CN116261598A - 具有优异的可处理性的含槐糖脂的组合物 - Google Patents

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CN116261598A CN202180067998.5A CN202180067998A CN116261598A CN 116261598 A CN116261598 A CN 116261598A CN 202180067998 A CN202180067998 A CN 202180067998A CN 116261598 A CN116261598 A CN 116261598A
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Abstract

本发明提供了具有优异的可处理性的含槐糖脂(SL)的组合物及其生产方法。根据本发明的含SL的组合物具有以下特性：(A)内酯型SL的含量：45质量％至81质量％/100质量％的SL的总量，以及(B)油酸‑二乙酰基内酯型SL的含量：至多95质量％/100质量％的内酯型SL的总量。

Description

具有优异的可处理性的含槐糖脂的组合物
技术领域
本发明涉及具有优异的可处理性的含槐糖脂的组合物和含槐糖脂的组合物的生产方法。
背景技术
已知作为生物来源的表面活性剂的生物表面活性剂(“Biosurfactant”，“BS”)是可生物降解且安全的。作为糖脂型BS的槐糖脂(“Sophorolipid”，“SL”)是通过酵母由发酵获得的发酵产物。SL可以例如通过在补充有碳源例如糖类(如葡萄糖)以及植物油和脂肪的液体培养基上接种酵母，并在温和的温度下在压力下使该培养基通气的同时搅拌该培养基来容易地生产。由于槐糖脂比其他BS具有更高的生产率(例如，约100g/L)，因此槐糖脂看起来适合于在工业规模上的生产。
然而，为了在工业规模上大量地生产发酵产物，一个挑战是从培养结束时获得的培养产物中有效地回收目标产物。根据培养条件，SL以在培养液中的溶解的形式产生。在这种情况下，必须从培养液中提取SL，例如，通过使用有机溶剂或通过柱色谱法分离(参见，例如，非专利文献1、非专利文献2和专利文献1)，这对环境和操作者造成了负担。根据培养条件，SL也可以在低温下凝固。从培养罐中取出凝固的SL是困难的，需要例如添加温水或加热培养罐。这需要增加的生产能量，并且也增加了工作过程和操作者的工作负荷。
有许多已知的SL生产方法。例如，专利文献2提出在培养基中混合作为疏水性底物的脂肪酸和脂质(植物油)，目的是使用假丝酵母(Candida yeast)以高产率大量地获得SL。此外，专利文献3公开了在用于生产大量具有强的抗细菌和抗真菌活性的内酯型SL的培养方法中，控制供应至培养基的氧的量增加了所产生的二乙酰基内酯型SL的摩尔比，并且使二乙酰基内酯型SL的摩尔比增加至80％或更高，使得容易获得易于处理的呈固体形式的SL。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP2014-140383A
专利文献2：JP2002-45195A
专利文献3：WO2010/050413
专利文献4：JP2003-9896A
非专利文献
非专利文献1：D.G.Cooper and D.A.Paddock,Appl.Environ.Microbiol.,47,173-176(1984)
非专利文献2：R.D.Ashby,D.K.Y.Solaiman and T.A.Foglia,Biotechnol.Lett.,30,1093-1100,2008
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供改善含SL的组合物(以下为“含SL的组合物”)的可处理性的技术。具体地，本发明的一个目的是提供具有优异的可处理性的含SL的组合物和用于生产所述含SL的组合物的方法。术语“可处理性”包括沉降特性和/或流动性。具体地，本发明的一个目的是提供含SL的组合物，所述含SL的组合物具有沉降特性，并且可以通过允许在培养结束时在培养产物中沉降来容易地从培养产物中被分离或回收；以及提供用于生产含SL的组合物的方法。本发明的另一个目的是提供在低温(-5℃)下不凝固并具有流动性的含SL的组合物，以及提供用于生产所述含SL的组合物的方法。
技术方案
本发明人进行了广泛的研究以实现所述目的，并发现通过在包含特定比率的植物油和脂肪酸的培养基中对产SL酵母进行培养而获得的含SL的组合物具有优异的沉降特性。发明人还证实了所述含SL的组合物包含预定比率的内酯型SL和油酸-二乙酰基内酯型SL。此外，本发明人证实了当将水含量调节成35质量％至70质量％时，含SL的组合物在-5℃的温度下不凝固，并且在低温下具有流动性。本发明作为基于这些发现的进一步研究的结果而完成，并且包括以下实施方案。
(I)含槐糖脂(SL)的组合物
(I-1)含SL的组合物，包含以下特征：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的SL的总量的45质量％至81质量％，以及
(B)油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100质量％的内酯型SL的总量的95质量％或更低。
(I-2)根据(I-1)所述的含SL的组合物，包含以下特征：
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低。
(I-3)根据(I-1)或(I-2)所述的含SL的组合物，包含以下特征：
(D)水含量为55质量％或更低。
(I-4)根据(I-1)至(I-3)中任一项所述的含SL的组合物，还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的10质量％至50质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的0.1质量％至40质量％。
(I-5)根据(I-1)至(I-4)中任一项所述的含SL的组合物，其中在将所述含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含SL的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高。
(I-6)根据(I-1)至(I-5)中任一项所述的含SL的组合物，还包含以下特征：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的58质量％至81质量％。
(I-7)根据(I-6)所述的含SL的组合物，包含以下特征：
(D)水含量为45质量％或更低。
(I-8)根据(I-6)或(I-7)所述的含SL的组合物，还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的15质量％至25质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的5质量％至25质量％。
(I-9)根据(I-6)至(I-8)中任一项所述的含SL的组合物，其中在将所述含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含SL的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为8180mPa.s或更高。
(II)用于生产含SL的组合物的方法1
(II-1)用于生产含SL的组合物的方法，所述含SL的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的45质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述内酯型SL的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产SL酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物仅包含脂肪酸，或者所述疏水性底物包含脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油，以及
游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100％的所述脂肪酸的总量的20质量％或更高，优选30质量％或更高，或者当所述疏水性底物包含所述熔点为30℃或更低的植物油时，所述游离脂肪酸的比例为所述培养基中的被视为100质量％的所述脂肪酸和所述植物油的总量的20质量％或更高，优选30质量％或更高。
(II-2)根据(II-1)所述的方法，其中培养产物的pH在培养的早期阶段为4至5。
(II-3)根据(II-2)所述的方法，其中所述培养产物的pH在培养期期间不被控制。
(II-4)根据(II-1)至(II-3)中任一项所述的方法，其中设定所述培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至所述培养产物的氧的量为145l/小时或更高，优选为200l/小时或更高，更优选为500l/小时或更高，并且在没有任何限制的情况下为1200l/小时或更低。
(II-5)根据(II-1)至(II-4)中任一项所述的方法，其中所述含SL的组合物还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的10质量％至50质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的0.1质量％至40质量％。
(II-6)根据(II-1)至(II-5)中任一项所述的方法，其中在将所述含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含SL的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高。
(III)用于生产含SL的组合物的方法2
(III-1)用于生产含SL的组合物的方法，所述含SL的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的45质量％至81质量％，优选55质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述内酯型SL的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产SL酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物仅包含熔点为30℃或更低的植物油，以及
培养产物的pH在培养期间被调节成4.5至5。
(III-2)根据(III-1)所述的方法，其中设定培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至所述培养产物的氧的量为200l/小时或更高，并且在没有任何限制的情况下为1200l/小时或更低。
(III-3)根据(III-1)或(III-2)所述的方法，其中所述含SL的组合物还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的10质量％至50质量％，优选15质量％至30质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的0.1质量％至40质量％，优选1质量％至30质量％。
(III-4)根据(III-1)至(III-3)中任一项所述的方法，其中在将所述含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含SL的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高，优选8000mPa.s或更高。
(IV)用于生产含SL的组合物的方法3
(IV-1)用于生产含SL的组合物的方法，所述含SL的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的45质量％至81质量％，优选50质量％至80质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100质量％的所述内酯型SL的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产SL酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物仅包含熔点为30℃或更低的植物油，或者所述疏水性底物包含脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油，
游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述熔点为30℃或更低的植物油的总量的0质量％至低于20质量％，或者当所述疏水性底物包含所述脂肪酸时，所述游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述脂肪酸和所述熔点为30℃或更低的植物油的总量的0质量％至低于20质量％，以及
设定培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养产物的氧的量为145l/小时或更低。
(IV-2)根据(IV-1)所述的方法，其中所述培养产物的pH在培养的早期阶段为4至5。
(IV-3)根据(IV-2)所述的方法，其中所述培养产物的pH在所述培养期期间不被控制。
(IV-4)根据(IV-1)至(IV-3)中任一项所述的方法，其中所述含SL的组合物还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的10质量％至50质量％，优选10质量％至20质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的所述SL的总量的0.1质量％至40质量％，优选5质量％至30质量％。
(IV-5)根据(IV-1)至(IV-4)中任一项所述的方法，其中在将所述含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含SL的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高，优选3000mPa.s或更高。
有益效果
本发明生产并提供了在沉降特性和可处理性方面优异的含SL的组合物。本发明还生产并提供了在-5℃的低温下不凝固并具有优异流动性的含SL的组合物。
具体实施方式
(I)含槐糖脂(SL)的组合物
(1)槐糖脂
槐糖脂(SL)是由槐糖或具有一些乙酰化的羟基的槐糖、和羟基脂肪酸组成的糖脂。槐糖是由两个结合的葡萄糖分子(β1→2)组成的碳水化合物。羟基脂肪酸是具有羟基的脂肪酸。SL大致分类为酸性SL和内酯型SL。酸性SL是其中羟基脂肪酸的羧基游离的槐糖脂。内酯型SL是其中羟基脂肪酸的羧基与分子中的槐糖结合的槐糖脂。由酵母物种(产SL酵母)通过发酵所获得的槐糖脂通常为由下式(1)表示的酸性SL和由下式(2)表示的内脂型SL的混合物，并且获得作为30种或更多种类型的结构同系物(例如具有不同脂肪酸链长度(R2)的那些，在槐糖的6’位置(R3)和6”位置(R4)处乙酰化或质子化的那些，以及在槐糖的3’位置、4’位置、2”位置、3”位置和4”位置中的一者(R5)处酯化的那些)的集合。
酸性SL
[化1]
Figure BDA0004159313030000081
在式(1)中，R1表示氢原子或甲基；
R3和R4相同或不同，并且表示氢原子或乙酰基；
所有R5为氢原子，或者5个R5中的一者为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基，并且剩余的四个R5全为氢原子；
R2为饱和脂族烃链，或者任选地经一个或更多个取代基取代的具有至少一个双键的不饱和脂族烃链；以及
R6为羟基。
在本说明书中，式(1)中所有R5都为氢原子的酸性槐糖脂被称为“酸性SLa”，其余的酸性槐糖脂被称为“酸性SLb”。当两者在没有任何区分的情况下被统称时，其被称为“酸性SL”。酸性SL为单体，并且可以被称为与后面所述的二聚SL不同的“单体酸性SL”。
内脂型SL
[化2]
Figure BDA0004159313030000091
在化学式(2)中，R1至R4如化学式1中所限定。
在本说明书中，式(2)中R3和R4二者为乙酰基的内酯型槐糖脂被称为“二乙酰基内酯型SL”。当槐糖脂在没有关于是否存在乙酰基的区分的情况下被统称时，其被称为“内酯型SL”。内脂型SL为单体，并且可以被称为与后面所述的二聚SL不同的“单体内脂型SL”。
通过使用产SL酵母经由发酵所获得的SL可以包含由式(1)表示的酸性SL构成的二聚体，在所述由式(1)表示的酸性SL中，一个R5为饱和或不饱和脂肪酸残基，其可以具有在C-1位置的其R6处与由下式(3)表示的酸性SL在R7中的一者结合以形成单键的羟基。
二聚SL
[化3]
Figure BDA0004159313030000101
在式(3)中，R1’为氢原子或甲基；
R3’和R4’相同或不同，并且表示氢原子或乙酰基；
R2’为饱和脂族烃链，或者任选地经一个或更多个取代基取代的具有至少一个双键的不饱和脂族烃链；以及
一个R7与由式(1)表示的酸性SL的R6结合以形成单键，并且剩余R7全为氢原子。
在式(1)至(3)中，由R2或R2’表示的饱和或不饱和脂族烃链中的碳数没有限制，但通常为例如9至20，优选为9至18，更优选为11至16，并且特别优选为14至16。饱和脂族烃链的实例包括线性或支化亚烷基，其中线性亚烷基是优选的。不饱和脂族烃链的实例包括具有1至3个双键的亚烯基。不饱和脂族烃链优选为具有1至2个双键的亚烯基，并且更优选为具有1个双键的亚烯基。对由R2或R2’表示的饱和或不饱和脂族烃链的取代基没有限制。取代基的实例包括卤素原子、羟基、低级(C1-6)烷基、卤代低级(C1-6)烷基、羟基低级(C1-6)烷基、和卤代低级(C1-6)烷氧基。卤素原子或者与烷基或烷氧基结合的卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
式(1)中的由R5表示的饱和脂肪酸残基的实例包括C12-20线性脂肪酸残基(月桂酸残基、肉豆蔻酸残基、十五烷酸残基、棕榈酸残基、十七烷酸残基、硬脂酸残基、和花生酸残基)，优选C14-20线性脂肪酸残基，更优选C16-20线性脂肪酸残基，甚至更优选C16-18线性脂肪酸残基，并且特别优选C16棕榈酸残基和C18硬脂酸残基。不饱和脂肪酸残基的实例包括具有1至3个双键的C12-20线性脂肪酸残基。双键数优选为1个至2个，并且更优选为1个。碳原子数优选为16至20个，更优选为16至18个，并且特别优选为18个。优选的不饱和脂肪酸残基的实例包括具有一个双键的C16棕榈油酸残基；具有一个双键的C18油酸残基或者具有一个双键的异油酸残基(优选油酸残基)；具有两个双键的C18亚油酸残基；各自具有三个双键的C18亚麻酸残基(9、12、15)、亚麻酸残基(6、9、12)和桐酸残基；以及各自具有两个双键的C20亚麻酸残基(9、12、15)、亚麻酸残基(6、9、12)和桐酸残基。更优选地，不饱和脂肪酸残基为具有一个双键的C16棕榈油酸残基和具有一个双键的C18油酸残基，特别优选为具有一个双键的C18油酸残基。
这些脂肪酸残基可以具有羟基或者可以不具有羟基。具有羟基的脂肪酸残基的羟基数为1个或2个，优选1个。羟基可以存在于例如脂肪酸残基中的ω位置或ω-1位置处。在酸性SL(1)中，当R5为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基时，-OR5可以存在于槐糖环的3’位置、4’位置、2”位置、3”位置和4”位置中的任一者处。更具体地，酸性SL(1)包括其中具有为上述脂肪酸残基的R5的-OR5基团存在于这些位置中的一者处的SL化合物。
在式(2)中R3和R4二者为乙酰基的二乙酰基内酯型槐糖脂包括其中R1为甲基，以及R2为具有一个双键的C15亚烯基的SL化合物。在这些SL化合物中，特别优选的是其中R2为在8-位置和9-位置具有双键的C15亚烯基，以及与R1结合的碳原子在1-位置的化合物。在本发明中，该化合物被称为“油酸-二乙酰基内酯型SL”。
优选的产SL酵母的实例包括熊蜂生假丝酵母(Candida bombicola)。假丝酵母(Candida)属已被重命名为斯塔莫酵母(Starmerella)属。已知这种酵母会产生显著量的SL(Canadian Journal of Chemistry,39,846(1961)(注意：文献中所述的球拟酵母(Torulopsis)属属于假丝酵母属，但目前被分类为如上所述的斯塔莫酵母属)；Appliedand Environmental Microbiology,47,173(1984)；等等)。熊蜂生假丝酵母(斯塔莫酵母)已保藏在作为生物资源库的美国模式培养物集存库(American Type CultureCollection，ATCC)(熊蜂生假丝酵母ATCC22214)，并且可从该美国模式培养物集存库获得。其它已知产生SL且属于假丝酵母属(斯塔莫酵母属)的产SL酵母物种也是可使用的。这样的产SL酵母物种的实例包括木兰假丝酵母(Candida magnoliae)、腹股沟假丝酵母(Candidagropengisseri)、蜜生假丝酵母(Candida apicola)、嗜石油假丝酵母(Candidapetrophilum)、Candida bogoriensis、和巴蒂斯塔假丝酵母(Candida batistae)。
(2)含SL的组合物
在上述槐糖脂中，本发明涵盖的含SL的组合物是包含至少酸性SL和内酯型SL的那些。优选地，本发明涵盖的含SL的组合物为包含预定比率的内酯型SL和油酸-二乙酰基内酯型SL的那些，更优选为包含预定比率的酸性SL和二聚SL的那些。本发明涵盖的含SL的组合物还包含以预定比率包含水的含水材料。
具体地，根据本发明的含SL的组合物包括具有以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)的组合物：
(A)内酯型SL的含量为被视为100质量％的SL的总量的45质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100质量％的内酯型SL的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低。
例如，内脂型SL的含量优选为，但不限于被视为100质量％的SL的总量的45质量％至78质量％，更优选50质量％至78质量％。
例如，油酸-二乙酰基内酯型SL的含量下限为，但不限于，被视为100质量％的内酯型SL的总量的10质量％。例如，油酸-二乙酰基内酯型SL的含量优选在40质量％至95质量％，更优选55质量％至95质量％的范围内。
例如，以干重为基础，己烷提取物的含量为但不限于6质量％或更低，优选0质量％至5质量％，更优选0质量％至2.2质量％。含SL的组合物中己烷提取物的含量可以通过在室温(20±5℃)下用正己烷进行提取由含SL的组合物中获得的干燥产物的重量来确定。细节在以下实施例部分中描述。
根据本发明的含SL的组合物还包括具有以下特征的组合物：
(D)水含量为55质量％或更低。
根据本发明的含SL的组合物可以为不含水的干燥产物，或者是包含水的含水材料。含SL的组合物优选为包含52质量％或更低的量的水的含水材料。例如，水含量的下限为但不限于30质量％，优选35质量％或更高，更优选40质量％或更高。含SL的组合物(含水材料)中的水含量优选为35质量％至55质量％，更优选为40质量％至55质量％。含SL的组合物的水含量可以由含SL的组合物在105℃下经受干燥处理3小时之前和之后的含SL的组合物的重量差来确定。细节在以下实施例部分中描述。
根据本发明的含SL的组合物还包括除了上述特征(A)和(B)、(A)至(C)或(A)至(D)之外具有以下特征的组合物：
(E)酸性SL的含量为被视为100质量％的SL的总量的10质量％至50质量％，以及
(F)二聚SL的含量为被视为100质量％的SL的总量的0.1质量％至40质量％。
例如，酸性SL的含量优选为但不限于被视为100质量％的SL的总量的13质量％至50质量％，更优选为15质量％至46质量％。例如，二聚SL的含量优选为但不限于被视为100质量％的SL的总量的0.5质量％至30质量％，更优选为1质量％至30质量％。
上述特征(A)、(B)、(E)和(F)可以由通过以下而获得的每种槐糖脂的峰面积来计算：用乙醇(99.5体积％)稀释目标含SL的组合物使得干燥的剩余物为约1％，并在下表1所示的条件下使所制备的经乙醇稀释的产物经受高效液相色谱(HPLC)。用于计算干燥的剩余物的方法在以下实施例部分描述。
表1
HPLC分析的条件
Figure BDA0004159313030000141
在表1所示条件下的HPLC中，单体酸性SL在以10分钟至23分钟(酸性SLa)和45分钟至58分钟(酸性SLb)的保留时间的区域中洗脱。单体内酯型SL(其包含二乙酰基内酯型SL；以下同样适用)在以23分钟至40分钟的保留时间的区域中洗脱。在该区域出现的峰中，特别是在28分钟至33分钟的区域中，具有最高强度的峰来源于油酸-二乙酰基内酯型SL。二聚SL在以58分钟至70分钟的保留时间的区域中洗脱。
包含在含SL的组合物中的酸性SL(酸性SLa、酸性SLb)、内酯型SL和二聚SL的质量比可以由从HPLC分析获得的各个峰的百分比来计算。具体地，假设各SL(酸性SL、内酯型SL、二聚SL)的峰面积之和(100)为总的SL量(100质量％)，并计算各SL的峰面积在总的SL量中的百分比，以确定各SL的质量百分比。
在内酯型SL的总量(100质量％)中油酸-二乙酰基内酯型SL的百分比也可以由从HPLC分析获得的各个峰的百分比来计算。
根据本发明的含SL的组合物包括在将含SL的组合物调节成具有50质量％的水含量并使含SL的组合物在-5℃下静置72小时之后，在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高的组合物。例如，粘度优选为但不限于2000mPa.s或更高，更优选为2500mPa.s或更高。粘度的上限没有限制，只要实现本发明的效果即可；例如，上限为221300mPa.s或更低，优选为21000mPa.s或更低。
可以用TVB-10M粘度计测量粘度持续1分钟的测量时间。根据要测样品的粘度，可以使用具有以下转子型号和搅拌速度的粘度计：
表2
测量粘度 转子型号 搅拌速度
低于2000mPa·s M2或M3 60rpm
2000mPa·s至10000mPa·s M4 60rpm
10000mPa·s至20000mPa·s M4 30rpm
20000mPa·s至50000mPa·s M4 12rpm
50000mPa·s至100000mPa·s M4 6rpm
100000mPa·s至200000mPa·s M4 3rpm
200000mPa·s至400000mPa·s M4 1.5rpm
如上所述，根据本发明的含SL的组合物包含预定量的SL。根据本发明的含SL的组合物在其生产方法方面没有特别限制，并且包括后面描述的通过培养产SL酵母进行生产的那些；然而，根据本发明的含SL的组合物具有至少以下使得当用蒸馏水将含SL的组合物调节成得到约91.7质量％的水含量并调节成具有酸性范围的pH(pH：2.5至3.0)时，包含在所述组合物中的槐糖脂变得不溶且沉淀出来的特性。在本发明中，含SL的组合物的该特性被称为“沉降特性”。
尽管在实施例部分(物理特性评估方法，(2-2)含SL的组合物在蒸馏水中的沉降特性)中描述了含SL的组合物的沉降特性的评估方法的细节，但是以下给出了简要的说明。
将25g蒸馏水(产物温度：20℃)添加到5g已被调节成产生50％的干燥的剩余物的含SL的组合物(产物温度：20℃)中，以稀释含SL的组合物(水含量：约91.7质量％)。如果经稀释的产物具有在2.5至3.0之外的pH，用pH调节剂(例如，酸例如盐酸或硫酸，或者碱性试剂例如氢氧化钠或氢氧化钾)将pH调节成2.5至3.0。将经稀释的产物在搅拌下混合10秒，然后使其在20℃下静置5分钟，随后目视确定是否存在沉降物。如果观察到明显的沉降物(或明显的分离)，则该组合物被确定为“具有沉降特性”；否则，该组合物被确定为“不具有沉降特性”。
具体地，“具有沉降特性”意指含SL的组合物包含这样的条件下的SL：当将所述组合物调节成具有约91.7质量％的水含量的酸性稀释产物(pH：2.5至3.0)时，SL变得不溶且沉淀出来。具有这样的沉降特性的含SL的组合物被认为是容易处理的，因为SL可以是不溶的，并使得通过简单的方法例如用蒸馏水稀释组合物和/或将pH调节成酸性范围来沉淀出来以回收。
如后面的实施例(制造例1至4的物理特性评估结果)所描述的，在评估方法中被评估为“具有沉降特性”的含SL的组合物以同样的方式在培养产物中也被观察到具有优异的沉降特性。具体地，如果具有与在评估方法中被评估为“具有沉降特性”的含SL的组合物的组成(总的SL量，SL组成(％)，内酯型SL中包含的油酸-二乙酰基内酯型SL的百分比(％)，或/和己烷提取物的含量)相同组成的含SL的组合物通过对产SL酵母进行培养来生产，则认为含SL的组合物在培养产物中具有优异的沉降特性。
根据本发明的含SL的组合物还具有低温流动性。尽管在实施例部分中描述了含SL的组合物的低温流动性的评估方法的细节，但以下给出了简要的说明。
将含SL的组合物放入盖有盖子的容器中，并使其在-5℃下在黑暗中静置3天(72小时)。然后，将容器倒置，并目视观察内容物的流动性30秒。如果要测量的含SL的组合物的水含量不为50质量％，则添加蒸馏水以将水含量调节成50质量％。如果目视检查显示内容物具有流动性，则认为含SL的组合物“具有低温流动性”；否则，含SL的组合物被认为“不具有低温流动性”。
具有低温流动性的含SL的组合物被认为比在低温下凝固的不具有流动性的含SL的组合物更容易加工和处理。
(II)用于生产含SL的组合物的方法
根据本发明的含SL的组合物可以为具有上述组成和特性的任何组合物，并且所述含SL的组合物的生产方法不受特别限制。没有限制地，例如，含SL的组合物可以经由通过使用包含疏水性底物和亲水性底物的含水液体培养基在预定条件下对产SL酵母进行培养来生产。然而，在这种情况下，本发明所涵盖的含SL的组合物不包含通过培养自身获得的培养产物(如下文“含SL的培养产物”)。
疏水性底物对用作培养基溶剂的水具有低亲和力。疏水性底物的类型优选包括但不限于脂肪酸和包含脂肪酸作为成分的植物油。脂肪酸包括C6-18饱和或不饱和脂肪酸。这些可以单独使用，或者以两者或更多者的组合使用。疏水性底物优选为选自C12-18饱和或不饱和脂肪酸中的至少一种脂肪酸，更优选为选自C16饱和脂肪酸(棕榈酸)和C18饱和或不饱和脂肪酸(硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸)中的至少一种脂肪酸。植物油优选包括但不限于，包含C12-18饱和或不饱和脂肪酸作为甘油三酯的脂肪酸组分的那些。植物油包括大豆油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油(高亚油酸、高油酸)、木棉油、芝麻油、玉米油、米油、花生油、红花籽油(高亚油酸、高油酸)、橄榄油、亚麻籽油、桐油、蓖麻子油、棕榈仁油、棕榈油精、棕榈硬脂精和椰子油。这些植物油均具有30℃或更低的熔点。这些可以单独使用，或者以两者或更多者的组合使用。
亲水性底物对用作培养基溶剂的水具有高亲和力。亲水性底物优选为但不限于产SL酵母的生长所需的碳水化合物和氮源。碳水化合物包括单糖例如葡萄糖、果糖和半乳糖，以及二糖例如蔗糖和麦芽糖，其中单糖例如葡萄糖是优选的。氮源的类型包括酵母提取物、蛋白胨和尿素。
除了疏水性底物和亲水性底物之外，就以下这些物质不干扰本发明的效果来说，培养基可以任选地包含无机盐(例如，磷酸盐、镁盐和钠盐)、有机酸(例如，乳酸、乙酸、柠檬酸和丙酸)以及对产SL酵母的生长有用的维生素。
尽管通过使用产SL酵母生产含SL的组合物的方法不受限制，但下面所述的三种方法(生产方法1至3)是优选的。
(1)生产方法1
生产方法1包括通过使用至少脂肪酸或者脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油作为添加到供使用的培养基中的疏水性底物，并且使用包含游离脂肪酸的培养基来对产SL酵母进行培养的步骤，所述游离脂肪酸的量为包含在培养基中的被视为100质量％的脂肪酸的总量的20质量％或更高，或者当疏水性底物包含植物油时为包含在培养基中的被视为100质量％的脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油的总量(其被统称为“脂肪酸和植物油的总量”)的20质量％或更高。
培养基中被视为100％的脂肪酸和植物油的总量中游离脂肪酸的比例优选但不限于30质量％或更高。上限为100质量％(然而，这仅在不使用植物油，并且仅使用脂肪酸作为疏水性底物的情况下)。
在所述生产方法中，除了在培养的早期阶段pH在4至5的范围内之外，培养产物的pH优选在培养期期间不被控制。在这种情况下，在培养期期间，培养产物的pH逐渐降低，并且通常在培养结束时达到但不限于约3的pH。
在所述生产方法中，产SL酵母的培养优选根据通气搅拌培养方法来进行。通气搅拌培养的条件例如可以设定成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量为145l/小时或更高。表观氧传质系数优选为200l/小时或更高，更优选为500l/小时或更高。上限为但不限于1200l/小时或更低。在实施例部分中描述了设定供应至培养产物的氧的量的方法的细节(同样适用于以下生产方法2和3)。
包含SL的培养产物(含SL的培养产物)可以通过在上述条件下在20℃至45℃，优选25℃至35℃下进行培养约4天至14天，优选约5天至7天来获得。提供本发明效果的期望的含SL的组合物可以通过根据后面所述的方法处理含SL的培养产物来制备和获得。
(2)生产方法2
生产方法2包括通过使用熔点为30℃或更低的植物油作为要添加到培养基中的疏水性底物，并通过在培养期期间将培养产物的pH调节至4.5至5来对产SL酵母进行培养的步骤。
培养期期间培养产物的pH可以通过适当添加pH调节剂(例如氢氧化钠或氢氧化钾)，同时监测培养产物的pH来调节，尽管该方法不受限制。
在所述生产方法中，产SL酵母的培养优选根据通气搅拌培养方法来进行。通气搅拌培养的条件例如可以设定成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量高于160l/小时。表观氧传质系数优选为200l/小时或更高，更优选为500l/小时或更高。上限为但不限于1200l/小时或更低。包含SL的培养产物(含SL的培养产物)可以通过在上述条件下在20℃至45℃，优选25℃至35℃下进行培养约4天至14天，优选约5天至7天来获得。提供本发明效果的期望的含SL的组合物可以通过根据后面所述的方法处理含SL的培养产物来制备和获得。
(3)生产方法3
生产方法3包括通过使用熔点为30℃或更低的植物油或者脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油作为添加到供使用的培养基中的疏水性底物，并且使用包含游离脂肪酸的培养基来对产SL酵母进行培养的步骤，所述游离脂肪酸的量为包含在培养基中的被视为100质量％的熔点为30℃或更低的植物油的总量的0质量％至低于20质量％，或者当疏水性底物包含脂肪酸时，为包含在培养基中的被视为100质量％的脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油的总量(其被统称为“脂肪酸和植物油的总量”)的0质量％至低于20质量％，其中通气搅拌培养的条件设置成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量为145l/小时或更低。
氧传质系数的下限例如为，但不限于75l/小时。优选地，在使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量为100l/小时至145l/小时，更优选为120l/小时至145l/小时的通气搅拌培养的条件下进行培养。在所述生产方法中，除了在培养的早期阶段pH在4至5的范围内之外，培养产物的pH优选在培养期期间不被控制。在这种情况下，在培养期期间，培养产物的pH逐渐降低，并且通常在培养结束时达到但不限于约3的pH。
包含SL的培养产物(含SL的培养产物)可以通过在上述条件下在20℃至45℃，优选25℃至35℃下进行培养约4天至14天，优选约5天至12天来获得。提供本发明效果的期望的含SL的组合物可以通过根据后面所述的方法处理含SL的培养产物来制备和获得。
含SL的培养产物的处理和用于回收含SL的组合物的方法
通过上述方法生产的含SL的培养产物包含产SL酵母(真菌细胞)、和诸如未使用的疏水底物和亲水性底物的培养基组分、以及所生产的SL。因此，优选除去真菌细胞和培养基组分，以制备以相对高的百分比包含SL的含SL的组合物。根据本发明的含SL的组合物优选为通过从含SL的培养产物中除去真菌细胞和培养基组分而制备的含SL的组合物。就不干扰本发明的效果来说，从含SL的培养产物中除去真菌细胞和培养基组分以回收根据本发明的含SL的组合物的方法可以为已知方法的组合。
具体地，如以下制造例1所述，已被允许在室温下静置的(酸性)含SL的培养产物自底部分离成以下三层：主要包含SL的褐色液体层、主要包含真菌细胞的乳白色固体层、和主要包含培养基中的外来物质的上清液层。经受加热灭菌然后在室温下静置的(酸性)含SL的培养产物也以同样的方式分离成三层。在除去上清液层之后，添加与上清液层的量相等量的水，并用氢氧化钠水溶液将pH调节成约6至7以溶解SL。随后，将经调节的溶液离心，以及例如向回收的上清液中添加硫酸水溶液，以将pH调节成约2至3，从而使SL不溶解。在使未溶解的SL静置之后，进行倾析，从而获得呈包含约40％至55％的水的含水材料的形式的含SL的组合物。细节在后面所述的制造例1中给出。例如，在JP2003-9896A(专利文献4)中公开了该方法作为以高产率回收在含SL培养产物中包含的SL的方法。
如此制备的含SL的组合物以如上所述的比例(没有限制)包含SL(酸性SL、内酯型SL和二聚SL)，并且包含基本上由这些槐糖脂组成的那些。含SL的组合物还可以包含以致使得到6质量％或更低的己烷提取物内容物的这样比例的脂肪酸，以及SL。含SL的组合物包含基本上由SL和脂肪酸组成的那些。在以下实施例中详细说明了计算己烷提取物的含量的方法。
脂肪酸不受限制，只要脂肪酸不干扰作为根据本发明的含SL的组合物的特性的沉降特性和/或低温流动性即可。根据下述实验例1，脂肪酸包括C6-8饱和脂肪酸或C18饱和脂肪酸(己酸、辛酸和硬脂酸)，以及C18不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和亚麻酸)。
如本文所用的术语“含有”和“包含”包括基本上由...组成和由...组成的含义。
实施例
为了帮助理解本发明的结构和效果，以下参照制造例和实验例描述本发明。然而，本发明不限于这些制造例和实验例。除非另有说明，否则以下实验在室温(20±5℃)下在大气压下进行。除非另有说明，否则单位“％”意指质量％，以及单位“份”意指质量份。
以下给出了在下述制造例和实验例中使用的起始材料以及测量方法和评估方法。表2列出了用作起始材料的植物油的物理特性(碘值、熔点、凝固点)、甘油三酯(植物油的主要成分)的脂肪酸组成(重量％)和用作起始材料的脂肪酸的脂肪酸组成。
起始材料
棕榈油精：商品名，NBD棕榈油精IV 56(可从Unitata Berhad获得)
红花籽油(高亚油酸)：商品名，Safflower Salad Yu(可从Summit Oil Mill Co.,Ltd.获得)
大豆油：商品名，Diazu Shirashime Yu(可从Summit Oil Mill Co.,Ltd.获得)
菜籽油(Shirashime油)：商品名，Natane Shirashime Yu(可从Summit Oil MillCo.,Ltd.获得)
葵花籽油(高油酸)：商品名，High Oleic Himawari Yu(可从Summit Oil MillCo.,Ltd.获得)
红花籽油(高油酸)：商品名，High Oleic Safflower Yu(可从Summit Oil MillCo.,Ltd.获得)
脂肪酸(HE1885)：商品名，Nouracid HE 1885(包含21重量％或更高的棕榈酸和64重量％或更高的油酸)(可从Oleon获得)
脂肪酸(NAA-34)：商品名，NAA-34(包含21重量％或更高的棕榈酸和58重量％或更高的油酸)(可从NOF公司获得)
葡萄糖：商品名，Nisshoku Gansui kesshou Budoutou[含水结晶葡萄糖](可从Nihon Shokuhin Kako Co.,Ltd.获得)
无机酸盐：KH2PO3、MgSO4、NaCl(配方(质量比)：10:5:1)
酵母提取物：商品名，Meast Powder N(可从Asahi Food&Healthcare,Ltd.获得)
蛋白胨：商标名，来自大豆的蛋白胨(可从Sigma-Aldrich获得)
表3
Figure BDA0004159313030000221
测量方法
(1)用于计算含SL的组合物中的SL含量和SL组成的方法
用乙醇(99.5体积％)稀释含SL的组合物以得到约1％的干燥的剩余物，并使所制备的经乙醇稀释的产物在表1所示的条件下经受高效液相色谱(HPLC)。用于测量干燥的剩余物的方法在后面的部分(2)中描述。
在表1所示的条件下的HPLC中，单体酸性SL在以10分钟至23分钟(酸性SLa)和45分钟至58分钟(酸性SLb)的保留时间的区域中洗脱。单体内酯型SL(其包含二乙酰基内酯型SL；以下同样适用)在以28分钟至40分钟的保留时间的区域中洗脱。在该区域中，特别是在28分钟至33分钟的区域中出现的峰，具有最高强度的峰来源于油酸-二乙酰基内酯型SL。二聚SL在以58分钟至70分钟的保留时间的区域中洗脱。
通过使用由用具有已知浓度的标准样品由HPLC分析获得的每个峰面积制备的标准曲线来计算包含在含SL的组合物中的酸性SL、内酯型SL和二聚SL的量。含SL的组合物中总的SL量通过将酸性SLa、酸性SLb、内酯型SL和二聚SL的各含量加起来来确定。每种SL(酸性SL、内酯型SL、二聚SL)在包含在含SL的组合物中的SL的总量(100质量％)中的比例(SL组成％)可以由HPLC分析中的峰面积比来计算。油酸-二乙酰基内酯型SL在内酯型SL的总量(100质量％)中的比例也可以由HPLC分析中的峰面积比来计算。
(2)用于测量含SL的组合物中干燥的剩余物和水含量的方法
1.用干燥的玻璃珠(珠子直径：3.0mm)铺设培养皿并用盖子盖住，随后精确测量整个重量(容器重量)。
2.将混合并均匀化的含SL的组合物(含水材料)铺在培养皿中的珠子的整个顶部，然后将其立即盖住并精确称重(干燥之前的重量)。
3.将培养皿转移至105℃下的干燥器(恒温干燥器DY300：Yamato ScientificCo.，Ltd.)中，并在没有盖子的情况下干燥3小时。
4.用盖子盖住培养皿，并转移到包含干燥剂(硅胶)的干燥器中，冷却至室温，精确称重(干燥之后的重量)。
5.由以下公式计算干燥的剩余物和水含量。
干燥的剩余物(重量％)＝(A/B)×100
水含量(重量％)＝100–干燥的剩余物(重量％)
A：干燥之后含SL的组合物的重量(g)(＝干燥之后的重量(g)-容器的重量(g))
B：干燥之前含SL的组合物的重量(g)(＝干燥之前的重量(g)-容器的重量(g))
(3)用于测量含SL的组合物中己烷提取物含量的方法
1.预先精确地测量离心管和烧杯的重量。
2.将约5g混合并均匀化的含SL的组合物放置在离心管中，并精确地测量重量(重量a)。
3.添加与所取的含SL的组合物的量相等量的正己烷，并将试管紧密密封，随后剧烈摇动混合。
4.以1000×g进行离心10分钟。
5.用移液管或类似装置仅取出己烷层并放置在烧杯中。
6.进行上述提取操作三次。该操作在将含SL的组合物和正己烷的温度调节成室温(20±5℃)之后进行。
7.将容纳回收的己烷层的烧杯在热水浴(约80℃)中加热以使己烷挥发，然后精确地测量重量(重量b)。
8.由以下公式计算己烷提取物含量(以湿重为基础和以干重为基础)。
己烷提取物含量(重量％，以湿重为基础)＝(A/B)×100
A：烧杯中剩余物的重量(g)(＝重量b(g)-烧杯的重量(g))
B：含SL的组合物的重量(g)(＝重量a(g)-离心管的重量(g))己烷提取物含量(重量％，以干重为基础)＝(己烷提取物含量(重量％，以湿重为基础)/干燥的剩余物(重量％))×100
(4)用于设定培养期期间供应至培养产物的氧的量的方法
使用氧传质系数(kLa)作为培养期期间供应至培养产物的氧的量的指标。
具体地，将3L自来水(伪培养物)放置在5L培养罐中用于实际培养物(不接种真菌)，并根据亚硫酸钠法用废气分析仪(测量气体：
O2)测量在实际应用的培养条件(30℃)下培养物(伪培养物)中的氧传质系数(kLa)。
以下将由此测量的氧传质系数(kLa)称为“表观氧传质系数(kLa)”。
1.按空气中的氧气标签校准废气分析仪(OFF-GAS Jr.
DEX-2561-1:ABLE公司)。
2.将亚硫酸钠溶解在自来水中以制备3L亚硫酸钠水溶液(浓度：0.4mol/L)。向所制备的亚硫酸钠水溶液中添加3mL硫酸铜水溶液(浓度：
0.1mol/L)。
3.在实际应用的培养条件下(例如通气量、搅拌(转速))在30℃下进行孵育，kLa由培养罐(水中)中的溶解氧水平、水中的饱和溶解氧水平、空气中的氧水平、通气量和废气中的氧水平来计算。
具体地，表观氧传质系数(kLa)是基于由下式1计算的式2来确定的。
dC/dt＝kLa(C*-C)-R(式1)
C：培养罐(水中)中的溶解氧水平(mg/L)
(使用在设定通气量和搅拌(转速)之后20分钟测量的值。然而，因为此处向自来水中添加亚硫酸钠，因此C＝0。)
C*：水中的饱和溶解氧水平
(使用在30℃下水中的饱和溶解氧水平(7.53mg/L)。)
kLa：氧传质系数(l/小时)
R：呼吸频率(mg·O2/L/小时)
(因为测量是在没有真菌细胞的情况下进行的，因此R＝0)
kLa ＝ dC/dt/7.53 (式2)
dC/dt：伪培养期间每单位时间内培养罐(水中)中溶解氧水平的变化(培养罐(水中)中的耗氧量(mg/L/小时))
物理特性评估方法
(1)粘度(mPa.s)的评估
1.将55g含SL的组合物放置在PET容器(标准瓶(5号)：50-mL体积，内径24.7mm，瓶体直径38mm，瓶体高68.5mm)中，并使其在
-5℃下在黑暗中静置72小时。
2.在使含SL的组合物静置之后，用以下仪器在以下条件下测量在-5℃的产物温度下的含SL的组合物的粘度。
测量仪器：TVB-10M粘度计(Toki Sangyo Co.,Ltd)
转子和搅拌转速：参见表2
测量时间:1分钟
(2)沉降特性的评估
(2-1)含SL的组合物在含SL的培养产物中的沉降特性
1.将培养完成之后的含SL的培养产物放置在离心管中。
2.将培养产物调节成20℃的产物温度，并用手充分摇动离心管10秒以搅拌样品。
3.使离心管中经搅拌的培养产物在20℃下在黑暗中静置12小时。
4.在使其静置之后，目视观察培养产物在离心管中是否存在沉降物，并根据以下标准进行评估。
○具有沉降特性：观察到沉降物。
×无沉降特性：没有观察到沉降物。
(2-2)含SL的组合物在蒸馏水中的沉降特性(确定是否存在分离和沉降物)
1.将5g被调节成以得到50％的干燥的残余物的含SL的组合物和25g蒸馏水添加到离心管中。
2.使用pH计(HM-30G，DKK-TOA公司)用盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等将样品(水含量：91.7％)的pH调节成2.5至3.0。
3.在被调节成20℃的产物温度的样品的情况下，用手充分摇动离心管10秒以搅拌样品，然后使其在20℃下静置5分钟。
4.在使样品静置之后，目视观察样品在离心管中是否存在沉降物，并根据以下标准进行评估。
○具有沉降特性：观察到明显的分离和/或沉降物(透明上清液(含水层)和乳状或褐色沉降物层(含SL的组合物))。
×无沉降特性：整个离心管均匀透明或略微不透明，没有观察到分离或沉降。
(3)低温流动性的评估
1.将15g含SL的组合物放置在PET容器(标准瓶(5号))中，用盖子盖住，并使其在-5℃下在黑暗中静置3天(72小时)。当含SL的组合物的水含量不为50％时，使用其水含量被调节成50％的含SL的组合物。
2.在进行静置之后，在-5℃下将容器颠倒倒置。目视观察内容物的流动性30秒，并根据以下标准进行评估。
○优异的低温流动性：内容物具有流动性。倒置之前存在在容器的底部的内容物在容器被倒置之后30秒内流动朝向容器口。
△具有低温流动性：虽然内容物具有流动性，但是倒置之前在容器的底部上的内容物在倒置之后移动到容器口需要大于30秒。
×差的低温流动性：内容物一点也不具有流动性。在容器的底部上的内容物一点也不流动，或者保持固态并落至容器口。
制造例1：含SL的组合物的生产(生产方法1)
(1)预培养
供使用的培养基为每升水中包含10g葡萄糖、10g蛋白胨和5g酵母提取物的液体培养基。使产SL酵母(球拟假丝酵母(Starmerellabombicola)ATCC22214菌株)在30℃下经受振荡培养2天，并将这确定为预培养液。
(2)主培养
将120mL预培养液接种到放置在5-L发酵罐(台式发酵罐，Bioneer-NEO:B.E.Marubishi Co.,Ltd.)中的主培养基(3L)中，并在30℃下进行通气搅拌培养5天以使该培养液发酵。将通气搅拌培养的条件设置成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量为540l/小时(通气量：1.8L/分钟，搅拌速度：600rpm)。
供使用的主培养基通过将表3所示的疏水性底物(植物油、脂肪酸)和亲水性底物(葡萄糖、酵母提取物和尿素)添加到水中以形成包含无机盐的含水液体培养基(灭菌之前的pH：4.5至4.8)来制备。在培养期期间，培养产物的pH不被控制。
在从培养开始的第6天，结束培养。将从发酵罐中取出的培养产物(pH：约3)加热至50℃至80℃，然后恢复至室温(25℃)，并使其静置1天或更多天。结果，培养产物从底部依次分成以下三层：褐色液体层、推测主要包含真菌细胞的乳白色固体层、和上清液。在除去上清液之后，以与除去的上清液的量相等的量添加工业用水或地下水。在搅拌所得混合物的同时，逐渐添加48％的氢氧化钠水溶液以将pH调节成6.5至6.9，从而使培养产物中包含的SL溶解。通过台式离心机(Westfalia:Westfalia Separator AG；2,400×g，15分钟，室温(25℃))使所得产物离心，以使乳白色固体(真菌细胞)沉淀，并收集包含SL的上清液。在搅拌所收集的上清液的同时，逐渐添加浓度为62.5％的硫酸水溶液以将pH调节成2.5至3.0，从而使SL不溶解。在使所得混合物在室温(25℃)下静置2天之后，通过倾析尽可能地除去上清液，从而获得作为含SL的组合物的剩余物(含水材料)。
根据上述方法测量由此获得的含SL的组合物的总的SL量、SL组成(％)、包含在内酯型SL中的油酸-二乙酰基内酯型SL的比例(％)、水含量和己烷提取物含量。总的SL量、SL组成和油酸-二乙酰基内酯型SL的比例由各区域的峰面积确定，所述各区域的峰面积通过用乙醇(99.5体积％)稀释所得的含SL的组合物以得到约1％的干燥的剩余物，然后在上述条件下使经稀释的产物经受HPLC来获得。
根据上述方法评估由此获得的含SL的组合物的粘度(mPa.s)、沉降特性和低温流动性。
表4-1(实施例1-1至1-14)和表4-2(比较例1-1至1-7)集中示出了结果。表4-1和表4-2示出了通过在不控制培养期期间(为约5的最初pH在培养过程中降低至3)培养产物的pH的情况下培养所获得的含SL的组合物的测量和评估结果，其中通气搅拌培养的条件被设定成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至每个培养产物的氧的量为各表中所示的值(l/小时)。
表4-2还示出了以与上述相同的方式测量和评估现有含SL的组合物(商业产品1-5)的总的SL量、SL组成(％)、包含在内酯型SL中的油酸-二乙酰基内酯型SL的比例(％)、水含量、己烷提取物含量、粘度、沉降特性和低温流动性的结果。
表4-1
Figure BDA0004159313030000291
表4-2
Figure BDA0004159313030000301
如表4-2所示，在这些培养条件下，当添加至培养基中的疏水性底物仅为植物油时，所制备的含SL的组合物被证实不具有沉降特性(参见比较例1-2至1-7)。此外，当疏水性底物为植物油和脂肪酸，其中游离脂肪酸的比例为总量(100％)的10％或更低时，含SL的组合物也被证实不具有如上述情况下的沉降特性(参见比较例1-1)。这表明在这些情况下产生的SL溶解在培养产物中。
然而，如表4-1所示，当添加到培养基中的疏水性底物为植物油和脂肪酸，其中游离脂肪酸的比例为总量(100％)的20％或更高时，所制备的含SL的组合物被证实具有沉降特性(实施例1-1至1-4，以及1-7至1-14)。这表明在这些情况下产生的SL未溶解在培养产物中。此外，当添加到培养基中的疏水性底物仅为脂肪酸时，所制备的含SL的组合物也被证实具有沉降特性(使SL不溶解，参见实施例1-5和1-6)。这些含SL的组合物(实施例1-1至1-14)在-5℃下的流动性(低温流动性)也都是优异的。
这些结果显示，当疏水性底物仅为脂肪酸时，或者当疏水性底物为脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油，其中游离脂肪酸比例为总量(100％)的20％至100％时，在不控制培养期期间pH的情况下通过将培养产物的表观氧传质系数(kLa)优选设定成200l/小时或更高，可以制备根据沉降特性和低温流动性二者可处理性优异的含SL的组合物(实施例1-1至1-14)。通过使用脂肪酸HE1885代替脂肪酸NAA-34也获得了相同的结果。
在组成和物理特性方面这些含SL的组合物之间的比较显示，当内酯型SL的含量为被视100％的总的SL量的45％至81％，优选45％至70％；油酸-二乙酰基内酯型SL的含量为被视为100％的内酯型SL的总量的95％或更低，优选92％或更低；以干重为基础，己烷提取物含量为6％或更低，优选3％或更低(以湿重为基础，为3％或更低，优选1.5％或更低)；酸性SL含量为被视为100％的总的SL量的10％至50％，优选15％至50％；以及二聚SL含量为被视为100％的总的SL量的45％或更低，优选40％或更低时，含SL的组合物在沉降特性和低温流动性方面可以是优异的。这样的含SL的组合物(水含量：40％至55％)在-5℃下也具有流动性，并且粘度为2310mPa.s至18980mPa.s。
制造例2：含SL的组合物的生产(生产方法2)(2-1)
以与制造例1中相同的方式将120mL以与制造例1中相同的方式制备的预培养液接种到主培养基(3L)中，并在30℃下进行通气搅拌培养5天以使该培养液发酵。供使用的主培养基通过将表5所示的疏水性底物(植物油、脂肪酸)和亲水性底物(葡萄糖、酵母提取物和尿素)添加到水中以形成包含无机盐的含水液体培养基(灭菌之前的pH：4.5至4.8)来制备。在培养期期间，将培养产物的pH控制成落在4至5.5的范围内。通气搅拌培养的条件被设置成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养产物的氧的量为540l/小时(通气量：1.8L/分钟，搅拌速度：600rpm)。
在从培养开始的第6天，结束培养，以与制造例1中相同的方式回收并获得含SL的组合物。根据上述方法以与制造例1中相同的方式测量所获得的含SL的组合物的总的SL量、SL组成(％)、包含在内酯型SL中的油酸-二乙酰基内酯型SL的比例(％)、水含量和己烷提取物含量。也根据上述方法评估了所获得的含SL的组合物的粘度(mPa.s)、沉降特性和低温流动性。
表5集中地示出了结果。
表5
Figure BDA0004159313030000331
如以上制造例1的比较例1-2至1-7(表4-2)所示，当仅使用植物油作为培养基中的疏水性底物时，除非在培养期期间控制培养产物的pH，否则所制备的含SL的组合物不具有沉降特性。如表5所示，在比较例2-3中观察到相同的现象。相比之下，如果在培养期期间将培养产物的pH控制成落在4.5至5的范围内，证实了单独使用植物油作为疏水性底物能够提供具有沉降特性的含SL的组合物(实施例2-1和2-2)。然而，即使在这些pH控制条件下，如果pH为4或更低，则所制备的含SL的组合物不具有沉降特性(比较例2-1)。即使在这些pH控制条件下，如果pH为5.5或更高，则所制备的含SL的组合物被证实具有降低的低温流动性(比较例2-2)。
如以上制造例1的实施例1-5和1-6(表4-1)所示，当仅使用脂肪酸作为培养基中的疏水性底物时，在培养期期间在不控制培养产物的pH的情况下制备的含SL的组合物在沉降特性和低温流动性二者方面是优异的；然而，当在培养期期间将培养产物的pH控制成5时，所获得的含SL的组合物被证实表现出降低的低温流动性(比较例2-4)。
制造例3：含SL的组合物的生产(生产方法2)(2-2)
以与制造例2中描述的实施例2-2同样的方式制备含SL的组合物，不同之处在于通气搅拌培养的条件被设定成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养产物的氧的量为160l/小时至367l/小时，以及培养期为6天至12天。评估含SL的组合物的组成、粘度(mPa.s)、沉降特性和低温流动性。
表6示出了结果。
表6
Figure BDA0004159313030000351
单独使用植物油作为疏水性底物，其中在培养期期间将培养产物的pH控制成5，以及其中根据表观氧传质系数(kLa)的氧供应被设定成160l/小时或更低，被证实提供了沉降良好但具有降低的低温流动性的含SL的组合物(比较例3-1)。这表明，当仅使用植物油作为疏水性底物时，将根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养产物的氧的量设定成高于160l/小时，优选200l/小时或更高，同时在培养期期间将培养产物的pH控制成5对于生产根据沉降特性和低温流动性二者可处理性优异的含SL的组合物是有用的。
制造例4：含SL的组合物的生产(生产方法3)
以与制造例1中相同的方式将120mL以与制造例1中相同的方式制备的预培养液接种到主培养基(3L)中，并在30℃下进行通气搅拌培养5至10天(实施例4-1至4-3：10天，比较例4-1：7天，比较例4-2：5天)以使该培养液发酵。供使用的主培养基通过将表7所示的疏水性底物(植物油、脂肪酸)和亲水性底物(葡萄糖、酵母提取物和尿素)添加到水中以形成包含无机盐的含水液体培养基(灭菌之前的pH：4.5至4.8)，来制备。在培养期期间，培养基的pH不被控制(在培养过程中pH降低至3)，以及通气搅拌培养的条件被设定成使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养基的氧的量为表7中所示的值(实施例4-1：通气量0.5L/分钟，搅拌速度380rpm，实施例4-2：通气量0.5L/分钟，搅拌速度410rpm，实施例4-3：通气量0.5L/分钟，搅拌速度410rpm)。
在从培养开始的第6天至第11天，结束培养。以与制造例1中相同的方式回收和获得含SL的组合物。根据上述方法以与制造例1中相同的方式测量所获得的含SL的组合物的SL组成(％)、包含在内酯型SL中的油酸-二乙酰基内酯型SL的比例(％)、水含量和己烷提取物含量。根据上述方法还评估了所获得的含SL的组合物的粘度(mPa.s)、沉降特性和低温流动性。
表7集中地示出了结果。
表7
Figure BDA0004159313030000371
如上述制造例1至3中所示，在培养期期间在不控制培养产物的pH的情况(为约5的初始pH在培养过程中降低至3)下单独使用植物油作为培养基中的疏水性底物提供了不具有沉降特性的含SL的组合物(比较例1-2至1-7，和比较例2-3)。相比之下，如表7所示，如果在培养期期间根据表观氧传质系数的供应至培养产物的氧的量被控制成145l/小时或更低，则在不控制培养产物的pH的情况下单独使用植物油作为疏水性底物(游离脂肪酸含量：0％)被证实提供了具有沉降特性以及优异的低温流动性的含SL的组合物(实施例4-1和4-2)。
在制造例1中，在不控制pH的情况下使用以10％或更低的量包含游离脂肪酸的培养基的培养被证实提供了不具有沉降特性的含SL的组合物(比较例1-1)；然而，实施例4-3的结果表明，同样在这种情况下，通过将培养期期间根据表观氧传质系数的供应至培养产物的氧的量设定成145l/小时或更低，可以制备在沉降特性和低温流动性二者方面都优异的含SL的组合物。
实验例1：培养基中剩余脂肪酸与SL的沉降特性之间的关系的评估在制造例1中，通过使用由表现出含SL的组合物的沉降特性的培养体系(实施例1-3)和没有表现出含SL的组合物的沉降特性的培养体系(比较实施例1-2)制备的含SL的组合物，评估含SL的组合物的沉降特性与组合物中包含的游离脂肪酸的量(以干重为基础)之间的关系。实施例1-3中制备的含SL的组合物(水分含量：44.1％)和比较例1-2中制备的含SL的组合物(水分含量：57.5％)分别以根据己烷提取物量(以干重为基础)为0.36％和0.117％的量包含游离脂肪酸。
具体地，将脂肪酸添加到实施例1-3和比较例1-2中获得的含SL的组合物中以得到表8中所示的量(质量％)。表8还示出了根据己烷提取物量(以干重为基础)添加的脂肪酸的量。实际的含SL的组合物各自将包含对应于含SL的组合物中己烷提取物的量的游离脂肪酸，所述量通过将表8的“根据己烷提取物量添加的脂肪酸的量”栏中所示的值增加0.36％或0.117％来确定。
将25g蒸馏水添加到容纳有5g单独的含SL的组合物的离心管中，以得到30g的总量(水含量：91.7％)。然后在20℃下用手摇动这些试管10秒，使它们均匀混合，并使其静置5分钟，随后评估沉降特性(是否存在沉降物)。根据以下标准进行用于评估沉降特性的方法。
沉降特性的评估
○：在使试管静置之后5分钟内观察到沉降(沉降物)。
×：在使试管静置之后5分钟内未观察到沉降(沉降物)。
表8汇总了结果。
表8
Figure BDA0004159313030000391
表8(1)的结果表明，无论脂肪酸的量(己烷提取物的含量)如何，实施例1-3中获得的含SL的组合物(即，内酯型SL和油酸-二乙酰基内酯型SL的含量满足本发明的要求(A)和(B)的含SL的组合物)被证实具有优异的沉降特性和良好的可处理性。然而，表8(2)的结果表明，尽管取决于脂肪酸的类型，当脂肪酸的量根据己烷提取物的量为7％或更低，特别是6％或更低时，比较例1-2中获得的含SL的组合物(即，内酯型SL的含量不满足本发明的要求(A)的含SL的组合物)被证实具有差的沉降特性和差的可处理性。这表明本发明的技术对于根据己烷提取物的含量脂肪酸含量为7％或更低，特别是6％或更低的含SL的组合物特别有用，所述含SL的组合物为具有倾向于具有差的沉降特性的含SL的组合物。
实验例2：含SL的组合物中游离脂肪酸含量对发泡能力影响的评估将包含不同量的游离脂肪酸的含SL的组合物单独添加到餐具清洁剂中。评估每种餐具清洁剂的发泡能力，并评估含SL的组合物中游离脂肪酸含量对发泡能力的影响。
(1)测试样品的制备
由实施例1-3的含SL的组合物和油酸制备包含表9所示量的脂肪酸的含SL的组合物1至4。如表10所示，将0.5g这些含SL的组合物1至4分别添加到4.5g餐具清洁剂(HappyElephant，蔬菜和餐具清洁剂(SarayaCo.,Ltd.)；脂肪酸含量：0％)中，从而制备测试样品1至4。
表9
Figure BDA0004159313030000411
(2)发泡能力的评估方法
用蒸馏水稀释所制备的测试样品1至4和餐具清洁剂(对照样品)以得到浓度为15％的餐具清洁剂。
将经稀释的测试样品1至4和对照样品各自以1g的量单独添加到量筒中，并向其中添加100mL自来水(25℃)，随后用连接有均匀化分散器(直径40)的Robomix(型号：RM/1001，制造商：PRIMIX公司)以5000rpm搅拌3分钟。
从量筒上的刻度读取自搅拌结束30秒、60秒和180秒之后的泡沫高度。
(3)发泡能力的评估结果
表10示出了结果。
表10
Figure BDA0004159313030000421
表10中所示的结果表明，添加到餐具清洁剂中的根据本发明的含SL的组合物增加了发泡能力(参见对照样品和测试样品1)。结果还表明发泡能力的增加随着含SL的组合物中脂肪酸含量的增加而受到限制(测试样品1至4)。将含SL的组合物中的脂肪酸含量限制成6％或更低导致含SL的组合物的发泡能力等于或大于餐具清洁剂本身的发泡能力。因此，也从发泡特性的角度来看，含SL的组合物中的游离脂肪酸含量看起来优选为6％或更低。

Claims (14)

1.一种含槐糖脂的组合物，包含以下特征：
(A)内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的45质量％至81质量％，以及
(B)油酸-二乙酰基内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述内酯型槐糖脂的总量的95质量％或更低。
2.根据权利要求1所述的含槐糖脂的组合物，包含以下特征：
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低。
3.根据权利要求1或2所述的含槐糖脂的组合物，包含以下特征：
(D)水含量为55质量％或更低。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的含槐糖脂的组合物，还包含以下特征(E)或(F)，或者两者：
(E)酸性槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的10质量％至50质量％，以及
(F)二聚槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的0.1质量％至40质量％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的含槐糖脂的组合物，其中在将所述含槐糖脂的组合物调节成具有50质量％的水含量并使所述含槐糖脂的组合物在-5℃下静置72小时之后，所述含槐糖脂的组合物的用TVB-10M粘度计测量持续1分钟的测量时间的在-5℃的产物温度下的粘度为1490mPa.s或更高。
6.一种用于生产含槐糖脂的组合物的方法，所述含槐糖脂的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的45质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述内酯型槐糖脂的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产槐糖脂酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物为脂肪酸，或者所述疏水性底物包含脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油，以及
游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述脂肪酸的总量的20质量％或更高，或者当所述疏水性底物包含所述熔点为30℃或更低的植物油时，所述游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述脂肪酸和所述植物油的总量的20质量％或更高。
7.根据权利要求6所述的方法，其中培养产物的pH在培养的早期阶段为4至5。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养产物的pH在培养期期间不被控制。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中设定所述培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至所述培养产物的氧的量为145l/小时或更高。
10.一种用于生产含槐糖脂的组合物的方法，所述含槐糖脂的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的45质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述内酯型槐糖脂的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产槐糖脂酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物为熔点为30℃或更低的植物油，以及
培养产物的pH在培养期间被调节成4.5至5。
11.根据权利要求10所述的方法，其中设定培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至所述培养产物的氧的量为200l/小时或更高。
12.一种用于生产含槐糖脂的组合物的方法，所述含槐糖脂的组合物包含以下特征(A)和(B)，或(A)至(C)：
(A)内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述槐糖脂的总量的45质量％至81质量％，
(B)油酸-二乙酰基内酯型槐糖脂的含量为被视为100质量％的所述内酯型槐糖脂的总量的95质量％或更低，以及
(C)以干重为基础，己烷提取物的含量为6质量％或更低；
所述方法包括在包含疏水性底物和亲水性底物的培养基中对产槐糖脂酵母进行培养，
其中
所述疏水性底物为熔点为30℃或更低的植物油，或者所述疏水性底物包含脂肪酸和熔点为30℃或更低的植物油，
游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述熔点为30℃或更低的植物油的总量的0质量％至低于20质量％，或者当所述疏水性底物包含所述脂肪酸时，所述游离脂肪酸的比例为包含在所述培养基中的被视为100质量％的所述脂肪酸和所述熔点为30℃或更低的植物油的总量的0质量％至低于20质量％，以及
设定培养期期间通气搅拌培养的条件，使得根据表观氧传质系数(kLa)的供应至培养产物的氧的量为145l/小时或更低。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养产物的pH在培养的早期阶段为4至5。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养产物的pH在所述培养期期间不被控制。
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