CN116286777B - 一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，属于固定化酶技术领域，包括以下步骤：将己二胺与葡萄糖二酸反应制备己二胺葡萄糖二酸聚合物，将所述己二胺葡萄糖二酸聚合物能过静电纺丝形成纳米纤维膜，然后将纳米纤维膜通过交联剂和催化剂制备纤维膜，将所述纤维膜与酶作用对酶进行固定化，制得固定化酶材料；本发明将己二胺与葡萄糖二酸为单体合成一种新型高分子材料，该高分子通过静电纺丝技术制备固定化载体材料，可以增加酶与底物间的比表面积，非常容易地实现酶的固定化；本发明的制备方法极大地提高了酶的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域，更具体的说是涉及一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法。
背景技术
酶催化反应具有高效性、专一性和条件温和等优点，因此，酶在化学合成和生物技术领域有着巨大的应用前景。然而，酶的三维活性结构主要由较弱的非共价作用维持，高温、强酸强碱性和化学性应激源可以减弱或消除酶的活性，从而限制了其工业生产中的应用。酶的固定化是解决上述难题的重要技术之一。固定化酶具有操作简便、效率高等特点，可以有效提高酶的活性、稳定性、重复利用性，降低经济成本。自1916年首次报道固定化酶以来，许多载体已被广泛用于固定化酶，其中应用最多的为聚合物基质。
葡萄糖二酸是一种天然、无毒的化合物，少量产生于包括人类的哺乳动物和一些植物中，富存于十字花科蔬菜、草莓和柑橘类水果中，因此生物相容性好。由可再生资源的单体葡萄糖氧化制得，其在医疗和工业中有着广泛的应用，比如降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等，或可能用作聚合物前体，包括新型尼龙和高度分支聚酯等。同时被美国能源部确定为12种“最具有价值的生物炼制产品之一”，由于该有机酸的重要性，正越来越得到学术界和工业界的重视。
目前一些聚合物基质利用二胺与二酸反应制备，而二胺在常温常压下存储时容易吸收空气中的二氧化碳和水分，生成二胺碳酸盐，严重影响二胺自身纯度。对运输、储存以及使用过程的工作环境带来了很大的不便。且原料纯度不够将直接影响聚合物基质的性能。
因此，如何提供新型的、功能性良好的酶固定化材料是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法。将己二胺与葡萄糖二酸为原料合成了一种新型聚合物，用于固定化酶载体。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将己二胺和葡萄糖二酸配置成一定浓度的溶液，充分混合，搅拌均匀，加入催化剂，在恒定温度下反应一段时间；
步骤2、在真空下缓慢降温，同时加入少量晶种，稳定2-5h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
步骤3、将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，搅拌聚合反应0.5-3h，将得到的聚合物溶解后配置成纺丝液，进行静电纺丝形成纳米纤维膜；
步骤4、将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入交联剂和催化剂活化反应4-6h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
步骤5、将纤维膜加入至酶液中，反应2-6h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
优选的：步骤（1）所述己二胺的浓度为10-30%，己二胺与葡萄糖二酸的摩尔比为1:1.0-1.05，搅拌速度为100-300r/min，反应温度为25-60℃，反应时间为30-120min。
进一步的步骤1所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、丁酮、二甲基亚砜中的一种或多种；催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、1,3-二异丙基碳二亚胺中的一种或多种，加量为己二胺质量的0.1-0.5%。
进一步的步骤2所述真空度为-0.080--0.065MPa，降温速率为0.3-2℃/h，晶种加入量为己二胺质量的1-5%，晶种尺寸为150-200目。
进一步的步骤3聚合温度为200-220℃，搅拌速度为100-300r/min。
进一步的步骤3所述的溶剂为甲酸、乙酸等水溶液，溶剂浓度为80-90%，聚合物浓度为5-15%。
进一步的步骤3所述的静电纺丝电压为14kV，纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纤维膜。
进一步的步骤4所述纳米纤维膜与二甲基亚砜的用量比为1g：50-60mL，交联剂为环氧氯丙烷，加量为纤维膜质量的20-30倍，催化剂为氢氧化钠，pH值为8-12，反应温度为50-60℃。
进一步的步骤5所述酶液为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶中的一种或多种，加酶量为1g：10-20mL，反应温度为40-75℃，pH为5.0-7.5。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，取得的技术优势在于将己二胺与葡萄糖二酸为单体合成一种新型高分子材料；将该高分子通过静电纺丝技术制备固定化载体材料，可以增加酶与底物间的比表面积，非常容易地实现酶的固定化；本发明的制备方法极大地提高了酶的利用率，降低了生产成本，可以广泛用于酶的固定化领域。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
上述试剂均为市售取得，对其来源、品牌无要求，符合实验要求即可。
本发明实施例公开了一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法。
实施例1、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成10%浓度的甲醇和乙醇混合溶液，其中甲醇和乙醇体积比例为1:1，加入与己二胺摩尔比为1:1.0的葡萄糖二酸充分混合，100r/min转速下搅拌均匀，加入0.1%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在30℃下反应120min；
（2）在-0.065MPa下以1.0℃/h速率缓慢降温，同时加入5%的150目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定5h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，温度为200℃， 300r/min搅拌下聚合反应3h，将聚合物80%甲酸溶解后配置成5%纺丝液，14kV纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（4）按1g：50mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入20倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH8.0，50℃活化反应6h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（5）按1g：10mL比例将纤维膜加入至纤维素酶液中，75℃ pH6.0反应6h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，纤维素酶购自夏盛，酶活为11000u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为83.2%。
实施例2、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成30%浓度的水溶液，加入与己二胺摩尔比为1:1.05的葡萄糖二酸充分混合，300r/min转速下搅拌均匀，加入0.5%二环己基碳二亚胺，在60℃下反应30min；
（2）在-0.080MPa下以2.0℃/h速率缓慢降温，同时加入1% 200目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定5h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，220℃ 100r/min搅拌下聚合反应0.5h，将聚合物90%乙酸溶解后配置成15%纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（4）按1g：60mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入30倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH12.0，60℃活化反应4h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（5）按1g：20mL比例将纤维膜加入至蛋白酶酶液中，45℃ pH6.0反应2h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，蛋白酶购自夏盛，酶活为25u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为87.6%。
实施例3、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成10%浓度的丙酮和丁酮的混合溶液，所述丙酮和丁酮体积比为1:4，加入与己二胺摩尔比为1:1.02的葡萄糖二酸充分混合，加入0.2% 1,3-二异丙基碳二亚胺，200r/min转速下搅拌均匀，在25℃下反应30min；
（2）在-0.075MPa下以0.3℃/h速率缓慢降温，同时加入3% 180目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定2h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，210℃ 200r/min搅拌下聚合反应1.5h，将聚合物85%甲酸溶解后配置成10%纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（4）按1g：55mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入25倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH10.0，55℃活化反应5h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（5）按1g：15mL比例将纤维膜加入至脂肪酶液中，40℃ pH7.5反应5h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
脂肪酶购自隆科特，酶活为50000u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为85.7%。
实施例4、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成20%浓度的正丙醇和异丙醇混合溶液（体积比为2:3），加入与己二胺摩尔比为1:1.0的葡萄糖二酸充分混合，150r/min转速下搅拌均匀，加入0.3% 1,3-二异丙基碳二亚胺，在50℃下反应60min；
（2）在-0.075MPa下以1.5℃/h速率缓慢降温，同时加入2% 180目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定3h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，200℃ 300r/min搅拌下聚合反应3h，将聚合物85%甲酸溶解后配置成8%纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（4）按1g：50mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入30倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH9.0，50℃活化反应6h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（5）按1g：15mL比例将纤维膜加入至淀粉酶液中，60℃ pH6.0反应4h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，淀粉酶购自夏盛，酶活为3000u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为82.5%。
实施例5、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成25%浓度的二甲基亚砜溶液，加入与己二胺摩尔比为1:1.0的葡萄糖二酸充分混合，150r/min转速下搅拌均匀，加入0.1% 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.2%二环己基碳二亚胺，在60℃下反应120min；
（2）在-0.080MPa下以2.0℃/h速率缓慢降温，同时加入4% 100目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定5h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，220℃ 100r/min搅拌下聚合反应1h，将聚合物90%甲酸溶解后配置成10%纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（4）按1g：60mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入30倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH10.0，60℃活化反应4.5h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（5）按1g：15mL比例将纤维膜加入至淀粉酶与糖化酶液中（淀粉酶与糖化酶体积比为1:1），60℃ pH5.0反应5h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，淀粉酶购自夏盛，酶活为3000u/mL；糖化酶购自隆科特，酶活为100000u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为82.9%。
对比例1、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）按摩尔比为1:1.1加入己二胺和葡萄糖二酸，在氮气下，230℃ 100r/min搅拌下聚合反应0.3h，将聚合物80%甲酸溶解后配置成3%纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
（2）按1g：30mL将纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入10倍纳米纤维膜质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH7.0，40℃活化反应10h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
（3）按1g：5mL比例将纤维膜加入至纤维素酶液中，40℃ pH8.0反应10h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，纤维素酶购自夏盛，酶活为11000u/mL
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为51.3%。
对比例2、一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，具体步骤如下：
（1）将己二胺配置成5%浓度的二甲基亚砜溶液，加入与己二胺摩尔比为1:0.95的葡萄糖二酸充分混合，400r/min转速下搅拌均匀，加入0.2% 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在70℃下反应180min；
（2）在-0.060MPa下以3.0℃/h速率缓慢降温，同时加入0.5% 80目的己二胺葡萄糖二酸盐作为晶种，稳定8h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
（3）将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，270℃ 100r/min搅拌下聚合反应0.5h，制得己二胺葡萄糖二酸聚合物；
（4）按1g：30mL比例将聚合物放入二甲基亚砜中，加入10倍聚合物质量的环氧氯丙烷，氢氧化钠调pH7.5，70℃活化反应1.5h，然后中和，清洗，干燥制得活化的聚合物；
（5）按1g：5mL比例将聚合物加入至淀粉酶液中，60℃ pH5.0反应10h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
其中，淀粉酶购自夏盛，酶活为3000u/mL。
将固定化酶循环使用10次后，酶的保留率为39.7%。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将己二胺和葡萄糖二酸加入溶剂中配置成一定浓度的溶液，充分混合，搅拌均匀，加入催化剂，在恒定温度下反应；
步骤2、在真空下缓慢降温，同时加入少量晶种，稳定2-5h，抽滤，洗涤，干燥，即得己二胺葡萄糖二酸盐；
步骤3、将制备的己二胺葡萄糖二酸盐在氮气下，温度在220℃状态下，100r/min搅拌下聚合反应0.5-1h，将聚合物通过溶剂溶解后配置成纺丝液，14kV 纺丝速度为0.3mL/h，接收距离为15cm，利用铝箔收集纳米纤维膜；
步骤4、将所述纳米纤维膜放入二甲基亚砜中，加入交联剂和催化剂活化反应4-6h，然后中和，清洗，干燥制得活化的纤维膜；
步骤5、将纤维膜加入至酶液中，反应2-6h，洗涤至无酶蛋白洗出，干燥后4℃冷藏，即得固定化酶材料。
2.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤1所述己二胺的浓度为10-30%，己二胺与葡萄糖二酸的摩尔比为1:1.0-1.05，搅拌速度为100-300r/min，所述反应恒定温度为25-60℃，所述反应时间为30~120min。
3.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤1所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、丁酮、二甲基亚砜中的一种或多种；催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、1,3-二异丙基碳二亚胺中的一种或多种，所述催化剂加量为己二胺质量的0.1-0.5%。
4.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤2所述真空度为-0.080至-0.065MPa，降温速率为0.3-2℃/h，晶种加入量为己二胺质量的1-5%，晶种尺寸为150-200目。
5.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤3聚合温度为200-220℃，搅拌速度为100-300r/min。
6.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤3所述的溶剂为甲酸、乙酸溶液，溶剂浓度为80-90%，所述纺丝液浓度为5-15%。
7.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤4所述纳米纤维膜与二甲基亚砜的用量比为1g：50-60mL，交联剂为环氧氯丙烷，所述环氧氯丙烷加量为纤维膜质量的20-30倍，催化剂为氢氧化钠，pH值为8-12，所述反应温度为50~60℃。
8.根据权利要求1所述己二胺和葡萄糖二酸共聚物制备固定化酶材料的方法，其特征在于，步骤5所述酶液为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶中的一种或多种，加酶量为1g：10-20mL，反应温度为40-75℃，pH为5.0-7.5。
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