CN116251179A - 非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其由免疫量的下述组分组成：非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白、非洲猪瘟病毒复制蛋白、非洲猪瘟病毒吸附蛋白、非洲猪瘟病毒毒力蛋白；以及该非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。本发明的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物能为猪提供良好的免疫效力，其蛋白抗原之间有协同作用，可以在蛋白总含量低的条件下，提供更好的免疫效力。

Description

非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物、制备方法及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率更可高达100％，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，2018年传入我国，带来巨大的直接和间接经济损失。该病被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。

非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，且大部分基因功能未知，病毒与宿主细胞相互作用的机制不明确，难以大规模培养，传代易变异,病毒免疫逃逸机制不清，因此常规灭活疫苗及减毒活疫苗迄今尚无实质性进展，且减毒活疫苗使用不当存在毒力返强及散毒的生物安全风险。

因此，临床上亟需非洲猪瘟疫苗，要求其具有良好的免疫效果，能有效保护猪，同时没有生物安全的风险。

发明内容

为此，本发明通过现代生物学方法，将病原的基因和蛋白进行重组表达，并对其免疫保护能力进行检验，进行亚单位疫苗的开发，有效解决目前各类疫苗免疫效果不理想的问题。

本发明提供非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由多组分蛋白抗原组成，能为猪提供良好的免疫效力。

本发明提供非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的多组分蛋白抗原之间有协同作用，可以在蛋白总含量低的条件下，提供更好的免疫效力。

本发明提供所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的应用，所述应用是指在制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。

本发明的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗采用多组分非洲猪瘟病毒蛋白抗原，所述多组分非洲猪瘟病毒蛋白抗原共同施用，协同增效，免疫效果好，有效解决了目前非洲猪瘟病毒疫苗面临的免疫原性差的问题；所述疫苗组合物可通过基因工程手段进行大量的表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产，无生物安全风险。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

术语“非洲猪瘟病毒”是指非洲猪瘟病毒(ASFV,African swine fever virus)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)下仅有的种，具有传染性和极高的致病性，ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定，急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。直至2020年仍未有针对ASFV的特效疫苗或是抗病毒药物可以有效的在疫情爆发时及时控制病毒的传播。

术语“非洲猪瘟病毒p72蛋白”是指产生于病毒感染晚期，由ORF B646L基因编码，为非洲猪瘟病毒重要的抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要。

术语“非洲猪瘟病毒p30蛋白”是指非洲猪瘟病毒表达的早期膜蛋白，由ORFCP204L基因编码，通常在感染后2-4小时产生，在整个感染期间持续表达，与病毒入侵宿主细胞有关，是重要的结构蛋白。

术语“非洲猪瘟病毒p54蛋白”是指非洲猪瘟病毒表达的早期膜蛋白，由OR FE183L基因编码，含跨膜结构域，定位于内质网衍生的内膜前体，在病毒吸附易感细胞和入侵过程中发挥重要作用，是重要的结构蛋白。

术语“非洲猪瘟病毒p34蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码一种名为p220的多聚蛋白，该p220多聚蛋白存在于成熟病毒粒子的核衣壳中，占病毒蛋白总量的30％左右，在病毒组装和病毒感染中发挥着重要的作用。P220多聚蛋白在蛋白酶的作用下可有序的裂解为p150、p34、p37和p14。p150、p34、p37和p14在病毒衣壳的组装过程中起着至关重要的作用，其中，p34属于p220中重要的结构蛋白，对病毒内核蛋白的包装起着重要的作用。

术语“非洲猪瘟病毒p17蛋白”是指非洲猪瘟病毒表达的晚期膜蛋白，由ORF D117L基因编码，位于病毒内膜的跨膜蛋白。

术语“非洲猪瘟病毒K196R蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种胸苷激酶，于非洲猪瘟病毒感染早期表达，为DNA复制提供能量。

术语“非洲猪瘟病毒O174L蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种DNA聚合酶X，参与碱基修复。

术语“非洲猪瘟病毒NP419L蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种ATP依赖性DNA连接酶，参与碱基修复。

术语“非洲猪瘟病毒p10蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种DNA结合蛋白，涉及病毒吸附。

术语“非洲猪瘟病毒p11.5蛋白”是指在非洲猪瘟病毒复制的晚期表达，由ORFA137R基因编码，涉及病毒吸附。

术语“非洲猪瘟病毒DP96R蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种能抑制Ⅰ型IFN表达和NF-κB活化的蛋白，又称“pDP96R蛋白”。

术语“非洲猪瘟病毒DP71L蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码的一种能抑制cGAS+MITA或MITA诱导的IFNβ活性的蛋白。

术语“简并序列”是指同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象，这样的序列就叫简并序列。

术语“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有非洲猪瘟病毒蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对非洲猪瘟的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除非洲猪瘟病毒蛋白抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

术语“冻干保护剂”是指是除赋形剂外，给予药物有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。

术语“剂型”是指药物制剂的形态。也指根据药物性质，以及治病和处方的要求制成的药剂(成品药)。合适的剂型是为了发挥药物的最佳疗效，减少毒副作用，以及便于使用、贮存和运输。

术语“注射剂(injection)”是指药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，可以是注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)；尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(PEG)等。

术语“注射用粉末”是指在无菌环境下将药液冷冻，将原料药“掺”在某些辅料或溶在某些溶媒中，经过一定的加工处理制成不同形式的制剂。

术语“预防”在涉及非洲猪瘟病毒感染时是指抑制非洲猪瘟病毒的复制、抑制非洲猪瘟病毒的传播或防止非洲猪瘟病毒在其宿主体内定居，以及减轻非洲猪瘟病毒感染的疾病或病症的症状。

发明详述

本发明提供一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白、非洲猪瘟病毒复制蛋白、非洲猪瘟病毒吸附蛋白、非洲猪瘟病毒毒力蛋白；其中，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34、p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R、O174L、NP419L蛋白中的至少一种，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10、p11.5蛋白中的至少一种，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R、DP71L蛋白中的至少一种；以及所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R蛋白或O174L蛋白或NP419L蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10蛋白或p11.5蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R蛋白或DP71L蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白p34蛋白和p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白K196R蛋白，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白p10蛋白，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白DP71L蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白p34蛋白和p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白O174L蛋白，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白p11.5蛋白，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白DP71L蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白p34蛋白和p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白NP419L蛋白，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白p10蛋白，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白DP96R蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白、和p54蛋白，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白p34蛋白和p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白K196R蛋白，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白p11.5蛋白，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白DP96R蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白为SEQ ID NO.1或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白为SEQ ID NO.2或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白为SEQ ID NO.3或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白为SEQ ID NO.4或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白为SEQ ID NO.5或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白为SEQ ID NO.6或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白为SEQ ID NO.7或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白为SEQ ID NO.8或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白为SEQID NO.9或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白为SEQ ID NO.10或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白为SEQ ID NO.11或其简并序列编码；以及所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白为SEQ ID NO.12或其简并序列编码。

根据较佳的实施方式，本领域技术人员可以根据常规技术知识，选择编码所述非洲猪瘟病毒p72、p30、p54、p34、p17、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白的其他的简并序列。其他简并序列可以根据具体表达体系的偏爱密码子选择。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p30、p54、p34、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白为大肠杆菌表达系统表达，其编码序列根据大肠杆菌表达系统的偏爱密码子选择。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白为sf9昆虫细胞表达系统表达，其编码序列根据sf9昆虫细胞表达系统的偏爱密码子选择。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p17蛋白为CHO细胞表达系统表达，其编码序列根据CHO细胞表达系统的偏爱密码子选择。

根据较佳的实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白为SEQ ID NO.1编码；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白为SEQ ID NO.2编码；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白为SEQ ID NO.3编码；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白为SEQ ID NO.4编码；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白为SEQ ID NO.5编码；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白为SEQ IDNO.6编码；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白为SEQ ID NO.7编码；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白为SEQ ID NO.8编码；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白为SEQ ID NO.9编码；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白为SEQ ID NO.10编码；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白为SEQ ID NO.11编码；以及所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白为SEQ ID NO.12编码。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为≥25μg/ml。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml或175μg/ml。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、p34蛋白、p17蛋白、K196R蛋白、O174L蛋白、NP419L蛋白、p10蛋白、p11.5蛋白、DP96R蛋白和DP71L蛋白均选择较低含量，即便非洲猪瘟病毒蛋白抗原总用量较单一组分抗原用量降低，也能获得更高的抗体滴度，保证更好的免疫效果。

根据较佳的实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为25～175μg/ml。

根据较佳的实施方式，本发明所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为75～125μg/ml。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物由以下含量的组分组成：含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p72蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p54蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p34蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p17蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p10蛋白，含量为25μg/ml的所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物由以下含量的组分组成：含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p72蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p30蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p54蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p34蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p17蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白，含量为75μg/ml的所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物由以下含量的组分组成：含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p72蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p30蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p54蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p34蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p17蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p10蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物由以下含量的组分组成：含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p72蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p30蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p54蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p34蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p17蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白，含量为125μg/ml的所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物由以下含量的组分组成：含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p72蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p30蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p54蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p34蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p17蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白，含量为175μg/ml的所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白。

根据较佳的实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中，所述非洲猪瘟病毒蛋白抗原总含量为200-1400μg/ml。

非洲猪瘟病毒蛋白总含量可选自200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml、600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml、800μg/ml、850μg/ml、900μg/ml、950μg/ml、1000μg/ml、1050μg/ml、1100μg/ml、1150μg/ml、1200μg/ml、1250μg/ml、1300μg/ml、1350μg/ml、1400μg/ml。

根据较佳的实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。

根据较佳的实施方式，所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂，所述佐剂含量为50％V/V。

根据较佳的实施方式，所述药学上可接受的载体包括冻干保护剂，所述冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸。

根据较佳的实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的剂型选自溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂、或缓控释植入剂。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的剂型为溶液型注射剂、混悬型注射剂、或注射用粉末。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药、或透皮给药。

根据更佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的给药方式为皮下注射给药。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的剂型为溶液型注射剂、或混悬型注射剂。

本发明提供了所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的应用，其中，所述应用是指在制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。

根据较佳的实施方式，所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物能发挥协同增效的免疫保护作用，对猪有更好的免疫效果。

本发明还提供一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：

步骤(1)合成所述非洲猪瘟病毒蛋白基因，克隆、重组至克隆载体；

步骤(2)将扩增步骤(1)所述克隆载体上的所述非洲猪瘟病毒蛋白基因、以及表达载体，酶切，重组得到包含所述非洲猪瘟病毒蛋白基因的表达载体；

步骤(3)将所述包含非洲猪瘟病毒蛋白基因的表达载体导入宿主，表达所述非洲猪瘟病毒蛋白，并对所述表达的非洲猪瘟病毒蛋白进行鉴定以获得非洲猪瘟病毒蛋白；

步骤(4)将获得的非洲猪瘟病毒蛋白与药学上可接受的载体混匀，即得非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的非洲猪瘟病毒蛋白可通过原核表达系统来制备，也可通过真核表达系统、细胞表达系统或化学合成方法来制备。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p30、p54、p34、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白基因的表达载体为大肠杆菌表达系统克隆载体。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白基因的表达载体为sf9昆虫细胞表达系统表达载体。

根据较佳的实施方式，所述非洲猪瘟病毒p17蛋白基因的表达载体为CHO细胞表达系统表达载体。

本发明还提供一种含有所述非洲猪瘟病毒蛋白的基因序列的表达载体。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1非洲猪瘟病毒p30、p54、p34、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白的原核表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应编码序列表SEQ ID NO.13所示表达载体的核苷酸序列，命名为pNVC1载体。

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，相应编码p30、p54、p34蛋白；SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，相应编码K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白，并将合成的核苷酸克隆到pNVC1载体上，命名为重组质粒pNVC1-p30、pNVC1-p54、pNVC1-p34、pNVC1-K196R、pNVC1-O174L、pNVC1-NP419L、pNVC1-p10、pNVC1-p11.5、pNVC1-DP96R、pNVC1-DP71L。

分别将上述重组质粒pNVC1-p30、pNVC1-p54、pNVC1-p34、pNVC1-K196R、pNVC1-O174L、pNVC1-NP419L、pNVC1-p10、pNVC1-p11.5、pNVC1-DP96R、pNVC1-DP71L转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株，接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，制备发酵用种子液。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将3L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导培养12小时。发酵密度大约为40左右(OD600)停止培养，离心收集菌体。

重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体3次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过12％SDS-PAGE电泳检测。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

实施例2非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,相应编码p72蛋白，并将合成的核苷酸克隆到pFB载体上，命名为重组质粒pFB-p72。

将上述重组质粒pFB-p72转化到DH10Bac感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑取白色单一菌落至含卡那、四环素、庆大霉素三种抗性的液体LB培养基中摇菌过夜，按Bac-to-Bac操作说明上的方法提取重组Bacmid，命名为Bac-p72。

参考CellfectinⅡReagent转染试剂盒操作说明，将重组Bacmid Bac-p72转染sf9昆虫细胞，置于27℃恒温培养箱培养大约72h，细胞病变明显后，收获细胞上清，为P1代重组杆状病毒，标记为rBac-p72。将P1代重组杆状病毒按1:20～1:40的体积比加入sf9的细胞摇瓶中，27℃继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒。取P2代重组杆状病毒按照1:100的体积比接种1L体积sf9细胞，接种48h-72h收获细胞，1000×g离心10min收集感染细胞。

用细胞裂解液(25mM NaHCO₃，pH 8.3)裂解细胞沉淀30分钟，10000×g，4℃离心10min获得裂解上清，通过Western Blot确认目的蛋白得到表达。用镍柱亲和层析进行蛋白粗纯，随后进行分子筛纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

实施例3非洲猪瘟病毒p17蛋白的CHO细胞表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，相应编码p17蛋白，将合成的核苷酸克隆到pCHO1.0载体上，命名为重组质粒pCHO-p17。

按无内毒素中提试剂盒说明书提取质粒pCHO-p17，用Nru I酶对其进行线性化处理。处理后的质粒用Free Style MAX reagent共转染CHO细胞，48h后取细胞悬液离心收集后在两个150cm2方瓶含有1:100稀释的抗结团剂的CHO完全培养基中重悬细胞，细胞在2个含有不同浓度的MTX和嘌呤霉素的CD Forti完全培养基继续培养，观察细胞生长状态，在细胞开始显示复苏迹象时，将其转移至125ml摇瓶中，添加适量的嘌呤霉素和MTX,维持选择压力，将筛选获得的2个细胞池命名为A、B。接着将细胞池A、B分别在2个含有不同浓度的MTX和嘌呤霉素的CD Forti完全培养基继续培养，进行第二轮加压筛选，待新的抗性细胞克隆生长起来后获得4个细胞池，分别命名为A1、A2、B1、B2，用流加培养的方法进行为期10天的培养，点杂交比较不同细胞池的表达水平，选择产率高的细胞池进行有限稀释克隆。

取两阶段筛选获得的产率较高的2个细胞池开展连续稀释接种至96孔板中(0.5个细胞/孔)，每个细胞池铺20块96孔板，共铺40块96孔板。接种12天后待96孔板中细胞形成单克隆集落时，从形成单集落的524个孔取样，点杂交鉴定蛋白表达情况，选取100个克隆。将100个克隆从96孔板扩大培养至6孔板，通过点杂交鉴定每个6孔板细胞的表达产量，从中选择出效率最高的20个克隆开展流加补料培养，收取培养第12天的样品鉴定不同克隆的表达量，通过SDS-PAGE对收获的样品进行表达产量鉴定，最终选择5个高产效率克隆进行第2轮有限稀释。

对第1轮有限稀释筛选获得的5个克隆开展第2轮有限稀释克隆分离，连续稀释接种至96孔板中(0.5个细胞/孔)，每个克隆铺10块96孔板，共铺50块板。接种12天后待96孔板中细胞形成单克隆集落时，从形成单集落的584个孔取样，点杂交鉴定蛋白表达情况，选取100个克隆。将100个克隆从96孔板扩大培养至6孔板，通过点杂交鉴定每个6孔板细胞的表达产量，从中选择出效率最高的20个克隆开展流加补料培养，鉴定不同克隆的表达量，通过SDS-PAGE对收获的样品进行表达产量鉴定，最终筛选出5个高产效率克隆。

复苏经两轮有限稀释克隆分离筛选获得的5个高产效率克隆，于125-ml培养瓶中进行传代培养，连续传代至30代。根据每天测定的活细胞数及细胞活率，绘制每个克隆30代的生长曲线，结果表明5株细胞的增殖特性均较稳定。分别于第10代、20代、30代开展流加补料培养，对10d收获样品进行SDS-PAGE、Western Blot比较目的蛋白产量，从5个克隆中筛选获得1个增殖特性稳定，产率最高的克隆，命名为rCHO-p17。

将构建筛选的rCHO-p17细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×10⁵个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。

培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白非洲猪瘟病毒p17蛋白得到表达。

实施例4非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备

将实施例1制备得到的p30、p54、p34、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白，实施例2制备得到的p72蛋白，实施例3制备得到的p17蛋白加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含有非洲猪瘟病毒多组分蛋白抗原的亚单位疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表1。

表1本发明非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物成分配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3	疫苗4	疫苗5
						p72(μg/ml)	25	75	125	125	175
p30(μg/ml)	25	75	125	125	175
						p54(μg/ml)	25	75	125	125	175
p34(μg/ml)	25	75	125	125	175
						p17(μg/ml)	25	75	125	125	175
K196R(μg/ml)	25	-	-	125	175
						O174L(μg/ml)	-	75	-	-	-
NP419L(μg/ml)	-	-	125	-	-
						p10(μg/ml)	25	-	125	-	-
P11.5(μg/ml)	-	75	-	125	175
						DP96R(μg/ml)	-	-	125	125	175
DP71L(μg/ml)	25	75	-	-	-
						双相佐剂(V/V％)	50％	50％	50％	50％	50％

实施例5非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性试验

取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪30头，随机分为6组，每组5头。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组免疫疫苗3，第4组免疫疫苗4，第5组免疫疫苗5，第6组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射4ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，两次免疫之间间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。

用非洲猪瘟全病毒灭活抗原(购自欧洲联盟非洲猪瘟参考实验室(EUROPEANUNION REFERENCE LABORATORY FOR AFRICAN SWINE FEVER，URL-ASF))包被酶标板，4℃包被过夜；弃包被液，用洗涤液洗涤后；加入封闭液(称取蔗糖50g，加入200mL新生牛血清、1mLProclin300，补加PBS(0.01mol/L，pH值7.4)定容至1000mL)，2-8℃封闭16-24小时，弃去封闭液后干燥，密封后于2-8℃保存备用。

样品稀释液：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600mL、Proclin300 1mL、新生牛血清200mL、PUR染料0.028g，完全溶解后用纯化水定容至1000mL，混匀后0.22μm过滤后无菌分装，2-8℃保存。

洗涤液：取氯化钠160g、磷酸氢二钠58g、磷酸二氢钾4.8g、氯化钾4g、超纯水800mL、吐温20 10mL，完全溶解后用纯化水定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤，无菌分装。使用时用蒸馏水稀释20倍。

二抗：酶标的羊抗猪二抗，使用时进行1:2000稀释。

显色液：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于纯化水，定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色剂A。取四甲基联苯二胺(TMB)0.2g、无水乙醇10mL，溶于纯化水定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色剂B。

终止液：2M H₂SO₄。

检测时在酶标反应孔中先加入90μl样品稀释液，然后加入10μl待检血清，阴性、阳性对照，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，羊抗猪酶标抗体100μl/孔加入反应板，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，加入显色剂A、显色剂B各50μl/孔，37℃显色10分钟，加终止液50μl/孔终止反应，用酶标仪读取吸光度OD_450nm，根据判定结果进行判定。

判定标准：OD值≥0.19阳性，OD值＜0.19为阴性。

检测结果见表2。

表2非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果

结果显示，非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物均具有良好的免疫原性，抗体检测均为阳性。表明，本发明的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗采用多组分非洲猪瘟病毒蛋白抗原，免疫效果好。

实施例6非洲猪瘟病毒蛋白免疫原性验证试验

1.非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物的制备

将实施例1制备得到的p30、p54、p34、K196R、O174L、NP419L、p10、p11.5、DP96R、DP71L蛋白，实施例2制备得到的p72蛋白，实施例3制备得到的p17蛋白分别加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含有非洲猪瘟病毒单组分蛋白抗原的亚单位疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表3、表4、表5。

表3非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物成分配比1

表4非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物成分配比2

组分	疫苗10	疫苗11	疫苗12	疫苗13
					O174L(μg/ml)	1000	-	-	-
NP419L(μg/ml)	-	1000	-	-
					p10(μg/ml)	-	-	1000	-
p11.5(μg/ml)	-	-	-	1000
					双相佐剂(V/V％)	50％	50％	50％	50％

表5非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物成分配比3

组分	疫苗14	疫苗15	疫苗16	疫苗17
					DP96R(μg/ml)	1000	-	-	-
DP71L(μg/ml)	-	1000	-	-
					p72(μg/ml)	-	-	1000	-
p17(μg/ml)	-	-	-	1000
					双相佐剂(V/V％)	50％	50％	50％	50％

2.非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验

取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪65头，随机分为13组，每组5头。第7组-第18组分别免疫疫苗6-疫苗17，第19组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射4ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。

参照实施例5非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒制备方法，分别用非洲猪瘟病毒p30蛋白、p54蛋白、p34蛋白、K196R蛋白、O174L蛋白、NP419L蛋白、p10蛋白、p11.5蛋白、DP96R蛋白、DP71L0蛋白、p72蛋白、p17蛋白包被酶标板，制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。

检测结果见表6～17。

表6非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果1

表7非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果2

表8非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果3

表9非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果4

表10非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果5

表11非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果6

表12非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果7

表13非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果8

表14非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果9

表15非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果10

表16非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果11

表17非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果12

结果显示，非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物均能引起不同程度的免疫反应，抗体检测均为阳性。表明，本发明的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗采用的非洲猪瘟病毒蛋白抗原，均具有免疫原性，以此制备的非洲猪瘟病毒多组分亚单位疫苗免疫效果更好，抗体水平更高。

比较表2、表6～17中检测的OD值，本发明非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物当抗原总用量(即免疫剂量4ml的本发明非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中各抗原蛋白含量总和)仅为0.8mg(疫苗1)或2.4mg(疫苗2)或4.0mg(疫苗3)或4.0mg(疫苗4)，其检测的OD_450nm值分别为2.468、2.862、3.072和3.084，而表6～17中检测的非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物抗原用量(即免疫剂量4ml的非洲猪瘟病毒单组分亚单位疫苗组合物中抗原蛋白含量)为4mg，较疫苗1或疫苗2或疫苗3或疫苗4抗原总用量更高或相当，其检测的OD_450nm值均远小于疫苗1或疫苗2或疫苗3或疫苗4免疫后血清中抗体OD_450nm值，说明本发明非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物中各抗原组分之间产生了协同增效作用，能产生更强的免疫反应，抗体滴度更高。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1965

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 1

atggcttctg gcggcgcctt ctgcctgatc gccaacgacg gtaaagctga caagatcatc 60

ctggcccaag acctgctgaa ctcacgcatc tccaacatca agaacgtcaa caagtcctac 120

ggcaagcctg acccagagcc tacattgtcc cagatcgagg aaacccacct cgtgcacttc 180

aacgctcact tcaagcccta cgttcctgtt ggcttcgagt acaacaaggt gcgccctcac 240

accggaaccc caacactggg caacaagctg actttcggca tccctcaata cggtgacttc 300

ttccacgaca tggtgggtca ccacatcctg ggcgcctgtc actccagctg gcaggacgcc 360

ccaatccagg gcacaagcca gatgggcgct cacggccagc tccagacttt ccctcgtaac 420

ggctacgact gggacaacca gacacccctg gagggagctg tgtacaccct cgtggaccca 480

ttcggacgcc caatcgtgcc tggaactaag aacgcctacc gtaacctcgt ctactactgc 540

gaataccctg gcgaacgtct ctacgaaaac gtgcgcttcg acgttaacgg taacagcctc 600

gacgaatact cttccgacgt gacaacactg gttaggaagt tctgcatccc cggagacaag 660

atgactggtt acaagcacct ggttggtcag gaagtgagcg tggaaggcac ctccggacca 720

ctcctctgca acatccacga cctgcacaag ccccaccaga gcaagcccat cctgactgac 780

gagaacgaca cacagcgcac ttgcagccac accaacccta agttcctctc ccagcacttc 840

ccagaaaact cccacaacat ccaaacagcc ggcaagcagg acatcacccc tatcaccgac 900

gccacctacc tcgacatccg ccgtaacgtt cactactcct gtaacggacc acaaacacct 960

aagtactacc aaccaccact ggctctctgg atcaagttgc gtttctggtt caacgagaac 1020

gttaacctcg ccatcccctc tgtgagcatc cccttcggcg aacgcttcat cacaatcaag 1080

ctcgcctcac agaaggacct ggttaacgag ttccctggcc tcttcgtgag gcagtcccgc 1140

ttcatcgctg gtcgccccag caggcgcaac atccgtttca agccttggtt catccccggc 1200

gtcatcaacg aaatcagcct gactaacaac gaactctaca tcaacaacct gttcgtgacc 1260

cctgagatcc acaacctgtt cgtgaagcgt gttaggttca gtctgatcag ggtccacaag 1320

actcaagtga cccacaccaa taacaaccac cacgacgaga agctgatgag cgctctgaag 1380

tggcccatcg aatacatgtt catcggtctg aagcccacct ggaacatctc cgaccagaac 1440

cctcaccagc accgtgattg gcacaagttc ggccacgtgg tcaacgctat catgcagcct 1500

actcaccacg ctgagatcag cttccaggac cgtgacacag ccctccctga cgcttgttct 1560

agcatctctg atatctctcc agtcacttac ccaatcaccc tgcctatcat caagaacatc 1620

tcagtcaccg cccacggtat taacctgatc gacaagttcc cttctaagtt ctgttcatcc 1680

tacatcccat tccactacgg aggtaacgcc atcaagacac ctgacgaccc tggtgctatg 1740

atgatcacct tcgctctcaa gccacgcgag gaataccagc cctccggtca catcaacgtt 1800

agccgcgctc gtgagttcta catcagctgg gacaccgact acgtgggtag catcactacc 1860

gctgacctcg tggtgtctgc ttccgccatc aacttcctgc tgctccagaa cggtagcgcc 1920

gtgctccgct actcaaccca ccaccaccac catcaccacc actaa 1965

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 2

atgattctgc atgttctgtt tgaagaagaa accgaaagca gtgcaagcag tgaaaatatt 60

catgaaaaga atgacaacga gaccaatgaa tgtaccagca gctttgaaac cctgtttgaa 120

caggaaccga gcagcgaagt gccgaaagat agcaaactgt atatgctggc ccagaaaacc 180

gttcagcata ttgaacagta tggcaaagca ccggatttta ataaggttat tcgtgcccat 240

aatttcattc agaccatcta tggtaccccg ctgaaagaag aagaaaaaga agttgttcgt 300

ctgatggtta ttaagctgct gaaaaagatt agtttcttcc tgacctatat ctaa 354

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 3

agtagtcgca aaaagaaagc agccgcaatt gaagaagaag atattcagtt tatcaacccg 60

tatcaggatc agcagtgggt tgaagtgacc ccgcagccgg gcaccagtaa accggcaggt 120

gccaccaccg caagtgtggg taaaccggtt accggtcgcc cggcaaccaa tcgtccggca 180

accaacaaac cggtgaccga taatccggtg accgaccgtc tggttatggc caccggtggc 240

ccggccgctg cacctgcagc agcatcagca ccggcacatc cggcagaacc gtataccacc 300

gtgaccaccc agaataccgc cagccagacc atgagtgcca ttgaaaatct gcgccagcgt 360

aatacctata cccataaaga tctggaaaat agcctgtaa 399

<210> 4

<211> 975

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 4

ggtgacaaaa acccggttca gcacatcaaa gactaccaca tcgactctgt ttcttctaaa 60

gctaaactgc gtatcatcga aggtatcatc cgtgctatcg ctaaaatcgg tttcaaagtt 120

gacaccaaac agccgatcga agacatcctg aaagacatca aaaaacagct gccggacccg 180

cgtgctggtt ctaccttcgt taaaaacgct gaaaaacagg aaaccgtttg caaaatgatc 240

gctgacgcta tcaaccagga attcatcgac ctgggtcagg acaaactgat cgacaccacc 300

gaaggtgctg cttctatctg ccgtcagatc gttctgtaca tcaactctct gacccacggt 360

ctgcgtgctg aatacctgga cgttcacggt tctatcgaaa acaccctgga aaacatcaaa 420

ctgctgaacg acgctatcaa acagctgcac gaacgtatgg ttaccgaagt taccaaagct 480

gctccgaacg aagaagttat caacgctgtt accatgatcg aagctgttta ccgtcgtctg 540

ctgaacgaac agaacctgca gatcaacatc ctgaccaact tcatcgacaa catcctgacc 600

ccgacccaga aagaactgga caaactgcag accgacgaag ttgacatcat caaactgctg 660

aacgacacca actctgttct gggtaccaaa aacttcggta aagttctgtc ttacaccctg 720

tgcaacctgg gtatcgctgc ttctgttgct aacaaaatca acaaagctct gcagaaagtt 780

ggtctgaaag ttgaacagta cctgcagtct aaaaactggg ctgaattcga caaagaactg 840

gacctgaaac gtttctctgg tctggtttct gctgaaaaca tcgctgaatt cgaaaaagct 900

gttaacctgc tgcgtcagac cttcaacgaa cgtcacaaaa tcctggaaaa ctcttgcgct 960

aaaaaaggtg gttaa 975

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 5

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cagtccaccc agggcctcct ggctcacacc atcgccaagt atcctggcac cggcggcggc 120

ggatccggag gaggaggatc taacagaacc atcgattgca agtcctccat ccctaagcct 180

cctccatcct actacgtcca acaacctgag cctcaccacc actttcctgt gttcttccgc 240

aagagaaaga actccacctc cctgcagagc cacatcccct ccgacgagca gctggccgag 300

ctggcccact cctga 315

<210> 6

<211> 591

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 6

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gctggtaaaa ccaccttcct gatccactgc atctacatgc tggaacgtct ggaaaaaaaa 120

gttgttttca tcaaatctac caaaaacacc cgtgacaaaa ccatcaaaac ccactctggt 180

atccagctgc gtccgaaaca gtgcaaaatc atcgaatcta cccagctgtc tgacgttggt 240

tctctgaccg acatccacgc tgttgttgtt gacgaagctc acttcttcga cgacctgatc 300

acctgccgta cctgggctga agaagaaaaa atcatcatcc tggctggtct gaacgcttct 360

ttcgaacaga aaatgttccc gccgatcgtt cgtatcttcc cgtactgctc ttgggttaaa 420

tacatcggtc gtacctgcat gaaatgcaac cagcacaacg cttgcttcaa cgttcgtaaa 480

aacgctgaca aaaccctgat cctggctggt ggttctgaac tgtacgttac ctgctgcaac 540

aactgcctga aaaacacctt catcaaacag ctgcagccga tcaaatacta a 591

<210> 7

<211> 525

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 7

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gaatacaacg gtcagctgat caaaatcctg tctaaaaaca tcgttgctgt tggttctctg 120

cgtcgtgaag aaaaaatgct gaacgacgtt gacctgctga tcatcgttcc ggaaaaaaaa 180

ctgctgaaac acgttctgcc gaacatccgt atcaaagacc tgtctttctc tgttaaagtt 240

tgcggtgaac gtaaatgcgt tctgttcatc gaatggaaaa aaaacaccta ccagctggac 300

ctgttcaccg ctctggctga agaaaaaccg tacgctgttc tgcacttcac cggtccggtt 360

tcttacctga tccgtatccg tgctgctctg aaaaaaaaaa actacaaact gaaccagtac 420

ggtctgttca aaaaccagac cctggttccg ctgaaaatca ccaccgaaaa agaactgatc 480

aaagaactgg gtttcaccta ccgtatcccg aaaaaacgtc tgtaa 525

<210> 8

<211> 1260

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 8

atgctgaacc agttcccggg tcagtactct aacaacatct tctgcttccc gccgatcgaa 60

tctgaaacca aatctggtaa aaaagcttct tggatcatct gcgttcaggt tgttcagcac 120

aacaccatca tcccgatcac cgacgaaatg ttctctaccg acgttaaaga cgctgttgct 180

gaaatcttca ccaaattctt cgttgaagaa ggtgctgttc gtatctctaa aatgacccgt 240

gttaccgaag gtaaaaacct gggtaaaaaa aacgctacca ccgttgttca ccaggctttc 300

aaagacgctc tgtctaaata caaccgtcac gctcgtcaga aacgtggtgc tcacaccaac 360

cgtggtatca tcccgccgat gctggttaaa tacttcaaca tcatcccgaa aaccttcttc 420

gaagaagaaa ccgacccgat cgttcagcgt aaacgtaacg gtgttcgtgc tgttgcttgc 480

cagcagggtg acggttctat cctgctgtac tctcgtacca aaaaagaatt cctgggtctg 540

gacaacatca aaaaagaact gaaacagctg tacctgttca tcgacgttcg tgtttacctg 600

gacggtgaac tgtacctgca ccgtaaaccg ctgcagtgga tcgctggtca ggctaacgct 660

aaaaccgact cttctgaact gcacttctac gttttcgact gcttctggtc tgaccagctg 720

cagatgccgt ctaacaaacg tcagcagctg ctgaccaaca tcttcaaaca gaaagaagac 780

ctgaccttca tccaccaggt tgaaaacttc tctgttaaaa acgttgacga agctctgcgt 840

ctgaaagctc agttcatcaa agaaggttac gaaggtgcta tcgttcgtaa cgctaacggt 900

ccgtacgaac cgggttacaa caactaccac tctgctcacc tggctaaact gaaaccgctg 960

ctggacgctg aattcatcct ggttgactac acccagggta aaaaaggtaa agacctgggt 1020

gctatcctgt gggtttgcga actgccgaac aaaaaacgtt tcgttgttac cccgaaacac 1080

ctgacctacg ctgaccgtta cgctctgttc cagaaactga ccccggctct gttcaaaaaa 1140

cacctgtacg gtaaagaact gaccgttgaa tacgctgaac tgtctccgaa aaccggtatc 1200

ccgctgcagg ctcgtgctgt tggtttccgt gaaccgatct ctgttctgga aatcatctaa 1260

<210> 9

<211> 237

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 9

atgccgacca aagctggtac caaatctacc gctaacaaaa aaaccaccaa aggttcttct 60

aaatctggtt cttctcgtgg tcacaccggt aaaacccacg cttcttcttc tatgcactct 120

ggtatgctgt acaaagacat ggttaacatc gctcgttctc gtggtatccc gatctaccag 180

aacggttctc gtctgaccaa atctgaactg gaaaaaaaaa tcaaacgttc taaataa 237

<210> 10

<211> 414

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 10

atggaagctg ttctgaccaa actggaccag gaagaaaaaa aagctctgca gaacttccac 60

cgttgcgctt gggaagaaac caaaaacatc atcaacgact tcctggaaat cccggaagaa 120

cgttgcacct acaaattcaa ctcttacacc aaaaaaatgg aactgctgtt caccccggaa 180

ttccacaccg cttggcacga agttccggaa tgccgtgaat tcatcctgaa cttcctgcgt 240

ctgatctctg gtcaccgtgt tgttctgaaa ggtccgacct tcgttttcac caaagaaatc 300

aaaaacctgg gtatcccgtc taccatcaac gttgacttcc aggctaacat cgaaaacatg 360

gacgacctgc agaaaggtaa cctgatcggt aaaatgaaca tcaaagaagg ttaa 414

<210> 11

<211> 291

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 11

atgtctaccc acgactgctc tctgaaagaa aaaccggttg acatgaacga catctctgaa 60

aaatctgttg ttgttgacaa cgctccggaa aaaccggctg gtgctaacca catcccggaa 120

aaatctgctc gtgaaatgac ctcttctgaa tggatcgctg aatactggaa aggtatcaaa 180

cgtggtaacg acgttccgtg ctgctgcccg cgtaaaatga cctctgctga caaaaaattc 240

tctgttttcg gtaaaggttc tctgatgcgt tctatccaga aaaacaacta a 291

<210> 12

<211> 213

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 12

atgggtcgtc gtcgtaaaaa acgtaccaac gacgctaaac acgttcactt cgctaccgct 60

gttgaagttt gggaagctga cgacatcgaa cgtaaaggtc cgtgggaaca ggttgctgtt 120

gaccgtttcc gtttccagcg tcgtatcgct tctgttgaag aactgctgtc tgctgttctg 180

ctgcgtcaga aaaaactgct ggaacagcag taa 213

<210> 13

<211> 5369

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（E.coli）

<400> 13

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 2160

caccgcatac aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 2220

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 2280

aatagcacgt gctaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 2340

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 2400

tagaaaagat caaaggatct acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg 2460

ctggcctttt gctcacatgt ctcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa cgttactccc acaggtgagc 2820

gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggctcgtt 2880

tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg 2940

gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggcccgcg 3000

ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcgtgtgc 3060

gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg gggggctgcg aggggaacaa 3120

aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg 3180

gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 3240

cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 3300

tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 3360

gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc tggccaatgc cctggctcac 3420

aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 3480

gagcatctga cttctggcta taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca 5220

ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 5280

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 5340

tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5369

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的蛋白抗原由免疫量的下述组分组成：

非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白、非洲猪瘟病毒复制蛋白、非洲猪瘟病毒吸附蛋白、非洲猪瘟病毒毒力蛋白；

其中，所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白、p17蛋白，所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R蛋白、O174L蛋白、NP419L蛋白中的至少一种，所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10蛋白、p11.5蛋白中的至少一种，所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R蛋白、DP71L蛋白中的至少一种；以及

所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R蛋白或O174L蛋白或NP419L蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10蛋白或p11.5蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R蛋白或DP71L蛋白。

3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP71L蛋白。

4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为O174L蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p11.5蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP71L蛋白。

5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为NP419L蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p10蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R蛋白。

6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物含有非洲猪瘟病毒p72蛋白、p30蛋白和p54蛋白；所述非洲猪瘟病毒核衣壳组装蛋白为p34蛋白和p17蛋白；所述非洲猪瘟病毒复制蛋白为K196R蛋白；所述非洲猪瘟病毒吸附蛋白为p11.5蛋白；所述非洲猪瘟病毒毒力蛋白为DP96R蛋白。

7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白为SEQ ID NO.1或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白为SEQ ID NO.2或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白为SEQ ID NO.3或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白为SEQ ID NO.4或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白为SEQ IDNO.5或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白为SEQ ID NO.6或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白为SEQ ID NO.7或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白为SEQ ID NO.8或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白为SEQ ID NO.9或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白为SEQ ID NO.10或其简并序列编码；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白为SEQ ID NO.11或其简并序列编码；以及所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白为SEQ ID NO.12或其简并序列编码。

8.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为≥25μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为≥25μg/ml；

优选地，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为25～175μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为25～175μg/ml；

进一步优选地，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p30蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p54蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p34蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p17蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒K196R蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒O174L蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒NP419L蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p10蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒p11.5蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白含量为75～125μg/ml；所述非洲猪瘟病毒DP71L蛋白含量为75～125μg/ml。

9.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、MontanideISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100；

所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V；或

所述药学上可接受的载体包括冻干保护剂，所述冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸。

10.根据权利要求1～9任一项所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的应用，其中，所述应用是指在制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。