CN116251095A - 银杏内酯b在制备预防肿瘤转移的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明提供了银杏内酯B在制备预防肿瘤转移的药物中的应用。本发明研究表明，银杏内酯B在600μM浓度范围内对癌细胞尤其是人循环肿瘤细胞(CTC)的活性没有显著影响；银杏内酯B在200μM浓度范围内对人CTC的凋亡、细胞周期没有显著影响，但在50μM浓度时即可显著抑制人CTC粘附人血管内皮细胞；银杏内酯B的细胞粘附/细胞活性抑制比率(AIR值)>1；银杏内酯B长期给药不影响小鼠体重和血常规指标，但可以显著预防由CTC诱发的肿瘤转移。本发明揭示了银杏内酯B作为活性成分在制备预防CTC诱发的肿瘤转移的药物中的作用。本发明填补了银杏内酯B在该领域的技术空白。

Description

银杏内酯B在制备预防肿瘤转移的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及银杏内酯B在制备预防肿瘤转移的药物中的应用。

背景技术

肿瘤转移的根源是循环肿瘤细胞(circulating tumor cells；简称CTC)及其代谢产物。正常人血中白细胞数量4～10×10⁶个/mL，红细胞数量3.8～5.5×10⁹个/mL，而CTC仅有1～30个/mL。因此，所有抗癌药无法专一性杀死CTC而不产生任何毒副作用。面对半个世纪以来“抗癌药”治疗的高代价、高副作用和低疗效，再对比同期心血管病死亡率下降60％的显著成果，传统的肿瘤转移后再用抗癌药物治疗的思路已经很难再产生颠覆性的突破了，亟需独辟蹊径，破解现存肿瘤药物防治的技术瓶颈、填补技术空白，开创新的治疗领域。

研究表明，原发性结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌患者手术后3-5年内仍有30-70％的转移率。而再次转移往往是全身多器官的转移，抗癌药和靶向药物对此都束手无策。

肿瘤的转移与转移的根源(CTC)和转移的条件(CTC所处微环境的改变)具有辩证的、相辅相成的关系(即seed-and-soil关系)。CTC是肿瘤转移的内因，其所处的微环境是肿瘤转移的外因，CTC(内因)通过其最适合的微环境(外因)而起到粘附/着床和转移的作用。本发明人发现了多种可以安全有效维持CTC微环境稳态、不利于CTC诱发肿瘤转移的药物，证明了CTC微环境中多种因素参与了微环境的稳态性。药物维持微环境的健康、稳态，可使CTC失去其着床、侵袭、转移起始反应的诱因，使得CTC这个内因失去最适合转移的外部条件，因此可以有效预防CTC诱发肿瘤转移起始反应的发生。针对半个世纪都无法解决的肿瘤转移后造成的死亡，本发明人独辟蹊径，开展了历时10年的针对CTC及其微环境的肿瘤转移药物预防的研究。

肿瘤转移复发的根源是CTC。CTC在其微环境各种因素的影响下，转为具有EMT(上皮-间质转化)活性的CTC，从而开始了向血管内膜粘附和向血管外侵袭(extravasation)的肿瘤转移瀑布(cascade)反应(图1)。尽管目前对转移源头是始发于干细胞、CTC衍生的RNA、DNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环microRNA还是传播型癌细胞(Disseminated cancercells,DCC)，存在不同的看法和解释，但是肿瘤转移的根源是CTC及其代谢产物已是人们普遍认可的，这就构成了针对CTC的预防肿瘤转移的新技术、新药物和重大科学问题。

具有转移特性的CTC与无转移特性的、原发性肿瘤细胞在细胞形态学、分子生物学、细胞基因组学、细胞蛋白质组学、循环血中的顽强存活性与转移组织的血管内皮细胞粘附特性等许多方面具有明显的差异，不能混为一谈。本发明人的在先研究(Cancer 2015；121(17):3036-45；Biosensors&Bioelectronics 2018；122:239-246)揭示了CTC带有原发性肿瘤和淋巴结转移的生物学特性。CTC表面特征蛋白包括EpCAM、HER2、CD44、CD47、CK蛋白等。这些表面特征蛋白在体内转移组织微环境作用下可产生顺应性的动态改变。传统“抗癌药”对肿瘤细胞的作用模式是完全不适合于CTC的。

手术后，原发性肿瘤消失了，但血中的CTC仍然存在。基于本发明人对CTC转移机制的认识，在探索新思路、新研发战略的早期，本发明人原创性地假设CTC在远端转移组织的粘附/着床是肿瘤转移的关键起始步骤，这一反应需要多种炎性因子、细胞因子、粘附分子、整合素和血小板的参与，并在最合适的时空条件下完成CTC的侵润、着床，终致肿瘤全身转移。如果某种药物能够干预CTC在毛细血管内皮细胞的粘附(这一重要的肿瘤转移的源头步骤)，就有可能有效地预防与CTC相关的肿瘤手术后的再转移。

循环血中具有转移活性(即非休眠)的CTC要在外周转移组织成功实现其转移的级联瀑布反应，首先必须实现它在血管内膜的着床和浸润。炎性因子、细胞因子可以诱导细胞粘附分子ICAM、VCAM的活性，从而促进CTC在转移组织血管内皮细胞的粘附，诱发转移。早期研究就证明炎性因子NF-kB可以诱导内皮细胞VCAM活性的提高，诱导淋巴细胞迁移到炎症组织(Pharmacol.Research，139(2019)535-549)。CTC在远端组织的转移起始于它与活化血小板、白细胞的相互作用。在sLe(a/x)、Selectin的参与下，CTC的整合素和内皮细胞的粘附分子(VCAM、ICAM)相互作用，在肿瘤训导血小板(tumor-educatedplatelets)的护卫作用下，实现CTC在内皮细胞的粘附、侵袭和转移。

本发明人设想，如果能够安全、有效地用药物干扰这一瀑布反应的起始步骤(即CTC在血管、淋巴管内皮细胞的粘附)，甚至综合控制CTC所处微环境中的几个关键位点，就有可能有效地预防基于CTC的肿瘤手术后的再转移。根据细胞失巢即凋亡的Anoikis理论，任何无法及时粘附于血管内壁的CTC将在血液层流冲力(Shear stress)、免疫攻击的综合作用下而死亡(Nature 2004；430:973-4；Nature 2009；461:109-13)。以上结果表明，本发明人可以用药物维持CTC微环境的健康、稳态，使CTC失去其着床、侵袭、转移起始反应的温床。如果CTC这个内因失去其最适合粘附/着床变化的外因条件，本发明人就可以安全有效地预防CTC在外周转移组织由粘附诱发的肿瘤转移。

本发明人原创性提出“只要干预肿瘤转移级联反应的关键起始步骤，即CTC在外周转移组织的粘附/着床，就可安全有效地预防基于CTC的肿瘤转移”这一新思路。基于这一思路，研发了若干可干预CTC在外周转移组织的粘附/着床药物：

1.Signal Transduct Target Ther.2022；7(1):341IF38.4.

2.Journal ofexperimental&clinical cancerresearch 2021,40(1),300.

3.Oncotarget 2016,7(16),21699-712.

4.TheAAPSjournal 2014,16(2),289-98.

5.Molecular carcinogenesis 2017,56(8),1896-1908.

6.Medicinal researchreviews 2014,34(5),979-1000.

7.Oncotarget 2017,8(35),59123-59135.

8.Scientific reports 2016,6,22388.

9.Small 2016,12(19),2595-608.

10.Molecular carcinogenesis 2019,58(1),144-155.

11.Journal ofexperimental&clinical cancerresearch 2019,38(1),232.

12.Scientific reports 2015,5,7830.

13.Frontiers inpharmacology 2019,10,1296.

14.Scientific reports 2016,6,30549.

15.Integrative cancertherapies 2017,16(4),556-562.

16.Scientific reports 2017,7(1),3888.

17.TheAAPSjournal 2017,19(6),1779-1790.

18.Journal ofpharmaceutical andbiomedical analysis 2015,107,341-5.

19.Oncotarget 2015,6(34),35157-72.

20.Current cancer drug targets 2019,19(4),296-303)。

这些药物在CTC微环境中抑制了由炎性因子IL-1β、NF-kB诱发的整合素β1、α6、αvβ6、FAK、MMP2、MMP9在癌细胞表面的表达；抑制了整合素IIb/IIIA、整合素β3、P-selectin在血小板表面的表达；抑制了由炎性因子诱发的ICAM、VCAM和E-selectin在内皮细胞表面的表达，从而实现了它们安全、有效地抑制CTC诱发肿瘤转移的作用。比如，本发明人在分子细胞、组织和整体动物三级水平原创性地揭示了一氧化氮药物通过干预炎性因子和血小板聚集、舒张微血管，可以干预CTC在血管内皮细胞粘附后诱发的肿瘤转移(Scientificreports 2015；5,7830；Pharmacol.Res.2019；139:535-549；Eur.J.Pharmacol.2016；791:62-71)。传统的抗癌药通过诱导细胞凋亡、产生细胞毒性以及改变细胞分裂周期抑制肿瘤的生长增殖甚至杀死肿瘤细胞达到“抗癌”的作用。但是这种“抗癌”方式通常是以牺牲自身正常细胞的同时来换取肿瘤细胞的死亡。患者还伴随抗癌药引起的肝脏功能毒性、骨髓毒性、心脏毒性甚至全身反应等严重的不良反应，而且抗癌药并不能够抑制CTC的迁移、侵袭、粘附等来抑制肿瘤的转移，因此一些抗癌药在安全性和有效性上不尽如人意。例如，美国癌症研究协会一项III期研究表明，转移性结肠癌晚期患者接受阿替利珠单抗和考比替尼联合治疗的总生存期为8.9个月，药物联用仅对2.7％患者产生效果。

银杏(学名：Ginkgo biloba L.)是银杏科、银杏属植物，又名白果、鸭脚子。《本草纲目》中记载：“银杏，宋初始著名，而修本草者不收，近时方药亦时用之”、“熟食温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊。生食降痰，消毒杀虫”。2002年中华人民共和国卫生部公布的《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》显示，白果在“既是食品又是药品的物品名单”中。可见银杏是一种传统的药、食两用物质。在2020年版《中华人民共和国药典》中定义，银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。目前人们从银杏叶中提取得到的化合物多达160余种，包括黄酮类、萜类、酚类、生物碱类等活性成分。萜类是银杏叶中重要的活性成分，目前人们已从银杏叶中提取得到的萜类物质包括银杏内酯A、B、C、K及白果内酯等，银杏内酯作为血小板活化因子(PAF)受体强大的拮抗剂以及非特异性甘氨酸受体和γ-氨基丁酸受体拮抗剂，目前广泛应用于心脑血管疾病的治疗中。

对银杏叶萜类物质银杏内酯的研究可追溯到20世纪30年代，1932年Funikawa等首次报道了从银杏叶中分离得到银杏内酯(Sci.Papers Ins.Phys.Chem.Res.(Japan),1932,19,27)，它的化学结构被Maruyama等(Tetrahedron Lett.,1967,4,299)和Nakanishi等(J.Am.Chem.Soc,1971,93,3546)所确定。

现代药理学研究表明，银杏内酯具有广泛的药理作用，包括抗氧化、血小板拮抗、再灌注损伤保护、改善记忆、心肌保护、抗炎、细胞损伤保护、脑卒中治疗、降血脂等。银杏内酯可竞争性结合PAF受体、抑制血小板的聚集以及血栓形成的药理学特性，是自然界中获得的活性极强的PAF受体拮抗剂。活化的血小板与血液中的CTC具有高度亲和力，可以与CTC结合帮助CTC抵抗免疫细胞的攻击，以及保护CTC免受血流剪切力的伤害从而存活下来，利于CTC的转移。本发明人的先前研究(Pharmacol Res.2019；139:535-549.)揭示了抑制血小板对CTC的保护作用可有效抑制CTC诱发的肿瘤体内转移，尤其是抑制CTC在血管内皮细胞的粘附(CTC诱发肿瘤转移的关键起始步骤；图1)。因此作为活性极强的PAF受体拮抗剂，银杏内酯B可望成为安全有效的预防肿瘤转移的药物。但目前有关银杏内酯B在预防CTC诱发肿瘤转移方面的研究还未有报道。

发明内容

为克服现有技术中没有预防CTC诱发肿瘤转移的预防药的缺陷，本发明首次揭示并提供了银杏内酯B在制备预防循环肿瘤细胞及其代谢产物诱发的肿瘤转移的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了银杏内酯B在制备预防循环肿瘤细胞及其代谢产物诱发的肿瘤转移的药物中的应用。

优选的，循环肿瘤细胞的代谢产物包括循环肿瘤RNA、循环肿瘤DNA、循环microRNA和传播型癌细胞中的一种或几种。

优选的，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌或黑色素瘤。

优选的，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型包括注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、滴丸或栓剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明的研发战略与半个世纪以来“抗癌药”杀死癌细胞的传统观念完全不同，是理论、模型、技术和产品的创新，可从源头上阻断肿瘤转移的发生、发展(具体区别见表1)。预防肿瘤转移的药物不仅可以用于没有转移的癌症早期患者、不适宜手术切除肿瘤的患者、肿瘤手术前后的患者，甚至还可用于具有高度癌症转移风险的易感人群的肿瘤转移预防。药物长期预防的关键是其有效性和安全性。

表1传统“抗癌药”和本发明肿瘤转移预防药的区别

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2、本发明提供了银杏内酯B在制备在预防CTC及其代谢产物诱发肿瘤转移的安全药物的应用。银杏内脂B具有极低的细胞毒性，在有效预防肿瘤转移浓度范围内，它不影响CTC的细胞活性、不会引起CTC凋亡、不改变细胞周期。长期给药不会改变小鼠的血常规指标，不会对小鼠器官造成损害，可适用于长期安全使用。与传统“抗癌药”在作用机制上和毒副作用上有明显的区别。

3、CTC与血管内皮粘附是肿瘤转移起始反应的关键源头步骤，本发明通过干预CTC与血管内皮的粘附，从源头抑制肿瘤的转移。其中，银杏内酯B干预CTC与血管内皮的粘附效果可用粘附/抑制率来表示。粘附/抑制率(adhesion inhibition ratio,AIR)是药物的IC₁₀或IC₅₀(指药物抑制受试细胞10％或50％增殖所需的浓度)与EC₅₀(指药物抑制肿瘤细胞与内皮细胞之间50％粘附所需的浓度)的比值。

4、本发明通过尾静脉注射肿瘤细胞(模拟CTC)后，小鼠肺部肿瘤转移数的减少与银杏内酯B给药剂量呈量效关系，表明银杏内酯B可达到预防肿瘤转移的效果。

5、本发明在全球首次运用“循环肿瘤细胞(CTC)是肿瘤转移的根源”这一科学知识，原创性提出“只要干预肿瘤转移级联反应的关键起始步骤，即CTC在外周转移组织的粘附/着床，就可安全有效地预防基于CTC的肿瘤转移”这一思路，首次发现银杏内酯B具有安全、有效的抑制CTC诱发肿瘤转移的作用，由此构成的药物应用理念与半个世纪“抗癌药”杀死癌细胞的传统观念完全不同，是理论、模型、技术和产品的创新，可从源头上阻断肿瘤转移的发生、发展，构成了与传统“抗癌药”泾渭分明的格局。同时，本发明也拓展了传统药、食两用物质银杏内酯的经济发展空间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明与传统抗癌药、传统银杏内酯研究的作用点的差异(本发明银杏内酯的作用点是抑制CTC在血管内皮细胞的粘附，作用时间是CTC进入血液后)；

图2为不同浓度的银杏内酯B(10～1000μM)对人循环肿瘤细胞(人结肠癌CTC、人肺癌CTC、人乳腺癌CTC)作用24h后细胞活力的影响；

图3为不同浓度的银杏内酯B(10～200μM)对人结肠癌CTC凋亡实际分析图谱；

图4为不同浓度的银杏内酯B(10～200μM)对人结肠癌CTC凋亡情况的统计数据图；

图5为不同浓度的银杏内酯B(10～200μM)对人乳腺癌CTC凋亡实际分析图谱；

图6为不同浓度的银杏内酯B(10～200μM)对人乳腺癌CTC凋亡情况的统计数据图；

图7为不同浓度的银杏内酯B对人结肠癌CTC周期分布实际分析图谱；

图8为不同浓度的银杏内酯B对人结肠癌CTC周期分布情况的统计数据图；

图9为不同浓度的银杏内酯B对人乳腺癌CTC周期分布实际分析图谱；

图10为不同浓度的银杏内酯B对人乳腺癌CTC周期分布情况的统计数据图；

图11为银杏内酯B干预人乳腺癌、结肠癌CTC与人静脉内皮细胞粘附的作用(注：A为不同浓度的银杏内酯B对人乳腺癌CTC对人静脉内皮细胞粘附的作用；B为不同浓度的银杏内酯B对人乳腺癌CTC与人静脉内皮细胞粘附的抑制率％；C为银杏内酯B粘附/抑制率(AIR值)的统计分析图；D为不同浓度的银杏内酯B对人结肠癌CTC与人静脉内皮细胞粘附的抑制率％；*表示P<0.05，组间差异具有显著性；****表示P<0.0001，组间差异具有非常显著性)；

图12为银杏内酯B连续给药21天(mg/kg/day；每天2次BID)后对小鼠体重和血常规指标的影响(注：A为小鼠体重的变化图；B为小鼠血常规指标白细胞、血红蛋白、红细胞、血小板的数据统计图)；

图13为银杏内酯B给药21天(mg/kg/day；BID)后对小鼠组织器官心、肝、脾、肺、肾无毒性影响的组织切片H&E染色显微分析图；

图14为银杏内酯B抑制小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠结肠癌细胞CT-26在小鼠肺转移中的作用(注：A为小鼠乳腺癌转移模型的肿瘤转移情况及肺部组织切片H&E染色的情况；B为小鼠结肠癌转移模型的肿瘤转移情况及肺部组织切片H&E染色的情况；*表示P<0.05，组间差异具有显著性；***表示P<0.001，组间差异具有极显著性；****表示P<0.0001，组间差异具有非常显著性)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例以人乳腺癌CTC、人肺癌CTC和人结肠癌CTC为实验循环肿瘤细胞。

实施例1

研究银杏内酯B对人CTC活性的影响：

肿瘤病人CTC的制备按照本发明人在先研究建立的方法(Cancer121(17):3036-45,2015)。取对数生长期的人乳腺癌CTC、人肺癌CTC或人结肠癌CTC经胰蛋白酶消化计数后接种于96孔板中，每孔含培养基100μL，其中细胞数量为5000个，37℃5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。弃去旧的培养基，加入含有不同浓度银杏内酯B的培养基，每组设4个复孔。药物作用24小时后，每孔加入CCK-8溶液使其含量为10％，轻轻晃动96孔板以帮助混匀，放入培养箱中继续培养1小时，使用酶标仪检测在450nm处的吸光值(OD值)，计算细胞成活率(％)＝(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％。结果如图2所示。

由图2可知，不同浓度(10～1000μmol/L)的药物作用24h后对人乳腺癌、人肺癌和人结肠癌CTC几乎无明显毒副作用(IC₅₀>1000μmol/L)。

实施例2

研究银杏内酯B对人CTC凋亡的影响：

取对数生长期的人结肠癌或人乳腺癌CTC经胰蛋白酶消化计数后接种于6孔板中，每孔含培养基2mL，其中细胞数量为1.5×10⁵个，37℃5％CO₂细胞培养箱中培养24小时后，弃去原培养基后加入含药物培养基(10～200μmol/L)继续培养24小时。用不含EDTA的胰酶消化收集所有细胞，用PBS清洗细胞一遍，加入500μLBinding Buffer悬浮细胞，加入5μLAnnexin V-FITC混匀后，加入5μL PI染液混匀；将细胞放于室温条件下避光孵育15min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。通过Flow Jo软件进行结果分析。结果如图3和图4(人结肠癌)，以及图5和图6(人乳腺癌)所示。

由图3、图4、图5和图6可知，不同浓度(0、10、25、50、100、200μmol/L)的药物作用24h后对人结肠癌或人乳腺癌细胞凋亡情况无明显影响。

实施例3

研究银杏内酯B对人CTC细胞周期分布的影响：

取对数生长期的人乳腺癌CTC、人结肠CTC经胰蛋白酶消化计数后接种于6孔板中，每孔含培养基2mL，其中细胞数量为1.5×10⁵个，37℃5％CO₂细胞培养箱中培养24小时后，弃去原培养基后加入含不同药物浓度培养基(10、25、50、100、200μmol/L)继续培养24小时。胰酶消化收集所有细胞，1800rpm/3min离心后弃去培养基得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍细胞，再次离心后在离心管中留0.2mL PBS，加入提前预冷的75％乙醇1mL轻轻混匀后于4℃冰箱放置过夜。离心弃去乙醇，冷PBS清洗细胞一遍，加入500μL冷PBS轻轻重悬细胞，加入RnaseA溶液20μL 37℃水浴孵育30min，加入400μLPI染液，轻轻混匀后4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况通过Flow Jo软件进行结果分析。结果如图7、图8、图9和图10所示。

由图7和图8(人结肠癌)，以及图9和图10(人乳腺癌)可知，不同浓度(10～200μmol/L)的药物作用24h后对人结肠癌CTC或人乳腺癌CTC细胞周期分布无显著影响。

实施例4

研究银杏内酯B对人CTC在人静脉内皮细胞的粘附作用的影响：

人静脉内皮细胞取自健康产妇分娩的新生儿脐带，并按照本发明人在先建立的方法(Scientific reports 2014；4:4344)进行分离、传代培养与鉴定。取对数期的脐静脉内皮细胞接种于铺有明胶的24孔板中，待细胞铺满板底后，将罗丹明-123染色(绿色)的人乳腺癌CTC用培养基配制成浓度为3×10⁵个/mL单细胞混悬液，同时加入药物使其终浓度为(25、50、100、200μmol/L)，得到含不同药物浓度的单细胞混悬液。弃去24孔板中培养基，加入上述含不同药物浓度的人乳腺癌CTC单细胞混悬液500μL(1.5×10⁵个细胞)，继续放于37℃培养箱中继续培养作用1小时。弃去24孔板中培养基，用PBS清洗三遍，加入无血清无酚红培养基500μL。然后在荧光显微镜下进行拍照，随机选取6个视野，计算不同药物浓度作用后的CTC黏附于内皮细胞的粘附数量以及粘附抑制的百分比。结果如图11所示。

由图11可知，CTC与内皮细胞之间的粘附率下降与药物浓度呈量效关系，与空白对照组相比，随着药物浓度的升高，肿瘤细胞在内皮细胞表面的粘附数量下降。粘附/抑制率(Adhesion inhibition ratio,AIR)为药物的IC₁₀或IC₅₀(指药物引起受试细胞10％或50％的增殖抑制浓度)与EC₅₀(指药物引起肿瘤细胞与内皮之间的粘附效率下降50％的浓度)的比值。AIR值越大说明药物预防肿瘤转移的效果主要是由于干预肿瘤细胞与内皮之间的粘附引起的，而不是通过杀死细胞导致细胞直接“脱粘附”所致。银杏内酯B的毒性极小，使用GraphPad Prism 8计算得到的对乳腺癌CTC的IC₅₀>1000μmol/L(1386.94μmol/L)，且IC₁₀也超过了200μmol/L(207.17μmol/L)，AIR值为1.16。银杏内酯B对肺癌CTC和结肠癌CTC的IC₁₀和IC₅₀超出最大试验浓度(图2)。说明银杏内酯B主要是由于干预肿瘤细胞与内皮细胞之间的粘附而发挥作用。

实施例5

研究银杏内酯B给药21天后对小鼠体重、血常规指标的影响：

将6周龄BALB/c小鼠30只随机分为三组，每组10只，将药物银杏内酯B溶于0.5％CMC-Na中配成不同药物浓度的混悬液，单次给药剂量分别为0mg/kg、5mg/kg、100mg/kg(BID)。以口服灌胃方式给药，一天给药两次。隔天称量小鼠体重。持续给药21天后利用毛细玻璃管在小鼠眼眶静脉采血后乙醚处死。用血液分析仪分析小鼠的血常规指标。结果如图12所示。

由图12可知，不同剂量的银杏内酯B对小鼠体重几乎没有明显影响。给药剂量为0mg/kg、5mg/kg、100mg/kg(BID)三组小鼠血液的血常规指标：白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板计数(PLT)无明显变化。可见，银杏内酯B给药并不会改变血液血常规指标，不会导致炎症的产生，是一种安全的药物。

实施例6

研究银杏内酯B给药21天后对小鼠重要器官的毒副作用：

将实施例5中乙醚处死的三组小鼠(n＝8/组)解剖后取出心、肝、脾、肺、肾等器官，浸泡于含量4％的多聚甲醛组织固定液中固定48小时后，将组织放在流水中清洗，用小刀切成黄豆状大小的组织后依次进行脱水、包埋、切片、复水脱蜡、染色、封片，在正置显微镜下进行拍照。结果如图13所示。

由图13可知，给药剂量分别为0mg/kg、5mg/kg、100mg/kg(BID)的小鼠心、肝、脾、肺、肾等器官的病理切片并没有明显区别，说明银杏内酯B对其他组织器官没有毒副作用。

实施例7

研究银杏内酯B对小鼠乳腺癌CTC远端肺转移的影响：

6周龄BALB/c小鼠提前3天以灌胃形式给药，32只小鼠随机分为4组，每组8只，单次给药剂量分别为0mg/kg、5mg/kg、20mg/kg、100mg/kg，一天给药两次(BID)。第三天给药后，取处于对数生长期的小鼠乳腺癌CTC或小鼠结肠癌CTC，用胰蛋白酶消化后加入含胎牛血清的培养基终止消化，1800rpm/3min离心后弃去培养基得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍细胞，再用PBS重新悬浮细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。每只BALB/c小鼠尾静脉注射100μL细胞悬液(含1×10⁵个细胞)，模拟CTC，持续灌胃21天后乙醚处死小鼠，将肺取出用生理盐水清洗后放于Bouin氏液中固定48小时后记录肺部形成的乳腺癌结节数。而后将小鼠的肺部组织进行脱水、包埋、切片、H&E染色拍照检测。结果如图14所示。

由图14可知，给药组小鼠的肺部乳腺癌CTC结节数明显少于对照组，且结节数的多少与银杏内酯B药物存在浓度依赖性，肺部结节数的减少与银杏内酯B剂量的增加成正比。小鼠肺部组织病理切片染色显示，未给药组肿瘤较大且明显，给药组肿瘤随着剂量的增加而减小。这表明，银杏内酯B对小鼠乳腺癌CTC远端肺转移具有抑制作用。

综上所述，本发明利用人源血中肿瘤细胞微量扩增离体培养得到CTC，评价银杏内酯B对CTC毒性、凋亡情况、周期分布以及其对内皮的粘附作用的效果；利用动物模型在小鼠尾静脉注射肿瘤细胞(模拟CTC)探究银杏内酯抑制肿瘤转移的作用，系统性说明了银杏内酯B安全可靠，能够有效抑制CTC诱发的肿瘤转移。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.银杏内酯B在制备预防循环肿瘤细胞及其代谢产物诱发的肿瘤转移的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，循环肿瘤细胞的代谢产物包括循环肿瘤RNA、循环肿瘤DNA、循环microRNA和传播型癌细胞中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌或黑色素瘤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、滴丸或栓剂。

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