洗脱液洗脱，使用QubitTM dsDNA HS Assay K it测定纯化产物的浓度，并按梯度稀释至50pg/μL并用PerkinElmer LabChip GX Touch 24 Nucleic Acid Analyzer进行内参对照品的片段质检，条带单一，片段大小约166bp(如图3和图4所示)；
(4)将上述200pg/μL未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品DNA溶液按1:1等体积混合配置成100pg/μL的未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品的混合DNA溶液(即混合内参对照品)。
利用上述混合后内参对照品与商品化PCR反应液、文库构建及测序试剂组合，即可制备检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的试剂盒。
实施例2
本实施例进行人血浆cfDNA重亚硫酸盐转化及测序。
人血浆cfDNA标准品购于Horizon，片段大小160bp，浓度20ng/μL，取实施例1中200pg混合内参对照品加入到20ng人血浆cfDNA中，然后进行重亚硫酸盐转化处理，按试剂盒(Zymo，D5031)说明进行操作，将反应产物进行文库构建，按试剂盒(Yeasen，12211ES08)说明书操作，取文库构建产物进行QC定量后上机测序。
实施例3
本实施例对实施例2中测序结果分析，检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和5-甲基胞嘧啶检出率。
在下机Reads中识别未甲基化内参对照品DNA序列(No-5mC SEQ)，根据上述引物对1在λDNA上扩增片段起始终止位置并向两端各扩展100bp，与转化后的人基因组序列进行比对，筛选出相应No-5mC SEQ(图5)的Reads，再去除引物1的序列即获得No-5mC SEQ序列位置，从而统计出下机Reads中所有No-5mC SEQ Reads的条数；按照此方法统计多次测试结果(表3)。
表3
| 编号 | 下机数据(Raw_Reads) | No-5mC SEQ Reads条数 |
| 1 | 5,434,021 | 594,235 |
| 2 | 8,348,122 | 671,529 |
| 3 | 5,870,497 | 622,455 |
在下机Reads识别甲基化内参对照品DNA序列(5mC SEQ)，根据引物对2在λDNA上扩增片段起始终止位置并向两端各扩展100bp，与转化后的人基因组序列进行比对，筛选出相应5mC SEQ(图6)的Reads，再去除引物2的序列即获得5mC SEQ序列位置，从而统计出下机Reads中所有5mC SEQ Reads的条数；按照此方法统计多次测试结果(表4)。
表4
统计下机Reads中No-5mC SEQ序列的Reads数目，进一步地统计每条No-5mC SEQReads中胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)数目，重盐硫酸盐处理cfDNA转化率(％)＝所有No-5mC SEQ Reads中胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)数目/所有No-5mC SEQ Reads中胞嘧啶(C)的数目，计算转化率，按照此方法统计多次测试结果(表5)，结果表明，多次重复测试中胞嘧啶的转化率均在99.7％以上，说明本发明方法能够准确检出cfDNA经重亚硫酸盐处理后胞嘧啶的转化率。
表5
统计下机Reads中5mC SEQ序列的Reads数目，进一步地统计每条5mC SEQ Reads中5-甲基胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)数目，重盐硫酸盐处理cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率(％)＝1-(所有5mC SEQ Reads中5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目/所有No-5mC SEQReads中5-甲基胞嘧啶的数目)，计算5-甲基胞嘧啶检出率，按照此方法统计多次测试结果(表6)，结果表明，多次重复测试中5-甲基胞嘧啶的检出率均在97.8％以上，说明该方法能够准确检出cfDNA经重亚硫酸盐处理后5-甲基胞嘧啶的检出率。
表6
实施例4
本实施例评估实施例3中本发明制备的内参对照品计算转化率和检出率的准确性。
使用常规商业化未甲基化λDNA(Control DNA unmethylated lambda，来源于Promega公司，D1512)来评估胞嘧啶的转化率，使用CpG甲基化的pUC19基因组(Control DNACpG methylated pUC19，来源于Zymo Research，D5017)评估5-甲基胞嘧啶的检出率，需要将其打断后添加到cfDNA中，经重亚硫酸转化之后建库上机测序，具体结果如表7所示，结果表明使用常规的内参对照品计算的转化率和检出率与本发明所述方法计算结果一致，说明本发明的评估重亚硫酸盐处理后的转化率和检出率的方法是准确、可行，说明与常规对照品相比，本发明制备的对照品具备低成本、便于制备的特点同时，还能够直接应用于同时检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率，无需额外打断等处理，利于简化检测过程。
表7
综上所述，本发明以与待测cfDNA样本无同源性的DNA为模板，分别以dNTP和5-甲基化-dCTP/dATP/dGTP/dTTP为原料，扩增获得与待测cfDNA片段大小接近的未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品，成本低、便于制备，能够用于同时检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA样品的胞嘧啶的转化率和5-甲基胞嘧啶检出率，结果准确可靠，且利于简化检测过程、降低检测成本。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法，其特征在于，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；
所述制备方法包括：
以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；
以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以5-甲基-dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，利用引物对2进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到甲基化对照品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA选自大肠杆菌噬菌体或质粒，包括λDNA、质粒pUC19、质粒pUC18或质粒pUC57中任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述引物对1和引物对2各自独立地为根据与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA的序列设计的引物；
所述未甲基化对照品和甲基化对照品的长度分别为163bp和167bp。
4.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品，其特征在于，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品，所述对照品由权利要求1-3任一项所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法制备得到。
5.权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在制备检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的产品中的应用。
6.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品；
所述试剂盒还包括PCR反应液。
7.权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率中的应用。
8.一种重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
将待测人血浆cfDNA样本与权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品混合，进行重亚硫酸盐转化，将转化后的产物进行文库构建并测序，对测序数据进行分析，计算重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率和重亚硫酸盐处理cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率。
9.根据权利要求8所述的重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，其特征在于，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率的计算方法包括：
统计测序Reads中未甲基化对照品的Reads数目，统计所有未甲基化对照品的Reads中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率的计算公式如式(1)所示；
所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率的计算方法包括：
统计测序Reads中甲基化对照品的Reads数目，统计所有甲基化对照品的Reads中5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，所述重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率的计算公式如式(2)所示；
10.根据权利要求8或9所述的重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将待测人血浆cfDNA样本与权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品混合，进行重亚硫酸盐转化，将转化后的产物进行文库构建并测序；
(2)对测序数据进行分析，统计测序Reads中未甲基化对照品的Reads数目和甲基化对照品的Reads数目，统计所有未甲基化对照品的Reads中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，统计所有甲基化对照品的Reads中5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶数目，分别按式(1)和式(2)计算重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA的转化率和重亚硫酸盐处理cfDNA的5-甲基胞嘧啶检出率。
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