CN116250398A - 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法 - Google Patents

脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116250398A
CN116250398A CN202310109760.5A CN202310109760A CN116250398A CN 116250398 A CN116250398 A CN 116250398A CN 202310109760 A CN202310109760 A CN 202310109760A CN 116250398 A CN116250398 A CN 116250398A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alfalfa
seeds
alfalfa seeds
virus
amv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310109760.5A
Other languages
English (en)
Inventor
班丽萍
李瑾
李鑫
尚巧霞
刘艳琪
戴雯婷
许慧中
罗撄宁
王彦
徐洋帆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202310109760.5A priority Critical patent/CN116250398A/zh
Publication of CN116250398A publication Critical patent/CN116250398A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A01C1/08—Immunising seed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

本发明属于紫花苜蓿种子处理领域，涉及一种脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法。该方法包括以下步骤：1)将紫花苜蓿种子在2‑8倍体积无菌水中浸泡1.0‑3.0h；2)将无菌水浸泡的紫花苜蓿种子吸干水分并用1.0‑3.0％的NaClO溶液浸种0.5‑1.5h；3)用无菌水清洗NaClO溶液浸泡的紫花苜蓿种子；以及4)干燥清洗后的紫花苜蓿种子。本发明的方法可以有效降低处理过的紫花苜蓿种子所萌发幼苗的MsAPV2带毒量和AMV带毒量，同时本发明的方法还提高了紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率，整个脱毒过程简便，效率高，适合实际生产中应用。

Description

脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法
技术领域
本发明涉及紫花苜蓿种子处理领域，特别是涉及一种脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa)，素有“牧草之王”的美誉，是全世界最重要的优质豆科牧草，也是我国目前种植面积最大的牧草品种。然而在紫花苜蓿产生过程中病毒病害问题也日益凸显，制约着紫花苜蓿产业的进一步健康发展。紫花苜蓿在生长过程中受50多种病毒侵染，在我国发生最为广泛的病毒主要有紫花苜蓿甲型双分病毒2号(Medicagosativa alphapartitivirus 2,MsAPV2)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)两种。其中MsAPV2是近年来发现的一种含量高、分布广的病毒。两种病毒均可以通过紫花苜蓿种子传播，产生的幼苗中病毒含量还随幼苗生长而波动增长。幼苗作为初侵染毒源，经介体昆虫二次传播，极易造成病害的快速流行，防治难度大；同时带毒种子是病毒远距离传播的重要途径，对病毒病的发生、传播、危害影响极大。因此对种子进行脱毒处理，从源头上杜绝病原，是有效控制和预防紫花苜蓿病毒病大发生，从而减少经济损失的重要举措。
种子上常用的病毒控制方法主要有物理处理、化学药剂处理或二者联合使用，可以起到钝化、脱除部分种子携带病毒的作用。目前，这些脱毒技术已运用于南瓜、甜瓜、番茄和辣椒种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus,CGMMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜瓜坏死斑病毒(Melon necroticspotvirus，MNSV)、茄瓜花叶病毒(Pepino mosaic virus,PepMV)、番茄褐果病毒(Tomato brownrugosefruit virus,ToBRFV)和蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的脱除中，脱除效率在49.77％到100％。
不同于上述作物种子，紫花苜蓿种子多为肾形，种子体积较小，有饱满的种胚和栅栏细胞紧密排列的种皮，因此对高温、化学药剂的耐受程度与其他作物种子有较大差异，处理不当还极有可能会影响种子的发芽势和发芽率。在紫花苜蓿上目前仅针对可能引起肠胃炎的人类诺如病毒(Human norovirus,HuNoV)、鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)和杜兰病毒(Tulane virus,TV)进行了种子脱毒研究，主要是采用Ca(OCl)2或臭氧处理紫花苜蓿种子，脱毒效率为66.03％～82.78％。此外，由于病毒种属差异，导致理化性质例如病毒致死温度、致死时间的极大差异，故对于化学药剂的选择也有严苛的要求。目前对于紫花苜蓿种子上常见的病毒AMV的脱除研究，仅在甜椒(Capsicum annuum)种子中进行。在干热处理(50℃处理60min或120min；90℃处理90min或120min；120℃处理120min)甜椒种子后，通过ELISA的方法在幼苗上检测AMV，脱毒效率虽能达到100％，但是处理过后甜椒种子发芽率仅为4％～42％，在实际生产中实用性太差。对于紫花苜蓿种子中植物病毒的脱除研究非常少，尤其对于广泛分布的AMV和MsAPV2，尚不存在有效脱除方法。
因此，在紫花苜蓿种子脱毒处理中，找到一个有效脱除紫花苜蓿种子中病毒、尤其是MsAPV2和AMV的方法，既能够保障种子脱毒效果，又不影响种子活力，是一个亟待解决的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是，提供一种脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法，以解决紫花苜蓿种子脱毒效率低、脱毒后紫花苜蓿种子发芽率低的问题。
本发明的目的及其技术问题的解决可以通过以下技术方案来实现。
本发明提供了一种脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法，包括以下步骤：
1)将紫花苜蓿种子在2-8倍体积无菌水中浸泡1.0-3.0h；
2)将无菌水浸泡后的紫花苜蓿种子吸干水分并用2-8倍体积1.0-3.0％的NaClO溶液浸种0.5-1.5h；
3)用无菌水清洗NaClO溶液浸泡的紫花苜蓿种子；以及
4)干燥清洗后的紫花苜蓿种子。
在本发明的一个实施方案中，植物病毒是MsAPV2。
在本发明的一个实施方案中，植物病毒是AMV。
在本发明的一个实施方案中，植物病毒是MsAPV2和AMV。
在本发明的另一实施方案中，本发明的方法还包括：
5)病毒检测步骤，即利用荧光定量PCR对脱毒前后紫花苜蓿种子和幼苗的cDNA进行荧光定量PCR检测并计算紫花苜蓿种子和幼苗的脱毒效率。
与现有技术相比，本发明具有明显有益的技术效果。具体而言，本发明具有如下优点：
1)本发明提供的方法操作简便且所需材料常见、成本低廉。本发明中采用的无菌水为实验室常见用品，在实际生产中也可以通过高压灭菌很快获得；NaClO是常见的漂白剂，容易获得，配制简单。全部脱毒过程耗时较短，操作简便。
2)本发明创新性的先将紫花苜蓿种子浸泡于无菌水中浸种，为使种子吸涨种皮变软或破裂，增加种皮通透性，使后续的化学处理更加有效。而且此方法可以同时有效地降低MsAPV2和AMV这两种病毒在紫花苜蓿幼苗中的含量，极大地节约了生产成本和所需时间，而且还可以提升紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率；
3)相较于传统机械传毒、血清学检测和常规PCR检测方法极大地提高了病毒检测的灵敏度(是RT-PCR灵敏度的100-1000倍)和准确性，同时还缩短了检测时间，相较于探针法荧光定量PCR检测，在通过熔解曲线保证特异性的前提下，省去了探针引物构建的成本。
附图说明
图1显示了AMV和MsAPV2两种病毒qRT-PCR与RT-PCR检测方法灵敏性对比实验，其中M：DL2000 DNA maker；(A)Line 1-8为从1.08×108～1.08×101copies/μL按照10倍稀释浓度的AMV质粒；(B)Line 1-8为从6.64×107copies/μL～6.64×100copies/μL按照10倍稀释浓度的MsAPV2质粒。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
本发明人针对我国种植面积最大的牧草紫花苜蓿的种子，结合发明人前期的探索以及对MsAPV2和AMV种子传播性质和病毒本身的生物学特性的研究，通过荧光定量PCR试验精准对比15种不同的种子脱毒处理的效果，最终创造性地提出了一种可以有效降低紫花苜蓿种子及其萌发的幼苗中MsAPV2和AMV的带毒量的方法，即先将紫花苜蓿种子在2-8倍体积无菌水中浸种1-3h，使种子吸涨、种皮变软或破裂，增加种皮通透性，之后吸干水分，用1.0-3.0％的NaClO溶液浸种0.5-1.5h，对种子中的病毒进行消除，最终可以有效地使得处理过的紫花苜蓿种子所萌发的紫花苜蓿幼苗的MsAPV2带毒量降低93.72％，AMV带毒量降低68.73％，同时该方法还提高了紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率，整个脱毒过程简便，效率高，适合实际生产中应用。
本发明提供的脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法包括以下步骤：
1)将紫花苜蓿种子在2-8倍体积无菌水中浸泡1.0-3.0h；
2)将无菌水浸泡后的紫花苜蓿种子吸干水分并用2-8倍体积1.0-3.0％的NaClO溶液浸种0.5-1.5h；
3)用无菌水清洗NaClO溶液浸泡的紫花苜蓿种子；以及
4)干燥清洗后的紫花苜蓿种子。
在本发明的一个实施方案中，植物病毒是MsAPV2。
在本发明的一个实施方案中，植物病毒是AMV。
在本发明优选的实施方案中，植物病毒是MsAPV2和AMV。
在本发明的一个实施方案中，在步骤1)中，将紫花苜蓿种子浸泡于2-8倍体积无菌水中，例如2倍体积、3倍体积、4倍体积、5倍体积、6倍体积、7倍体积、8倍体积，优选5倍体积。在另一个实施方案中，紫花苜蓿种子浸泡于无菌水中的时间可以为1.0-3.0h，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，优选2.0h。
在本发明优选的实施方案中，在步骤1)中，将紫花苜蓿种子在5倍体积无菌水中浸泡2h。
在本发明的一个实施方案中，NaClO溶液的浓度可以为1.0-3.0％。在具体实施方案中，NaClO溶液的浓度可以1.0％、1.1％、1.2％、1.0％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％，优选2.0％。NaClO溶液浸泡时间可以为0.5-1.5h，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5h，优选1.0h。
在本发明优选的实施方案中，在步骤2)中，将紫花苜蓿种子在2.0％的NaClO溶液中浸泡1.0h。
在本发明的一个实施方案中，步骤1)和2)可以在室温下进行，例如25℃左右，例如22℃、23℃、24℃、25℃、26℃。
在本发明的一个实施方案中，在步骤3)中，清洗进行至少3次，例如3、4、5、6、7次，优选5次。
在本发明的一个实施方案中，干燥可以通过滤干紫花苜蓿种子的水分然后自然晾干来进行，或者通过本领域技术人员已知的其他干燥方式来进行，例如烘干。
本发明提供的脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法还可以包括：5)病毒检测步骤，即利用荧光定量PCR对脱毒前后紫花苜蓿种子和幼苗的cDNA进行荧光定量PCR检测并计算紫花苜蓿种子和幼苗的脱毒效率。
在本发明的一个实施方案中，病毒检测步骤具体包括：
5.1)利用MsAPV2和AMV重组质粒分别构建MsAPV2标准曲线回归方程和AMV标准曲线回归方程；
5.2)以处理前后紫花苜蓿种子和幼苗样本cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，以荧光定量PCR反应后的Ct作为y带入标准曲线回归方程，计算样本中AMV和MsAPV2的基因拷贝数；
5.3)利用下述公式计算紫花苜蓿种子和幼苗脱毒效率：
Figure BDA0004076335640000061
Figure BDA0004076335640000062
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1紫花苜蓿种子脱毒处理试验
试验1.将紫花苜蓿种子在2倍体积无菌水中浸泡3h，之后吸干水分并用3％的NaClO溶液浸泡0.5h，处理结束后用无菌水清洗3次，滤干水分后自然晾干。
试验2.将紫花苜蓿种子在8倍体积无菌水中浸泡1h，之后吸干水分并用1％的NaClO溶液浸泡1.5h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干。
试验3.将紫花苜蓿种子在6倍体积无菌水中浸泡1.5h，之后吸干水分并用1.5％的NaClO溶液浸泡1h，处理结束后用无菌水清洗3次，滤干水分后自然晾干。
试验4.将紫花苜蓿种子在4倍体积无菌水中浸泡2.5h，之后吸干水分并用3％的NaClO溶液浸泡0.5h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干。
试验5.将紫花苜蓿种子在5倍体积无菌水中浸泡2h，之后吸干水分并用2％的NaClO溶液浸泡1h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干。
比较例
将以下现有种子脱毒方法作为比较例：
比较例1、未处理对照：将紫花苜蓿种子不做处理，直接用于后续实验；
比较例2、干热处理法：将紫花苜蓿种子放置于70℃烘箱内，处理72h后自然冷却；
比较例3、干热处理法：将紫花苜蓿种子放置于80℃烘箱内，处理72h后自然冷却；
比较例4、温汤处理法：将紫花苜蓿种子浸泡于5倍体积60℃无菌温水中浸种1h，之后吸干水分，自然晾干；
比较例5、浸泡处理法：将紫花苜蓿种子浸泡于5倍体积无菌水中浸种2h，之后吸干水分，自然晾干；
比较例6、Na3PO4处理法：用10％Na3PO4溶液将紫花苜蓿种子浸泡4h，之后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干；
比较例7、NaClO处理法：用2％NaClO溶液将紫花苜蓿种子浸泡1h，之后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干；
比较例8、浸泡+Na3PO4处理法：先将紫花苜蓿种子在5倍体积无菌水中浸种2h，之后吸干水分用10％Na3PO4溶液浸泡1h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干；
比较例9、浸泡+0.5％NaClO处理法：先将紫花苜蓿种子在5倍体积无菌水中浸种2h，之后吸干水分用0.5％NaClO溶液浸泡1h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干；
比较例10、浸泡+5％NaClO处理法：先将紫花苜蓿种子在5倍体积无菌水中浸种2h，之后吸干水分用5％NaClO溶液浸泡1h，处理结束后用无菌水清洗5次，滤干水分后自然晾干。
实施例2.种子萌发能力检测
在150mm培养皿中放置两层滤纸，用无菌水润湿。从实施例1脱毒处理后的紫花苜蓿种子中挑选100粒饱满的种子，放入培养皿中于光周期16L：8D和湿度60％的培养箱中培养，每天记录种子发芽情况，以超过胚轴1/2作为发芽标准，根据公式3计算发芽势，公式4计算发芽率。
Figure BDA0004076335640000081
Figure BDA0004076335640000082
实施例3.病毒检测
在本实施例中，利用荧光定量PCR对脱毒处理前后紫花苜蓿种子以及紫花苜蓿幼苗的cDNA进行定量检测，并计算种子脱毒效率和幼苗脱毒效率。具体过程如下：
1、种子RNA提取。随机选取20粒处理后的种子或未处理的种子作为一个重复，每个处理三个重复，液氮速冻后用研磨仪以1200rpm的速度研磨90sec，样品研磨成粉末状后用CTAB法提取RNA。
2、幼苗RNA提取。随机选取10株幼苗作为一个重复，每个处理三个重复，液氮速冻后用研磨仪以1200rpm的速度研磨90sec，样品研磨成粉末状后用TRIzol提取RNA。
3、RNA反转录。以每个样品的总RNA为模板，用UnionScript First-strand cDNASynthesis Mix for qPCR(with dsDNase)试剂盒(北京金沙生物科技有限公司)进行cDNA合成。具体操作按照说明书进行。
4、荧光定量PCR方法构建。运用已有的MsAPV2和AMV重组质粒(用MsAPV2和AMV特异性引物扩增出目的片段后，回收目的片段，将胶回收产物和T，转化于DH5α大肠杆菌中，挑取转化子测序，测序成功菌体继续扩繁后提取重组质粒)，依据公式5计算重组质粒DNA标准品的初始拷贝数(每个碱基对的分子量采用660道尔顿)。重组质粒使用Easy Dilution(宝日医生物技术(北京)有限公司)进行连续10倍稀释。
Figure BDA0004076335640000083
将上述制备的重组质粒DNA标准品作为模板，利用MsAPV2特异性引物(F:5’-GAGCCTTTGCTCCTCTGGACT-3’,R:5’-GCAGCTTCATTGGCAGCAAC-3’)和AMV特异性引物(F:5’-GAAGTTCGGGTTTGAGYTGGTC-3’,R:5’-GACCCAAACTTCGTTGAATCG-3’)进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系如下：
Figure BDA0004076335640000091
反应条件及熔解曲线条件如下：
Figure BDA0004076335640000092
每个模板做3个重复，取平均值用于病毒含量结果分析。根据目标产物与其它非特异产物的熔解温度不同，熔解曲线可通过其是否为单峰用于判断qPCR扩增产物的特异性。根据计算不同浓度下的Ct值，最终构建的MsAPV2标准曲线回归方程为：y＝-3.10x+37.42，构建的AMV标准曲线回归方程为：y＝-3.36x+40.65。
灵敏性对比检测
将10倍稀释的质粒标准品取8个浓度作为模板DNA，按照普通PCR扩增方法进行扩增，通过1.5％琼脂糖凝胶检测，检测结果与荧光定量PCR对比灵敏度。PCR反应体系如下：
Figure BDA0004076335640000093
检测结果表明，常规PCR反应MsAPV2质粒浓度在6.64×103copies/μL及以上才有条带，在6.64×102copies/μL及以下没有扩增条带。说明常规PCR检测的下限为6.64×103copies/μL。表明MsAPV2荧光定量PCR比常规PCR敏感100倍(图1A)。常规PCR反应在AMV质粒浓度为1.08×105copies/μL及以上才有条带，在1.08×104copies/μL及以下没有扩增条带。说明常规PCR检测的下限为1.08×105copies/μL。AMV荧光定量PCR比常规PCR敏感1000倍(图1B)。
5、病毒定量检测。以处理前后种子cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，以荧光定量PCR反应后的Ct作为y带入标准曲线回归方程，计算样本中MsAPV2和AMV的基因拷贝数。
6、计算种子(公式1)和幼苗(公式2)脱毒效率：
Figure BDA0004076335640000101
Figure BDA0004076335640000102
7、脱毒结果分析
通过荧光定量PCR对15种脱毒处理后的紫花苜蓿种子进行病毒检测，结果发现所有处理均对降低紫花苜蓿种子和幼苗中MsAPV2(表1)及AMV(表2)病毒含量有效果。对MsAPV2而言，15种处理方法对苜蓿种子全部有效，病毒脱除效率在81.84％以上(表1)，同样60℃热水浸泡处理1h(比较例4)效果为最佳，脱毒效率达到98.89％，但根据表3中种子发芽率情况，比较例4发芽率仅为46.25％，因此不适合作为脱毒处理方式使用；为了更准确判断脱毒处理的效果，对紫花苜蓿幼苗进行MsAPV2检测15种处理方法使幼苗带毒量减少51.37％～97.30％，效果最佳的是10％Na3PO4浸种4h(比较例6)，但是由于其影响种子发芽势和发芽率，因此在实际应用中会效果欠佳，因此结合发芽率与病毒含量结果，无菌水浸泡2h后2％NaClO浸种1h(试验5)为降低紫花苜蓿种子中新型病毒MsAPV2的最佳方式。
对AMV而言，15种处理方法对苜蓿种子全部有效，病毒脱除效率在70.60％以上，其中60℃热水浸泡处理1h(比较例4)效果最佳，脱毒效率达到99.55％，但由于发芽率较低，不适合作为脱毒处理方式使用。对紫花苜蓿幼苗进行AMV检测，15种方法中有3种方法没有效果(比较例2、3和4)，其余方法脱毒效率为13.64％～69.49％，其中2％NaClO浸种1h(比较例7)、5倍无菌水浸泡2h之后2％NaClO浸种1h(试验5)及10％Na3PO4浸种4h(比较例6)的处理效果均超过60％(表2)。但是由于比较例6中种子发芽率仅为75.00％(表3)，故也不适用于实际使用。因此结合发芽率与病毒含量结果，适用于紫花苜蓿种子的脱除AMV的方法为用无菌水浸泡之后用NaClO浸种，此方法可以在第一次浸泡的时候使种子吸涨有利于之后NaClO作用种子达到脱毒的效果，其中最佳方法为试验5，5倍无菌水浸泡2h之后2％NaClO浸种1h。
综上，在紫花苜蓿种子中，常带的病毒为MsAPV2和AMV，根据试验结果本发明提供的先将将紫花苜蓿种子在2-8倍体积无菌水中浸泡1.0-3.0h，之后再用1.0-3.0％的NaClO溶液浸种0.5-1.5h，后清洗并晾干种子的方法，可以有效降低两种病毒的含量并且对种子萌发没有影响。其效果优于单独用水浸泡(比较例5)、单独用NaClO溶液浸种(比较例7)以及组合使用时用极低或极高的NaClO溶液浸种(比较例9、10)的方式；相较于另一种化学试剂Na3PO4(比较例6、8)的处理效果，本发明提供的方法可以有效的提高种子的发芽率和发芽势；相较于热处理中的干热(比较例2、3)和湿热(比较例4)处理，本发明提供的方法在脱毒处理效果和种子萌发方面都有着绝对优势。因此，本发明提供的方法不仅取材方便、操作简单，而且取得的脱毒效果好，还可以促进种子萌发，是降低侵染紫花苜蓿种子MsAPV2和AMV病毒含量的有效方法。
表1.紫花苜蓿种子MsAPV2脱毒效果
Figure BDA0004076335640000121
表2.紫花苜蓿种子AMV脱毒效果
Figure BDA0004076335640000131
表3.不同脱毒处理对中苜一号紫花苜蓿种子发芽率和发芽势
Figure BDA0004076335640000141

Claims (10)

1.脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将紫花苜蓿种子在2-8倍体积无菌水中浸泡1.0-3.0h；
2)将无菌水浸泡的紫花苜蓿种子吸干水分并用1.0-3.0％的NaClO溶液浸种0.5-1.5h；
3)用无菌水清洗NaClO溶液浸泡的紫花苜蓿种子；以及
4)干燥清洗后的紫花苜蓿种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病毒是紫花苜蓿甲型双分病毒2号(Medicago sativa alphapartitivirus 2,MsAPV2)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病毒是苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaic virus,AMV)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病毒是MsAPV2和AMV。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将所述紫花苜蓿种子浸泡于5倍体积无菌水中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述浸泡进行2h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述NaClO溶液的浓度为2％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述浸泡进行1h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：5)病毒检测步骤，即利用荧光定量PCR对脱毒前后紫花苜蓿种子和幼苗的cDNA进行荧光定量PCR检测并计算紫花苜蓿种子和幼苗的脱毒效率。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤5)具体包括：
5.1)利用AMV和MsAPV2重组质粒分别构建AMV标准曲线回归方程和MsAPV2标准曲线回归方程；
5.2)以处理前后紫花苜蓿种子和幼苗样本cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，以荧光定量PCR反应后的Ct作为y带入标准曲线回归方程，计算样本中MsAPV2和AMV的基因拷贝数；
5.3)利用下述公式计算紫花苜蓿种子和幼苗脱毒效率：
Figure FDA0004076335620000021
Figure FDA0004076335620000022
CN202310109760.5A 2023-02-14 2023-02-14 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法 Pending CN116250398A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310109760.5A CN116250398A (zh) 2023-02-14 2023-02-14 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310109760.5A CN116250398A (zh) 2023-02-14 2023-02-14 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116250398A true CN116250398A (zh) 2023-06-13

Family

ID=86683768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310109760.5A Pending CN116250398A (zh) 2023-02-14 2023-02-14 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116250398A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113604490B (zh) 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用
CN112898391B (zh) 枳抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遗传改良中的应用
CN102329805A (zh) 一种水稻OsMYB基因的编码序列和应用
CN106754925A (zh) 一种脱落酸快速诱导启动子及其应用
CN111778226B (zh) 一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用
CN110616225B (zh) 玉米生长素转运基因ZmABCB15及其在抗粗缩病中的应用
CN115418410B (zh) 黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法
CN116250398A (zh) 脱除紫花苜蓿种子中植物病毒的方法
CN107667857B (zh) 一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法
CN116855495A (zh) 受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pGhPER21及其制备方法和应用
CN108409846B (zh) 一种大豆耐盐相关myb转录因子及其编码基因与应用
CN115161332B (zh) 一种刺葡萄VdERF2基因及其编码蛋白和应用
CN112322653B (zh) 一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法
CN112708634B (zh) 一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法
CN111961672A (zh) 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用
CN109053870B (zh) AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用
CN111926022A (zh) 水稻耐盐胁迫基因OsNBR1的克隆及应用
CN116622729B (zh) 一种撑×绿竹竹梢枯病的抗病基因及其应用
CN115948460B (zh) 辣椒抗疫病相关基因CaWRKY66及其应用
CN109762833B (zh) 一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用
Li et al. Construction of expression vectors of the melon resistance gene fom-2 and genetic transformation
CN117587029A (zh) 一种培育矮化、分蘖增加、叶色变浅的转基因植物的方法及其应用
CN106498027A (zh) 一种玉米抗粗缩病鉴定方法
CN118345197A (zh) 一种检测菊花b病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法和应用
CN116762695A (zh) 一种枣树茎尖脱毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination