CN116286786A - 一种单细胞内rna全转录组标记和测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请一种单细胞内RNA全转录组标记的方法。进一步的，涉及一种单细胞内RNA全转录组测序的方法，以及一种单细胞内RNA m6A修饰测序方法和一种单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序方法。本申请的方法实现了单细胞水平的RNA标记，并且提供了高通量单细胞RNA m6A标记及测序的方法。
Description
技术领域
本申请涉及测序领域。具体涉及一种单细胞内RNA全转录组标记的方法。进一步的，涉及一种单细胞内RNA全转录组测序的方法，以及一种单细胞内RNA m6A修饰组的测序方法和一种单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序方法。
背景技术
表观遗传学是经典遗传学的重要补充，在不改变DNA序列的情况下，核酸、蛋白质等生物大分子时刻处于时空特异、双向可逆的动态修饰之中，可遗传的调控着基因表达的变化。随着人类基因组计划的完成和测序技术的进步，核酸修饰逐渐成为了新的研究热点。在核酸表观遗传领域中，RNA修饰引发的表观转录组学在近些年受到大量的关注。RNA中除了常规的四种组成碱基之外，在碱基和糖环上还存在着一些化学修饰。目前，研究人员已经在RNA分子上发现了170多种化学修饰，这些修饰广泛存在于各种RNA类型中，包括转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、核内小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)等。在RNA修饰的早期发展阶段，相关研究主要集中在含量丰富的非编码RNA上，例如tRNA、rRNA和snRNA等。随着RNA化学修饰在全转录组水平上的发现与鉴定，RNA修饰相关酶和识别蛋白的发现，以及潜在生物医学功能的揭示，引发了“表观转录组学”的研究热潮。
目前，在真核生物的mRNA上已经发现了包括端帽结构处的7-甲基鸟嘌呤(m7G)，N6,2’-O-二甲基腺嘌呤(m6Am)，2-氧甲基化(Nm)，还包括内部的N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤(I)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶(Ψ)和N4-乙酰胞嘧啶(ac4C)。其中，m6A修饰是mRNA上含量最丰富且研究最广泛的一种甲基化修饰。目前发现m6A可以影响RNA的剪接、稳定性和翻译等代谢过程，进而调控组织分化、记忆形成、肿瘤发生、病毒感染等重要的生理和病理过程。
对于RNA m6A修饰来说，目前基于抗体、酶和化学分子开发了多种各具特色的全转录组检测方法(Hartstock K.,et al.2019,Chemistry)，但是目前仍然没有能在单细胞中检测m6A修饰的测序方法。
为开发单细胞RNA m6A修饰的检测方法，需要开发一种能够实现单细胞内全转录组标记的测序的方法。
发明内容
本申请的发明人在研究过程中注意到，在单细胞测序过程中，现有技术普遍利用随机引物或者混合的随机引物和多聚T的引物，但是这些方法逆转录都会造成polyA尾巴RNA较多的系统偏差。而且由于二代测序的读长限制，这些方法建立的RNA文库不能覆盖完整的转录组，只能对转录本的一侧进行测序。所以本申请的发明人对RNA片段进行打断，以多轮RNA连接标记RNA分子，保证测序的均一性，并设计了独特的接头组(第一接头组至第四接头组)。例如，在第一接头组的第一链中的第一个碱基设置为任意的随机碱基(序列表中用N表示)，这是为了排除碱基的差异所带来的连接效率的差别。本发明的标记方法实现了标记链和RNA链在同一链，这种标记不会受到高温加热导致解链的影响。
进一步的，本申请的方法与现有技术的主要区别在于本申请使用了连接法标记细胞而不是基于碱基配对和逆转录，而且标记信息链和RNA处于同一链，实现稳定的标记，有利于后续提取RNA和抗体富集等操作。现有技术在标记过程中使用了RNA逆转录酶会导致RNA以DNA:RNA杂合链的形式存在，造成RNA修饰信息的识别困难，也可能造成RNA的降解。本发明保证了RNA完整的单链状态。在标记RNA的同时不影响RNA的状态。
因此，在第一方面，本申请提供了一种单细胞内RNA全转录组标记的方法，所述方法包括：
(1)提供含有细胞的样品，对所述细胞进行固定和通透；
(2)将细胞内RNA打断，并进行3’末端修复，获得多个RNA片段；
(3)对所述RNA片段进行标记，具体步骤如下：
(a)提供第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，
其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补，
将腺苷酰化酶(Adenylase)和第一链接触，在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第一接头组与所述RNA片段接触，以使得所述第一接头组的第一链与RNA片段的3’末端连接；
(b)提供第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，
其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第二接头组与步骤(a)的产物接触，以使得所述第二接头组与第一接头组的第一链的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第一中和引物(例如，第二链)与上述退火后获得的产物接触，所述第一中和引物(例如，第二链)与第三链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(c)提供第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，
其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第三接头组与步骤(b)的产物接触，以使得所述第三接头组的第四链与第二接头组的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第二中和引物(例如，第五链)与上述退火后获得的产物接触，所述第二中和引物(例如，第五链)与第三接头组中的第四链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(d)提供第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，
其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第四接头组与步骤(c)的产物接触，以使得所述第四接头组的第六链与第三接头组的第四链的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第三中和引物(例如，第七链)与上述退火后获得的产物接触，所述第三中和引物(例如，第七链)与第四接头组中的第六链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(e)提供第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，
其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第五接头组与步骤(d)的产物接触，以使得所述第五接头组与第四接头组的第六链的3’末端连接；
(f)在允许核酸连接的条件下，将DNA聚合酶与步骤(g)获得的产物接触；
(4)分选单细胞，即获得RNA全转录组标记的单细胞。
在某些实施方案中，每一轮的接头组的第一链、第三链、第四链或第六链的序列中都带有特定的6-12个碱基序列，称为连接序列。连接序列设计的原则是特异。在某些实施方案中，连接序列是8个碱基的任意排列组合。在某些实施方案中，任意变动2个以下的碱基，连接序列的序列都不会相同。这是为了防止测序错误导致的误差。在某些实施方案中，连接序列(即，含有连接序列的第一链、第三链、第四链或第六链)的数量跟实验的单细胞的数量是对应的，连接序列(即，含有连接序列的第一链、第三链、第四链或第六链)的数量必须大于一次测序所检测的细胞数。数量越大越好，但是相应的操作工作量也变大，所以数量一般在10倍的细胞数为宜。
在某些实施方案中，每一轮的接头组中的第一链、第二链、第三链、第四链、第五链、第六链、第七链和第八链的序列中都含有模板序列，目的是为了能够和其余链互补。例如，在某些实施方案中，第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补。在此类实施方案中，只要能够实现上述互补功能的所述第一模板序列和所述模板序列，都在本申请意欲保护的范围内，并不局限于实施例所具体使用的序列。而设计能够互补的所述第一模板序列和所述模板序列的方法，对于本领域技术人员来说是已知的。
在某些实施方案中，第一接头组中的第一链进行腺苷酰化反应。在某些实施方案中，第一接头组中的第一链通过腺苷酰化酶(Adenylase)进行腺苷酰化反应。
在某些实施方案中，第一链、第三链、第四链和第六链均进行磷酸化反应。在某些实施方案中，第一链、第三链、第四链和第六链的5’末端均带有磷酸化修饰。
在某些实施方案中，第六链的第二模板序列与用于测序的引物互补。
在第二方面，本申请提供了一种单细胞内RNA全转录组测序的方法，所述方法包括：
(1)通过如前所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集如前所述的方法中步骤(4)获得的单细胞中的RNA；
(3)对所述RNA进行测序，即实现单细胞内RNA全转录组测序。
在某些实施方案中，全转录组包含了全部RNA的信息，例如，mRNA，rRNA，tRNA。
在第三方面，本申请提供了一种单细胞内RNA m6A修饰组测序的方法，所述方法包括：
(1)通过如前所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集如前所述的方法中步骤(4)获得的单细胞中的RNA；
(3)对所述RNA进行测序，即实现单细胞内RNA m6A修饰组测序；
任选地，对上述步骤(2)的产物进行醇沉以及rRNA去除。
在第四方面，本申请提供了一种单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序方法，所述方法包括：
(1)通过如前所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集步骤(1)获得的单细胞中的RNA；
(3)对步骤(5)获得的产物进行洗脱，获得RNA-蛋白质复合物；
(4)将步骤(3)获得的RNA-蛋白质复合物进行凝胶电泳并转膜，选择目标蛋白上方区域的RNA-蛋白质复合物产物进行切胶回收；
(5)提取步骤(4)获得的产物中的RNA，并建立RNA文库；
(6)对步骤(5)获得的产物进行醇沉以及rRNA去除；
(7)对步骤(6)获得的RNA进行测序，即实现单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：
(i)对步骤(4)获得的单细胞进行醇沉；
(ii)去除步骤(i)获得的产物中的DNA；
(iii)利用步骤(ii)获得的产物建立RNA文库。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：
(i)对步骤(4)获得的单细胞进行RNA提取纯化和醇沉；
(ii)对步骤(i)获得的产物进行免疫沉淀(例如，充分洗涤并用m6A核苷类似物进行竞争洗脱释放含有m6A修饰的RNA)；
(iii)对步骤(ii)获得的产物进行洗脱。
在某些实施方案中，对(iii)获得的产物进行醇沉以及去除rRNA。
在某些实施方案中，所述建立RNA文库的方法包括：
(a)对(ii)获得的产物中的RNA进行反转录；
(b)对步骤(a)获得的产物进行PCR扩增；
(c)对步骤(b)获得的产物进行T7-RNA聚合酶扩增；
(d)去除步骤(c)获得的产物中的rRNA；
(e)对步骤(d)获得的产物进行反转录以及PCR扩增。
在某些实施方案中，所述醇沉的步骤包括：将SDS、蛋白酶K和Triton X-100溶液与细胞接触；然后提取RNA；然后加入乙醇、醋酸钠以及糖原。
在某些实施方案中，步骤(a)中，所述连接序列为9个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，步骤(b)和(c)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，步骤(d)中，所述连接序列为16个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，步骤(e)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。
在某些实施方案中，所述第二链的第一模板序列的长度16-22个碱基(例如，19个碱基)。
在某些实施方案中，所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)。
在某些实施方案中，所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)。
在某些实施方案中，所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)。
在某些实施方案中，所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:70所示的序列。
在某些实施方案中，第二链具有如SEQ ID NO:97所示的序列。
在某些实施方案中，所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如SEQ IDNO:98至SEQ ID NO:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:167所示的序列。
在某些实施方案中，所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如SEQ IDNO:195至SEQ ID NO:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:264所示的序列。
在某些实施方案中，第五链具有如SEQ ID NO:291所示的序列。
在某些实施方案中，所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如SEQ IDNO:293至SEQ ID NO:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:362所示的序列。
在某些实施方案中，所述第七链具有如SEQ ID NO:389所示的序列。
在某些实施方案中，在步骤(b)至步骤(d)中，提供DNA聚合酶(例如，DNA连接酶，例如，T4 DNA连接酶)。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，使1％-5％(例如，1％，2％，3％，4％，5％)甲醛与细胞接触，冰上放置10min-30min(例如，15min)，加入5％Digitonin，评估细胞通透的情况。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，取个106细胞，使其与DPBS接触，然后与10mL4％甲醛接触，在冰上固定20分钟。使其与10μL 5％Digitonin，30μL RNA酶抑制剂接触，冰上放置5分钟。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，细胞内RNA打断的方法为通过离子和高温加热方法或RNA酶切方法。
在某些实施方案中，离子和高温加热方法的具体步骤为：在金属离子(例如，镁离子或锌离子)的存在下，25℃-42℃(例如，25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，37℃，40℃，42℃)水浴30min-120min(例如，30min，60min，90min，120min)。
在某些实施方案中，离子和高温加热方法的具体步骤为：在锌离子的存在下，37℃水浴90min。然后，加入EDTA与缓冲液(例如，DPBS中加入500μL 10mM Tris-HCL(pH 8.0)和20μL 5％Triton X-100)。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，3’末端修复的方法为：使打断的RNA与核酸聚合酶(例如，T4 PNK酶)接触。
在某些实施方案中，在步骤(4)中，通过流式细胞术分选单细胞。
在本申请的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含：
(a)第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，
其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个碱基(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补；
(b)第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，
其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补；
(c)第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，
其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补；
(d)第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，
其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补；
(e)第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，
其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补；
任选地，所述试剂盒还包含：用于腺苷酰化的试剂(例如，腺苷酰化酶(Adenylase))，用于磷酸化的试剂(例如，T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase))，DNA聚合酶(例如，T4 DNA连接酶)，金属离子(例如，锌离子，镁离子)，用于细胞固定和通透的试剂(例如，甲醛，甲醇，Digitonin，TritonX-100，Tween-20)，用于打断RNA的试剂(例如，核糖核酸酶(RNase I)，微球菌核酸酶(MNase))，用于RNA测序的试剂，用于RNA 3’末端修复的试剂，用于分选单细胞的试剂，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述第一链的连接序列为9个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，所述第三链和第四链的连接序列为8个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，所述第六链的连接序列为16个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，所述第八链的连接序列为8个碱基的随机排列。
在某些实施方案中，所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。
在某些实施方案中，所述第二链的第一模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)。
在某些实施方案中，所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)。
在某些实施方案中，所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)。
在某些实施方案中，所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)。
在某些实施方案中，所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)。
在某些实施方案中，所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:70所示的序列。
在某些实施方案中，第二链具有如SEQ ID NO:97所示的序列。
在某些实施方案中，所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如SEQ IDNO:98至SEQ ID NO:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:167所示的序列。
在某些实施方案中，所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如SEQ IDNO:195至SEQ ID NO:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:264所示的序列。
在某些实施方案中，第五链具有如SEQ ID NO:291所示的序列。
在某些实施方案中，所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如SEQ IDNO:293至SEQ ID NO:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:362所示的序列。
在某些实施方案中，所述第七链具有如SEQ ID NO:389所示的序列。
如前所述的试剂盒在单细胞内RNA全转录组标记中的用途；或在单细胞内RNA全转录组测序中的用途；或在单细胞内RNA m6A修饰组测序中的用途；或用于单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序中的用途。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所使用的，术语“转录组(transcriptome)”与“全转录组”表示相同的含义，可互换使用。其是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合。通常，转录组包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。转录组测序包括了组织或细胞中所有的mRNA，无论mRNA是否会进行翻译。
如本文所使用的，术语“腺苷酰化”是指以5’端磷酸化的单链DNA为底物，利用腺苷酰化酶将ATP分解成AMP和PPi，AMP转移到单链DNA的5’磷酸基团上，形成腺苷酰化单链DNA，从而制备出腺苷酰化接头。
如本文所使用的，术语“磷酸化”是指磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质(protein)上的过程。
如本文所使用的，术语“N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰”是指在腺苷6位的N原子上插入一个甲基取代基。
如本文所使用的，术语“RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)”是指一类伴随RNA的调控代谢过程与RNA结合的蛋白质的总称。RNA结合蛋白是细胞中一类重要的蛋白质，它们通过识别特殊的RNA结合域与RNA互作，广泛参与到RNA剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个转录后调控过程中。
如本文所使用的，术语“免疫沉淀”是指利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白及其结合的核酸底物的一种方法。通常来说，免疫沉淀首先通过抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合，再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的珠子(Agarose或Sepharose)孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，可用于沉淀产物的纯化提取，包括蛋白质，DNA或者RNA。
如本文所使用的，术语“醇沉(Alcohol Precipitation)”是指一种除去杂质保留目的有效成分的方法。本文中是指利用乙醇沉淀RNA，该方法利用核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，可以与许多1价、2价离子结合形成盐类，后者在有机溶剂中不溶解也不变性，在较低温度下形成沉淀，从而去除其他杂质的方法。
如本文所使用的，术语“中和引物”是指能够与接头组互补的引物，即能够实现中和接头组的功能的全部引物。在本申请的方法中，为了保证接头组的正确连接，在混样之前需要提前将多余的接头组用中和引物进行提前饱和配对消耗。本领域技术人员可以理解，本申请的中和引物并不局限于实施例所实际使用的具体序列的中和引物，只要能够实现中和接头组功能的引物均属于本申请所意欲保护的范围。因此，在某些实施方案中，第一中和引物是能够与第三链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第一中和引物是第二链。在某些实施方案中，第二中和引物是能够与第三接头组中的第四链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第二中和引物是第五链。在某些实施方案中，第三中和引物是能够与第四接头组中的第六链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补的引物。在某些实施方案中，第三中和引物是第七链。
发明的有益效果
与现有技术相比，本申请的方法实现了单细胞水平的RNA标记，能够对细胞内所有的RNA片段进行无偏差标记，而现有技术存在普遍的mRNA偏好性。申请的方法与现有技术的主要区别在于本申请使用了连接法标记细胞而不是碱基配对，标记信息链和RNA处于同一链，实现稳定的标记，有利于后续提取RNA和抗体富集等操作。本申请的方法保证了RNA完整的单链状态。在标记RNA的同时不影响RNA的状态。
另外，目前尚无可实现高通量单细胞m6A检测的方法，而本申请提供了高通量单细胞RNA m6A标记及测序的方法，填补了这一领域的空白。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1为本申请方法中对细胞RNA标记的流程和原理图。
图2为构建的文库结果，其中，图2a显示了插入和标记序列的扩增结果，图2b显示了文库测序的碱基信息。
图3为单细胞测序结果，其显示了单个细胞内捕捉到的RNA分子数。
图4为单细胞细胞转录组测序数据分析结果，其显示了单细胞全转录组聚类和单个细胞中细胞周期marker基因JPT1表达的情况。
图5为单细胞m6A测序分析结果，其中，图5a显示了IGV展示代表基因m6A的富集情况，图5b显示了单细胞m6A测序中单个细胞中检测到的含有m6A修饰的基因数目。
图6为本申请方法中第一至第五接头组中各个链的互补或连接关系图。
图7为本申请方法中第一至第五接头组中各个链的互补或连接序列图。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
注：上表中的“N”表示碱基A、T、C、G中的任意一种；第一、三、四、六链的5’末端均带有磷酸化修饰；“*”代表硫代修饰。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.细胞固定和通透
本申请的方案可以同时标记106个细胞。细胞经DPBS冲洗两次后，加入10mL 4％甲醛(每100万细胞加入1mL 4％甲醛)，在冰上固定20分钟，每隔5分钟混匀一次。同时提前取出5％Digitonin(购自InvitrogenTM，BN2006)在90℃中预热融化。在固定好的细胞中加入10μL 5％Digitonin，加入30μL RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)，轻轻的混匀后，在冰上放置5分钟，每隔2分钟混匀一次，最后通过细胞计数仪评估细胞通透情况。本实施例最终的评估结果显示，细胞通透情况良好，可用于后续实验。
实施例2.RNA的打断和3’末端修复
配置solution A，即在500μL DPBS中加入500μL 10mM Tris-HCL(pH 8.0)和20μL5％Tritonx-100。同时在实施例1的基础上，将通透的细胞分成两管，各5mL。在4℃预冷的恒温高速离心机中500g离心5分钟。小心去除上清，勿触碰细胞沉淀。每管各加入500μLsolution A，混匀后转移到1.5mL离心管中。再次用同样的转速离心3分钟，去除上清，加入500μL的solution A，混匀后离心去除上清。此时加入等体积的solution A(100μL)，再加入20μL含zn2+的10×Fragmentation reagent(Thermo，货号AM8740)，在37℃金属浴中反应90分钟。反应结束后，加入20μL stop solution(Thermo，货号AM8740)和20μL solution A。充分混匀后在4℃预冷的恒温高速离心机中500g离心3分钟，去除上清，加入500μL solutionA混匀后，再次离心，去除上清。
此时每管分别加入450μL的NF-H2O，50μL T4 PNK buffer，20μL5％TritonX-100，20μL T4 PNK酶，在37℃金属浴中反应90分钟。
实施例3.细胞的标记和分选
第一组实验：以下实验使用96条第一链、第三链、第四链和第六链。
1、细胞内RNA的标记
在上述实施例2的基础上，将3’末端修复后的细胞合并成一管，加入100μL T4 DNAligase buffer。充分混匀后分成10管，每管100μL，再分别加入10μL如SEQ ID NO:1至SEQID NO:96所示的第一链和如SEQ ID NO:97所示的第二链所组成的第一接头组R1(第一接头组通过5’DNA Adenylation Kit(NEB#E2610L)预先进行了腺苷酰化反应。按照试剂盒的说明书，反应条件为65℃反应1小时，然后85℃反应5分钟终止反应。然后置于-20℃留存备用)，在37℃金属浴上过夜反应。反应结束后，分别加入200μL solution A，充分混匀后，在离心机中600g离心3分钟，小心地去除上清，在第1管中加入500μL solution A，充分混匀后加入到第2管，以此操作直到第10管，充分混匀后，再分成10管，再分别加入3μL如SEQ IDNO:98至SEQ ID NO:193所示的第三链所组成的第二接头组R2，在37℃金属浴中反应30-60分钟，优选45分钟。反应结束后，加入3.2μL第二链，以中和过量的第三链。在37℃金属浴中反应15分钟后，以此前的方式将10管收集到1管，再加入90μL T4 DNA ligase，充分混匀后，再分装成10管，每管100μL，再分别加入3.5μL如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:290所示的第四链和如SEQ ID NO:291所示的第五链所组成的第三接头组R3，在37℃金属浴上反应45分钟，再分别加入3.8μL第五链，以中和过量的第四链，混匀后在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再加入90μL T4 DNA ligase，混匀后分装到10管中，每管100μL，再分别加入4μL如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:388所示的第六链和如SEQ ID NO:389所示的第七链所组成的第四接头组R4，在37℃金属浴中反应45分钟，在分别加入4.3μL第七链，以中和过量的第六链，在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再分成两管，每管500μL，在离心机中500g离心3分钟，去除上清。加入适量的dNTP mix(10mM)、Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification Buffer(购自NEB，M0374M。Bst 3.0DNA Polymerase试剂中的buffer)和RNase Inhibitor，总体积为500μL，分装到8联排管中，每管25μL，每孔再分别加入2.5μL不同的第八链(即，图6中的P5接头)，即购自NEB，E7500L NEBNext MultiplexOligos for Illumina.E7500L的index，置于金属浴上37℃反应30分钟。
第二组实验：以下实验使用70条第一链、第三链、第四链和第六链。
1、细胞内RNA的标记
在上述实施例2的基础上，将3’末端修复后的细胞合并成一管，加入100μL T4 DNAligase buffer。充分混匀后分成10管，每管100μL，再分别加入10μL如SEQ ID NO:1至SEQID NO:70所示的第一链和如SEQ ID NO:97所示的第二链所组成的第一接头组R1(第一接头组通过5’DNA Adenylation Kit(NEB#E2610L)预先进行了腺苷酰化反应。按照试剂盒的说明书，反应条件为65℃反应1小时，然后85℃反应5分钟终止反应。然后置于-20℃留存备用)，在37℃金属浴上过夜反应。反应结束后，分别加入200μL solution A，充分混匀后，在离心机中600g离心3分钟，小心地去除上清，在第1管中加入500μL solution A，充分混匀后加入到第2管，以此操作直到第10管，充分混匀后，再分成10管，再分别加入3μL如SEQ IDNO:98至SEQ ID NO:167所示的第三链所组成的第二接头组R2，在37℃金属浴中反应30-60分钟，优选45分钟。反应结束后，加入3.2μL第二链，以中和过量的第三链。在37℃金属浴中反应15分钟后，以此前的方式将10管收集到1管，再加入90μL T4 DNA ligase，充分混匀后，再分装成10管，每管100μL，再分别加入3.5μL如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:264所示的第四链和如SEQ ID NO:291所示的第五链所组成的第三接头组R3，在37℃金属浴上反应45分钟，再分别加入3.8μL第五链，以中和过量的第四链，混匀后在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再加入90μL T4 DNA ligase，混匀后分装到10管中，每管100μL，再分别加入4μL如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:362所示的第六链和如SEQ ID NO:389所示的第七链所组成的第四接头组R4，在37℃金属浴中反应45分钟，在分别加入4.3μL第七链，以中和过量的第六链，在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再分成两管，每管500μL，在离心机中500g离心3分钟，去除上清。加入适量的dNTP mix(10mM)、Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification Buffer(购自NEB，M0374M。Bst 3.0DNA Polymerase试剂中的buffer)和RNase Inhibitor，总体积为500μL，分装到8联排管中，每管25μL，每孔再分别加入2.5μL不同的第八链(即，图6中的P5接头)，即购自NEB，E7500L NEBNext MultiplexOligos for Illumina.E7500L的index，置于金属浴上37℃反应30分钟。
第三组实验：以下实验使用45条第一链、第三链、第四链和第六链，并且各个接头组的序列以及中和引物的序列与上述不同。
1、细胞内RNA的标记
在上述实施例2的基础上，将3’末端修复后的细胞合并成一管，加入100μL T4 DNAligase buffer。充分混匀后分成10管，每管100μL，再分别加入10μL如SEQ ID NO:1至SEQID NO:45所示的第一链和如SEQ ID NO:97所示的第二链所组成的第一接头组R1(第一接头组通过5’DNA Adenylation Kit(NEB#E2610L)预先进行了腺苷酰化反应。按照试剂盒的说明书，反应条件为65℃反应1小时，然后85℃反应5分钟终止反应。然后置于-20℃留存备用)，在37℃金属浴上过夜反应。反应结束后，分别加入200μL solution A，充分混匀后，在离心机中600g离心3分钟，小心地去除上清，在第1管中加入500μL solution A，充分混匀后加入到第2管，以此操作直到第10管，充分混匀后，再分成10管，再分别加入3μL如SEQ IDNO:98至SEQ ID NO:142所示的第三链所组成的第二接头组R2，在37℃金属浴中反应30-60分钟，优选45分钟。反应结束后，加入3.2μL第二链，以中和过量的第三链。在37℃金属浴中反应15分钟后，以此前的方式将10管收集到1管，再加入90μL T4 DNA ligase，充分混匀后，再分装成10管，每管100μL，再分别加入3.5μL如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:239所示的第四链和如SEQ ID NO:291所示的第五链所组成的第三接头组R3，在37℃金属浴上反应45分钟，再分别加入3.8μL第五链，以中和过量的第四链，混匀后在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再加入90μL T4 DNA ligase，混匀后分装到10管中，每管100μL，再分别加入4μL如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:337所示的第六链和如SEQ ID NO:389所示的第七链所组成的第四接头组R4，在37℃金属浴中反应45分钟，在分别加入4.3μL第七链，以中和过量的第六链，在37℃金属浴中反应15分钟，同样收集到1管中。再分成两管，每管500μL，在离心机中500g离心3分钟，去除上清。加入适量的dNTP mix(10mM)、Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification Buffer(购自NEB，M0374M。Bst 3.0DNA Polymerase试剂中的buffer)和RNase Inhibitor，总体积为500μL，分装到8联排管中，每管25μL，每孔再分别加入2.5μL不同的第八链(即，图6中的P5接头)，即购自NEB，E7500L NEBNext MultiplexOligos for Illumina.E7500L的index，置于金属浴上37℃反应30分钟。
2、DNA补齐
完成上述多轮连接之后，使用T4 DNA聚合酶(NEB)对标记DNA链3’末端进行补齐。反应温度12度，反应30分钟。
3、细胞分选
反应结束后，合成1管，再均分成2管，在离心机中500g离心3分钟，去除上清，每管加入500μL solution A，用40μm滤膜过滤，收集到流式管中进行分选单细胞。每1万个单细胞分选到放有50μL裂解液的1.5mL离心管中。
实施例4.单细胞全转录组测序
(1)醇沉
取出上述实施例3分选出来的细胞，加入1μL Proteinase K(DUOMI，R21066-5mL)，在56℃金属浴中反应4小时，在70℃反应20分钟使酶失活。加入150μL NF-H2O，200μL RNA提取液，充分混匀后在4℃放置5分钟，在4℃预冷恒温高速离心机中14000rpm离心5分钟，轻轻的取出上清置于新的1.5mL离心管中，加入1μL糖原，3倍体积的无水乙醇，20μL的醋酸钠，充分混匀后在-80℃中过夜醇沉。在4℃预冷恒温高速离心机中14000rpm离心40分钟，去除上清，用75％乙醇洗涤沉淀一次，再次离心5分钟，弃掉上清，将管盖打开，置于室温干燥约5-10分钟，用50μL水溶解沉淀。
(2)去除DNA
加入0.4x DNA clean beads(20μL)(购自诺维赞，N411-02)，混匀后室温孵育5分钟，放在磁力架上直至溶液澄清(大约5分钟)，小心吸取上清到新的离心管中，再加入0.4xDNA clean beads，混匀后室温孵育5分钟，放在磁力架上，待溶液澄清(大约5分钟)，小心移除上清，样品依然放在磁力架上，加入300μL 80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清，重复此步骤再次漂洗，室温下开盖干燥磁珠约5-10分钟，加入30Μl NF-H2O，涡旋振荡混匀，室温静置2分钟，在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后将上清吸至到新的离心管中。
(3)反转录
在上述的体系中加入反转录试剂，此处所用的反转录酶是SMARTScribeTMReverse Transcriptase(Thermo，货号639538)，并且加入链置换引物N4TSO(其序列如SEQID NO:98所示)，涡旋振荡充分混匀后，置于PCR仪器中，25℃5分钟，42℃90分钟，85℃10分钟，4℃保存。
(4)PCR扩增
将上述得到的cDNA用DNA clean beads进行纯化，用32μL无酶水溶解。使用with-universal(其序列如SEQ ID NO:292所示)和T7-pre-universal引物(其序列如SEQ ID NO:390所示)进行全转录组的扩增。对于本方案大约需要14个循环即可完成全转录组的扩增。
(5)T7扩增
按照T7 High Efficiency Transcription Kit试剂盒的说明书配置T7反转录体系，涡旋混匀后在PCR仪中37℃过夜反应。
(6)rRNA去除
加入2μLEDTA终止反应后，用RNA clean beads纯化后，溶解到80μL的无酶水中，测定此时RNA的浓度。用DNase去除反应体系中的模板DNA后再次用RNA clean beads纯化。使用核糖体去除试剂盒去除核糖体RNA再次纯化RNA。
(7)反转录和PCR扩增
在上述的体系中加入with-universal引物(其序列如SEQ ID NO:292所示)，按照说明书的要求进行反转录。反转录结束后加入RNaseA在37℃中消化5分钟。用DNA cleanbeads纯化后溶解在32μL的无酶水中。最后使用with-universal(其序列如SEQ ID NO:292所示)和universal(其序列如SEQ ID NO:391所示)进行PCR的扩增，需要4-8个循环。PCR结束后，再次用DNA clean beads纯化，溶解于40μL无酶水中，至此得到上机测序的文库。
上述步骤(3)至(7)涉及的序列，方法和原理具体可参见专利CN111549025A。
实施例5.单细胞m6A组测序
下述免疫相关实验过程中所用的试剂(例如，缓冲液、抗体等)、工具(例如，磁珠等)均来自试剂盒Magna MeRIPTM m6A Kit-Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine，购自Millipore，17-10499。
(1)为免疫反应准备磁珠
分别取出6.25μL protein A beads和protein G beads到1.5mL的离心管中，加入200μL 1×IP buffer，混匀后放在磁力架上，弃掉上清，重复洗涤3次。再加入100μL 1×IPbuffer，加入5μg抗体，室温旋转孵育30分钟。
抗体孵育后，放在磁力架上，待溶液澄清，弃掉上清，用1×IP buffer漂洗三次，最后加入400μL 1×IP buffer混匀。
(2)免疫沉淀反应
在实施例4步骤(1)醇沉去除DNA之后，加入10μL RNase Inhibitor，20μL 5×IPbuffer，400μL准备的磁珠混合液，4℃旋转反应4小时。
(3)洗脱
反应结束后，将样品置于磁力架上，收集上清作为Input样本，beads用1×IPbuffer漂洗3次，加入100μL根据说明书配置的洗脱液，4℃旋转1小时，将样品放到磁力架上，收集上清。再将beads中加入100μL的洗脱液，4℃旋转1小时，放在磁力架上，收集上清。两次的上清可以合在一起，作为IP样本。
Input和IP样本均加入1/50的10％SDS和Proteinase K(DUOMI，R21066-5mL)进行消化释放RNA。
(4)醇沉，步骤同实施例4的(1)。
(5)rRNA去除，步骤同实施例4的(6)。
分析：
多种分析软件用于对SPLiT-pool文库测序数据的下游处理。首先，利用cutadapt软件去除双端数据的测序接头，然后根据ligation和barcode组合的具体位置和固定碱基序列对双端reads进行筛选，并在符合筛选条件的测序数据上添加barcode信息。随即利用Trimmomatic软件对满足文库结构的插入片段进行序列长度和碱基质量的质控，得到最终质控的双端数据，用于小鼠转录组的序列比对。比对到小鼠转录组上的序列可以根据reads上标记的barcode组合信息进行拆分，每种barcode组合内的reads信息代表单个细胞内的转录组信息。同时，针对每个单细胞内reads的数量、捕获到的基因数目等条件，对其进行保留或丢弃，以得到高质量的单细胞数据，用于单细胞转录组下游分析。
将单细胞的数据经过降维和聚类，得到不同种类的细胞，将m6A组数据和input组数据进行同一种类合并并通过macs2软件进行m6A位点的鉴定。将单细胞的reads在保守的m6A修饰区间进行mapping和统计，得到单细胞m6A位点的表达矩阵。通过分析m6A表达矩阵将细胞进行降纬和聚类，得到更加精细的细胞种群，发现细胞表观转录组的异质性。
实施例6.单细胞RNA结合蛋白测序
取出上述实施例3分选出来的细胞，进行如下实验：
(1)为免疫反应准备磁珠
分别取出6.25μL protein A beads和protein G beads到1.5mL的离心管中，加入200μL 1×IP buffer，混匀后放在磁力架上，弃掉上清，重复洗涤3次。再加入100μL 1×IPbuffer，加入5μg特定蛋白的抗体，室温旋转孵育30分钟。
抗体孵育后，放在磁力架上，待溶液澄清，弃掉上清，用1×IP buffer漂洗三次，最后加入400μL1×IP buffer混匀。
(2)免疫沉淀反应
将实施案例3得到的样本通过超声破碎仪器进行超声匀浆后，加入10μL RNaseInhibitor，20μL 5×IP buffer，400μL准备的磁珠混合液，4℃旋转反应4小时。
(3)洗脱
试用IP buffer对beads进行反复洗涤6次以上。试用SDS loading buffer对蛋白进行变性洗脱。
(4)片段筛选
将上一步得到的RNA-蛋白质复合物进行凝胶电泳并转膜，切下特定片段以上部分。
(5)RNA提取和建库
将切下来样本均加入1/50的10％SDS和Proteinase K(DUOMI，R21066)进行消化释放RNA。
(6)醇沉，步骤同实施例4的(1)。
(7)rRNA去除，步骤同实施例4的(6)。
实验结果：
在实施例4中，我们使用293T细胞进行单细胞测序。使用10000细胞进行，利用分子标签筛选出3000多细胞UMI(唯一分子标签)数量大于1000的细胞作为后续的分析。表明能够将细胞按照不同的细胞周期进行区分。合并单细胞数据能够获得更大量细胞测序同等的结果。实施例3的第一组实验、第二组实验、第三组实验均能够在后续过程中实现单细胞的测序。
在实施例5中，m6A部分我们的数据表明本方法能够成功捕获到单细胞的m6A信息。在分析方面，采取先将单细胞数据进行合并后找出稳定的m6A位点之后建立单细胞m6A含量的表达矩阵。聚类结果显示m6A数据可以反映不同的细胞状态，而且不依赖转录组的数据。
在实施例6中，RNA结合蛋白部分我们以YTHDC1为例进行测序。同样可以建库成功，合并单细胞的数据能够得到YTHDC1的结合区域。单细胞数据可以得到细胞间的异质性。
如图2所示，本申请通过PCR或者测序的方法证明了实施例4，5结束后得到的文库片段中准确的加入了标记序列。同时说明实施例1，2，3得到了相应的效果。如图3所示，本发明实施例4的结果证明实现了单个细胞的RNA测序，能够从标记信息里面得到单个细胞的RNA信息。如图4所示，实施例4的分析结果证明了本发明能够得到处于不同细胞周期的细胞的全转录组数据，图中用Marker基因JPT1标记了G2M期细胞。如图5所示，实施例5的分析结果证明了本发明实现了对单个细胞中含有m6A的基因的识别和检测。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）
<120> 一种单细胞内RNA全转录组标记和测序的方法
<130> IDC210311
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<170> PatentIn version 3.5
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<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
ncaagactag attacaagga cgacgatg 28
<210> 48
<211> 28
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<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<213> artificial
<220>
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<213> artificial
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<213> artificial
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<221> misc_feature
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<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
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<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<400> 87
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<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 88
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<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 89
ncgacacacg attacaagga cgacgatg 28
<210> 90
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 90
ncggattgcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 91
nctaaggtcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 92
ngaacaggcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 93
ngacagtgcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 94
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 94
ngagttagcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 95
ngatgaatcg attacaagga cgacgatg 28
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第一链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 96
ngccaagacg attacaagga cgacgatg 28
<210> 97
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第二链
<400> 97
aggccagagc attcgcatcg tcgtccttgt aatc 34
<210> 98
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 98
cgaatgctct ggcctaacgt gatctcaagc acgtggat 38
<210> 99
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 99
cgaatgctct ggcctaaaca tcgctcaagc acgtggat 38
<210> 100
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 100
cgaatgctct ggcctatgcc taactcaagc acgtggat 38
<210> 101
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 101
cgaatgctct ggcctagtgg tcactcaagc acgtggat 38
<210> 102
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 102
cgaatgctct ggcctaccac tgtctcaagc acgtggat 38
<210> 103
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 103
cgaatgctct ggcctacatt ggcctcaagc acgtggat 38
<210> 104
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 104
cgaatgctct ggcctcagat ctgctcaagc acgtggat 38
<210> 105
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 105
cgaatgctct ggcctcatca agtctcaagc acgtggat 38
<210> 106
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 106
cgaatgctct ggcctcgctg atcctcaagc acgtggat 38
<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 107
cgaatgctct ggcctacaag ctactcaagc acgtggat 38
<210> 108
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 108
cgaatgctct ggcctctgta gccctcaagc acgtggat 38
<210> 109
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 109
cgaatgctct ggcctagtac aagctcaagc acgtggat 38
<210> 110
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 110
cgaatgctct ggcctaacaa ccactcaagc acgtggat 38
<210> 111
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 111
cgaatgctct ggcctaaccg agactcaagc acgtggat 38
<210> 112
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 112
cgaatgctct ggcctaacgc ttactcaagc acgtggat 38
<210> 113
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 113
cgaatgctct ggcctaagac ggactcaagc acgtggat 38
<210> 114
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 114
cgaatgctct ggcctaaggt acactcaagc acgtggat 38
<210> 115
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 115
cgaatgctct ggcctacaca gaactcaagc acgtggat 38
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 116
cgaatgctct ggcctacagc agactcaagc acgtggat 38
<210> 117
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 117
cgaatgctct ggcctacctc caactcaagc acgtggat 38
<210> 118
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 118
cgaatgctct ggcctacgct cgactcaagc acgtggat 38
<210> 119
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 119
cgaatgctct ggcctacgta tcactcaagc acgtggat 38
<210> 120
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 120
cgaatgctct ggcctactat gcactcaagc acgtggat 38
<210> 121
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 121
cgaatgctct ggcctagagt caactcaagc acgtggat 38
<210> 122
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 122
cgaatgctct ggcctagatc gcactcaagc acgtggat 38
<210> 123
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 123
cgaatgctct ggcctagcag gaactcaagc acgtggat 38
<210> 124
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 124
cgaatgctct ggcctagtca ctactcaagc acgtggat 38
<210> 125
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 125
cgaatgctct ggcctatcct gtactcaagc acgtggat 38
<210> 126
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 126
cgaatgctct ggcctattga ggactcaagc acgtggat 38
<210> 127
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 127
cgaatgctct ggcctcaacc acactcaagc acgtggat 38
<210> 128
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 128
cgaatgctct ggcctgacta gtactcaagc acgtggat 38
<210> 129
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 129
cgaatgctct ggcctcaatg gaactcaagc acgtggat 38
<210> 130
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 130
cgaatgctct ggcctcactt cgactcaagc acgtggat 38
<210> 131
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 131
cgaatgctct ggcctcagcg ttactcaagc acgtggat 38
<210> 132
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 132
cgaatgctct ggcctcatac caactcaagc acgtggat 38
<210> 133
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 133
cgaatgctct ggcctccagt tcactcaagc acgtggat 38
<210> 134
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 134
cgaatgctct ggcctccgaa gtactcaagc acgtggat 38
<210> 135
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 135
cgaatgctct ggcctccgtg agactcaagc acgtggat 38
<210> 136
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 136
cgaatgctct ggcctcctcc tgactcaagc acgtggat 38
<210> 137
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 137
cgaatgctct ggcctcgaac ttactcaagc acgtggat 38
<210> 138
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 138
cgaatgctct ggcctcgact ggactcaagc acgtggat 38
<210> 139
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 139
cgaatgctct ggcctcgcat acactcaagc acgtggat 38
<210> 140
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 140
cgaatgctct ggcctctcaa tgactcaagc acgtggat 38
<210> 141
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 141
cgaatgctct ggcctctgag ccactcaagc acgtggat 38
<210> 142
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 142
cgaatgctct ggcctctggc atactcaagc acgtggat 38
<210> 143
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 143
cgaatgctct ggcctgaatc tgactcaagc acgtggat 38
<210> 144
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 144
cgaatgctct ggcctcaaga ctactcaagc acgtggat 38
<210> 145
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 145
cgaatgctct ggcctgagct gaactcaagc acgtggat 38
<210> 146
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 146
cgaatgctct ggcctgatag acactcaagc acgtggat 38
<210> 147
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 147
cgaatgctct ggcctgccac atactcaagc acgtggat 38
<210> 148
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 148
cgaatgctct ggcctgcgag taactcaagc acgtggat 38
<210> 149
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 149
cgaatgctct ggcctgctaa cgactcaagc acgtggat 38
<210> 150
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 150
cgaatgctct ggcctgctcg gtactcaagc acgtggat 38
<210> 151
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 151
cgaatgctct ggcctggaga acactcaagc acgtggat 38
<210> 152
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 152
cgaatgctct ggcctggtgc gaactcaagc acgtggat 38
<210> 153
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 153
cgaatgctct ggcctgtacg caactcaagc acgtggat 38
<210> 154
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 154
cgaatgctct ggcctgtcgt agactcaagc acgtggat 38
<210> 155
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 155
cgaatgctct ggcctgtctg tcactcaagc acgtggat 38
<210> 156
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 156
cgaatgctct ggcctgtgtt ctactcaagc acgtggat 38
<210> 157
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 157
cgaatgctct ggccttagga tgactcaagc acgtggat 38
<210> 158
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 158
cgaatgctct ggccttatca gcactcaagc acgtggat 38
<210> 159
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 159
cgaatgctct ggccttccgt ctactcaagc acgtggat 38
<210> 160
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 160
cgaatgctct ggccttcttc acactcaagc acgtggat 38
<210> 161
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 161
cgaatgctct ggccttgaag agactcaagc acgtggat 38
<210> 162
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 162
cgaatgctct ggccttggaa caactcaagc acgtggat 38
<210> 163
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 163
cgaatgctct ggccttggct tcactcaagc acgtggat 38
<210> 164
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 164
cgaatgctct ggccttggtg gtactcaagc acgtggat 38
<210> 165
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 165
cgaatgctct ggcctttcac gcactcaagc acgtggat 38
<210> 166
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 166
cgaatgctct ggcctaactc accctcaagc acgtggat 38
<210> 167
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 167
cgaatgctct ggcctaagag atcctcaagc acgtggat 38
<210> 168
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 168
cgaatgctct ggcctaagga cacctcaagc acgtggat 38
<210> 169
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 169
cgaatgctct ggcctaatcc gtcctcaagc acgtggat 38
<210> 170
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 170
cgaatgctct ggcctaatgt tgcctcaagc acgtggat 38
<210> 171
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 171
cgaatgctct ggcctacacg accctcaagc acgtggat 38
<210> 172
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 172
cgaatgctct ggcctacaga ttcctcaagc acgtggat 38
<210> 173
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 173
cgaatgctct ggcctagatg tacctcaagc acgtggat 38
<210> 174
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 174
cgaatgctct ggcctagcac ctcctcaagc acgtggat 38
<210> 175
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 175
cgaatgctct ggcctagcca tgcctcaagc acgtggat 38
<210> 176
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 176
cgaatgctct ggcctaggct aacctcaagc acgtggat 38
<210> 177
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 177
cgaatgctct ggcctatagc gacctcaagc acgtggat 38
<210> 178
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 178
cgaatgctct ggcctatcat tccctcaagc acgtggat 38
<210> 179
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 179
cgaatgctct ggcctattgg ctcctcaagc acgtggat 38
<210> 180
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 180
cgaatgctct ggcctcaagg agcctcaagc acgtggat 38
<210> 181
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 181
cgaatgctct ggcctcacct tacctcaagc acgtggat 38
<210> 182
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 182
cgaatgctct ggcctccatc ctcctcaagc acgtggat 38
<210> 183
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 183
cgaatgctct ggcctccgac aacctcaagc acgtggat 38
<210> 184
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 184
cgaatgctct ggcctcctaa tccctcaagc acgtggat 38
<210> 185
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 185
cgaatgctct ggcctcctct atcctcaagc acgtggat 38
<210> 186
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 186
cgaatgctct ggcctcgaca cacctcaagc acgtggat 38
<210> 187
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 187
cgaatgctct ggcctcggat tgcctcaagc acgtggat 38
<210> 188
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 188
cgaatgctct ggcctctaag gtcctcaagc acgtggat 38
<210> 189
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 189
cgaatgctct ggcctgaaca ggcctcaagc acgtggat 38
<210> 190
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 190
cgaatgctct ggcctgacag tgcctcaagc acgtggat 38
<210> 191
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 191
cgaatgctct ggcctgagtt agcctcaagc acgtggat 38
<210> 192
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 192
cgaatgctct ggcctgatga atcctcaagc acgtggat 38
<210> 193
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第三链
<400> 193
cgaatgctct ggcctgccaa gacctcaagc acgtggat 38
<210> 194
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> N4TSO
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 194
cacgacgctc ttccgatctn nnnggg 26
<210> 195
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 195
agtcgtacgc cgatgaacgt gatcgaaaca tcggccac 38
<210> 196
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 196
agtcgtacgc cgatgaaaca tcgcgaaaca tcggccac 38
<210> 197
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 197
agtcgtacgc cgatgatgcc taacgaaaca tcggccac 38
<210> 198
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 198
agtcgtacgc cgatgagtgg tcacgaaaca tcggccac 38
<210> 199
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 199
agtcgtacgc cgatgaccac tgtcgaaaca tcggccac 38
<210> 200
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 200
agtcgtacgc cgatgacatt ggccgaaaca tcggccac 38
<210> 201
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 201
agtcgtacgc cgatgcagat ctgcgaaaca tcggccac 38
<210> 202
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 202
agtcgtacgc cgatgcatca agtcgaaaca tcggccac 38
<210> 203
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 203
agtcgtacgc cgatgcgctg atccgaaaca tcggccac 38
<210> 204
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 204
agtcgtacgc cgatgacaag ctacgaaaca tcggccac 38
<210> 205
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 205
agtcgtacgc cgatgctgta gcccgaaaca tcggccac 38
<210> 206
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 206
agtcgtacgc cgatgagtac aagcgaaaca tcggccac 38
<210> 207
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 207
agtcgtacgc cgatgaacaa ccacgaaaca tcggccac 38
<210> 208
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 208
agtcgtacgc cgatgaaccg agacgaaaca tcggccac 38
<210> 209
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 209
agtcgtacgc cgatgaacgc ttacgaaaca tcggccac 38
<210> 210
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 210
agtcgtacgc cgatgaagac ggacgaaaca tcggccac 38
<210> 211
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 211
agtcgtacgc cgatgaaggt acacgaaaca tcggccac 38
<210> 212
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 212
agtcgtacgc cgatgacaca gaacgaaaca tcggccac 38
<210> 213
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 213
agtcgtacgc cgatgacagc agacgaaaca tcggccac 38
<210> 214
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 214
agtcgtacgc cgatgacctc caacgaaaca tcggccac 38
<210> 215
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 215
agtcgtacgc cgatgacgct cgacgaaaca tcggccac 38
<210> 216
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 216
agtcgtacgc cgatgacgta tcacgaaaca tcggccac 38
<210> 217
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 217
agtcgtacgc cgatgactat gcacgaaaca tcggccac 38
<210> 218
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 218
agtcgtacgc cgatgagagt caacgaaaca tcggccac 38
<210> 219
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 219
agtcgtacgc cgatgagatc gcacgaaaca tcggccac 38
<210> 220
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 220
agtcgtacgc cgatgagcag gaacgaaaca tcggccac 38
<210> 221
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 221
agtcgtacgc cgatgagtca ctacgaaaca tcggccac 38
<210> 222
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 222
agtcgtacgc cgatgatcct gtacgaaaca tcggccac 38
<210> 223
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 223
agtcgtacgc cgatgattga ggacgaaaca tcggccac 38
<210> 224
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 224
agtcgtacgc cgatgcaacc acacgaaaca tcggccac 38
<210> 225
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 225
agtcgtacgc cgatggacta gtacgaaaca tcggccac 38
<210> 226
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 226
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<210> 227
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 227
agtcgtacgc cgatgcactt cgacgaaaca tcggccac 38
<210> 228
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 228
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<210> 229
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 229
agtcgtacgc cgatgcatac caacgaaaca tcggccac 38
<210> 230
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 230
agtcgtacgc cgatgccagt tcacgaaaca tcggccac 38
<210> 231
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 231
agtcgtacgc cgatgccgaa gtacgaaaca tcggccac 38
<210> 232
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 232
agtcgtacgc cgatgccgtg agacgaaaca tcggccac 38
<210> 233
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 233
agtcgtacgc cgatgcctcc tgacgaaaca tcggccac 38
<210> 234
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 234
agtcgtacgc cgatgcgaac ttacgaaaca tcggccac 38
<210> 235
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 235
agtcgtacgc cgatgcgact ggacgaaaca tcggccac 38
<210> 236
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 236
agtcgtacgc cgatgcgcat acacgaaaca tcggccac 38
<210> 237
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 237
agtcgtacgc cgatgctcaa tgacgaaaca tcggccac 38
<210> 238
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 238
agtcgtacgc cgatgctgag ccacgaaaca tcggccac 38
<210> 239
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 239
agtcgtacgc cgatgctggc atacgaaaca tcggccac 38
<210> 240
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 240
agtcgtacgc cgatggaatc tgacgaaaca tcggccac 38
<210> 241
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 241
agtcgtacgc cgatgcaaga ctacgaaaca tcggccac 38
<210> 242
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 242
agtcgtacgc cgatggagct gaacgaaaca tcggccac 38
<210> 243
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 243
agtcgtacgc cgatggatag acacgaaaca tcggccac 38
<210> 244
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 244
agtcgtacgc cgatggccac atacgaaaca tcggccac 38
<210> 245
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 245
agtcgtacgc cgatggcgag taacgaaaca tcggccac 38
<210> 246
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 246
agtcgtacgc cgatggctaa cgacgaaaca tcggccac 38
<210> 247
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 247
agtcgtacgc cgatggctcg gtacgaaaca tcggccac 38
<210> 248
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 248
agtcgtacgc cgatgggaga acacgaaaca tcggccac 38
<210> 249
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 249
agtcgtacgc cgatgggtgc gaacgaaaca tcggccac 38
<210> 250
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 250
agtcgtacgc cgatggtacg caacgaaaca tcggccac 38
<210> 251
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 251
agtcgtacgc cgatggtcgt agacgaaaca tcggccac 38
<210> 252
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 252
agtcgtacgc cgatggtctg tcacgaaaca tcggccac 38
<210> 253
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 253
agtcgtacgc cgatggtgtt ctacgaaaca tcggccac 38
<210> 254
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 254
agtcgtacgc cgatgtagga tgacgaaaca tcggccac 38
<210> 255
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 255
agtcgtacgc cgatgtatca gcacgaaaca tcggccac 38
<210> 256
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 256
agtcgtacgc cgatgtccgt ctacgaaaca tcggccac 38
<210> 257
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 257
agtcgtacgc cgatgtcttc acacgaaaca tcggccac 38
<210> 258
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 258
agtcgtacgc cgatgtgaag agacgaaaca tcggccac 38
<210> 259
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 259
agtcgtacgc cgatgtggaa caacgaaaca tcggccac 38
<210> 260
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 260
agtcgtacgc cgatgtggct tcacgaaaca tcggccac 38
<210> 261
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 261
agtcgtacgc cgatgtggtg gtacgaaaca tcggccac 38
<210> 262
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 262
agtcgtacgc cgatgttcac gcacgaaaca tcggccac 38
<210> 263
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 263
agtcgtacgc cgatgaactc acccgaaaca tcggccac 38
<210> 264
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 264
agtcgtacgc cgatgaagag atccgaaaca tcggccac 38
<210> 265
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 265
agtcgtacgc cgatgaagga caccgaaaca tcggccac 38
<210> 266
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 266
agtcgtacgc cgatgaatcc gtccgaaaca tcggccac 38
<210> 267
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 267
agtcgtacgc cgatgaatgt tgccgaaaca tcggccac 38
<210> 268
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 268
agtcgtacgc cgatgacacg acccgaaaca tcggccac 38
<210> 269
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 269
agtcgtacgc cgatgacaga ttccgaaaca tcggccac 38
<210> 270
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 270
agtcgtacgc cgatgagatg taccgaaaca tcggccac 38
<210> 271
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 271
agtcgtacgc cgatgagcac ctccgaaaca tcggccac 38
<210> 272
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 272
agtcgtacgc cgatgagcca tgccgaaaca tcggccac 38
<210> 273
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 273
agtcgtacgc cgatgaggct aaccgaaaca tcggccac 38
<210> 274
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 274
agtcgtacgc cgatgatagc gaccgaaaca tcggccac 38
<210> 275
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 275
agtcgtacgc cgatgatcat tcccgaaaca tcggccac 38
<210> 276
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 276
agtcgtacgc cgatgattgg ctccgaaaca tcggccac 38
<210> 277
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 277
agtcgtacgc cgatgcaagg agccgaaaca tcggccac 38
<210> 278
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 278
agtcgtacgc cgatgcacct taccgaaaca tcggccac 38
<210> 279
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 279
agtcgtacgc cgatgccatc ctccgaaaca tcggccac 38
<210> 280
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 280
agtcgtacgc cgatgccgac aaccgaaaca tcggccac 38
<210> 281
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 281
agtcgtacgc cgatgcctaa tcccgaaaca tcggccac 38
<210> 282
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 282
agtcgtacgc cgatgcctct atccgaaaca tcggccac 38
<210> 283
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 283
agtcgtacgc cgatgcgaca caccgaaaca tcggccac 38
<210> 284
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 284
agtcgtacgc cgatgcggat tgccgaaaca tcggccac 38
<210> 285
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 285
agtcgtacgc cgatgctaag gtccgaaaca tcggccac 38
<210> 286
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 286
agtcgtacgc cgatggaaca ggccgaaaca tcggccac 38
<210> 287
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 287
agtcgtacgc cgatggacag tgccgaaaca tcggccac 38
<210> 288
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 288
agtcgtacgc cgatggagtt agccgaaaca tcggccac 38
<210> 289
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 289
agtcgtacgc cgatggatga atccgaaaca tcggccac 38
<210> 290
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第四链
<400> 290
agtcgtacgc cgatggccaa gaccgaaaca tcggccac 38
<210> 291
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第五链
<400> 291
catcggcgta cgactatcca cgtgcttgag 30
<210> 292
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> With-universal
<400> 292
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 293
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 293
gccaccatgg cagaaaacgt gatnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 294
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 294
gccaccatgg cagaaaaaca tcgnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 295
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 295
gccaccatgg cagaaatgcc taannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 296
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 296
gccaccatgg cagaaagtgg tcannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 297
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 297
gccaccatgg cagaaaccac tgtnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 298
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 298
gccaccatgg cagaaacatt ggcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 299
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
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gccaccatgg cagaatggaa caannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 358
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 358
gccaccatgg cagaatggct tcannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 359
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaatggtg gtannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<212> DNA
<213> artificial
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<223> 第六链
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<222> (24)..(31)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<213> artificial
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<223> 第六链
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<212> DNA
<213> artificial
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<223> 第六链
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gccaccatgg cagaaacacg accnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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gccaccatgg cagaaacaga ttcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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gccaccatgg cagaaagatg tacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
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<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaagcac ctcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaagcca tgcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaaggct aacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaatagc gacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaatcat tccnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaaattgg ctcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaacaagg agcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaacacct tacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 377
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 377
gccaccatgg cagaaccatc ctcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 378
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 378
gccaccatgg cagaaccgac aacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 379
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
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gccaccatgg cagaacctaa tccnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 380
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
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<400> 380
gccaccatgg cagaacctct atcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 381
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
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gccaccatgg cagaacgaca cacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 382
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
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gccaccatgg cagaacggat tgcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
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<213> artificial
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<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
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<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 385
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<210> 386
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 386
gccaccatgg cagaagagtt agcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 387
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 387
gccaccatgg cagaagatga atcnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 388
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第六链
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 388
gccaccatgg cagaagccaa gacnnnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ct 52
<210> 389
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 第七链
<400> 389
ttctgccatg gtggcgtggc cgatgtttcg 30
<210> 390
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> T7-pre-universal
<400> 390
taatacgact cactataggg agacacgacg ctcttccgat ct 42
<210> 391
<211> 58
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> universal
<400> 391
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
Claims (16)
1.一种单细胞内RNA全转录组标记的方法，所述方法包括：
(1)提供含有细胞的样品，对所述细胞进行固定和通透；
(2)将细胞内RNA打断，并进行3’末端修复，获得多个RNA片段；
(3)对所述RNA片段进行标记，具体步骤如下：
(a)提供第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，
其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补，
将腺苷酰化酶(Adenylase)和第一链接触，在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第一接头组与所述RNA片段接触，以使得所述第一接头组的第一链与RNA片段的3’末端连接；
(b)提供第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，
其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第二接头组与步骤(a)的产物接触，以使得所述第二接头组与第一接头组的第一链的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第一中和引物(例如，第二链)与上述退火后获得的产物接触，所述第一中和引物(例如，第二链)与第三链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(c)提供第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，
其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第三接头组与步骤(b)的产物接触，以使得所述第三接头组的第四链与第二接头组的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第二中和引物(例如，第五链)与上述退火后获得的产物接触，所述第二中和引物(例如，第五链)与第三接头组中的第四链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(d)提供第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，
其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第四接头组与步骤(c)的产物接触，以使得所述第四接头组的第六链与第三接头组的第四链的3’末端连接；
任选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，将第三中和引物(例如，第七链)与上述退火后获得的产物接触，所述第三中和引物(例如，第七链)与第四接头组中的第六链的第一模板序列、第二模板序列或它们的部分序列互补；
(e)提供第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，
其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补，
在允许核酸杂交或退火的条件下，将所述第五接头组与步骤(d)的产物接触，以使得所述第五接头组与第四接头组的第六链的3’末端连接；
(f)在允许核酸连接的条件下，将DNA聚合酶与步骤(g)获得的产物接触；
(4)分选单细胞，即获得RNA全转录组标记的单细胞。
2.一种单细胞内RNA全转录组测序的方法，所述方法包括：
(1)通过权利要求1所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集权利要求1中步骤(4)获得的单细胞中的RNA；
(3)对所述RNA进行测序，即实现单细胞内RNA全转录组测序。
3.一种单细胞内RNA m6A修饰组测序的方法，所述方法包括：
(1)通过权利要求1所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集权利要求1中步骤(4)获得的单细胞中的RNA；
(3)对所述RNA进行测序，即实现单细胞内RNA m6A修饰组测序；
任选地，对上述步骤(2)的产物进行醇沉以及rRNA去除。
4.一种单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序方法，所述方法包括：
(1)通过权利要求1所述的方法对单细胞内RNA全转录组标记；
(2)富集步骤(1)获得的单细胞中的RNA；
(3)对步骤(5)获得的产物进行洗脱，获得RNA-蛋白质复合物；
(4)将步骤(3)获得的RNA-蛋白质复合物进行凝胶电泳并转膜，选择目标蛋白上方区域的RNA-蛋白质复合物产物进行切胶回收；
(5)提取步骤(4)获得的产物中的RNA，并建立RNA文库；
(6)对步骤(5)获得的产物进行醇沉以及rRNA去除；
(7)对步骤(6)获得的RNA进行测序，即实现单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序。
5.权利要求2或3的方法，其中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：
(i)对步骤(4)获得的单细胞进行醇沉；
(ii)去除步骤(i)获得的产物中的DNA；
(iii)利用步骤(ii)获得的产物建立RNA文库。
6.权利要求2-4任一项的方法，其中，在步骤(2)中，富集具体包括如下步骤：
(i)对步骤(4)获得的单细胞进行RNA提取纯化和醇沉；
(ii)对步骤(i)获得的产物进行免疫沉淀(例如，充分洗涤并用m6A核苷类似物进行竞争洗脱释放含有m6A修饰的RNA)；
(iii)对步骤(ii)获得的产物进行洗脱；
优选地，对(iii)获得的产物进行醇沉以及去除rRNA。
7.权利要求4-6任一项的方法，所述建立RNA文库的方法包括：
(a)对(ii)获得的产物中的RNA进行反转录；
(b)对步骤(a)获得的产物进行PCR扩增；
(c)对步骤(b)获得的产物进行T7-RNA聚合酶扩增；
(d)去除步骤(c)获得的产物中的rRNA；
(e)对步骤(d)获得的产物进行反转录以及PCR扩增。
8.权利要求3-7任一项的方法，其中，所述醇沉的步骤包括：将SDS、蛋白酶K和TritonX-100溶液与细胞接触；然后提取RNA；然后加入乙醇、醋酸钠以及糖原。
9.权利要求1-8任一项的方法，在步骤(3)中，具有选自下列的一项或多项特征：
(1)步骤(a)中，所述连接序列为9个碱基的随机排列；
(2)步骤(b)和(c)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列；
(3)步骤(d)中，所述连接序列为16个碱基的随机排列；
(4)步骤(e)中，所述连接序列为8个碱基的随机排列；
(5)所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)；
(6)所述第二链的第一模板序列的长度16-22个碱基(例如，19个碱基)；
(7)所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(8)所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(9)所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(10)所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(11)所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(12)所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(13)所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(14)所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(15)所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)；
(16)所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)；
(17)所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)；
(18)所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:70所示的序列；
(19)第二链具有如SEQ ID NO:97所示的序列；
(20)所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:167所示的序列；
(21)所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ IDNO:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:264所示的序列；
(22)第五链具有如SEQ ID NO:291所示的序列；
(23)所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ IDNO:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:362所示的序列；
(24)所述第七链具有如SEQ ID NO:389所示的序列；
(25)在步骤(b)至步骤(d)中，提供DNA聚合酶(例如，DNA连接酶，例如，T4 DNA连接酶)。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中，在步骤(1)中，使1％-5％(例如，1％，2％，3％，4％，5％)甲醛与细胞接触，冰上放置10min-30min(例如，15min)，加入5％Digitonin，评估细胞通透的情况；
优选地，在步骤(1)中，取个106细胞，使其与DPBS接触，然后与10mL 4％甲醛接触，在冰上固定20分钟。使其与10μL 5％Digitonin，30μL RNA酶抑制剂接触，冰上放置5分钟。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中，在步骤(2)中，细胞内RNA打断的方法为通过离子和高温加热方法或RNA酶切方法；
优选地，离子和高温加热方法的具体步骤为：在金属离子(例如，镁离子或锌离子)的存在下，25℃-42℃(例如，25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，37℃，40℃，42℃)水浴30min-120min(例如，30min，60min，90min，120min)；
优选地，离子和高温加热方法的具体步骤为：在锌离子的存在下，37℃水浴90min。然后，加入EDTA与缓冲液(例如，DPBS中加入500μL 10mM Tris-HCL(pH 8.0)和20μL 5％Tritonx-100)。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中，在步骤(2)中，3’末端修复的方法为：使打断的RNA与核酸聚合酶(例如，T4 PNK酶)接触。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中，在步骤(4)中，通过流式细胞术分选单细胞。
14.一种试剂盒，其包含：
(a)第一接头组，所述第一接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第一链，以及第二链，
其中，所述第一链包含连接序列以及模板序列，所述连接序列为6至12个碱基(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)的随机排列，且每一条第一链含有不同的连接序列以及相同的模板序列；所述第二链包含第一模板序列和第二模板序列，且第二链的第一模板序列与第一链的模板序列互补；
(b)第二接头组，所述第二接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第三链，
其中，所述第三链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第三链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第三链的第一模板序列与所述第一接头组中的第二链的第二模板序列互补；
(c)第三接头组，所述第三接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第四链，以及第五链，
其中，所述第四链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第四链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第五链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第五链的第一模板序列与第三链的第二模板序列互补，第五链的第二模板序列与第四链的第一模板序列互补；
(d)第四接头组，所述第四接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第六链，以及第七链，
其中，所述第六链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为14至20个(例如，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个)碱基的随机排列，且每一条第六链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列，
所述第七链包含第一模板序列和第二模板序列，其中，第七链的第一模板序列与第四链的第二模板序列互补，第七链的第二模板序列与第六链的第一模板序列互补；
(e)第五接头组，所述第五接头组包含至少1条(例如，2条至30条，30条至60条，60条至90条，90条至120条，120条至150条，150条至180条，180条至210条)第八链，
其中，所述第八链包含第一模板序列、连接序列以及第二模板序列，所述连接序列为6至12个(例如，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个)碱基的随机排列，且每一条第八链含有不同的连接序列以及相同的第一模板序列和第二模板序列；所述第八链的第一模板序列与第六链的第二模板序列互补；
任选地，所述试剂盒还包含：用于腺苷酸化的试剂(例如，腺苷酰化酶(Adenylase))，用于磷酸化的试剂(例如，T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase))，DNA聚合酶(例如，T4 DNA连接酶)，金属离子(例如，锌离子，镁离子)，用于细胞固定和通透的试剂(例如，甲醛，甲醇，Digitonin，TritonX-100，Tween-20)，用于打断RNA的试剂(例如，核糖核酸酶(RNase I)，微球菌核酸酶(MNase))，用于RNA测序的试剂，用于RNA 3’末端修复的试剂，用于分选单细胞的试剂，或其任意组合。
15.权利要求14的试剂盒，所述试剂盒具有选自下列的一项或多项特征：
(1)所述第一链的连接序列为9个碱基的随机排列；
(2)所述第三链和第四链的连接序列为8个碱基的随机排列；
(3)所述第六链的连接序列为16个碱基的随机排列；
(4)所述第八链的连接序列为8个碱基的随机排列；
(5)所述第一链的模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)；
(6)所述第二链的第一模板序列的长度为16-22个碱基(例如，19个碱基)；
(7)所述第二链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(8)所述第三链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(9)所述第三链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(10)所述第四链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(11)所述第四链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(12)所述第五链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(13)所述第五链的第二模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(14)所述第六链的第一模板序列的长度为13-18个碱基(例如，15个碱基)；
(15)所述第七链的第二模板序列的长度为18-22个碱基(例如，20个碱基)；
(16)所述第八链的第一模板序列的长度为20-24个碱基(例如，22个碱基)；
(17)所述第八链的第二模板序列的长度为30-36个碱基(例如，33个碱基)；
(18)所述第一接头组包含96条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:96所示的序列；或者，所述第一接头组包含70条第一链，所述第一链具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:70所示的序列；
(19)第二链具有如SEQ ID NO:97所示的序列；
(20)所述第二接头组包含96条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:193所示的序列；或者，所述第二接头组包含70条第三链，所述第三链具有如SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:167所示的序列；
(21)所述第三接头组包含96条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ IDNO:290所示的序列；或者，所述第三接头组包含70条第四链，所述第四链具有如SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:264所示的序列；
(22)第五链具有如SEQ ID NO:291所示的序列；
(23)所述第四接头组包含96条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ IDNO:388所示的序列；或者，所述第四接头组包含70条第六链，所述第六链具有如SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:362所示的序列；
(24)所述第七链具有如SEQ ID NO:389所示的序列。
16.权利要求14或15所述的试剂盒在单细胞内RNA全转录组标记中的用途；或在单细胞内RNA全转录组测序中的用途；或在单细胞内RNA m6A修饰组测序中的用途；或用于单细胞内RNA结合蛋白结合位点的测序中的用途。
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