CN116253771A - 人参皂苷衍生物及其制备方法与其抗炎应用 - Google Patents

人参皂苷衍生物及其制备方法与其抗炎应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物及其在药学上可接受的盐，以及其制备方法。本发明提供的式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物及其药学上可接受的盐具备抗炎活性，可用于制备抗炎类药物或抗炎类药物组合物。本发明提供的人参皂苷衍生物，相比现有临床药物，具有更好的抑制LPS诱导NO释放效果，且安全性良好，毒性更低，稳定性更强。

Description

人参皂苷衍生物及其制备方法与其抗炎应用
技术领域
本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及一类人参皂苷衍生物及其制备方法与其在制备抗炎药物中的应用，属于新化合物的提出、制备与应用技术领域。
背景技术
炎症是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但当诱导因素刺激过大可能会导致免疫过度反应，导致组织损伤甚至危及生命。
目前，临床使用的抗炎药物均存在不同程度的不良反应。因此，开发高效、低毒的抗炎药物是当下研究的重点。
一氧化氮(NO，Nitric oxide)是具有特殊生物学功能的小分子，气态NO可自由穿梭于生物膜，传递生物学信息，是细胞内的重要信使。其主要由诱导型一氧化氮合酶(iNOS，Inducible nitric oxide synthase)产生，iNOS在正常组织不表达，只过表达于炎症组织。其含量水平的高低可作为衡量炎症严重程度的重要指标，在炎症、免疫及癌症等的调节中都发挥着不可忽视的作用。
在炎症过程中，线粒体来源的ROS(MtROS)有助于多种促炎细胞因子的产生，MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针(MitoSOX Red Mitochondrial SuperoxideIndicator)是二氢乙啶(dihydroethidum，DHE)的一种阳离子衍生物，可以高度特异性检测活细胞MtROS的产生。在巨噬细胞中，MtROS的另一个重要作用是调节炎性小体。已知NLRP3炎性小体可以通过IL-1β和IL-18的释放来感知多种炎症刺激，并促进炎症的发展，从而引起进一步的损害，如神经退行性疾病和II型糖尿病的发展MtROS是激活NLRP3炎性小体的重要刺激物。
人参在中药材中占居首位，具有安神定魂、延长益寿等多重药效，人参皂苷是人参的主要活性成分，具有广泛的药理作用。尤其在抗炎活性上，如人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rg3、Rh1等发现在抗神经炎症、皮肤组织炎症、结肠炎等方面有显著的治疗作用，表现出较好的抗炎活性。Pyxinol及其C-24位差向异构体为20S-原人参二醇在体内的关键代谢产物，相比亲代人参皂苷易被人体吸收。前期研究发现Pyxinol可通过20(S)-原人参二醇直接环化氧化大量制备(Chin.J.Org.Chem.37(2017)，2109-2114)，并且发现其酯化衍生物对促炎因子NO、TNF-α有抑制作用(专利申请公布号CN 109776647A和CN 111647036A)，但现有技术公开的酯化衍生物由于酯基的存在，而血浆中含有酯酶，酯化衍生物容易被酯酶水解，导致药物在血浆中的稳定性不佳。为了获得活性更好、在体内更稳定的抗炎化合物，本发明开展了全新的结构改造与修饰，从中筛选获得更具开发价值的抗炎候选药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种人参皂苷衍生物及其制备方法与抗炎应用。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物，或如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物在药学上可接受的盐
Figure BDA0004060592950000021
式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ中，R为4-硝基苯基、4-腈基苯基、4-三氟甲基苯基、4-溴苯基、4-甲基苯基、3-吡啶基、苯基或环己基，优选为4-硝基苯基、4-腈基苯基或3-吡啶基。
优选所述人参皂苷衍生物为20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-24-烯-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、20(S)-达马烷-2-(4-硝基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇、20(S)-达马烷-2-(4-腈基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇或(20S,24R)-环氧达马烷-2-(4-硝基亚苄)-3β，12β，25-三醇。
本发明还提供了上述如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物的制备方法，所述方法的合成路线如下式所示：
Figure BDA0004060592950000041
进一步，所述方法包括以下步骤：
(1)以原人参二醇(20S-PPD)、式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物或式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物在氧化剂的作用下，进行选择性氧化反应，分别制得式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物；
所述氧化剂为戴斯马丁试剂(DMP试剂)或PCC(氯铬酸吡啶盐)，优选为DMP试剂。
式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物为(20S,24R)-环氧达马烷-3β，12β，25-三醇、式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物为(20S,24S)-环氧达马烷-3β，12β，25-三醇。
进一步，步骤(1)的溶剂为二氯甲烷(DCM)；
二氯甲烷的体积用量一般以原人参二醇(20S-PPD)、式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物或式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物的质量计为10～40mL/g，优选20～25mL/g。
原人参二醇(20S-PPD)、式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物或式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物与DMP的物质的量之比优选1：1～1.2；
反应温度为室温，反应时间为3～8小时。
氧化剂为DMP试剂时，加入碳酸氢钠调节pH，DMP试剂与碳酸氢钠的质量比为1:0.3～1。
氧化剂为DMP试剂时，加入适量叔丁醇促进氧化反应的进行，同时作为氧化剂的助溶剂。所述叔丁醇的体积用量一般以戴斯马丁试剂(DMP)的质量计为0.5～2mL/g。
所述步骤(1)中，选择性氧化反应结束后，反应液进行后处理，制得式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物；
所述后处理的方法一般为：反应液加水洗涤，饱和食盐水洗涤，干燥后抽滤、浓缩，柱层析分离制得式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物；
(2)式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物在氢氧化钾的醇溶液中与醛R-CHO进行缩合反应，分别制备得到式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物；
式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物和醛R-CHO的物质的量之比为1：0.1～10，优选1:1.5～5。
反应温度为室温，反应时间为1～8小时。
进一步，氢氧化钾的醇溶液中的醇为甲醇或乙醇，其中氢氧化钾的质量百分浓度为1％～50％，优选40％～45％；
所述氢氧化钾的醇溶液的体积用量以式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物的质量计为10～50mL/g，优选20～40mL/g。
所述式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物和氢氧化钾的物质的量之比为1：5～20，优选1：8～15。
所述步骤(2)中，缩合反应结束后，反应液进行后处理，分别制备得到式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物；所述后处理的步骤一般为：反应液用乙酸乙酯稀释，然后用水、饱和食盐水洗涤、干燥后抽滤、浓缩，柱层析分离制备得到式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物。
(3)式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物在NaBH4的醇溶液中，进行还原反应，分别制得式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物；
所述式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物和NaBH4的物质的量之比为1：1～10，优选1:1.5～5。
反应温度为室温，反应时间为0.1～8h。
所述NaBH4的醇溶液中，醇溶剂为乙醇、甲醇或异丙醇。
所述NaBH4的醇溶液的体积用量以式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物的质量计为10～50mL/g，优选20～40mL/g。
所述步骤(3)中，还原反应结束后，反应液进行后处理，分别制备得到式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物；所述后处理的步骤一般为：反应液用乙酸乙酯稀释，然后用水、饱和食盐水洗涤、干燥后抽滤、浓缩，柱层析分离制备得到式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物。
本发明衍生物药学上可接受的盐，是指常规的酸加成盐，其具有与衍生物同样的药学功效，且与合适的非毒性有机酸或无机酸成的盐。
本发明还提供所述式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物及其药学上可接受的盐具备抗炎活性，可用于制备抗炎类药物或抗炎类药物组合物；具体地，可用于制备治疗和预防炎症性肠病、脓毒血症等有关的疾病的药物或药物组合物。
含本发明的人参皂苷衍生物或其药学上可接受的盐,可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂等，还可以加入香料、甜味剂、液体或固体填充料或稀释剂等常用的人体可接受的药物辅料。
本发明所述的人参皂苷衍生物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。
本发明的人参皂苷衍生物临床所用剂量为0.01mg～1000mg/天，也可根据病情的轻重或剂型的不同偏离此范围。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1.化合物抗炎活性优异，本系列化合物在20μM浓度下对NO产生的抑制作用均强于市售药物氢化可的松琥珀酸钠，表现出更好的抗炎活性。而且优于现有技术中公开的酯化衍生物的抗炎活性(例如专利CN 111647036A公开的化合物8)。
2.化合物有更低的细胞毒性：在20μM浓度下细胞存活率均达到95％以上。大部分化合物在实验中的细胞存活率高于市售药物氢化可的松琥珀酸钠。
3.化合物结构更稳定。相比于现有技术中公开的具有抗炎活性的酯化衍生物，本发明衍生物中不含酯键，因此对不易受到血浆中酯酶的水解作用的影响，从而具有更强的血浆稳定性，提高药物的生物利用度。
综上所述，本发明提供的人参皂苷衍生物，相比现有临床药物，具有更好的抑制LPS诱导NO释放效果，且安全性良好，毒性更低，稳定性更强。
附图说明
图1为人参皂苷衍生物抗炎活性测试结果图。
图2为人参皂苷衍生物细胞毒性测试结果图。
图3为酶标仪检测MitoSOX实验与WesternBlot检测NLRP3实验，其中左图为MitoSOX实验结果图，右图为NLRP3实验结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-1)
将20S-原人参二醇(50mg)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入NaHCO3(50mg)。加入DMP(55mg)，滴加叔丁醇(40μL)，室温搅拌6h。加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到中间产物1[20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮]，收率80％。
将中间产物1(30mg)溶于KOH的乙醇溶液(KOH质量浓度40％，1mL)中，加入4-硝基苯甲醛(30mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，分离得到最终产物产物Ⅰ-1，收率91％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.46(s,1H),5.16(t,J＝7.0Hz,1H),4.04(s,1H),3.68(td,J＝9.8,4.6Hz,1H),3.05(d,J＝16.2Hz,1H),,2.31(d,J＝16.2Hz,1H),1.78(t,J＝10.5Hz,1H),1.69(s,3H),1.63(s,3H),1.23(s,3H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.86(s,3H).
实施例2：20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-2)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-腈基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-2，收率71％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(s,1H),5.17(t,J＝6.4Hz,1H),3.67(td,J＝9.8,4.6Hz,1H),3.03(d,J＝16.2Hz,1H),2.30(d,J＝15.7Hz,1H),1.78(t,J＝10.5Hz,1H),1.70(s,3H),1.64(s,3H),1.23(s,3H),1.18(s,3H),1.14(s,3H),,1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.86(s,3H).
实施例3：20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-三氟甲基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-3)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-三氟甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-3，收率70％。1HNMR(400MHz,CDCl3)7.65(d,J＝8.2Hz,2H),7.50(d,J＝8.0Hz,2H),7.46(s,1H),5.17(t,J＝7.1Hz,1H),3.97(s,2H),3.67(td,J＝9.8,4.6Hz,1H),3.06(d,J＝16.2Hz,1H),2.29(d,J＝16.1Hz,1H),1.78(t,J＝10.5Hz,1H),1.69(s,3H),1.63(s,3H),1.22(s,3H),1.18(s,3H),1.15(s,3H),1.02(s,3H),0.93(s,3H),0.85(s,3H).
实施例4：20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-溴基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-4)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-溴基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-4，收率74％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(d,J＝8.5Hz,2H),7.39(s,1H),7.28(d,J＝8.1Hz,2H),5.18(t,J＝7.1Hz,1H),4.04(s,2H),3.68(td,J＝10.4,5.7Hz,1H),3.03(d,J＝17.3Hz,1H),2.26(d,J＝16.1Hz,1H),1.78(t,J＝10.5Hz,1H),1.69(s,3H),1.64(s,3H),1.22(s,3H),1.17(s,3H),1.13(s,3H),1.01(s,3H),0.93(s,3H),0.82(s,3H).
实施例5：20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-甲基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-5)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-5，收率66％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H),7.33(d,J＝7.5Hz,2H),7.21(d,J＝7.5Hz,2H),5.17(t,J＝7.1Hz,1H),4.06(s,2H),3.71(td,J＝10.4,5.7Hz,1H),3.09(d,J＝16.1Hz,1H),2.36(s,3H),2.30(d,J＝15.1Hz,1H),1.69(s,3H),1.64(s,3H),1.23(s,3H),1.17(s,3H),1.12(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.85(s,3H).
实施例6：20(S)-12β，20-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-6)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入2-吡啶甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-6，收率80％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.71–8.64(m,1H),8.55–8.47(m,1H),,7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.40(s,1H),7.35(dd,J＝7.6,4.7Hz,1H),5.14(t,J＝7.1Hz,1H),3.67(td,J＝10.3,4.8Hz,1H),3.07(d,J＝16.2Hz,1H),2.32(d,J＝16.5Hz,1H),1.80(t,J＝10.6Hz,1H),1.68(s,3H),1.62(s,3H),1.19(s,6H),1.14(s,3H),1.04(s,3H),0.93(s,3H),0.88(s,3H).
实施例7：20(S)-12β，20-二羟基-2-亚苄基-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-7)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-7，收率82％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48–7.36(m,5H),7.34–7.29(m,1H),5.17(t,J＝7.1Hz,1H),3.67(td,J＝10.4,5.0Hz,1H),3.11(d,J＝17.6Hz,1H),2.31(d,J＝14.8Hz,1H),1.78(t,J＝10.6Hz,1H),1.69(s,3H),1.64(s,3H),1.22(s,3H),1.18(s,3H),1.13(s,3H),1.03(s,3H),0.93(s,3H),0.86(s,3H).
实施例8：20(S)-12β，20-二羟基-2-亚环己基-达马烷-24-烯-3-酮(Ⅰ-8)
将中间产物1(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入环己基甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析分离得到最终产物产物Ⅰ-8，收率79％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.45(d,J＝9.9Hz,1H),5.17(t,J＝8.2Hz,1H),3.66(td,J＝10.5,4.9Hz,1H),2.78(d,J＝15.6Hz,1H),1.71(s,3H),1.65(s,3H),1.23(s,3H),1.09(s,3H),1.07(s,3H),1.04(s,3H),0.93(s,3H),0.84(s,3H).
实施例9：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅱ-1)将20S-原人参二醇(2.0g)溶于二氯甲烷(50mL)中，加入m-CPBA(1.0g)，室温搅拌3h。氯仿稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到中间产物3[(20S,24R)-环氧达马烷-3β，12β，25-三醇]与中间产物4[(20S,24S)-环氧达马烷-3β，12β，25-三醇]。
将中间产物3(1g)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入NaHCO3(528mg)。加入DMP(1g)，滴加叔丁醇(1mL)，室温搅拌6h。氯仿稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到中间产物5[(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-达马烷-3-酮]，收率83％。
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-硝基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-1，收率65％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(d,J＝2.4Hz,1H),3.86(dd,J＝10.9,5.3Hz,1H),3.61(td,J＝10.4,4.6Hz,1H),3.05(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),1.29(s,3H),1.22(s,3H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),1.10(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.87(s,3H).
实施例10：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅱ-2)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1ml)中，加入4-腈基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-2，收率55％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.1Hz,2H),7.39(t,J＝2.2Hz,1H),3.87(dd,J＝10.9,5.3Hz,1H),3.61(td,J＝10.3,4.5Hz,1H),3.04(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),1.30(s,3H),1.23(s,3H),1.19(s,3H),1.14(s,3H),1.10(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.87(s,3H).
实施例11：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-三氟甲基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅱ-3)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(KOH质量浓度40％，1ml)中，加入4-三氟甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-3，收率75％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(d,J＝8.2Hz,2H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.45(s,1H),3.86(dd,J＝10.9,5.4Hz,1H),3.60(td,J＝10.4,4.6Hz,1H),3.07(dd,J＝16.5,1.7Hz,1H),1.29(s,3H),1.23(s,3H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),1.10(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.87(s,3H).
实施例12：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-溴基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅱ-4)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(KOH质量浓度40％，1ml)中，加入4-溴基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-4，收率63％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝8.5Hz,2H),7.37(t,J＝2.1Hz,1H),7.27(d,J＝8.6Hz,2H),5.89(s,1H),3.87(dd,J＝10.8,5.4Hz,1H),3.61(td,J＝10.4,4.6Hz,1H),3.04(dd,J＝16.4,1.8Hz,1H),1.29(s,3H),1.24(s,3H),1.18(s,3H),1.13(s,3H),1.11(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.86(s,3H).
实施例13：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-甲基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅱ-5)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1ml)中，加入4-甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-5，收率86％。1HNMR(400MHz,CDCl3)7.44(s,1H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(d,J＝7.9Hz,2H),3.88(dd,J＝10.8,5.3Hz,1H),3.62(td,J＝10.3,4.5Hz,1H),3.09(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),2.37(s,3H),1.29(s,3H),1.24(s,3H),1.18(s,3H),1.12(s,3H),1.11(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.87(s,3H).
实施例14：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-3-酮(Ⅱ-6)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入2-吡啶甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-6，收率64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68–8.62(m,1H),8.57–8.52(m,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(s,1H),7.34(dd,J＝8.0,4.6Hz,1H),5.84(s,1H),3.87(dd,J＝10.9,5.4Hz,1H),3.60(td,J＝10.4,4.7Hz,1H),3.05(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),1.29(s,3H),1.23(s,3H),1.19(s,3H),1.14(s,3H),1.10(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.88(s,3H).
实施例15：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-亚苄基-达马烷-3-酮(Ⅱ-7)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入苯甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-7，收率63％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.36(m,5H),7.34–7.29(m,1H),5.87(s,1H),3.87(dd,J＝10.8,5.3Hz,1H),3.62(td,J＝10.4,4.6Hz,1H),3.11(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),1.29(s,3H),1.24(s,3H),1.19(s,3H),1.13(s,3H),1.10(s,3H),1.06(s,3H),0.96(s,3H),0.88(s,3H).
实施例16：(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-亚环己基-达马烷-3-酮(Ⅱ-8)
将中间产物5(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入环己基甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅱ-8，收率63％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.46(ddd,J＝9.9,2.8,1.4Hz,1H),3.90(dd,J＝10.8,5.4Hz,1H),3.60(td,J＝10.3,4.5Hz,1H),2.81(dd,J＝15.7,1.5Hz,1H),1.30(s,3H),1.25(s,3H),1.12(s,3H),1.09(s,3H),1.08(s,3H),1.06(s,3H),0.95(s,3H),0.85(s,3H).
实施例17：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅲ-1)
将中间产物4(330mg)溶于二氯甲烷(7mL)中，加入NaHCO3(174mg)。加入DMP(352mg)，滴加叔丁醇(300μL)，室温搅拌6h。氯仿稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到中间产物5[(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-达马烷-3-酮]，收率81％。
将中间产物7(26mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-硝基苯甲醛(12mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-1，收率64％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(dd,J＝2.9,1.6Hz,1H),3.86(dd,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.60(td,J＝10.5,4.4Hz,1H),3.02(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),2.31(dd,J＝16.7,2.2Hz,1H),1.28(s,3H),1.27(s,3H),1.19(s,3H),1.14(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.95(s,3H),0.84(s,3H).
实施例18：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅲ-2)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-腈基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-2，收率67％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.3Hz,2H),7.39(t,J＝2.2Hz,1H),3.87(dd,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.59(td,J＝10.5,4.4Hz,1H),3.00(dd,J＝16.6,1.8Hz,1H),1.29(s,3H),1.28(s,3H),1.18(s,3H),1.13(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.84(s,3H).
实施例19：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-三氟甲基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅲ-3)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-三氟甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-3，收率82％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.68–7.62(m,2H),7.51–7.47(m,2H),7.44(t,J＝2.1Hz,1H),3.86(dd,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.60(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),3.04(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),2.31(dd,J＝17.3,2.4Hz,1H),2.23(ddd,J＝10.9,9.2,3.7Hz,1H),1.28(s,3H),1.28(s,3H),1.18(s,3H),1.14(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.84(s,3H).
实施例20：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-溴基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅲ-4)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-溴基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-4，收率55％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,J＝8.5Hz,2H),7.38–7.34(m,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),3.86(dd,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.60(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),3.01(dd,J＝16.4,1.8Hz,1H),1.28(s,6H),1.17(s,3H),1.12(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.83(s,3H).
实施例21：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-甲基亚苄)-达马烷-3-酮(Ⅲ-5)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入4-甲基苯甲醛(40mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-5，收率90％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(t,J＝2.3Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),3.86(dd,J＝8.8,6.7Hz,1H),3.61(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),3.06(dd,J＝16.4,1.7Hz,1H),2.38(s,3H),2.30(d,J＝16.2Hz,1H),2.23(ddd,J＝10.9,9.1,3.7Hz,1H),1.28(s,6H),1.17(s,3H),1.11(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.84(s,3H).
实施例22：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-3-酮(Ⅲ-6)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入2-吡啶甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-6，收率93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70–8.61(m,1H),8.61–8,50(m,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(s,1H),7.36(dd,J＝8.0,4.8Hz,1H),3.86(dd,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.59(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),3.02(dd,J＝16.5,1.8Hz,1H),2.34(d,J＝16.5Hz,1H),2.23(ddd,J＝11.0,9.2,3.8Hz,1H),1.28(s,3H),1.27(s,3H),1.19(s,3H),1.13(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.95(s,3H),0.85(s,3H).
实施例23：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-亚苄基-达马烷-3-酮(Ⅲ-7)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入苯甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-7，收率71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝1.1Hz,1H),7.42–7.38(m,4H),7.36–7.30(m,1H),3.86(dd,J＝8.8,6.8Hz,1H),3.60(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),3.07(dd,J＝16.1,1.5Hz,1H),2.32(d,J＝16.3Hz,1H),2.23(ddd,J＝10.9,9.2,3.8Hz,1H),1.28(s,3H),1.28(s,3H),1.18(s,3H),1.12(s,3H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.85(s,3H).
实施例24：(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-亚环己基-达马烷-3-酮(Ⅲ-8)
将中间产物7(40mg)溶于KOH的乙醇溶液(40％，1mL)中，加入环己基甲醛(40μL)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅲ-8，收率79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.45(ddd,J＝9.9,2.8,1.4Hz,1H),3.87(dd,J＝8.8,6.7Hz,1H),3.59(td,J＝10.4,4.4Hz,1H),2.77(dd,J＝15.8,1.6Hz,1H),1.30(s,3H),1.29(s,3H),1.11(s,3H),1.08(s,3H),1.07(s,3H),1.03(s,3H),0.94(s,3H),0.82(s,3H).
实施例25：20(S)-达马烷-2-(4-硝基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇(Ⅳ-1)
将衍生物Ⅰ-1(40mg)溶于异丙醇(1mL)中，加入NaBH4(10mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅳ-1，收率70％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝8.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),6.79(s,1H),5.14(t,J＝7.8Hz,1H),3.90(s,1H),3.57(td,J＝10.4,5.1Hz,1H),2.95(d,J＝12.8Hz,1H),1.68(s,3H),1.62(s,3H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),0.94(s,3H),0.90(s,3H),0.77(s,3H),0.73(s,3H).
实施例26：20(S)-达马烷-2-(4-腈基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇(Ⅳ-2)
将衍生物Ⅰ-2(40mg)溶于异丙醇(1mL)中，加入NaBH4(10mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅳ-2，收率75％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝7.9Hz,2H),7.28(d,J＝8.1Hz,2H),6.74(s,1H),5.14(t,J＝7.1Hz,1H),3.88(d,J＝2.0Hz,1H),3.57(td,J＝10.4,5.1Hz,1H),2.93(d,J＝12.6Hz,1H),1.68(s,3H),1.62(s,3H),1.19(s,3H),1.14(s,3H),0.94(s,3H),0.90(s,3H),0.76(s,3H),0.72(s,3H).
实施例27：(20S,24R)-环氧达马烷-2-(4-硝基亚苄)-3β，12β，25-三醇(Ⅴ-1)
将衍生物Ⅱ-1(40mg)溶于异丙醇(1mL)中，加入NaBH4(10mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅴ-1，收率69％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),6.78(s,1H),3.88(d,J＝2.0Hz,1H),3.83(dd,J＝9.0,6.6Hz,1H),3.50(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),2.90(d,J＝12.9Hz,1H),2.18(ddd,J＝10.9,9.1,3.6Hz,1H),1.26(s,3H),1.26(s,3H),1.14(s,3H),1.07(s,3H),0.94(s,3H),0.91(s,3H),0.76(s,3H),0.69(s,3H).
实施例28：(20S,24R)-环氧达马烷-2-(3-吡啶基亚甲基)-3β，12β，25-三醇(Ⅴ-6)
将衍生物Ⅱ-6(40mg)溶于异丙醇(1mL)中，加入NaBH4(10mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅴ-6，收率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44–8.40(m,2H),7.52(td,J＝7.8,2.0Hz,1H),6.71(s,1H),3.87(d,J＝2.1Hz,1H),3.83(dd,J＝8.9,6.6Hz,1H),3.50(td,J＝10.5,4.6Hz,1H),2.88(d,J＝12.9Hz,1H),2.18(ddd,J＝10.9,9.2,3.7Hz,1H),1.26(s,6H),1.13(s,3H),1.08(s,3H),0.94(s,3H),0.91(s,3H),0.76(s,3H),0.72(s,3H).
实施例29：(20S,24S)-环氧达马烷-2-(4-硝基亚苄)-3β，12β，25-三醇(Ⅵ-1)
将衍生物Ⅲ-1(40mg)溶于异丙醇(1mL)中，加入NaBH4(10mg)，室温搅拌1h。乙酸乙酯稀释加水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析得到最终产物产物Ⅵ-1，收率78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.16(d,J＝8.8Hz,2H),7.35–7.29(m,2H),6.79(s,1H),5.81(s,1H),4.81(s,1H),3.83(dd,J＝10.9,5.3Hz,1H),3.51(td,J＝10.3,4.7Hz,1H),2.93(d,J＝12.9Hz,1H),2.24(td,J＝10.6,4.5Hz,1H),1.26(s,3H),1.20(s,3H),1.14(s,3H),1.08(s,3H),0.96(s,3H),0.93(s,3H),0.77(s,3H),0.71(s,3H).
实施例30：人参皂苷衍生物对NO产生的抑制活性检测；
本发明通过Griess实验来检测LPS(LPS，Lipopolysaccharide)诱导的NO释放水平，进而评估人参皂苷衍生物的抗炎活性。
取对数生长期的RAW264.7细胞，以浓度为5×104每孔接种于96孔板并孵育24h，用LPS(1μg/mL)刺激造模，同时加入20μM浓度的人参皂苷衍生物，及阳性药氢化可的松(HSS,Hydrocortisone)，再将96孔板放入培养箱继续孵育24h。孵育完毕后取出孔板，于无菌环境下吸取各孔上清液至另一块96孔板中，每孔吸取100μL。使用Griess试剂检测吸出的上清液中亚硝酸盐水平来确定NO含量，然后在微孔板读数器(SpectraMax M3)中检测样品在540nm处的吸光度(OD540)；其中，空白组为无LPS和药物处理组；对照组为LPS刺激造模但无化合物处理组；使用Griess试剂检测RAW264.7细胞中脂多糖(LPS)诱导NO的释放水平。
NO抑制率＝[对照组(OD540)-化合物(OD540)]/[对照(OD540)-空白(OD540)]×100％
本发明所述人参皂苷衍生物的生物活性检测结果如图1所示。
图例说明如下：
每个数值来自三个平行实验平均±SD(n＝3)；
与空白组相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001；
与LPS刺激组相比*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；
图1纵坐标代表NO浓度。
图1的结果表明
本发明提供的人参皂苷衍生物具有良好的抗炎活性，均显著抑制了LPS诱导的NO释放增加，且抗炎活性均优于阳性药(氢化可的松)；化合物Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-6、Ⅱ-1、II-2、II-6、Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅳ-1、Ⅳ-2、Ⅴ-1在20μM浓度下对NO产生的抑制率是阳性对比氢化可的松琥珀酸钠的抑制率的2倍以上，在10μM浓度下仍能对NO产生的较高的抑制率。
实施例31：MTT法检测人参皂苷衍生物体外细胞毒性实验
MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以把外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，在细胞中沉积，而死细胞中不会出现这种现象。甲瓒结晶可以溶解在DMSO中，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定吸光度，在一定细胞数范围内，吸光度值与活细胞数成正比，从而间接反映活细胞数量。
该实验与实施例30一同进行。
MTT检测：：取实施例30中20μM浓度的人参皂苷衍生物处理的细胞，分别加5mg/mL的MTT溶液20μL/孔，于培养箱孵育4h。弃上清，加入DMSO 150μL/孔，振荡混匀；然后在SpectraMax M3中检测样品在570nm处的吸光度(OD570)；
细胞存活率＝[1-实验组存活率]/对照组存活率平均值×100％
本发明所述人参皂苷衍生物的细胞毒性检测结果如图2。
图例说明如下：
每个数值来自三个平行实验平均±SD(n＝3)；
各组数据间不同字母表示差异显著(p<0.05)；
与对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
实施例31的结果表明
本发明提供的人参皂苷衍生物与模型组细胞相比，细胞存活率无下降趋势，由此可见，人参皂苷衍生物在浓度为20μM时无细胞毒性，细胞存活率基本都达到低毒以上的标准。大部分人参皂苷衍生物的细胞毒性均低于临床药物氢化可的松。化合物Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-6、Ⅱ-1、II-2、II-6、Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅳ-1、Ⅳ-2、Ⅴ-1在表现出较强的NO抑制效果的同时在20μM时也具有较低的细胞毒性。
实施例32：酶标仪检测MitoSOX实验
取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，以100μL每孔的细胞悬液铺于黑色96孔板，培养箱孵育4h后，保证细胞贴壁。control组不做处理，Model组加入等体积DMSO，HSS组(20μM)、加药组中Ⅰ-1(5μM、10μM、20μM)预保护2h，再加入LPS(1μg/mL)继续放入培养箱孵育24h/30min。取出96孔板，无菌条件下，弃上清，再用37℃预热的PBS洗2遍，100μL/遍，然后加入50μL 5μM mitoSOX探针，再放入培养箱中避光孵育15min。取出玻底皿，避光无菌条件下，弃mitoSOX探针，用37℃预热好的PBS洗2遍，100μL/遍，最后加入50μLPBS用酶标仪检测其荧光强度，激发波长540nm，发射波长570nm。
Western Blot检测NLRP3实验
取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×107/mL，以2mL每孔的细胞悬液加入6孔板中，放入培养箱孵育24h。control组不做处理，Model组加入等体积DMSO，HSS组(20μM)，加药组Ⅰ-1(5μM、10μΜ、20μM)，预保护2h，再加入LPS(1μg/mL)继续放入培养箱孵育24h，裂解细胞检测NLRP3蛋白表达量。
图例说明如下：
每个数值来自三个平行实验平均±SD(n＝3)；
各组数据间不同字母表示差异显著(p<0.05)；
与对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
实施例32的结果表明，LPS处理主要诱导了MtROS的生成。在处理0.5h和24h时，Ⅰ-1几乎可以完全抑制LPS诱导的MtROS生成，并且表现出比HSS更好的效率。这些数据表明，抑制LPS触发的氧化应激与Ⅰ-1的活性密切相关。
在本研究中，LPS处理24小时引发NLRP3蛋白的显著上调。Ⅰ-1以剂量依赖的方式显著抑制了这种上调，但HSS没有。这些结果与MtROS生成实验的结果一致。NLRP3炎性小体的激活也可能与LPS触发的NO生成密切相关，NLRP3蛋白的表达是LPS触发的RAW264.7细胞iNOS上调的必要条件。我们的数据表明Ⅰ-1主要通过抑制LPS诱导的MtROS来阻断NLRP3的上调，从而抑制NO和其他炎症因子的释放。
实施例33：血浆稳定性实验
血浆工作液配制：抽取新鲜大鼠血液4mL置于含肝素钠的试管中，冰中保存降温至4℃。5000×g离心。上清-80℃保存。
药品工作液现配：取pH 7.4的磷酸盐缓冲液20μL，加入化合物I-1存储液(10mM)80μL。
药品在血浆中的稳定性测试：血浆工作液与药品工作液混匀，立取50μL至350μL甲醇，混匀，取上清，过微孔滤膜后-80℃保存，该样品记为为时间点0。
剩余混合血浆分为六份，每份50μL。37℃环境中孵育。在0.5,1,2,4,8,24h时间点加入350μL甲醇，混匀、4℃、20min沉淀蛋白，离心取上清，过微孔滤膜后-80℃保存。
将样品使用HPLC进行检测。
结果表明，化合物Ⅰ-1在大鼠血浆中37℃孵育24h，HPLC检测显示峰面积未有明显下降，具有良好的稳定性。
实施例34：制备治疗和预防炎症性肠病、脓毒血症等有关的疾病的药物或药物组合物中的应用。
以常规方法制备下列组成的试剂
片剂
Figure BDA0004060592950000191
Figure BDA0004060592950000201
取上述配方，用常规方法制备成片剂。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的但不限于具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (10)

1.如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物，或如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物在药学上可接受的盐
Figure FDA0004060592930000011
式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ中，R为4-硝基苯基、4-腈基苯基、4-三氟甲基苯基、4-溴苯基、4-甲基苯基、3-吡啶基、苯基或环己基。
2.如权利要求1所述的人参皂苷衍生物，其特征在于所述人参皂苷衍生物为20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-24-烯-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、20(S)-达马烷-2-(4-硝基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇、20(S)-达马烷-2-(4-腈基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇或(20S,24R)-环氧达马烷-2-(4-硝基亚苄)-3β，12β，25-三醇。
3.如权利要求1所述的如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物的制备方法，其特征在于所述方法的合成路线如下式所示：
Figure FDA0004060592930000031
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)以原人参二醇(20S-PPD)、式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物或式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物在氧化剂的作用下，进行选择性氧化反应，分别制得式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物；
(2)式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物在氢氧化钾的醇溶液中与醛R-CHO进行缩合反应，分别制备得到式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物；
(3)式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物在NaBH4的醇溶液中，进行还原反应，分别制得式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，氧化剂为戴斯马丁试剂或PCC；原人参二醇、式3所示的24R-pyxinol人参皂苷衍生物或式4所示的24S-pyxinol人参皂苷衍生物与戴斯马丁试剂的物质的量之比为1：1～1.2。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，式1所示的20(S)-12β，20-二羟基-达马烷-24-烯-3-酮、式5所示的中间产物或式7所示的中间产物和醛R-CHO的物质的量之比为1：0.1～10。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的人参皂苷衍生物和NaBH4的物质的量之比为1：1～10。
8.如权利要求1所述的式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗炎类药物或抗炎类药物组合物中的应用。
9.如权利要求9所述的应用，其特征在于；式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的人参皂苷衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗和预防炎症性肠病、脓毒血症疾病的药物或药物组合物中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述人参皂苷衍生物为20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-24-烯-3-酮、20(S)-12β，20-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-24-烯-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24R)-环氧-12β，25-二羟基-2-(3-吡啶基亚甲基)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-硝基亚苄)-达马烷-3-酮、(20S,24S)-环氧-12β，25-二羟基-2-(4-腈基亚苄)-达马烷-3-酮、20(S)-达马烷-2-(4-硝基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇、20(S)-达马烷-2-(4-腈基亚苄)-24-烯-3β-12β，20-三醇或(20S,24R)-环氧达马烷-2-(4-硝基亚苄)-3β，12β，25-三醇。
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