CN116693630A

CN116693630A - 非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白及其应用和产品

Info

Publication number: CN116693630A
Application number: CN202210177773.1A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 王孟月; 张许科
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-05

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，提供非洲猪瘟病毒p34‑p14亚单位蛋白及其应用和产品。非洲猪瘟病毒p34‑p14亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该蛋白作为抗原，能够为猪提供良好的免疫效力，在总蛋白含量较低的条件下可以提供更好的免疫效力。

Description

非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白及其应用和产品

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白及其应用和产品。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率更可高达100％，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，2018年传入我国，带来巨大的直接和间接经济损失。该病被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。

非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，且大部分基因功能未知，病毒与宿主细胞相互作用的机制不明确，难以大规模培养，传代易变异，病毒免疫逃逸机制不清，因此常规灭活疫苗及减毒活疫苗迄今尚无实质性进展，且减毒活疫苗使用不当存在毒力返强及散毒的生物安全风险。

因此，临床上亟需新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白。

本发明的第二目的在于提供与非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白相关的生物材料。

本发明的第三目的在于提供非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白或生物材料的应用。

本发明的第四目的在于提供一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物及其制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

与非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白相关的生物材料，生物材料包括如下任一项：

(a)核酸分子，编码上述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白；

(b)表达盒，含有(a)所述的核酸分子；

(c)重组载体，含有(a)所述的核酸分子或(b)所述的表达盒；

(d)重组细胞，含有(c)所述的载体。

上述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白或生物材料在制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。

一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，包括非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白和药学上可接受的载体。

上述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，利用编码非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的核酸分子构建重组载体，将该重组载体导入表达细胞进行表达，经纯化得到非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白，再与药学上可接受的载体混匀，得非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物。

本发明的有益效果为：

本发明提供的非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该蛋白作为抗原，具有协同增效作用，免疫效果良好，在总蛋白含量较低的条件下可以提供更好的免疫效力，有效解决了目前非洲猪瘟病毒疫苗面临的免疫原性差的问题，可以通过基因工程手段进行大量的表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产，无生物安全风险。与其相关的生物材料可以作为生物模块直接用于蛋白的生产。

具体实施方式

下面，对本发明的具体实施方式进行详细的说明。

对本发明中相关术语进行解释：

术语“非洲猪瘟病毒”是指非洲猪瘟病毒(ASFV,African swine fever virus)为非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)下仅有的种，具有传染性和极高的致病性，ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定，急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。直至2020年仍未有针对ASFV的特效疫苗或是抗病毒药物可以有效的在疫情爆发时及时控制病毒的传播。

术语“非洲猪瘟病毒p34蛋白”、“非洲猪瘟病毒p14蛋白”是指非洲猪瘟病毒编码一种名为p220的多聚蛋白，该p220多聚蛋白存在于成熟病毒粒子的核衣壳中，占病毒蛋白总量的30％左右，在病毒组装和病毒感染中发挥着重要的作用。P220多聚蛋白在蛋白酶的作用下可有序的裂解为p150、p34、p37和p14。p150、p34、p37和p14在病毒衣壳的组装过程中起着至关重要的作用，其中，p34、p14属于p220中重要的结构蛋白，对病毒内核蛋白的包装起着重要的作用。

术语“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有非洲猪瘟病毒蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对非洲猪瘟的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

在优选的实施方式中，佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

术语“冻干保护剂”是指除赋形剂外，给予药物有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。

术语“剂型”是指药物制剂的形态。也指根据药物性质，以及治病和处方的要求制成的药剂(成品药)。合适的剂型是为了发挥药物的最佳疗效，减少毒副作用，以及便于使用、贮存和运输。

术语“注射剂(injection)”是指药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，可以是注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)；尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(PEG)等。

术语“注射用粉末”是指在无菌环境下将药液冷冻，将原料药“掺”在某些辅料或溶在某些溶媒中，经过一定的加工处理制成不同形式的制剂。

术语“预防”在涉及非洲猪瘟病毒感染时是指抑制非洲猪瘟病毒的复制、抑制非洲猪瘟病毒的传播或防止非洲猪瘟病毒在其宿主体内定居，以及减轻非洲猪瘟病毒感染的疾病或病症的症状。

术语“表达盒”指含有为了在细胞中至少表达所含核酸分子而必需的调节元件(如启动子和多聚腺苷化位点)、纯化标签、筛选标签等的构建体。

GDKNPVQHIKDYHIDSVSSKAKLRIIEGIIRAIAKIGFKVDTKQPIEDILKDIKKQLPDPRAGSTFVKNAEKQETVCKMIADAINQEFIDLGQDKLIDTTEGAASICRQIVLYINSLTHGLRAEYLDVHGSIENTLENIKLLNDAIKQLHERMVTEVTKAAPNEEVINAVTMIEAVYRRLLNEQNLQINILTNFIDNILTPTQKELDKLQTDEVDIIKLLNDTNSVLGTKNFGKVLSYTLCNLGIAASVANKINKALQKVGLKVEQYLQSKNWAEFDKELDLKRFSGLVSAENIAEFEKAVNLLRQTFNERHKILENSCAKKGGDEEKTPLDRRIEAQRLDRKHILMEFLNKSTQAYNDFLENVKKIGIKLVKEIALTPNITRLRDALSRINDMGTIALDLSLIGFYTNAAAREERETFLTQLTLVKNVLEEISKTDPNFKNLYDSCSRLLQIIDFYTDIVQKKYGGEEDCECTRVGG(SEQ ID NO.4)。

非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白可通过原核表达系统来制备，也可通过真核表达系统、细胞表达系统或化学合成方法来制备。

本发明也提供上述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的相关生物材料，包括编码非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的核酸分子，含有该核酸分子的表达盒、重组载体和重组细胞。

在优选的实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所采用的骨架载体为pNVC1载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所采用的表达体系为大肠杆菌表达体系。

GGTGACAAAAACCCGGTTCAGCACATCAAAGACTACCACATCGACTCTGTTTCTTCTAAAGCTAAACTGCGTATCATCGAAGGTATCATCCGTGCTATCGCTAAAATCGGTTTCAAAGTTGACACCAAACAGCCGATCGAAGACATCCTGAAAGACATCAAAAAACAGCTGCCGGACCCGCGTGCTGGTTCTACCTTCGTTAAAAACGCTGAAAAACAGGAAACCGTTTGCAAAATGATCGCTGACGCTATCAACCAGGAATTCATCGACCTGGGTCAGGACAAACTGATCGACACCACCGAAGGTGCTGCTTCTATCTGCCGTCAGATCGTTCTGTACATCAACTCTCTGACCCACGGTCTGCGTGCTGAATACCTGGACGTTCACGGTTCTATCGAAAACACCCTGGAAAACATCAAACTGCTGAACGACGCTATCAAACAGCTGCACGAACGTATGGTTACCGAAGTTACCAAAGCTGCTCCGAACGAAGAAGTTATCAACGCTGTTACCATGATCGAAGCTGTTTACCGTCGTCTGCTGAACGAACAGAACCTGCAGATCAACATCCTGACCAACTTCATCGACAACATCCTGACCCCGACCCAGAAAGAACTGGACAAACTGCAGACCGACGAAGTTGACATCATCAAACTGCTGAACGACACCAACTCTGTTCTGGGTACCAAAAACTTCGGTAAAGTTCTGTCTTACACCCTGTGCAACCTGGGTATCGCTGCTTCTGTTGCTAACAAAATCAACAAAGCTCTGCAGAAAGTTGGTCTGAAAGTTGAACAGTACCTGCAGTCTAAAAACTGGGCTGAATTCGACAAAGAACTGGACCTGAAACGTTTCTCTGGTCTGGTTTCTGCTGAAAACATCGCTGAATTCGAAAAAGCTGTTAACCTGCTGCGTCAGACCTTCAACGAACGTCACAAAATCCTGGAAAACTCTTGCGCTAAAAAAGGTGGTGACGAAGAAAAAACCCCGCTGGACCGTCGTATCGAAGCTCAGCGTCTGGACCGTAAACACATCCTGATGGAATTCCTGAACAAATCTACCCAGGCTTACAACGACTTCCTGGAAAACGTTAAAAAAATCGGTATCAAACTGGTTAAAGAAATCGCTCTGACCCCGAACATCACCCGTCTGCGTGACGCTCTGTCTCGTATCAACGACATGGGTACCATCGCTCTGGACCTGTCTCTGATCGGTTTCTACACCAACGCTGCTGCTCGTGAAGAACGTGAAACCTTCCTGACCCAGCTGACCCTGGTTAAAAACGTTCTGGAAGAAATCTCTAAAACCGACCCGAACTTCAAAAACCTGTACGACTCTTGCTCTCGTCTGCTGCAGATCATCGACTTCTACACCGACATCGTTCAGAAAAAATACGGTGGTGAAGAAGACTGCGAATGCACCCGTGTTGGTGGT(SEQ ID NO.3)。

上述生物材料均可作为生物模块直接用于非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的制备中，从而用于制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物，例如疫苗。

在优选的实施方式中，非洲猪瘟p34-p14亚单位蛋白含量为≥100μg/ml，优选为100～300μg/ml。非洲猪瘟p34-p14亚单位蛋白含量选自100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml、175μg/ml、180μg/ml、185μg/ml、190μg/ml、195μg/ml、200μg/ml、205μg/ml、210μg/ml、215μg/ml、220μg/ml、225μg/ml、230μg/ml、235μg/ml、240μg/ml、245μg/ml、250μg/ml、255μg/ml、260μg/ml、265μg/ml、270μg/ml、275μg/ml、280μg/ml、285μg/ml、290μg/ml、295μg/ml或300μg/ml。

在优选的实施方式中，药学上可接受的载体包括佐剂、冻干保护剂、药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的至少一种。

更进一步地，佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的至少一种；皂苷优选为Quil A、QS-21、GPI-0100；佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为50％V/V。佐剂优选地为50％V/V的Montanide ISA 206佐剂。

更进一步地，冻干保护剂优选地选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸。

更进一步地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和白介素2。

在优选的实施方式中，非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的剂型选自溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂、或缓控释植入剂，优选为溶液型注射剂、混悬型注射剂、或注射用粉末，进一步优选为溶液型注射剂或混悬型注射剂。

在优选的实施方式中，非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药、或透皮给药，优选为皮下注射给药。

本发明同时提供上述非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备方法：利用编码非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的核酸分子构建重组载体，将该重组载体导入表达细胞进行表达，经纯化得到非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白，再与药学上可接受的载体混匀，得非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得

实施例1非洲猪瘟病毒p34、p14、p34-p14蛋白的原核表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应编码序列表SEQ ID NO.5所示表达载体的核苷酸序列，命名为pNVC1载体。

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，相应编码p34、p14、p34-p14蛋白，并将合成的核苷酸克隆到pNVC1载体上，分别命名为重组质粒pNVC1-p34、pNVC1-p14、pNVC1-p34-p14。

分别将上述重组质粒pNVC1-p34、pNVC1-p14、pNVC1-p34-p14转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株，接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，制备发酵用种子液。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将3L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导培养12小时。发酵密度大约为40左右(OD600)停止培养，离心收集菌体。

按每克菌体湿重加10毫升裂解液(20mmol/L Tris缓冲液(pH值7.0)，0.5mol/LNaCl)的比例重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体3次。13500rpm，离心40min，留取上清。

向上清液中加入0.02mol/L咪唑，过滤后采用蛋白层析纯化系统进行蛋白亲和层析纯化。层析介质为Ni Sepharose 6 Fast Flow，系统流速为90cm/h。上样前层析柱用平衡缓冲液(0.02mol/LTris(pH值7.0)，0.02mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl)进行平衡，上样后用缓冲溶液(0.02mol/LTris(pH值7.0)，0.05mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl)洗脱杂蛋白，用缓冲溶液(0.02mol/LTris(pH值7.0)，0.5mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl)洗脱目的蛋白，并收集洗脱产物。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，染色后应可见清晰的目的蛋白条带，凝胶经凝胶成像仪扫描，经软件分析目的蛋白的纯度均在85％以上。用BCA法测定蛋白含量p34、p14、p34-p14蛋白分别为2.4g/L、2.5g/L、2.4g/L。

实施例2非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备

将实施例1制备得到的p34-p14蛋白加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含有非洲猪瘟病毒蛋白抗原的亚单位疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表1。

表1非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物成分配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				p34-p14(μg/ml)	100	200	300
双相佐剂(V/V％)	50％	50％	50％

实施例3非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性试验

取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组免疫疫苗3，第4组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射4ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，两次免疫之间间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。

用非洲猪瘟全病毒灭活抗原(购自欧洲联盟非洲猪瘟参考实验室(EUROPEANUNION REFERENCE LABORATORY FOR AFRICAN SWINE FEVER，URL-ASF))包被酶标板，4℃包被过夜；弃包被液，用洗涤液洗涤后；加入封闭液(称取蔗糖50g，加入200mL新生牛血清、1mLProclin300，补加PBS(0.01mol/L，pH值7.4)定容至1000mL)，2-8℃封闭16-24小时，弃去封闭液后干燥，密封后于2-8℃保存备用。

样品稀释液：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600mL、Proclin300 1mL、新生牛血清200mL、PUR染料0.028g，完全溶解后用纯化水定容至1000mL，混匀后0.22μm过滤后无菌分装，2-8℃保存。

洗涤液：取氯化钠160g、磷酸氢二钠58g、磷酸二氢钾4.8g、氯化钾4g、超纯水800mL、吐温20 10mL，完全溶解后用纯化水定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤，无菌分装。使用时用蒸馏水稀释20倍。

二抗：酶标的羊抗猪二抗，使用时进行1:2000稀释。

显色液：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于纯化水，定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色剂A。取四甲基联苯二胺(TMB)0.2g、无水乙醇10mL，溶于纯化水定容至1000mL，混匀、过滤后无菌分装，为显色剂B。

终止液：2M H2SO4。

检测时在酶标反应孔中先加入90μl样品稀释液，然后加入10μl待检血清，阴性、阳性对照，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，羊抗猪酶标抗体100μl/孔加入反应板，37℃温育30分钟，用洗涤液洗板三次，加入显色剂A、显色剂B各50μl/孔，37℃显色10分钟，加终止液50μl/孔终止反应，用酶标仪读取吸光度OD450nm，根据判定结果进行判定。

判定标准：OD值≥0.19阳性，OD值＜0.19为阴性。

检测结果见表2。

表2非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性试验结果

结果显示，非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物均具有良好的免疫原性，抗体检测均为阳性。表明，本发明的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗采用非洲猪瘟病毒p34-p14蛋白抗原，免疫效果好。

实施例4非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性对比试验

1.非洲猪瘟病毒对比疫苗组合物的制备

将实施例1制备得到的p34、p14蛋白分别加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含有非洲猪瘟病毒蛋白抗原的对比疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表3。

表3非洲猪瘟病毒对比疫苗组合物成分配比

2.非洲猪瘟病毒亚单位疫苗免疫原性对比试验

取非洲猪瘟病毒抗原、抗体均为阴性的体重20kg左右的健康易感仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第5组、第6组分别免疫疫苗4、疫苗5，第7组免疫疫苗1，第8组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射4ml，对照组免疫等量的PBS+佐剂。免疫两次，间隔14天。第1次免疫前及第2次免疫后14天采血。

用实施例3非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒进行抗体检测，检测结果见表4。

表4非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物免疫原性对比试验结果

结果显示，非洲猪瘟病毒p34、p14、p34-p14蛋白亚单位对照疫苗均能引起不同程度的免疫反应，抗体检测均为阳性，非洲猪瘟病毒p34-p14蛋白亚单位疫苗免疫效果更好，抗体水平更高。

比较表2、表4中检测的OD值，本发明非洲猪瘟病毒p34-p14蛋白亚单位疫苗组合物当抗原总用量(即免疫剂量4ml的抗原蛋白含量总和)仅为0.4mg(疫苗1)或0.8mg(疫苗2)或1.2mg(疫苗3)，其检测的OD450nm值分别为2.018或2.021、2.452和2.691，而表4中检测的非洲猪瘟病毒p34蛋白亚单位疫苗组合物当抗原总用量(即免疫剂量4ml的抗原蛋白含量总和)为1.2mg(疫苗4)，非洲猪瘟病毒p14蛋白亚单位疫苗组合物当抗原总用量(即免疫剂量4ml的抗原蛋白含量总和)为1.2mg(疫苗5)，较疫苗1或疫苗2或疫苗3抗原总用量更高或相当，其检测的OD450nm值均远小于疫苗1或疫苗2或疫苗3免疫后血清中抗体OD450nm值，说明本发明非洲猪瘟病毒p34-p14蛋白亚单位疫苗组合物产生了协同增效作用，能产生更强的免疫反应，抗体滴度更高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白及其应用和产品

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgacaaaa acccggttca gcacatcaaa gactaccaca tcgactctgt ttcttctaaa 60

gctaaactgc gtatcatcga aggtatcatc cgtgctatcg ctaaaatcgg tttcaaagtt 120

gacaccaaac agccgatcga agacatcctg aaagacatca aaaaacagct gccggacccg 180

cgtgctggtt ctaccttcgt taaaaacgct gaaaaacagg aaaccgtttg caaaatgatc 240

gctgacgcta tcaaccagga attcatcgac ctgggtcagg acaaactgat cgacaccacc 300

gaaggtgctg cttctatctg ccgtcagatc gttctgtaca tcaactctct gacccacggt 360

ctgcgtgctg aatacctgga cgttcacggt tctatcgaaa acaccctgga aaacatcaaa 420

ctgctgaacg acgctatcaa acagctgcac gaacgtatgg ttaccgaagt taccaaagct 480

gctccgaacg aagaagttat caacgctgtt accatgatcg aagctgttta ccgtcgtctg 540

ctgaacgaac agaacctgca gatcaacatc ctgaccaact tcatcgacaa catcctgacc 600

ccgacccaga aagaactgga caaactgcag accgacgaag ttgacatcat caaactgctg 660

aacgacacca actctgttct gggtaccaaa aacttcggta aagttctgtc ttacaccctg 720

tgcaacctgg gtatcgctgc ttctgttgct aacaaaatca acaaagctct gcagaaagtt 780

ggtctgaaag ttgaacagta cctgcagtct aaaaactggg ctgaattcga caaagaactg 840

gacctgaaac gtttctctgg tctggtttct gctgaaaaca tcgctgaatt cgaaaaagct 900

gttaacctgc tgcgtcagac cttcaacgaa cgtcacaaaa tcctggaaaa ctcttgcgct 960

aaaaaaggtg gt 972

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgaagaaa aaaccccgct ggaccgtcgt atcgaagctc agcgtctgga ccgtaaacac 60

atcctgatgg aattcctgaa caaatctacc caggcttaca acgacttcct ggaaaacgtt 120

aaaaaaatcg gtatcaaact ggttaaagaa atcgctctga ccccgaacat cacccgtctg 180

cgtgacgctc tgtctcgtat caacgacatg ggtaccatcg ctctggacct gtctctgatc 240

ggtttctaca ccaacgctgc tgctcgtgaa gaacgtgaaa ccttcctgac ccagctgacc 300

ctggttaaaa acgttctgga agaaatctct aaaaccgacc cgaacttcaa aaacctgtac 360

gactcttgct ctcgtctgct gcagatcatc gacttctaca ccgacatcgt tcagaaaaaa 420

tacggtggtg aagaagactg cgaatgcacc cgtgttggtg gt 462

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgacaaaa acccggttca gcacatcaaa gactaccaca tcgactctgt ttcttctaaa 60

gctaaactgc gtatcatcga aggtatcatc cgtgctatcg ctaaaatcgg tttcaaagtt 120

gacaccaaac agccgatcga agacatcctg aaagacatca aaaaacagct gccggacccg 180

cgtgctggtt ctaccttcgt taaaaacgct gaaaaacagg aaaccgtttg caaaatgatc 240

gctgacgcta tcaaccagga attcatcgac ctgggtcagg acaaactgat cgacaccacc 300

gaaggtgctg cttctatctg ccgtcagatc gttctgtaca tcaactctct gacccacggt 360

ctgcgtgctg aatacctgga cgttcacggt tctatcgaaa acaccctgga aaacatcaaa 420

ctgctgaacg acgctatcaa acagctgcac gaacgtatgg ttaccgaagt taccaaagct 480

gctccgaacg aagaagttat caacgctgtt accatgatcg aagctgttta ccgtcgtctg 540

ctgaacgaac agaacctgca gatcaacatc ctgaccaact tcatcgacaa catcctgacc 600

ccgacccaga aagaactgga caaactgcag accgacgaag ttgacatcat caaactgctg 660

aacgacacca actctgttct gggtaccaaa aacttcggta aagttctgtc ttacaccctg 720

tgcaacctgg gtatcgctgc ttctgttgct aacaaaatca acaaagctct gcagaaagtt 780

ggtctgaaag ttgaacagta cctgcagtct aaaaactggg ctgaattcga caaagaactg 840

gacctgaaac gtttctctgg tctggtttct gctgaaaaca tcgctgaatt cgaaaaagct 900

gttaacctgc tgcgtcagac cttcaacgaa cgtcacaaaa tcctggaaaa ctcttgcgct 960

aaaaaaggtg gtgacgaaga aaaaaccccg ctggaccgtc gtatcgaagc tcagcgtctg 1020

gaccgtaaac acatcctgat ggaattcctg aacaaatcta cccaggctta caacgacttc 1080

ctggaaaacg ttaaaaaaat cggtatcaaa ctggttaaag aaatcgctct gaccccgaac 1140

atcacccgtc tgcgtgacgc tctgtctcgt atcaacgaca tgggtaccat cgctctggac 1200

ctgtctctga tcggtttcta caccaacgct gctgctcgtg aagaacgtga aaccttcctg 1260

acccagctga ccctggttaa aaacgttctg gaagaaatct ctaaaaccga cccgaacttc 1320

aaaaacctgt acgactcttg ctctcgtctg ctgcagatca tcgacttcta caccgacatc 1380

gttcagaaaa aatacggtgg tgaagaagac tgcgaatgca cccgtgttgg tggt 1434

<210> 4

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Asp Lys Asn Pro Val Gln His Ile Lys Asp Tyr His Ile Asp Ser

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Ala Lys Leu Arg Ile Ile Glu Gly Ile Ile Arg Ala

20 25 30

Ile Ala Lys Ile Gly Phe Lys Val Asp Thr Lys Gln Pro Ile Glu Asp

35 40 45

Ile Leu Lys Asp Ile Lys Lys Gln Leu Pro Asp Pro Arg Ala Gly Ser

50 55 60

Thr Phe Val Lys Asn Ala Glu Lys Gln Glu Thr Val Cys Lys Met Ile

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ile Asn Gln Glu Phe Ile Asp Leu Gly Gln Asp Lys Leu

85 90 95

Ile Asp Thr Thr Glu Gly Ala Ala Ser Ile Cys Arg Gln Ile Val Leu

100 105 110

Tyr Ile Asn Ser Leu Thr His Gly Leu Arg Ala Glu Tyr Leu Asp Val

115 120 125

His Gly Ser Ile Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ile Lys Leu Leu Asn Asp

130 135 140

Ala Ile Lys Gln Leu His Glu Arg Met Val Thr Glu Val Thr Lys Ala

145 150 155 160

Ala Pro Asn Glu Glu Val Ile Asn Ala Val Thr Met Ile Glu Ala Val

165 170 175

Tyr Arg Arg Leu Leu Asn Glu Gln Asn Leu Gln Ile Asn Ile Leu Thr

180 185 190

Asn Phe Ile Asp Asn Ile Leu Thr Pro Thr Gln Lys Glu Leu Asp Lys

195 200 205

Leu Gln Thr Asp Glu Val Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Asp Thr Asn

210 215 220

Ser Val Leu Gly Thr Lys Asn Phe Gly Lys Val Leu Ser Tyr Thr Leu

225 230 235 240

Cys Asn Leu Gly Ile Ala Ala Ser Val Ala Asn Lys Ile Asn Lys Ala

245 250 255

Leu Gln Lys Val Gly Leu Lys Val Glu Gln Tyr Leu Gln Ser Lys Asn

260 265 270

Trp Ala Glu Phe Asp Lys Glu Leu Asp Leu Lys Arg Phe Ser Gly Leu

275 280 285

Val Ser Ala Glu Asn Ile Ala Glu Phe Glu Lys Ala Val Asn Leu Leu

290 295 300

Arg Gln Thr Phe Asn Glu Arg His Lys Ile Leu Glu Asn Ser Cys Ala

305 310 315 320

Lys Lys Gly Gly Asp Glu Glu Lys Thr Pro Leu Asp Arg Arg Ile Glu

325 330 335

Ala Gln Arg Leu Asp Arg Lys His Ile Leu Met Glu Phe Leu Asn Lys

340 345 350

Ser Thr Gln Ala Tyr Asn Asp Phe Leu Glu Asn Val Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ile Lys Leu Val Lys Glu Ile Ala Leu Thr Pro Asn Ile Thr Arg Leu

370 375 380

Arg Asp Ala Leu Ser Arg Ile Asn Asp Met Gly Thr Ile Ala Leu Asp

385 390 395 400

Leu Ser Leu Ile Gly Phe Tyr Thr Asn Ala Ala Ala Arg Glu Glu Arg

405 410 415

Glu Thr Phe Leu Thr Gln Leu Thr Leu Val Lys Asn Val Leu Glu Glu

420 425 430

Ile Ser Lys Thr Asp Pro Asn Phe Lys Asn Leu Tyr Asp Ser Cys Ser

435 440 445

Arg Leu Leu Gln Ile Ile Asp Phe Tyr Thr Asp Ile Val Gln Lys Lys

450 455 460

Tyr Gly Gly Glu Glu Asp Cys Glu Cys Thr Arg Val Gly Gly

465 470 475

<210> 5

<211> 5369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 2160

caccgcatac aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 2220

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 2280

aatagcacgt gctaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 2340

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 2400

tagaaaagat caaaggatct acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg 2460

ctggcctttt gctcacatgt ctcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa cgttactccc acaggtgagc 2820

gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggctcgtt 2880

tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg 2940

gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggcccgcg 3000

ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcgtgtgc 3060

gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg gggggctgcg aggggaacaa 3120

aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg 3180

gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 3240

cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 3300

tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 3360

gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc tggccaatgc cctggctcac 3420

aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 3480

gagcatctga cttctggcta taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca 5220

ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 5280

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 5340

tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5369

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.与权利要求1所述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下任一项：

(a)核酸分子，编码权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白；

(b)表达盒，含有(a)所述的核酸分子；

(c)重组载体，含有(a)所述的核酸分子或(b)所述的表达盒；

(d)重组细胞，含有(c)所述的载体。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，(a)中核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

优选地，(c)中重组载体的骨架为pNVC1载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

优选地，(d)中重组细胞为大肠杆菌。

4.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白或权利要求2或3所述的生物材料在制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。

5.一种非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述非洲猪瘟p34-p14亚单位蛋白含量为≥100μg/ml，优选为100～300μg/ml。

7.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括佐剂、冻干保护剂、药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的至少一种；

优选地，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、MontanideISA 206、Gel佐剂中的至少一种；皂苷优选为QuilA、QS-21、GPI-0100；

优选地，所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为50％V/V；

优选地，所述佐剂为50％V/V的MontanideISA 206佐剂；

优选地，所述冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸；

优选地，所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和白介素2。

8.根据权利要求5-7任一项所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，剂型选自溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂、或缓控释植入剂，优选为溶液型注射剂、混悬型注射剂、或注射用粉末，进一步优选为溶液型注射剂或混悬型注射剂。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物，其特征在于，给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药、或透皮给药，优选为皮下注射给药。

10.权利要求5-9任一项所述的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物的制备方法，其特征在于，利用编码权利要求1所述非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白的核酸分子构建重组载体，将该重组载体导入表达细胞进行表达，经纯化得到非洲猪瘟病毒p34-p14亚单位蛋白，再与药学上可接受的载体混匀，得非洲猪瘟病毒亚单位疫苗组合物。