CN116286741A - 5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法。所述5’→3’核酸外切酶与所述基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态;所述基因编辑系统包含:位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA,其中,所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。本发明通过将5’→3’核酸外切酶引入基因编辑系统中,能够提高精准基因编辑效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法。
背景技术
基因编辑技术通过修改基因序列,包括核酸碱基的插入、缺失和替换,改变蛋白质的表达和功能,从而影响生物体的各种性状。在生物技术领域,使用基因编辑技术改变特定核酸序列,优化蛋白质的已有功能或产生新的功能,以此增强生物体的性状表现,已成为生物育种等生物产业的基础。在生物医疗领域,利用基因编辑技术修复特定位点突变到正常序列,是基因疾病彻底治愈的可能唯一有效途径。因此,能够高效、准确的产生特定核酸碱基的插入、缺失和替换的基因编辑技术(精准基因编辑技术),是生物产业、生物医疗等重要领域的关键技术,其中,提高同源重组修复(HDR)效率、降低非同源末端链接修复(NHEJ)是精准基因编辑的关键技术需求。
因此,亟需一种提高HDR效率的精准基因编辑系统。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
为此,本发明提供了一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法,通过将5’→3’核酸外切酶引入基因编辑系统中,能够提高同源重组修复(HDR)效率、降低非同源末端链接修复(NHEJ),以实现精准基因编辑需要说明的是,本发明是基于发明人的下列工作而完成的:
精准基因编辑技术由两个相对独立的部分组成:第一部分是通过核酸酶,识别并切割目的基因位点,在待编辑位点附近制造出核酸损伤;第二部分是利用细胞内源的核酸损伤修复过程引入特定的核酸改变。精准基因编辑技术的技术差别集中在第二部分,其中主要的技术路线包括寡核苷酸编辑模板介导的同源重组(ssODN HDR)、单碱基编辑(BaseEditing,BE)、引导编辑(Prime Editing,PE)和双链长链核酸编辑模板介导的同源重组(dsDNA HDR)等。上述技术路线有比较明确的局限性:(1)编辑范围小,ssODN HDR、BE、PE主要在核酸损伤附近(10个碱基以内)产生编辑,因而绝大多数基因组位点不能被该方法有效编辑;其中,BE除了编辑范围小之外,只能引入非常有限类型的碱基改变,因而只限于特殊情况的基因编辑应用;(2)效率低,虽然dsDNA HDR技术路线具有实现全基因组位点的各种类型的编辑的潜力,但该方法效率极低,且伴随不可控的随机基因突变(非同源重组,NHEJ),限制其实际使用。
基于此,发明人通过大量试验发现,核酸损伤位点5’→3’方向的核酸外切效率是dsDNA HDR技术路线中编辑效率被限制的主要因素;且非哺乳动物内源的5’→3’方向的核酸外切酶,尤其是来源于噬菌体的5’→3’方向的核酸外切酶,具有广泛的高度活跃的生物体内活性。发明人通过试验还发现,在基因编辑过程中,通过外源表达并招募噬菌体的5’→3’方向的核酸外切酶到目的基因编辑位点,可实现dsDNA HDR效率显著提高,同时极大的抑制NHEJ。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途。根据本发明的实施例,所述5’→3’核酸外切酶与所述基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种基因编辑系统。根据本发明的实施例,所述基因编辑系统包括:位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA;其中,所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种对细胞进行基因编辑的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将上述的基因编辑系统引入细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例中TLR报告系统工作原理示意;
图2为本发明实施例1中基因编辑效率柱状图;
图3为本发明实施例2中基因编辑效率柱状图;
图4为本发明实施例3中基因编辑效率柱状图;
图5为本发明实施例4中基因编辑效率柱状图;
图6为本发明实施例5中细胞NPM1位点的蛋白标记图;
图7为本发明实施例5中细胞FUS位点的蛋白标记图;
图8为本发明实施例6中PE-T7核酸外切酶的编辑系统示意图;
图9为本发明实施例6中PE系统编辑效率柱形图;
图10为本发明实施例7中有/无MS2招募系统的HDR通路修复效率柱形图;
图11为本发明实施例8中T7核酸外切酶在细胞内DSB处制造的不同长度单链DNA的热图;
图12为本发明实施例9中在Hela细胞系HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图13为本发明实施例9中在Hela细胞系DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图14为本发明实施例9中在HCT116细胞系HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图15为本发明实施例9中在HCT116细胞系DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图16为本发明实施例9中在U2OS细胞系HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图17为本发明实施例9中在U2OS细胞系DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图18为本发明实施例9中在mESC细胞系EMX1位点基因编辑效率柱状图;
图19为本发明实施例10中在大鼠原代神经元EMX1位点编辑效率柱状图;
图20为本发明实施例11中在TLR位点基因编辑效率柱状图;
图21为本发明实施例11中在HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图22为本发明实施例11中在DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图23为本发明实施例11中在RNF2位点基因编辑效率柱状图;
图24为本发明实施例11中在VEGFA位点基因编辑效率柱状图;
图25为本发明实施例12中在TLR位点基因编辑效率柱状图;
图26为本发明实施例12中在HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图27为本发明实施例12中在DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图28为本发明实施例12中在RNF2位点基因编辑效率柱状图;
图29为本发明实施例12中在VEGFA位点基因编辑效率柱状图;
图30为本发明实施例13中在TLR位点基因编辑效率柱状图;
图31为本发明实施例13中在HEK3位点基因编辑效率柱状图;
图32为本发明实施例13中在DNMT1位点基因编辑效率柱状图;
图33为本发明实施例13中在RNF2位点基因编辑效率柱状图;
图34为本发明实施例13中在VEGFA位点基因编辑效率柱状图;
图35为本发明实施例17中在引入插入突变基因编辑效率柱状图;
图36为本发明实施例17中在引入替换突变基因编辑效率柱状图;
图37为本发明实施例14中NPM1双色标记结果图;
图38为本发明实施例14中NPM1双色标记免疫荧光验证结果图;
图39为本发明实施例15中高通量筛选结果柱状图;
图40为本发明实施例15中高通量筛选结果代表性结果图;
图41为本发明实施例15中高通量筛选结果免疫荧光验证结果图;
图42为本发明实施例16中polyQ编辑验证结果图;
图43为本发明实施例16中polyQ长度对ATXN2应激反应影响结果柱状图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
如本文中所使用的术语“5’→3’核酸外切酶”是指从5’末端,即以5’至3’方向降解DNA的核酸外切酶。所关注的5’→3’核酸外切酶可以在平端处以及在某些实施方式中在3’和/或5’突出端处从dsDNA链的5’末端除去核苷酸。
在本文中所使用的术语“非融合状态”,指5’→3’核酸外切酶与基因编辑系统中的位点特异性核酸酶分别独立存在,两者之间并未存在任何连接关系,连接关系包括调控元件(例如但不限于,启动子序列、转录终止序列等)、核酸序列(例如,编码序列或开放读码框)连接和/或通过肽链/共价键连接。换句话说,在本文中所采用的5’→3’核酸外切酶和位点特异性核酸酶的最终发挥功能的状态是不构成融合蛋白。
在本文中所使用的术语“gRNA”和“向导RNA”可互换使用,指的是能够与CRISPR核酸酶形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。例如,在基于Cas9的基因编辑系统中,gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成,其中crRNA包含与靶序列具有足够相同性并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的序列。然而,本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA),其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。而在基于Cas12a的基因编辑系统中,gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成,其中crRNA包含的序列与靶序列具有足够相同性并且指导复合物(Cas12a+crRNA)与该靶序列序列特异性结合。基于所使用的CRISPR核酸酶和待编辑的靶序列设计合适的gRNA序列属于本领域技术人员的能力范围内。本领域已知可以设计pegRNA,pegRNA是sgRNA的一种衍生形式,在sgRNA的3’末端延伸出一小段RNA序列,该段序列包含Cas9切割位点两侧各约15~20nt的序列及中间待编辑的目的序列(若用于删除则无中间序列),一般适用于PE编辑系统,在执行sgRNA基本功能同时可作为逆转录酶的复制模板。
在本文中所使用的术语“招募系统”是指将多个一种蛋白富集到另一目的蛋白或目的区域的系统。该招募系统包括通过蛋白-蛋白相互作用、蛋白-小分子相互作用或蛋白-核酸相互作用,通过非共价键的分子间力,将多个一种蛋白富集到另一目的蛋白或目的区域的系统;该招募系统还可以包括通过化学修饰进行共价连接,将多个一种蛋白富集到另一目的蛋白或目的区域的系统。常用的蛋白-蛋白相互作用如suntag系统;蛋白-核酸相互作用如MS2-MCP、PP7-PCP系统等。
在本文中所使用的术语“基因组”不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA,而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体)中的细胞器DNA。
在本文中所使用的术语“动物细胞”包括适于基因组编辑的任何动物体的细胞。动物体的实例包括但不限于,哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫;家禽如鸡、鸭、鹅。
本发明提出了一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法,下面将分别对其进行详细描述。
5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途
在本发明的一个方面,本发明提出了一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途。根据本发明的实施例,该5’→3’核酸外切酶与基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态。
HDR通路修复在基因编辑系统中是最精准的一种修复通路,相比于其他修复通路,HDR通路更合适用于基因治疗的修复通路,但目前却没有被开发出高效的基因编辑工具。其原因为,HDR修复通路只活跃在细胞周期的S/G2期,而在细胞的其他时期都被多种调控机制抑制,但即使在S/G2期,NHEJ也会与HDR通路竞争。且通过试验发现,利用Cas9基于HDR通路的基因编辑在细胞系中只有大约1%的效率,而在没有细胞周期的不分裂细胞中几乎不发生HDR修复。因此,针对如此低的效率,使其无法作为实验工具,更无法作为治疗手段。
基于此,发明人通过对基因编辑技术的深入研究,发现核酸损伤位点5’方向的核酸外切效率是基因编辑系统的技术路线中编辑效率被限制的主要因素;并且,非哺乳动物内源的5’方向的核酸外切酶,具有广泛的高度活跃的生物体内活性。
具体地,发明人通过试验发现,在基因编辑过程中,通过外源表达并招募5’→3’核酸外切酶到目的基因编辑位点,5’→3’核酸外切酶可对DNA双链断裂(DNA Double StrandBreak,DSB)末端进行切割,以补充/代替细胞内源的核酸酶的切割作用,能够提高在HDR通路中间状态的长片段单链DNA的产生,进而提高HDR通路修复效率,同时极大的抑制NHEJ。
同时,发明人通过对分裂细胞(例如HEK293细胞)和不分裂细胞(例如神经细胞)的RNA测序分析发现,对于两种细胞类型,NHEJ修复通路的相关因子都有较高表达。但是,HDR通路发生几乎只存在于分裂细胞中,而不分裂细胞中缺乏CtIP等启动HDR通路末端切割步骤所需的蛋白,导致不分裂细胞中不发生HDR通路。并且,发明人发现,不分裂细胞中存在一定表达量的HDR通路下游链插入和复制等步骤的蛋白,而针对不分裂细胞的基因编辑系统中,发现若添加5’→3’核酸外切酶可完成对末端的切割,可以诱导HDR通路在不分裂细胞中发生。
因此,发明人通过于基因编辑系统中添加5’→3’核酸外切酶,提高了HDR通路修复相对于NHEJ修复的竞争力,同时,还可以使分裂细胞中除S/G2期之外的其他时期中也发生HDR通路修复,从而提高HDR通路修复效率,同时极大的抑制NHEJ;并且,本发明还发现,通过5’→3’核酸外切酶的添加,可在不分裂细胞中实现HDR通路。
需要说明的是,5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途,即为5’→3’核酸外切酶在基因编辑中的用途,换句话说,在本文中是指一种基因编辑的方法,该方法包含提供5’→3’核酸外切酶,和使用5’→3’核酸外切酶进行基因编辑。
根据本发明的实施例,所述基因编辑系统中采用的细胞为动物细胞,优选为哺乳动物细胞。发明人通过大量试验发现,通过添加5’→3’核酸外切酶提高HDR通路修复效率,适用于动物细胞的基因编辑系统中,尤其是适用于哺乳动物细胞中。
根据本发明的实施例,所述述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶。
发明人通过大量试验,对多种5’→3’核酸外切酶(简称核酸外切酶)加入到基因编辑系统中进行比较,最终发现,T7核酸外切酶(又称T7噬菌体核酸外切酶)可在细胞内DSB处制造出长片段的单链DNA,该长片段的单链DNA出有利于HDR通路修复、而无法使用NHEJ通路修复,从而降低NHEJ通路修复效率,同时提高了HDR通路修复效率。
根据本发明的实施例,所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80%同源性的氨基酸序列。发明人通过大量试验发现,采用与T7核酸外切酶具有同源性的核酸外切酶,均能够降低NHEJ通路修复效率,同时提高了HDR通路修复效率。
T7核酸外切酶的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1):
MALLDLKQFYELREGCDDKGILVMDGDWLVFQAMSAAEFDASWEEEIWHRCCDHAKARQILEDSIKSYETRKKAWAGAPIVLAFTDSVNWRKELVDPNYKANRKAVKKPVGYFEFLDALFEREEFYCIREPMLEGDDVMGVIASNPSAFGARKAVIISCDKDFKTIPNCDFLWCTTGNILTQTEESADWWHLFQTIKGDITDGYSGIAGWGDTAEDFLNNPFITEPKTSVLKSGKNKGQEVTKWVKRDPEPHETLWDCIKSIGAKAGMTEEDIIKQGQMARILRFNEYNFIDKEIYLWRP。
基因编辑系统
在本发明的又一方面,本发明提出了一种基因编辑系统。根据本发明的实施例,该基因编辑系统包含:位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA;其中,所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。
发明人通过试验发现,将上述位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA递送至细胞内后,位点特异性核酸酶于细胞内制造出DSB,然后5’→3’核酸外切酶在细胞系中发挥功能,产生长片段单链DNA,从而改变编辑结果中的HDR/NHEJ比例,降低NHEJ通路的修复效率,同时提高了HDR通路的修复效率。
需要说明的是,本发明的的递送方法不受限制,可根据具体的需求进行选择,具体可为,质粒过表达系统:包括质粒化学转染、质粒电穿孔等;病毒表达系统:腺相关病毒(AAV)侵染、慢病毒(lentivirus)侵染等;其他表达系统:包括蛋白质/RNA复合物电穿孔、mRMA电穿孔、mRMA化学转染等。
在本文中,术语“供体DNA”包括待插入细胞DNA(如基因组DNA、线粒体DNA或病毒DNA)中的核酸序列。供体核酸序列可以通过细胞表达。供体核酸可以是外源的,对于细胞是外来的或在细胞内是非天然存在的。
供体DNA与可以被DNA结合结构域结合的序列相关。例如,供体DNA可以与DNA结合结构域的共有序列相邻,或者可以与共有序列存在于相同载体上,或者可以与共有序列存在于相同多核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述位点特异性核酸酶的添加量为2~50ng。发明人经过大量实验得到上述较优添加量,由此,可进一步填提高的HDR通路的修复效率。
根据本发明的实施例,所述5’→3’核酸外切酶的添加量为40~120ng。发明人经过大量实验得到上述较优添加量,由此,可进一步填提高的HDR通路的修复效率。并且,发明人发现,5’→3’核酸外切酶的浓度过高则会破坏NHEJ和HDR两种编辑的发生。
根据本发明的实施例,所述供体DNA的添加量为0.2~100ng。发明人经过大量实验得到上述较优添加量,由此,可进一步填提高的HDR通路的修复效率。
根据本发明的实施例,所述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶。由此,相对于其他5’→3’核酸外切酶,T7核酸外切酶可在细胞内DSB处制造出长片段的单链DNA,该长片段的单链DNA出现有利于HDR通路修复、抑制NHEJ通路修复,从而降低NHEJ通路,同时提高了HDR通路的修复效率。
根据本发明的实施例,所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80%同源性的氨基酸序列。发明人通过大量试验发现,采用与T7核酸外切酶具有同源性的核酸外切酶,均能够降低NHEJ通路修复效率,同时提高了HDR通路修复效率。
根据本发明的实施例,所述位点特异性核酸酶选自核酸内切酶,具体地,所述位点特异性核酸酶可选自成簇规律间隔短回文重复、转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、归巢内切酶、限制性核酸内切酶中的至少之一。根据本发明的实施例,在基因编辑系统的应用中,可根据需求使用上述位点特异性核酸酶制造DSB,具体类型不受限制。
需要说明的是,针对上述位点特异性核酸酶可选自成簇规律间隔短回文重复、转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、归巢内切酶等核酸内切酶中的至少之一,也可为在上述任一位点特异性核酸酶的基础上改造的核酸酶(例如引入点突变),具体类型不受限制。
根据本发明的实施例,所述基因编辑系统进一步包含:gRNA。若基因编辑系统为CRISPR系统时,通过gRNA与簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9,下文简称Cas9共同制造出DSB。
根据本发明的实施例,所述gRNA包括选自crRNA/tracrRNA、sgRNA、pegRNA中的至少之一。根据本发明的实施例,在该基因编辑系统中,只要满足该向导RNA是能够与位点特异性核酸酶形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列即可,可采用上述向导RNA(本发明中的向导RNA包含传统的向导RNA以及对传统的向导RNA序列优化改进后的向导RNA)中的至少之一,其中,具体类型不受限制。
根据本发明的实施例,该基因编辑系统进一步包含:招募系统。发明人通过试验发现,通过采用招募系统,使5’→3’核酸外切酶大量富集,可进一步提高HDR通路的修复效率,且降低NHEJ通路的修复效率。
需要说明的是,本发明中的招募系统只要满足能使5’→3’核酸外切酶大量富集即可,可为蛋白-小分子相互作用的招募系统、核酸-蛋白相互作用的招募系统、蛋白-蛋白相互作用的招募系统,例如,可选择MS2/MCP系统、PP7-PCP系统、Suntag系统等作为招募系统,具体方式不受限制。
根据本发明的实施例,若招募系统为MS2/MCP系统,gRNA为gRNA-MS2,5’→3’核酸外切酶为MCP-外切酶融合蛋白。由此,可使5’→3’核酸外切酶大量富集,进一步提高HDR通路的修复效率。
根据本发明的实施例,所述供体DNA为采用硫代磷酸二酯键修饰的线性双链DNA和/或HMEJ形式的环状双链DNA。
发明人通过试验发现,通过引入末端保护手段保护供体DNA的末端,作为HDR通路的复制模板,在编辑开始前使供体DNA在细胞中稳定存在,进一步提高基因编辑的效率,并使编辑效率显著提高。根据本发明的实施例,相比于无修饰的线性双链DNA,本发明采用的上述供体DNA具有较高的HDR通路修复效率和HDR/NHEJ比例。
根据本发明的实施例,所述供体DNA上的所述硫代磷酸二酯键的修饰个数大于2,优选为4-10。由此,可进一步提高HDR通路的修复效率和HDR/NHEJ比例。
根据本发明的实施例,所述基因编辑系统的技术路线包括寡核苷酸编辑模板介导的同源重组、单碱基编辑、引导编辑和双链长链核酸编辑模板介导的同源重组中的一种。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途所描述的特征和优点,同样适用于该基因编辑系统,在此不再赘述。
对细胞进行基因编辑的方法
在本发明的另一方面,本发明提出了一种对细胞进行基因编辑的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:将上述基因编辑系统引入细胞。发明人发现,将上述基因编辑系统引入细胞,能够提高细胞中HDR编辑效率以及提高HDR/NHEJ比例。
根据本发明的实施例,所述细胞为动物细胞,优选为哺乳动物细胞。发明人通过大量试验发现,通过添加5’→3’核酸外切酶提高HDR通路修复效率,适用于动物细胞的基因编辑系统中,尤其是适用于哺乳动物细胞中。
根据本发明的实施例,所述细胞为终末分化原代细胞。发明人通过试验发现,T7核酸外切酶作为外源蛋白,其具有未明确受到细胞周期调控的特点,使得末端切割过程可以发生在细胞周期的各个时期,可诱导HDR通路在终末分化原代细胞等不分裂细胞发生。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统所描述的特征和优点,同样适用于该对细胞进行基因编辑的方法,在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:不同5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统对HDR通路的修复效率比较
本实施例的基因编辑系统包含如下步骤:
1、构建表达载体及供体DNA
sgRNA序列设计可通过benchling等设计网站完成。供体DNA建议使用700bp同源臂,构建为HMEJ供体形式。其余同源臂长度及供体DNA形式也可达成编辑目的。
通过CRISPR/Cas9系统制造DSB,通过MS2招募系统富集核酸外切酶,其中,核酸外切酶为T7噬菌体核酸外切酶、T5噬菌体核酸外切酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、lambda噬菌体核酸外切酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)、大肠杆菌核酸外切酶DCLRE1B(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)、大肠杆菌核酸外切酶RecE(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)或人源核酸外切酶EXO1(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示),T7噬菌体核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
T5噬菌体核酸外切酶的氨基酸序列:
MSKSWGKFIEEEEAEMASRRNLMIVDGTNLGFRFKHNNSKKPFASSYVSTIQSLAKSYSARTTIVLGDKGKSVFRLEHLPEYKGNRDEKYAQRTEEEKALDEQFFEYLKDAFELCKTTFPTFTIRGVEADDMAAYIVKLIGHLYDHVWLISTDGDWDTLLTDKVSRFSFTTRREYHLRDMYEHHNVDDVEQFISLKAIMGDLGDNIRGVEGIGAKRGYNIIREFGNVLDIIDQLPLPGKQKYIQNLNASEELLFRNLILVDLPTYCVDAIAAVGQDVLDKFTKDILEIAEQ(SEQID NO:2)。
lambda噬菌体核酸外切酶的氨基酸序列:
MTPDIILQRTGIDVRAVEQGDDAWHKLRLGVITASEVHNVIAKPRSGKKWPDMKMSYFHTLLAEVCTGVAPEVNAKALAWGKQYENDARTLFEFTSGVNVTESPIIYRDESMRTACSPDGLCSDGNGLELKCPFTSRDFMKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMWVTRKNAWYFANYDPRMKREGLHYVVIERDEKYMASFDEIVPEFIEKMDEALAEIGFVFGEQWR(SEQ ID NO:3)。
大肠杆菌核酸外切酶DCLRE1B的氨基酸序列:
MNGVLIPHTPIAVDFWSLRRAGTARLFFLSHMHSDHTVGLSSTWARPLYCSPITAHLLHRHLQVSKQWIQALEVGESHVLPLDEIGQETMTVTLLDANHCPGSVMFLFEGYFGTILYTGDFRYTPSMLKEPALTLGKQIHTLYLDNTNCNPALVLPSRQEAAHQIVQLIRKHPQHNIKIGLYSLGKESLLEQLALEFQTWVVLSPRRLELVQLLGLADVFTVEEKAGRIHAVDHMEICHSNMLRWNQTHPTIAILPTSRKIHSSHPDIHVIPYSDHSSYSELRAFVAALKPCQVVPIVSRRPCGGFQDSLSPRISVPLIPDSVQQYMSSSSRKPSLLWLLERRLKRPRTQGVVFESPEESADQSQADRDSKKAKKEKLSPWPADLEKQPSHHPLRIKKQLFPDLYSKEWNKAVPFCESQKRVTMLTAPLGFSVHLRSTDEEFISQKTREEIGLGSPLVPMGDDDGGPEATGNQSAWMGHGSPLSHSSKGTPLLATEFRGLALKYLLTPVNFFQAGYSSRRFDQQVEKYHKPC(SEQ ID NO:4)。
大肠杆菌核酸外切酶RecE的氨基酸序列:
MSTKPLFLLRKAKKSSGEPDVVLWASNDFESTCATLDYLIVKSGKKLSSYFKAVATNFPVVNDLPAEGEIDFTWSERYQLSKDSMTWELKPGAAPDNAHYQGNTNVNGEDMTEIEENMLLPISGQELPIRWLAQHGSEKPVTHVSRDGLQALHIARAEELPAVTALAVSHKTSLLDPLEIRELHKLVRDTDKVFPNPGNSNLGLITAFFEAYLNADYTDRGLLTKEWMKGNRVSHITRTASGANAGGGNLTDRGEGFVHDLTSLARDVATGVLARSMDLDIYNLHPAHAKRIEEIIAENKPPFSVFRDKFITMPGGLDYSRAIVVASVKEAPIGIEVIPAHVTEYLNKVLTETDHANPDPEIVDIACGRSSAPMPQRVTEEGKQDDEEKPQPSGTTAVEQGEAETMEPDATEHHQDTQPLDAQSQVNSVDAKYQELRAELHEARKNIPSKNPVDDDKLLAASRGEFVDGISDPNDPKWVKGIQTRDCVYQNQPETEKTSPDMNQPEPVVQQEPEIACNACGQTGGDNCPDCGAVMGDATYQETFDEESQVEAKENDPEEMEGAEHPHNENAGSDPHRDCSDETGEVADPVIVEDIEPGIYYGISNENYHAGPGISKSQLDDIADTPALYLWRKNAPVDTTKTKTLDLGTAFHCRVLEPEEFSNRFIVAPEFNRRTNAGKEEEKAFLMECASTGKTVITAEEGRKIELMYQSVMALPLGQWLVESAGHAESSIYWEDPETGILCRCRPDKIIPEFHWIMDVKTTADIQRFKTAYYDYRYHVQDAFYSDGYEAQFGVQPTFVFLVASTTIECGRYPVEIFMMGEEAKLAGQQEYHRNLRTLSDCLNTDEWPAIKTLSLPRWAKEYAND(SEQ ID NO:5)。
人源核酸外切酶EXO1的氨基酸序列:
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLK(SEQ ID NO:6)。
2、将编辑系统递送至目的细胞
通过质粒过表达体系实现,具体步骤如下:
1)在96孔细胞培养板中接种293T细胞,于37℃,5%二氧化碳环境中培养过夜。
2)通过瞬时转染的方法将含有编码Cas9蛋白和sgRNA-MS2的基因的表达载体(简称Cas9/sgRNA表达载体或Cas9/sgRNA)、以及含有编码MCP-外切酶融合蛋白的基因的表达载体(简称MCP-外切酶融合蛋白表达载体或MCP-外切酶融合蛋白)与供体DNA一起导入细胞系,其中,转染的质粒添加量为:Cas9/sgRNA 50ng、MCP-外切酶融合蛋白100ng、供体DNA50ng。若无特别说明,使用的供体DNA均为HMEJ供体,质粒总量200ng,转染试剂0.75μL。在细胞密度达到80%-90%时,通过PEI(1mg/mL)进行转染。或在细胞密度达到50%-60%时,通过lipo2000进行转染。
其中,Cas9/sgRNA表达载体和MCP-外切酶融合蛋白表达载体可采用本领域常规技术构建获得,例如可参见“Gibson,D.G.et al.Enzymatic assembly of DNAmolecules upto several hundred kilobases.Nat Methods 6,343-345,doi:10.1038/nmeth.1318(2009)”和“Potapov,V.et al.Comprehensive Profiling of Four Base OverhangLigation Fidelity by T4DNALigase and Application to DNAAssembly.ACS SynthBiol 7,2665-2674,doi:10.1021/acssynbio.8b00333(2018)”。
Cas9蛋白的氨基酸序列为:
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:7)。
sgRNA-MS2的氨基酸序列如下所示,N表示为A、T、C、G中的任意一种。大写字母表示spacer区域,根据编辑位点设计;小写字母表示骨架区域:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggc caacatgaggatcacccatgtctgcagggccaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO:8)。
MCP的氨基酸序列如下所示,MCP蛋白片段的C端和外切酶融合蛋白片段的N端相连:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGV ELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(SEQ ID NO:9)。
本实施例中的蛋白片段相对应的核苷酸序列根据其氨基酸序列采用常规方法或常规的软件。
3)将转染后的细胞于37℃,5%二氧化碳环境中继续培养48h。
4)根据实验目的,进行下游检测分析。
3、检测编辑结果并进行下游应用
在细胞基因组插入TLR报告系统(如图1所示)进行检测,具体步骤如下:
1)吸取孔中细胞培养基,缓慢加入50μL DPBS溶液清洗细胞。
2)吸去DPBS溶液,加入20μL的0.25%胰蛋白酶消化细胞1min。
3)加入80μL完全培养基,吹打重悬细胞。
4)将细胞转移至圆底96孔细胞培养板中,100g离心3min,弃去上清液。
5)使用100μL无血清培养基重悬细胞。
6)使用流式细胞分析仪采集数据。mKate荧光信号对应NHEJ通路修复,EGFP荧光信号对应HDR通路修复。
4、结果
HDR通路修复效率如图2所示,其中,横坐标表示核酸外切酶的物种来源,所有外切酶均与MS2形成融合蛋白,从左到右依次为:无外切酶阴性对照、T7噬菌体核酸外切酶、T5噬菌体核酸外切酶、lambda噬菌体核酸外切酶、大肠杆菌核酸外切酶DCLRE1B、大肠杆菌核酸外切酶RecE和人源核酸外切酶EXO1活性结构域;纵坐标表示修复效率。
结果显示各来源的核酸外切酶均可在细胞系中发挥功能,改变编辑结果中的HDR/NHEJ比例。其中T7核酸外切酶最为显著的降低了NHEJ通路的修复效率,同时提高了HDR通路的修复效率。
实施例2:不同供体DNA在基因编辑系统对HDR通路的修复效率比较
本实施例的基因编辑系统与实施例1的区别在于,核酸外切酶为T7核酸外切酶,本实施例选择不同的供体DNA进行实验,即为无修饰的线性双链DNA、硫代磷酸二酯键(PS)修饰的线性双链DNA(nPS指线性双链DNA的5’端有连续的n个硫代磷酸二酯键修饰)和HMEJ形式的环状双链DNA作为供体。
如图3所示,其中,横坐标表示供体DNA类型,PCR:线性双链DNA,nPS:5’末端有n个PS修饰的线性双链DNA,HMEJ:HMEJ形式环状双链DNA;纵坐标表示修复效率。
结果显示在引入末端保护手段后,HDR编辑效率显著提高,其中HMEJ供体具有最高的HDR编辑效率和HDR/NHEJ比例。
实施例3:对切割位点附近不同长度位点的编辑效率的研究
本实施例使用HMEJ双链DNA供体在距离切割位点100bp范围内的不同位置分别引入连续的三碱基突变(nBP指引入的突变位置与Cas9切割位点相距n个碱基对),通过二代测序分析表征基因编辑效率,其余步骤同实施例1。
其中,二代测序分析表征基因编辑效率的具体步骤如下:
1.使用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞。
2.500g离心沉淀细胞,去除上清液。
3.若瞬时转染的表达载体上带有荧光标签,可使用流式分选技术,根据荧光标签筛选出成功导入编辑系统的细胞,再进行下游步骤。该方法一般适用于转染效率较低的细胞系。
4.使用Quick extract(Epicentre)试剂重悬细胞,65℃孵育15min,68℃孵育15min,95℃孵育10min,获取基因组片段溶液。
5.使用编辑位点附近同源臂区域外的一段引物对编辑位点附近的基因组序列进行PCR扩增。扩增进行35个循环,用以消除供体DNA的干扰。
6.将步骤5中的产物按1:10用超纯水稀释,取1μL作为模板,使用编辑位点附近的一对引物按照二代测序要求进行建库,该步骤扩增不超过20个循环。该步骤要求PCR产物全长150bp-200bp(不计二代测序接头部分)。
7.使用CRISPResso2(具体参考文献Li X,Wang Y,Liu Y,et al.Base editingwith a Cpf1-cytidine deaminase fusion[J].Nat Biotechnol,2018,36(4):324-327)对测序结果进行分析,统计NHEJ通路修复和HDR通路修复所占比例。
如图4所示,其中,横坐标表示突变位点距离切割位点的距离,纵坐标表示修复效率。结果显示距切割位点距离更近的编辑位点具有更高的编辑效率,在距切割位点至少100bp长度处依旧可以完成有效编辑。
实施例4:对基因组的不同位点的编辑效率的研究
本实施例使用HMEJ双链DNA供体在细胞基因组的HEK3、DNMT1、RNF2、VEGFA四个内源位点分别进行编辑,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,其他步骤同实施例1。其中,本实施例中的质粒转染量为Cas9/sgRNA20ng、T7核酸外切酶80ng、供体DNA100ng。
如图5所示,其中,横坐标表示编辑位点所在基因名称或编辑位点名称,纵坐标表示修复效率,T7+为编辑过程中添加T7核酸外切酶,T7-为编辑过程中不添加T7核酸外切酶。结果显示,基因组的不同位点在编辑效率和修复通路选择上有所差异,但在所有位点均可完成高效率的HDR通路编辑。
实施例5:基因编辑系统在细胞系中的蛋白标记作用
本实施例使用HMEJ双链DNA供体,在基因组的NPM1基因位点C端(图6)和FUS基因位点N端(图7)分别敲入FlAsH短肽标签(具体参考文献Griffin B A,Adams S R,Tsien RY.Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside livecells[J].Science,1998,281(5374):269-72和Thorn K S,Naber N,Matuska M,et al.Anovel method of affinity-purifying proteins using a bis-arsenical fluorescein[J].Protein Sci,2000,9(2):213-7),在活细胞中观察目的蛋白的细胞定位。其中,本实施例中的质粒转染量为Cas9 20ng、T7核酸外切酶80ng、供体DNA100ng。
结果显示,该编辑工具可以非常高效的引入荧光标签,从而在活细胞中显示蛋白的细胞定位(NPM1定位:核仁,FUS定位:细胞核内核仁以外区域;左图:荧光标记内源蛋白,右图:hoechst标记染色质),从而可便捷实现蛋白内源表达水平的功能研究。
实施例6:T7核酸外切酶在PE编辑系统中编辑效率的研究
本实施例对PE编辑系统进行改进,将Cas9切刻酶(Cas9n)突变恢复为野生型Cas9,延长引物结合区域并与T7核酸外切酶联用,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,转染时使用50ng含有编码Cas9-MMLV融合蛋白/pegRNA的基因的表达质粒,100ng含有编码T7核酸外切酶的基因的表达质粒作为实验组;50ng含有编码Cas9n-MMLV融合蛋白/pegRNA的基因的表达质粒,100ng pUC19质粒作为PE系统对照,其他步骤同实施例1。
如图8和9所示,结果显示对于测试的多个基因组位点,改进型的PE-T7编辑系统(即为px330-mmlv/t7)均表现出显著高于PE系统的基因编辑效率。(图中cutting指在该基因组位点处造成的总编辑效率,ins/del指按照预期引入插入/缺失突变的效率)。
实施例7:针对招募系统的有无的比较
本实施例的基因编辑系统与实施例1的区别仅在于,核酸外切酶为T7核酸外切酶,通过使用无MS2-loop结构的sgRNA作为对照,对比了有/无MS2招募系统的HDR通路修复效率。
如图10所示,结果显示在引入MS2招募系统后,T7核酸外切酶抑制NHEJ通路,提高HDR通路的功能得到了进一步加强。
实施例8:T7核酸外切酶在细胞内DSB处制造的单链DNA的研究
本实施例中未使用供体DNA,仅引入Cas9/sgRNA与T7核酸外切酶作为实验组(即为T7+),在转染后不同时间点进行采样,通过酶切-荧光定量PCR法对单链DNA进行检测,对照物使用MCP蛋白代替T7核酸外切酶(即为T7-)(本实施例中使用6孔细胞培养板,转染时Cas9/sgRNA,T7核酸外切酶的含量分别为500ng、1500ng,PEI用量为12μL)。
如图11所示,结果显示在转染后一段时间内,加入T7核酸外切酶的样品DSB附近的单链DNA总量明显高于对照组。
实施例9:T7核酸外切酶在不同细胞系编辑效率的研究
本实施例使用HMEJ双链DNA供体,在多种细胞系上进行了基因编辑。实验通过流式细胞分选技术筛选出成功导入编辑工具的细胞,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,(本实施例中使用24孔细胞培养板,使用lipo3000试剂进行转染,转染试剂用量为1.5μL,转染时Cas9/sgRNA,T7核酸外切酶和donor DNA的含量分别为:HCT116,50ng,250ng,200ng;U2OS:250ng,350ng,300ng;Hela,50ng,250ng,200ng;mESC:200ng,200ng,150ng)其他步骤同实施例1,检测结果如图12-18所示。结果显示,在各种细胞系中,引入T7核酸外切酶均可抑制NHEJ通路的修复,并显著提高HDR通路的修复效率,因此,本发明的基因编辑系统的高效编辑性能不依赖细胞体系。
实施例10:T7核酸外切酶在原代大鼠神经元编辑效率的研究
本实施例使用HMEJ双链DNA供体,使用Lonza-4D电转仪通过电穿孔方式对E18大鼠胚胎的皮层神经细胞进行表达载体递送,使用20μL电穿孔体系,Cas9/sgRNA,T7核酸外切酶和donor DNA的含量分别为:500ng,1000ng,500ng(具体操作方法参考https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/DE/en/download/product/asset/21243),通过一代测序分析表征基因编辑效率,其他步骤同实施例1,分析结果见图19。结果显示,该编辑工具可在大鼠原代神经细胞完成有效的基因编辑。因此,本发明的基因编辑系统的可在终末分化原代细胞实现HDR编辑。
实施例11:特异性核酸内切酶转染浓度对编辑结果影响
本实施例使用HMEJ双链DNA供体在细胞基因组的不同位点分别进行编辑,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,其他步骤同实施例1,分析结果见图20-24。并测试了编辑中使用不同转染量的Cas9/sgRNA表达质粒,使用pUC19质粒补全转染总量。结果显示,当内切酶浓度较低时,可以获得较高的HDR/NHEJ比例,当内切酶浓度较高时,可以获得较高的HDR修复效率。
实施例12:T7核酸外切酶转染浓度对编辑结果影响
本实施例使用HMEJ双链DNA供体在细胞基因组的不同位点分别进行编辑,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,Cas9/sgRNA含量为20ng,其他步骤同实施例1,分析结果见图25-30。并测试了编辑中使用不同转染量的T7核酸外切酶表达质粒,使用MCP蛋白表达质粒补全转染总量。结果显示,随T7核酸外切酶浓度提高,NHEJ效率呈现下降趋势,HDR效率呈现先上升后下降趋势。
实施例13:供体DNA转染浓度对编辑结果影响
本实施例使用HMEJ双链DNA供体在细胞基因组的不同位点分别进行编辑,通过二代测序(参考实施例3)分析表征基因编辑效率,Cas9/sgRNA含量为20ng,T7核酸外切酶含量为80ng,其他步骤同实施例1,分析结果见图30-34。并测试了编辑中使用不同转染量的供体DNA质粒,使用pUC19质粒补全转染总量。结果显示,随供体DNA浓度上升,NHEJ通路效率下降,HDR通路效率上升。
实施例14:对NPM1进行双荧光敲入编辑
本实施例为实施例5的延伸应用。实验中同时使用在NPM1蛋白C端引入split-sfGFP标签的供体DNA(即为NPM1WT)和在NPM1蛋白C端引入致病的+4突变和FlAsH短肽标签的供体DNA(即为NPM1mut)。Cas9/sgRNA含量为50ng,T7核酸外切酶含量为80ng,供体DNA为100ng。其他步骤同实施例5。通过流式细胞仪分选得到了荧光标记双阳性的细胞,并通过共聚焦显微镜对荧光进行了观察(图37,(a):DAPI;(b):NPM1WT;(c):NPM1mut)。对引入的荧光标签与NPM1蛋白野生型/突变体免疫荧光的共定位分别进行观察(图38,(a)NPM1WT DAPI(b)NPM1WT荧光标签(c)NPM1WT免疫荧光染色(d)NPM1mut DAPI(e)NPM1mut荧光标签(f)NPM1mut免疫荧光染色。结果表明,该方法可以同时对一个细胞中同一基因的不同等位基因引入不同的突变,高效的制造双敲入杂合体细胞。
实施例15:通过基因编辑手段对FUS蛋白疾病相关突变体进行研究
本实施例为实施例5的延伸应用。实验中使用实施例5中获得的在FUS蛋白敲入FlAsH标签的细胞系。本实验通过基因编辑方法在FUS蛋白引入目前已发现的疾病相关点突变(本实施例以C端NLS区域点突变为例)并通过荧光显微镜观察突变体蛋白在细胞中的行为变化。Cas9/sgRNA含量为50ng,T7核酸外切酶含量为80ng,供体DNA各50ng。其他步骤同实施例5。使用500μM亚砷酸钠刺激细胞1h,通过对引入不同点突变的细胞中FUS蛋白进入应激颗粒(SGs)的比例进行观察,筛选得到了一组导致FUS定位于SGs的突变体(图39),突变体与野生型FUS亚细胞定位有明显差别(图40,(a)P525L突变体;(b)野生型)。然后对筛选结果通过单细胞培养和免疫荧光染色验证其突变与表型的对应关系,结果参见图41(图41,(a)WTDAPI;(b)WT FUS(c);Q519X DAPI;(d);Q519X FUS;(e)P525LDAPI;(f)P525L FUS)。结果表明,该方法可以高通量的对各种蛋白的点突变进行筛选和初步的功能鉴定。
实施例16:通过基因编辑手段研究ATXN2蛋白polyQ结构长度对蛋白功能的影响
ATXN2蛋白包含一个谷氨酰胺重复序列结构域(polyQ),野生型蛋白polyQ长度为22-23,其序列异常延长与多种疾病的发病相关。本实施例使用实施例5的方式在ATXN2蛋白引入FlAsH荧光标签,使用实施例15的方式在ATXN2蛋白polyQ区域引入突变,构建了具有不同polyQ长度的ATXN2基因编辑细胞系(nQ指该基因编辑细胞系中ATXN2蛋白polyQ结构域包含n个连续的谷氨酰胺)。我们使用Western-bloting检测ATXN2降解条带分子量变化,并通过一代测序对编辑结果进行了验证(图42,(a)Western-bloting 70kD-80kD ATXN2条带;(b)44Q细胞系polyQ序列一代测序结果)。并据此研究polyQ长度对ATXN2在细胞应激与恢复过程中行为的影响,通过Western-bloting进行了探究和总结(图43,左:WT;中:30Q;右:44Q;每组内分别为:应激前,应激后恢复0h,应激后恢复2h,应激后恢复6h)。结果表明,通过该方法可以避免研究突变体蛋白时引入浓度变化,对实验结果产生干扰。
实施例17:测试基因编辑工具引入突变的长度范围
本实施例使用引入插入突变或替换突变的供体DNA,其余实验方法同实施例3。如图35(插入突变)和36(替换突变)所示,其中,横坐标表示引入插入/替换突变的长度,纵坐标表示修复效率。结果显示,该编辑工具可有效编辑至少长达200bp的DNA片段。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途,其特征在于,所述5’→3’核酸外切酶与所述基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述基因编辑系统中采用的细胞为动物细胞,优选为哺乳动物细胞;
任选地,所述述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶;
任选地,所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80%同源性的氨基酸序列。
3.一种基因编辑系统,其特征在于,包含:
位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA;
其中,所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。
4.根据权利要求3所述的基因编辑系统,其特征在于,所述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶;
任选地,所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80%同源性的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的基因编辑系统,其特征在于,所述位点特异性核酸酶选自成簇规律间隔短回文重复、转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、归巢内切酶、限制性核酸内切酶中的至少之一;
任选地,所述位点特异性核酸酶的添加量为2~50ng;
任选地,所述5’→3’核酸外切酶的添加量为40~120ng;
任选地,所述供体DNA的添加量为0.2~100ng。
6.根据权利要求5所述的基因编辑系统,其特征在于,所述基因编辑系统进一步包含:gRNA;
任选地,所述gRNA包括选自sgRNA、pegRNA和crRNA/tracrRNA中的至少之一;
任选地,所述基因编辑系统进一步包含:招募系统;
任选地,若所述招募系统为MS2/MCP系统,所述gRNA为gRNA-MS2或pegRNA-MS2,所述5’→3’核酸外切酶为MCP-外切酶融合蛋白;
任选地,所述供体DNA为采用硫代磷酸二酯键修饰的线性双链DNA和/或HMEJ形式的环状双链DNA;
任选地,所述供体DNA上的所述硫代磷酸二酯键的修饰个数大于2,优选为4-10。
7.根据权利要求3或4所述的基因编辑系统,其特征在于,所述基因编辑系统的技术路线包括寡核苷酸编辑模板介导的同源重组、单碱基编辑、引导编辑和双链长链核酸编辑模板介导的同源重组中的一种。
8.一种对细胞进行基因编辑的方法,其特征在于,包括:
将权利要求3-7任一项所述的基因编辑系统引入细胞。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述细胞为动物细胞,优选为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,所述细胞为终末分化原代细胞。
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