CN116283658A - 一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂及其应用 - Google Patents

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管梦颖
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Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，公开了一种酰肼腙类HIF‑2α抑制剂及其应用。本发明提供的酰肼腙类HIF‑2α抑制剂，能够阻断HIF‑2α/ARNT二聚化，进而发挥HIF‑2转录抑制的作用。该HIF‑2α抑制剂化合物具有拮抗HIF‑2转录的活性，在人肾透明细胞癌细胞株786‑O中，显示出VEGF蛋白抑制活性。因此，该化合物具有应用于制备治疗VHL缺失或HIF‑2α异常表达疾病包括癌症、炎症、自身免疫性疾病以及铁超载相关疾病的药物中的前景。

Description

一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂及其应用。
背景技术
低氧诱导因子(hypoxia-inducedfactor,HIF)是细胞在缺氧下的关键核转录调控因子。在缺氧环境中，氧依赖的功能亚基HIF-α会积累并与结构亚基HIF-β形成异源二聚体复合物。该二聚体复合物进一步与转录共激活因子p300蛋白作用，与下游靶基因DNA上缺氧反应元件HRE结合，从而调控一系列蛋白转录过程，如血管生成、线粒体代谢和细胞增殖、转移等，以协助机体应对缺氧造成的压力。
HIF通路的活性异常，与癌症、炎症、贫血和肺动脉高压等多种疾病紧密相关，其中HIF-2α的过表达和活化是导致VHL-/-透明细胞肾细胞癌(ccRCC)的主要原因。研究表明，超过90％的ccRCC患者存在VHL失活，而VHL充当E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，会靶向降解HIF蛋白来调节细胞对缺氧的应激。VHL功能缺失会使HIF-2α在癌细胞中积累并转录激活下游靶基因，促进肿瘤细胞增殖和转移。因此，HIF-2已成为治疗肾透明细胞癌的新靶标。
现有技术中，靶向HIF-2α/ARNT二聚化的小分子抑制剂已经有文献报道，如PT-2385(J.Med.Chem.2018,61,9691)、MK-6482(PT-2977)(J.Med.Chem.2019,62,6876)、THS-044(J.Am.Chem.Soc.2009,131,17647)、0X3(J.Med.Chem.2013,56,1739)和四氮唑并氢化嘧啶衍生物(S,R)-37(J.Med.Chem.2015,58,5930)等。PT-2385、MK-6482、THS-044、0X3及(S,R)-37的结构如下所示。
Figure SMS_1
上述分子靶向HIF-2α/ARNT二聚化，通过特异性地结合于HIF-2α的PAS-B结构域特有的空腔，对HIF-2具有高度选择性。其中，Belzutifan(PT-2977)已于2021年8月31日获批上市，用于希佩尔林道综合征相关的肾透明细胞癌、复发性胶质母细胞瘤等的治疗。靶向HIF-2α/ARNT二聚化小分子抑制剂受到越来越多的关注，但结构类型不多。
因此，寻找和发现不同骨架的HIF-2α抑制剂，用于肾透明细胞癌等疾病的治疗，具有重要的临床意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂及其应用。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂。该酰肼腙类HIF-2α抑制剂可以特异性地结合于HIF-2α，抑制HIF-2α的过表达和活化。具体地，所述HIF-2α抑制剂的结构式为：
Figure SMS_2
其中，G为-O-或-NH-；
R1选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷胺基、C1-6二烷基胺基、C1-6含氟烷基、C3-8环烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R2选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C1-6含氟烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R3选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C1-6含氟烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R4选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6含氟烷基、C1-6含氟烷氧基、C3-8环烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R5选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6含氟烷基、C1-6含氟烷氧基、C3-8环烷基、C2-6不饱和脂链烃基。
本团队研究人员经研究发现，本发明提供的上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂，能够阻断HIF-2α/ARNT二聚化，进而发挥HIF-2转录抑制的作用。上述化合物具有拮抗HIF-2转录的活性，在人肾透明细胞癌细胞株786-O中，显示出VEGF蛋白抑制活性。HIF-2α的过表达和活化是导致VHL-/-透明细胞肾细胞癌的主要原因。因此，可将上述化合物应用于制备治疗VHL缺失或HIF-2α异常表达疾病包括癌症、炎症、自身免疫性疾病以及铁超载相关疾病的药物中。
作为本发明上述技术方案的优选，R1选自氢、氟、氯、溴、羟基、氰基、甲基、甲氧基；所述R2选自氢、甲基、乙基；所述R3选自氢、甲基、乙基；所述R4选自氟、氯、溴、氰基、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；所述R5选自氟、氯、溴、氰基、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基。
当R1～R5分别选自上述基团时，化合物具有优良的拮抗HIF-2转录的活性，在人肾透明细胞癌细胞株786-O中，显示出较强的VEGF蛋白抑制活性。
作为本发明上述技术方案的优选，所述HIF-2α抑制剂选自化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28，所述化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28的结构式为：
Figure SMS_3
Figure SMS_4
Figure SMS_5
化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28具有优良的拮抗HIF-2转录的活性，在人肾透明细胞癌细胞株786-O中，显示出较强的VEGF蛋白抑制活性。
作为本发明上述技术方案的优选，所述HIF-2α抑制剂选自化合物YA-1、YA-6、YA-7、YA-13、YA-15、YA-18、YA-19、YA-21、YA-23、YA-25、YA-28、YA-29、YA-32、YA-34、YA-35、YA-36、YB-1、YB-3、YB-5、YB-6、YB-7、YB-10、YB-13、YB-17、YB-18、YB-19的手性异构体，即所述HIF-2α抑制剂选自化合物R-YA-1、R-YA-6、R-YA-7、R-YA-13、R-YA-15、R-YA-18、R-YA-19、R-YA-21、R-YA-23、R-YA-25、R-YA-28、R-YA-29、R-YA-32、R-YA-34、R-YA-35、R-YA-36、R-YB-1、R-YB-3、R-YB-5、R-YB-6、R-YB-7、R-YB-10、R-YB-13、R-YB-17、R-YB-18、R-YB-19，所述化合物R-YA-1、R-YA-6、R-YA-7、R-YA-13、R-YA-15、R-YA-18、R-YA-19、R-YA-21、R-YA-23、R-YA-25、R-YA-28、R-YA-29、R-YA-32、R-YA-34、R-YA-35、R-YA-36、R-YB-1、R-YB-3、R-YB-5、R-YB-6、R-YB-7、R-YB-10、R-YB-13、R-YB-17、R-YB-18、R-YB-19的结构式为：
Figure SMS_6
Figure SMS_7
具体地，本发明还提供了一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂的制备方法。如下：
(1)当G为-NH-时，其反应流程如下所示：
Figure SMS_8
反应过程为：
①取代苯胺(化合物I-1)溶于溶剂，在弱酸性条件(pH5-7)下与C-2取代的羰基乙酸乙酯进行还原胺化反应制得2-苯氨基乙酸酯类中间体I-2。所用酸包括冰醋酸、盐酸、硫酸，所用溶剂包括乙腈、DMF、DMSO等；
②中间体I-2与水合肼发生肼解反应制得2-苯氨基乙酰肼类中间体I-3，所用的溶剂包括乙醇、THF、二氧六环、丙酮等；
③最后，中间体I-3在弱酸性条件(pH5-7)下与取代的2-羟基苯甲醛或2-羟基-萘-1-醛进行缩合反应，制备获得目标化合物YA-1～YA-38，所用酸为冰醋酸，所用溶剂为乙醇、乙腈、THF等。
(2)当G为-O-时，其反应流程如下所示：
Figure SMS_9
反应过程为：
①取代苯酚(化合物II-1)在碱性条件下与不同烷基取代的2-溴乙酸乙酯进行亲核反应制得2-苯氧基乙酸酯类中间体II-2。碱性试剂包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯，所用溶剂包括乙腈、丙酮、THF、DMF、DMSO等；
②中间体II-2与水合肼发生肼解反应制得2-苯氧基乙酰肼类中间体II-3，所用的溶剂包括乙醇、THF、二氧六环、丙酮等；
③最后，中间体II-3在弱酸性条件(pH5-7)下与取代的2-羟基苯甲醛或2-羟基-萘-1-醛进行缩合反应，制备获得目标化合物YB-1～YB-28，所用酸为冰醋酸，所用溶剂选自乙醇、乙腈、THF等。
另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包括上述HIF-2α抑制剂或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或辅料。
本发明通过将HIF-2作为靶标，提供一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，即酰肼腙类化合物，该化合物具有抑制HIF-2α活性的作用，以实现目标疾病，如癌症、炎症、自身免疫性疾病以及铁超载相关疾病等的治疗及预防。
本发明中所述“药学上可接受的载体”是指药学领域常规的药物载体，包括药学领域的常规稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶等，湿润剂如甘油，崩解剂如琼脂、碳酸钙等，吸收促进剂如季铵化合物，表面活性剂如十六烷醇，吸附载体如高岭土和皂黏土，润滑剂如滑石粉等，必要时还可以加入香味剂，甜味剂等。
药物制剂适用于通过任何适当途径给药，如口服(包括含服或舌下给药)、直肠给药、经鼻给药、局部给药(包括含服、舌下给药或经皮给药)、阴道给药或胃肠外给药(包括皮下注射、肌内注射、静脉注射或皮内注射)途径。这些制剂可由药剂学领域中已知的任何方法制备，如通过将活性成分与载体或赋形剂混在一起的方法。
本发明中“药学上可接受的盐”指通过常规的方法制备，包括但不限于有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐、无机碱盐。所述的有机酸盐包括但不限于草酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、苹果酸盐、枸掾酸盐、富马酸盐、樟脑磺酸盐、甲磺酸盐等；所述的无机酸盐包括但不限于硝酸盐、硫酸盐、氢卤酸盐、磷酸盐等。所述的有机碱盐包括但不限于甲醇钠、甲醇钾、乙醇钠、乙醇钾、三乙胺、叔丁胺等。所述的无机碱盐包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等。
具体地，本发明涉及上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备治疗VHL缺失或/和HIF-2α异常表达疾病的药物中的应用。
具体地，本发明还涉及上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗肿瘤的药物中的应用。
作为本发明上述技术方案的优选，肿瘤选自实体瘤，包括肾癌、肝癌、肺癌、胃癌、肉瘤、结直肠癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、多发性骨髓瘤、胶质瘤、淋巴瘤和成神经细胞瘤。
值得注意的是，在制备预防或/和治疗肿瘤的药物时，可选用其他抗肿瘤药物和本发明所提供的酰肼腙类HIF-2α抑制剂化合物或其可药用盐联合使用。其他抗肿瘤药包括但不限于有丝分裂抑制剂(如长春碱、长春地辛等)、微管蛋白分解抑制剂(如泰素)、抗代谢物(如5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和阿糖胞苷等)、烷基化试剂(如顺铂、卡铂和环磷酰胺等)、可插入抗生素(如阿雷素、丝裂霉素和争光霉素等)、酶(如天门冬氨酶等)、拓朴异构酶抑制剂(如依托伯苷和喜树碱等)。
具体地，本发明还涉及上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
具体地，本发明还涉及上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗炎症的药物中的应用。
作为本发明上述技术方案的优选，自身免疫性疾病以及炎症选自过敏、哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性接触皮炎、胰腺炎、肾衰竭、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肌纤维痛、红斑狼疮、慢性阻塞性肺病、牛皮癣、多发性硬化症和外伤感染。
具体地，本发明还涉及上述酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗铁超载疾病的药物中的应用。
作为本发明上述技术方案的优选，铁超载疾病选自血色素沉着病、红细胞增多症、帕套综合征和β-地中海贫血。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供了一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，能够阻断HIF-2α/ARNT二聚化，进而发挥HIF-2转录抑制的作用。该酰肼腙类HIF-2α抑制剂化合物具有优良的拮抗HIF-2转录的活性，在人肾透明细胞癌细胞株786-O中，显示出较强VEGF蛋白抑制活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明实施例中所述HIF-2α抑制剂包括化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28，化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28的结构式见表1。
表1
Figure SMS_10
/>
Figure SMS_11
/>
Figure SMS_12
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Figure SMS_13
Figure SMS_14
实施例1目标分子YA-1～YA-17的制备
1.制备N'-(2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-1)
Figure SMS_15
(1)(3-氟苯基)丙氨酸乙酯(化合物I-2-1)的制备
将3-氟苯胺(I-1-1，222mg,2mmol)和丙酮酸乙酯(255mg,2.2mmol)溶于10mLDMF中，加入冰醋酸至pH5-7，室温搅拌2h，分两次加入氰基硼氢化钠(188mg,6mmol)，室温搅拌8h，加入水，用乙酸乙酯提取，合并有机层，饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化得白色固体。收率为55％；ESI-MS:m/z＝212.2[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):7.07(m,1H),6.48(m,1H),6.39(m,1H),6.15(m,1H),5.95(s,1H),4.19(m,1H),4.09(m,1H),3.97(q,1H,J＝6.8Hz),1.50(d,3H,J＝6.8Hz),1.18(t,3H,J＝8.0Hz).
(2)2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物I-3-1)的制备
将(3-氟苯基)丙氨酸乙酯(I-2-1,1.0mmol)、50％N2H4.H2O(10.0mmol)溶于10mLEtOH中，80℃反应12h，减压蒸馏除去溶剂后，经硅胶柱层析纯化得白色固体，Yield：96％；ESI-MS:198.2[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):7.07(m,1H),6.54(s,1H),6.48(m,1H),6.37(m,2H),6.19(m,1H),4.14(q,1H,J＝6.8Hz,),2.39(s,2H),1.53(d,3H,J＝6.8Hz).
(3)N'-(2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-1)的制备
化合物I-3-1(100mg)溶于10mLEtOH中，加入2-羟基苯甲醛(61mg，0.5mmol)，80℃反应2h，冷却至室温，有固体析出，抽滤，滤饼用乙醇重结晶，真空干燥得白色固体，Yield：73％；ESI-MS:301.1[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):11.77(s,1H),11.05(s,1H),8.47(s,1H),7.50(dd,1H,J1＝7.8,J2＝1.6Hz),7.28(m,1H),7.09(q,1H,J＝7.9Hz),6.90(d,2H,J＝8.1Hz),6.43(dd,1H,J1＝8.2,J2＝2.1Hz),6.34(m,3H),3.97(p,1H,J＝6.9Hz),1.39(d,3H,J＝6.9Hz).2.(R)-N'-(2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物R-YA-1)的制备
将1.中制备得到的化合物YA-1通过手性柱拆分，得到手性异构体R-YA-1。
3.制备N'-(4-氟-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-2)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为4-氟-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得黄色固体。收率为67％；ESI-MS:m/z＝320.3[M+H]+。
4.制备N'-(5-氟-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-3)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-氟-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得黄色固体。收率为63％；ESI-MS:m/z＝320.3[M+H]+。
5.制备N'-(3-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-4)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为3-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为58％；ESI-MS:m/z＝336.1[M+H]+。
6.制备N'-(4-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-5)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为4-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为61％；ESI-MS:m/z＝336.1[M+H]+。
7.制备N'-(5-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-6)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为69％；ESI-MS:m/z＝336.1[M+H]+。
8.制备化合物R-YA-6
将7.中制备得到的化合物YA-6通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-6。
9.制备N'-(6-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-7)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为6-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为65％；ESI-MS:m/z＝336.1[M+H]+。
10.制备化合物R-YA-7
将9.中制备得到的化合物YA-7通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-7。
11.制备N'-(3-溴-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-8)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为3-溴-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为72％；ESI-MS:m/z＝381.2[M+H]+。
12.制备N'-(4-溴-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-9)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为4-溴-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为75％；ESI-MS:m/z＝381.2[M+H]+。
13.制备N'-(5-溴-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-10)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-溴-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为77％；ESI-MS:m/z＝381.2[M+H]+。
14.制备N'-(6-溴-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-11)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为6-溴-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为74％；ESI-MS:m/z＝381.2[M+H]+。
15.制备N'-(5-氰基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-12)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲酰基-4-羟基苯腈，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为76％；ESI-MS:m/z＝327.1[M+H]+。
16.制备N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-13)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为82％；ESI-MS:m/z＝316.1[M+H]+。
17.制备化合物R-YA-13
将16.中制备得到的化合物YA-13通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-13。
18.制备N'-(5-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-14)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-甲基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为86％；ESI-MS:m/z＝316.1[M+H]+。
19.制备N'-(5-甲氧基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-15)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-甲氧基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为83％；ESI-MS:m/z＝332.3[M+H]+。
20.制备化合物R-YA-15
将19.中制备得到的化合物YA-15通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-15。
21.制备N'-(2,3-二羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-16)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为2,3-二羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为69％；ESI-MS:m/z＝318.3[M+H]+。
22.制备N'-(2,6-二羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丙酰肼(化合物YA-17)
参考1.中制备化合物YA-1。将2-羟基苯甲醛替换为2,6-二羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得淡红色固体。收率为75％；ESI-MS:m/z＝318.3[M+H]+。
实施例2化合物YA-18～YA-27的制备
1.N'-(2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-18)的制备
参考实施例1的1.中制备化合物YA-1。将丙酮酸乙酯替换为2-丁酮酸乙酯，反应工艺所用物质的量配比与1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为80％；ESI-MS:m/z＝315.1[M+H]+。
2.制备化合物R-YA-18
将实施例2的1.中制备得到的化合物YA-18通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-18。
3.N'-(5-氟-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-19)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为5-氟-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得黄色固体。收率为73％；ESI-MS:m/z＝333.1[M+H]+。
4.制备化合物R-YA-19
将实施例2的3.中制备得到的化合物YA-19通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-19。
5.N'-(5-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-20)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为5-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为76％；ESI-MS:m/z＝349.1[M+H]+。
6.N'-(6-氯-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-21)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为6-氯-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为74％；ESI-MS:m/z＝349.1[M+H]+。
7.制备化合物R-YA-21
将实施例2的6.中制备得到的化合物YA-21通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-21。
8.N'-(5-溴-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-22)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为5-溴-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为81％；ESI-MS:m/z＝393.0[M+H]+。
9.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-23)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为80％；ESI-MS:m/z＝329.2[M+H]+。
10.制备化合物R-YA-23
将实施例2的9.中制备得到的化合物YA-23通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-23。
11.N'-(5-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-24)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为5-甲基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为78％；ESI-MS:m/z＝329.2[M+H]+。
12.N'-(5-甲氧基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-25)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为5-甲氧基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为84％；ESI-MS:m/z＝345.1[M+H]+。
13.制备化合物R-YA-25
将实施例2的12.中制备得到的化合物YA-25通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-25。
14.N'-(2,3-二羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-26)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为2,3-二羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得白色固体。收率为76％；ESI-MS:m/z＝331.1[M+H]+。
15.N'-(2,6-二羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-27)的制备参考实施例2的1.中制备化合物YA-18。将2-羟基苯甲醛替换为2,6-二羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的1.中制备化合物YA-18同，得粉色固体。收率为75％；ESI-MS:m/z＝331.1[M+H]+。
实施例3化合物YA-28～YA-36的制备
1.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氰基-5-氟苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-28)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-氟-5-氨基苯腈，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为71％；ESI-MS:m/z＝354.1[M+H]+。
2.制备化合物R-YA-28
将实施例3的1.中制备得到的化合物YA-28通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-28。
3.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氯苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-29)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-氯苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为74％；ESI-MS:m/z＝345.1[M+H]+。
4.制备化合物R-YA-29
将实施例3的3.中制备得到的化合物YA-29通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-29。
5.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((4-氯苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-30)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为4-氯苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为75％；ESI-MS:m/z＝345.1[M+H]+。
6.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-甲基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-31)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-甲基苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为68％；ESI-MS:m/z＝325.2[M+H]+。
7.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-甲基-5-氰基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-32)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-甲基-5-氨基苯腈，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为76％；ESI-MS:m/z＝350.2[M+H]+。
8.制备化合物R-YA-32
将实施例3的7.中制备得到的化合物YA-32通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-32。
9.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-甲氧基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-33)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-甲氧基苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为72％；ESI-MS:m/z＝341.2[M+H]+。
10.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-三氟甲氧基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-34)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-三氟甲氧基苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为81％；ESI-MS:m/z＝395.1[M+H]+。
11.制备化合物R-YA-34
将实施例3的10.中制备得到的化合物YA-34通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-34。
12.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-二氟甲氧基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-35)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-二氟甲氧基苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为82％；ESI-MS:m/z＝377.2[M+H]+。
13.制备化合物R-YA-35
将实施例3的12.中制备得到的化合物YA-35通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-35。
14.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氰基苯基)氨基)丁酰肼(化合物YA-36)的制备参考实施例2的9.中制备化合物YA-23。将3-氟苯胺替换为3-氰基苯胺，反应工艺所用物质的量配比与实施例2的9.中制备化合物YA-23同，得白色固体。收率为80％；ESI-MS:m/z＝336.1[M+H]+。
15.制备化合物R-YA-36
将实施例3的14.中制备得到的化合物YA-36通过手性柱拆分得到手性异构体R-YA-36。
实施例4化合物YA-37～YA-38的制备
1.N'-(2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)乙酰肼(化合物YA-37)的制备
参考实施例1的1.中制备化合物YA-1。将丙酮酸乙酯替换为乙醛酸乙酯，反应工艺所用物质的量配比与实施例1的1.中制备化合物YA-1同，得白色固体。收率为85％；ESI-MS:m/z＝287.1[M+H]+。
2.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-((3-氟苯基)氨基)乙酰肼(化合物YA-38)的制备参考实施例4的1.中制备化合物YA-37。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应工艺所用物质的量配比与实施例4的1.中制备化合物YA-37同，得白色固体。收率为83％；ESI-MS:m/z＝301.1[M+H]+。
实施例5化合物YB-1～YB-9的制备
1.N'-(2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-1)的制备
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(1)2-(3-氟苯氧基)丙酸乙酯(化合物II-2-1)的制备
将3-氟苯酚II-1-1(336mg,3.0mmol)和碳酸钾(829mg，6.0mmol)溶于10mL乙腈中，室温搅拌20min后加入2-溴丙酸乙酯(255mg,3.0mmol)，于50℃下反应18h，抽滤除去碳酸钾，滤液浓缩后经硅胶柱层析纯化得白色油状液体。收率为89％；ESI-MS:m/z＝212.2[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):7.21(m,1H),6.69(m,1H),6.65(m,1H),6.60(m,1H),4.72(q,1H,J＝6.8Hz),4.23(q,2H,J＝7.1Hz),1.62(d,3H,J＝6.8Hz),1.26(t,3H,J＝7.1Hz).
(2)2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物II-3-1)的制备
将2-(3-氟苯氧基)丙酸乙酯(II-2-1,2.0mmol)、50％N2H4.H2O(20.0mmol)溶于15mLEtOH中，80℃反应12h，减压蒸馏除去溶剂后，柱层析纯化得白色固体，Yield：50％，ESI-MS:199.2[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):7.28(m,1H),6.90(m,1H),6.84(m,1H),6.69(m,1H),6.38(s,1H),4.58(q,1H,J＝6.8Hz),2.44(s,2H),1.60(d,3H,J＝6.8Hz).
(3)N'-(2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-1)的制备
化合物II-3-1(100mg)溶于10mLEtOH中，加入2-羟基苯甲醛(61mg，0.5mmol)，80℃反应2h，冷却至室温，有固体析出，抽滤，滤饼用乙醇重结晶，真空干燥得白色固体，Yield：76％，ESI-MS:417.1[M+H]+；1HNMR(δ,DMSO-d6):8.34(d,1H,J＝1.1Hz),7.76(s,1H),7.51(ddd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝2.0Hz,J3＝1.0Hz),7.33(m,2H),6.91(m,3H),6.76(m,2H),4.62(q,1H,J＝6.8Hz),1.61(d,3H,J＝6.9Hz).
2.R-N'-(2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物R-YB-1)的制备
将实施例5的1.中得到的化合物YB-1通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-1。
3.N'-(5-氟-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-2)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-氟-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得黄色固体。收率80％；ESI-MS:320.1[M+H]+。
4.N'-(6-氯-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-3)的制备
参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为6-氯-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率78％；ESI-MS:336.1[M+H]+。
5.制备手化合物R-YB-3
将实施例5的4.中得到的化合物YB-3通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-3。
6.N'-(5-氯-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-4)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-氯-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率79％；ESI-MS:336.1[M+H]+；
7.N'-(5-溴-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-5)的制备
参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-溴-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率83％；ESI-MS:380.0[M+H]+。
8.制备手化合物R-YB-5
将实施例5的7.中得到的化合物YB-5通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-5。
9.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-6)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率75％；ESI-MS:316.1[M+H]+。
10.制备手化合物R-YB-6
将实施例5的9.中得到的化合物YB-6通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-6。
11.N'-(5-甲氧基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-7)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为5-甲氧基-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率77％；ESI-MS:332.1[M+H]+。
12.制备手化合物R-YB-7
将实施例5的11.中得到的化合物YB-7通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-7。
13.N'-(2,3-二羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-8)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为2,3-二羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率78％；ESI-MS:318.1[M+H]+。
14.N'-(2,6-二羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丙酰肼(化合物YB-9)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-羟基苯甲醛替换为2,6-二羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得粉色固体。收率79％；ESI-MS:318.1[M+H]+。
实施例6化合物YB-10～YB-19的制备
1.N'-(2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丁酰肼(化合物YB-10)的制备
参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-溴丙酸乙酯替换为2-溴丁酸乙酯，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率72％；ESI-MS:316.1[M+H]+。
2.制备手化合物R-YB-10
将实施例6的1.中得到的化合物YB-10通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-10。
3.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)丁酰肼(化合物YB-11)的制备参考实施例6的1.中制备化合物YB-10。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例6的1.中制备化合物YB-10同，得白色固体。收率81％；ESI-MS:330.1[M+H]+。
4.制备手化合物R-YB-11
将实施例6的3.中得到的化合物YB-11通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-11。
5.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氰基-5-氟苯氧基)丁酰肼(化合物YB-12)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-氟-5-羟基苯腈，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率85％；ESI-MS:355.1[M+H]+。
6.制备手化合物R-YB-12
将实施例6的5.中得到的化合物YB-12通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-12。
7.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氯苯氧基)丁酰肼(化合物YB-13)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-氯苯酚，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率86％；ESI-MS:346.1[M+H]+；8.制备手化合物R-YB-13
将实施例6的7.中得到的化合物YB-13通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-13。
9.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-甲基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-14)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-甲基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率74％；ESI-MS:326.2[M+H]+。10.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氰基-5-甲基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-15)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-甲基-5-羟基苯腈，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率75％；ESI-MS:351.1[M+H]+。
11.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-甲氧基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-16)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-甲氧基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率71％；ESI-MS:342.1[M+H]+。
12.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-三氟甲氧基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-17)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-三氟甲氧基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率76％；ESI-MS:396.1[M+H]+。
13.制备手化合物R-YB-17
将实施例6的12.中得到的化合物YB-17通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-17。
14.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-二氟甲氧基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-18)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-二氟甲氧基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率75％；ESI-MS:378.1[M+H]+。
15.制备手化合物R-YB-18
将实施例6的14.中得到的化合物YB-18通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-18。
16.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氰基苯氧基)丁酰肼(化合物YB-19)的制备参考实施例6的3.中制备化合物YB-11。将3-氟苯酚替换为3-羟基苯腈，反应所用物质的量配比与实施例6的3.中制备化合物YB-11同，得白色固体。收率80％；ESI-MS:337.1[M+H]+。
17.制备手化合物R-YB-19
将实施例6的16.中得到的化合物YB-19通过手性柱拆分得到手性异构体R-YB-19。
实施例7化合物YB-20～YB-25的制备
1.N'-(2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-20)的制备参考实施例5的1.中制备化合物YB-1。将2-溴丙酸乙酯替换为2-溴-2甲基丙酸乙酯，反应所用物质的量配比与实施例5的1.中制备化合物YB-1同，得白色固体。收率52％；ESI-MS:316.1[M+H]+。
2.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-21)的制备参考实施例7的1.中制备化合物YB-20。将2-羟基苯甲醛替换为3-甲基-2-羟基苯甲醛，反应所用物质的量配比与实施例7的1.中制备化合物YB-20同，得白色固体。收率50％；ESI-MS:330.1[M+H]+。
3.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氯苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-22)的制备参考实施例7的2.中制备化合物YB-21。将3-氟苯酚替换为3-氯苯酚，反应所用物质的量配比与实施例7的2.中制备化合物YB-21同，得白色固体。收率55％；ESI-MS:346.1[M+H]+。
4.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-三氟甲氧基苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-23)的制备参考实施例7的2.中制备化合物YB-21。将3-氟苯酚替换为3-三氟甲氧基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例7的2.中制备化合物YB-21同，得白色固体。收率58％；ESI-MS:396.1[M+H]+。
5.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-二氟甲氧基苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-24)的制备
参考实施例7的2.中制备化合物YB-21。将3-氟苯酚替换为3-二氟甲氧基苯酚，反应所用物质的量配比与实施例7的2.中制备化合物YB-21同，得白色固体。收率56％；ESI-MS:378.1[M+H]+。
6.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氰基苯氧基)-2-甲基丙酰肼(化合物YB-25)的制备
参考实施例7的2.中制备化合物YB-21。将3-氟苯酚替换为3-羟基苯腈，反应所用物质的量配比与实施例7的2.中制备化合物YB-21同，得白色固体。收率57％；ESI-MS:337.1[M+H]+。
实施例8化合物YB-26～YB-28的制备
1.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氟苯氧基)乙酰肼(化合物YB-26)的制备
参考实施例5的9.中制备化合物YB-6。将2-溴丙酸乙酯替换为2-溴乙酸乙酯，反应所用物质的量配比与实施例5的9.中制备化合物YB-6同，得白色固体。收率85％；ESI-MS:302.1[M+H]+。
2.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氯苯氧基)乙酰肼(化合物YB-27)的制备
参考实施例8的1.中制备化合物YB-26。将3-氟苯酚替换为3-氯苯酚，反应所用物质的量配比与实施例8的1.中制备化合物YB-26同，得白色固体。收率86％；ESI-MS:318.1[M+H]+。
3.N'-(3-甲基-2-羟基亚苄基)-2-(3-氰基苯氧基)乙酰肼(化合物YB-28)的制备
参考实施例8的1.中制备化合物YB-26。将3-氟苯酚替换为3-羟基苯腈，反应所用物质的量配比与实施例8的1.中制备化合物YB-26同，得白色固体。收率87％；ESI-MS:309.1[M+H]+。
实施例9本发明化合物的VEGFElisa活性测试
以PT-2385为阳性对照，采用VEGFElisaAssay评价上述部分化合物对人肾透明细胞癌细胞株786-O的VEGF蛋白抑制活性，本发明的其他化合物与以下所列举的化合物有类似的有益效果，但不应将此理解为本发明化合物仅具有以下有益效果。
将处于对数生长期的786-O细胞接种于96孔板(FisherScientific)内，每孔7500个细胞(180μL/孔),培养4小时后，将20μL不同浓度化合物储备液添加到每个孔以使最终浓度如下(μM)：20，6.67，2.22，0.74，0.25，0.082，0.027，0.009。约20小时后，通过抽吸去除培养基并向每个孔提供180μL生长培养基。将20μL新鲜配制10x的待测化合物储备液添加至每个孔，浓度与上述数值一样。低氧条件(1％氧气+5％二氧化碳+94％氮气)下培养24小时，将细胞培养基移出。采用从R&DSystems购买的ELISA试剂盒确定VEGF浓度。通过向每个孔中添加50μLCelltiterGlo试剂终止反应，轻轻晃动酶标板使终止反应充分进行。对接种细胞的平板进行Celltiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)，然后立即使用酶标仪在450nm波长测量各孔的光吸收值。使用剂量-响应-抑制(四参数)等公式通过GraphPadPrism分析数据，计算EC50值，结果如表2所示。
表2相关化合物的VEGF蛋白抑制活性
化合物 EC50(μM) 化合物 EC50(μM)
YA-1 ++ YA-4 ++
YA-13 +++ YA-15 ++
YA-18 +++ YA-21 ++
YA-23 +++ YA-28 ++
YA-34 ++ YB-3 ++
YB-6 +++ YB-7 ++
YB-10 ++ YB-11 +++
YB-12 ++ YB-17 +++
YB-21 ++ R-YA-13 ++++
R-YA-15 +++ R-YA-23 ++++
R-YA-34 +++ R-YB-10 +++
R-YB-11 ++++ R-YB-17 ++++
PT-2385 ++++
“++++”代表<5μM；“+++”代表5-10μM；“++”代表10-20μM；“+”代表＞20μM。
由表2实验结果可知，大多数化合物呈现出较强的VEGF蛋白表达抑制活性，具有良好的应用前景。
实施例10本发明化合物的荧光素酶实验
将荧光素酶LUC基因用Lipofectamine3000转染试剂(购自Invitrogen)稳定转入786-O细胞(购自ATCC)，构建为HIF2α报告基因细胞(786-O-HIF2α-Luc细胞)。在786-O-HIF2α-Luc细胞处于对数生长期时进行试验，弃去培养基(RPMIMEDIUM1640，购自Invitrogen)，PBS润洗三遍；加入胰蛋白酶(TrypLE，购自invitrogen)消化细胞，用培养基、10％胎牛血清、1％青霉素，链霉素清洗细胞终止消化。离心收集细胞，用PBS吹洗两遍，去除培养基中的酚红，重悬细胞至适当的浓度，检测细胞密度和活率，保证细胞活率在90％以上方可用于实验。
用Echo550(非接触式声波移液系统，购自Labcyte)将梯度浓度化合物转移至384孔内，25nl/孔；将细胞种到384孔板中，4500细胞/孔，25pul培养基，使化合物终浓度分别为10000、3333、1111、370、123、41.1、13.7、4.6、1.5、0.5nM。将细胞至于37℃，5％CO2环境中培养18-20h；加入Steady-GloTM荧光素酶测定系统(购自Promega)至384孔板，25ul/孔；用Envision检测发光值。根据每孔的RLU(RecordLuminescence)信号值计算抑制率％，然后通过Graphpad8.0拟合计算相应化合物IC50。结果如表3所示。
表3相关化合物的HIF2α蛋白抑制活性
化合物 IC50(μM) 化合物 IC50(μM)
YA-13 +++ YA-15 ++
YA-18 +++ YA-23 +++
YA-34 ++ YB-3 ++
YB-6 +++ YB-10 ++
YB-11 +++ YB-17 +++
YB-21 ++ R-YA-13 ++++
R-YA-15 +++ R-YA-23 ++++
R-YA-34 +++ R-YB-10 +++
R-YB-11 ++++ R-YB-17 ++++
PT-2385 ++++
“++++”代表<5μM；“+++”代表5-10μM；“++”代表10-20μM；“+”代表＞20μM。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，其特征在于：所述HIF-2α抑制剂的结构式为：
Figure FDA0004130751520000011
其中，G为-O-或-NH-；
R1选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷胺基、C2-6不饱和脂链烃基；
R2选自氢、C1-6烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R3选自氢、C1-6烷基、C2-6不饱和脂链烃基；
R4选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷胺基、C2-6不饱和脂链烃基；
R5选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷胺基、C2-6不饱和脂链烃基。
2.如权利要求1所述的一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，其特征在于：所述R1选自氢、氟、氯、溴、羟基、氰基、甲基、甲氧基；所述R2选自氢、甲基、乙基；所述R3选自氢、甲基、乙基；所述R4选自氟、氯、溴、氰基、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；所述R5选自氟、氯、溴、氰基、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基。
3.如权利要求1所述的一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，其特征在于：所述HIF-2α抑制剂选自化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28，所述化合物YA-1～YA-38、YB-1～YB-28的结构式为：
Figure FDA0004130751520000012
Figure FDA0004130751520000021
Figure FDA0004130751520000031
Figure FDA0004130751520000041
4.如权利要求3所述的一种酰肼腙类HIF-2α抑制剂，其特征在于：所述HIF-2α抑制剂选自化合物R-YA-1、R-YA-6、R-YA-7、R-YA-13、R-YA-15、R-YA-18、R-YA-19、R-YA-21、R-YA-23、R-YA-25、R-YA-28、R-YA-29、R-YA-32、R-YA-34、R-YA-35、R-YA-36、R-YB-1、R-YB-3、R-YB-5、R-YB-6、R-YB-7、R-YB-10、R-YB-13、R-YB-17、R-YB-18、R-YB-19，所述化合物R-YA-1、R-YA-6、R-YA-7、R-YA-13、R-YA-15、R-YA-18、R-YA-19、R-YA-21、R-YA-23、R-YA-25、R-YA-28、R-YA-29、R-YA-32、R-YA-34、R-YA-35、R-YA-36、R-YB-1、R-YB-3、R-YB-5、R-YB-6、R-YB-7、R-YB-10、R-YB-13、R-YB-17、R-YB-18、R-YB-19的结构式为：
Figure FDA0004130751520000042
Figure FDA0004130751520000051
Figure FDA0004130751520000061
5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述的HIF-2α抑制剂或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或辅料。
6.如权利要求1-4之一所述的酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备治疗VHL缺失或/和HIF-2α异常表达疾病的药物中的应用。
7.如权利要求1-4之一所述的酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗肿瘤的药物中的应用。
8.如权利要求1-4之一所述的酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
9.如权利要求1-4之一所述的酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗炎症的药物中的应用。
10.如权利要求1-4之一所述的酰肼腙类HIF-2α抑制剂在制备预防或/和治疗铁超载疾病的药物中的应用。
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