CN116249710A - 治疗性抗体 - Google Patents

治疗性抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN116249710A
CN116249710A CN202180058009.6A CN202180058009A CN116249710A CN 116249710 A CN116249710 A CN 116249710A CN 202180058009 A CN202180058009 A CN 202180058009A CN 116249710 A CN116249710 A CN 116249710A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
seq
ser
antibody
sequence identity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180058009.6A
Other languages
English (en)
Inventor
艾伦·布拉德利
安德鲁·詹姆斯·汤普森
丹尼尔·约翰·波兰德
王珏璇
罗伯托·班迪耶拉
史蒂夫·霍尔姆斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pete Maidi Co ltd
Original Assignee
Pete Maidi Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pete Maidi Co ltd filed Critical Pete Maidi Co ltd
Publication of CN116249710A publication Critical patent/CN116249710A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及调节OX40信号通路以治疗伴侣动物中的炎症性疾病例如特应性皮炎(AD)和/或湿疹的抗体。还描述了相关方法和用途。

Description

治疗性抗体
引言
本发明涉及调节OX40信号通路以治疗伴侣动物中的炎性疾病的抗体。
特应性皮炎(AD)和/或湿疹，以慢性、干燥、发痒、皮肤发红为特征，是狗的一个严重问题，影响10％-15％的宠物狗。
赛妥敏(Cytopoint)是目前治疗狗特应性皮炎的一种方法，建议每月注射一次，最低剂量为1mg kg-1。赛妥敏是一种抗IL31抗体(例如在WO2013/011407A1和WO2019/177697中描述的)，专门用于治疗与特应性皮炎相关的痒症(瘙痒)。然而，至少有三分之一的犬AD患者对赛妥敏的反应不是令人满意的，在某些情况下，第一次注射后疗效可能会降低(例如，参见“CYTOPOINT EMA/118401/2017(EMEA/V/C/003939/0000)的CVMP评估报告”，以及世界兽医皮肤病学会，2017年5月的赛妥敏圆桌会议，https://wavd.org/wp-content/uploads/cytopoint-roundtable-2017-05.pdf)。赛妥敏最常见的副作用(可能影响高达1000只动物中的1只)是变态反应，如过敏反应、面部水肿和荨麻疹。体重低于3公斤的狗不得给予赛妥敏。(https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/cytopoint-epar-product-information_en.pdf).
需要改进的治疗方法，以及治疗疾病根本原因而非症状的药物。特别是，需要一种安全、作用持续时间长、有效的治疗，以覆盖更广泛的患者，特别是无应答者。
有利地，靶向炎症级联中上游的OX40/OX40L提供了同时调节多种细胞因子的可能性。
US 10,196,435中描述了犬OX40L。迄今为止，科学或专利文献中尚未报道犬OX40的蛋白质序列。
Willett et al,Journal of Virology,81(18),2007,pages 9665-9679描述了结合猫CD134(OX40)的单克隆抗体(7D6)及其对猫免疫缺陷病毒的作用。
以前未示出OX40L或OX40抗体在治疗伴侣动物(如狗)中的免疫调节疾病，如特应性皮炎中的用途。
发明声明
在第一方面，本发明涉及抗体或其片段，其特异性结合伴侣动物OX40L或伴侣动物OX40。
伴侣动物可能是狗或猫。
在一个实施方案中，抗体或片段结合犬OX40L。
在一个实施方案中，抗体或片段能够：
a)降低、抑制或中和伴侣动物或伴侣动物细胞中的OX40活性或活化；
b)改变伴侣动物或伴侣动物细胞中细胞因子的分泌和/或
c)减少伴侣动物或伴侣动物细胞中白细胞的增殖。
在一个实施方案中，抗体或片段能够：
a)降低、抑制或中和伴侣动物或伴侣动物细胞中的OX40活性或活化；
b)减少伴侣动物或伴侣动物细胞中炎性细胞因子的分泌和/或
c)减少伴侣动物或伴侣动物细胞中炎性趋化因子或趋化因子受体的分泌和/或
d)增加伴侣动物或伴侣动物细胞中抑制性细胞因子的分泌和/或
e)增加伴侣动物或伴侣动物细胞中抑制性趋化因子或趋化因子受体的分泌和/或
f)减少伴侣动物中白细胞的增殖。
本文描述了评估这些性质的合适测定，例如用于测量NFkB活性的抑制的混合淋巴细胞反应(MLR)测定或HEK蓝测定，例如实施例中所示的测定，例如PBMC活化测定。其他测定是本领域技术人员已知的，也是可以使用的。
细胞因子或细胞因子受体可选自TNFα、IL-1Ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、RANTES、GM-CSF、TGF-β和干扰素γ。
在一个实施方案中，抗体或片段结合犬OX40。抗体或片段能够降低、抑制或中和伴侣动物或伴侣动物细胞中的OX40活性或活化。
在上述的一个实施方案和本发明涉及结合OX40或OX40L的抗体的各个方面中，抗体或片段是完全犬、嵌合或犬源化的抗体。术语“完全犬”和“犬”在本文中可互换使用。根据优选实施方案，抗体是犬(即完全犬)的。
例如，所述片段选自F(ab')2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重链(VH)、可变轻(VL)链、CDR区、单个VH或VL结构域、大抗体、小抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体和双scFv，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述至少一部分免疫球蛋白足以向多肽赋予特异性抗原结合。
在一个实施方案中，抗体或片段与另一部分缀合。抗体或片段可包含治疗部分、半衰期延长部分或标记。
在另一方面，本发明涉及结合分子，其包含上述抗体或片段。
在另一方面，本发明涉及上述的抗体或片段或结合分子，用于治疗疾病。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如上所述的抗体或其片段或结合分子。
在另一方面，本发明涉及如上所述的抗体或其片段、结合分子药物，用于治疗OX40或OX40L介导的疾病。
在另一方面，本发明涉及治疗或预防OX40或OX40L介导的疾病的方法，其包括向需要其的受试者施用上述抗体或片段、结合分子或药物组合物。
例如，该疾病选自炎症性或自身免疫性疾病。
该疾病可以是炎症性皮肤病，包括特应性皮炎、过敏性皮炎、瘙痒症、银屑病、硬皮病或湿疹；与炎症性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)相关的反应；缺血再灌注；成人呼吸窘迫综合征；哮喘；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、血管炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎症性疾病、继发于败血症或创伤的多器官损伤综合征、细菌性肺炎、抗原抗体复合物介导的疾病；肺部的炎症，包括胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维化。
在一个实施方案中，抗体或片段、结合分子、药物组合物与一种或多种治疗剂一起施用。
例如，所述一种或多种治疗剂选自雷帕霉素(西罗莫司)、他克莫司、环孢菌素(例如
Figure BDA0004113515770000041
)、皮质类固醇(例如甲基强的松龙)、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、抗CD28抗体、抗IL12/IL-23抗体、抗CD20抗体、抗CD30抗体、CTLA4-Fc分子、CCR5受体拮抗剂、抗CD40L抗体、抗VI_A4抗体、抗LFA1抗体、氟达拉滨、抗CD52抗体、抗CD45抗体、环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、抗补体C5抗体、抗a4b7整联蛋白抗体、抗IL6抗体、抗IL6-R抗体、抗IL2R抗体、抗CD25抗体、抗TNFa(TNFα)/TNFa-Fc分子、HDAC抑制剂、JAK抑制剂，如JAK-1和JAK-3抑制剂、抗IL-31抗体、SYK抑制剂、抗IL-4Ra抗体、抗IL-13抗体、抗TSLP抗体、PDE4抑制剂、lokietmab
Figure BDA0004113515770000042
和奥拉替尼(Oclacitinib)/>
Figure BDA0004113515770000043
在另一方面，本发明涉及减少细胞因子分泌的方法，其包括向需要其的受试者施用上述抗体或片段、结合分子或药物组合物。
在另一方面，本发明涉及多特异性结合剂，其包含如上所述的抗体或片段或结合分子。
在另一方面，本发明涉及组合疗法，其包含上述抗体或片段、结合分子或药物组合物。
在另一方面，本发明涉及免疫缀合物，其包含上述抗体或片段或结合分子。
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含上述抗体或其片段、结合分子或药物组合物。
在另一方面，本发明涉及分离的犬OX40蛋白，其包含SEQ ID NO.4或6或其变体。
在另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，其编码上述蛋白质，任选地包含SEQ IDNO.3或5或其变体。
在另一方面，本发明涉及载体，其包含上述核酸。
在另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含如上所述的核酸或载体，其中宿主细胞任选地选自哺乳动物、酵母、植物或细菌细胞。
在另一方面，本发明涉及检测伴侣动物中OX40L或OX40的方法，其包括使测试样品与上述抗体或片段或结合分子接触。
在另一方面，本发明涉及三聚体可溶性伴侣动物OX40L细胞外结构域探针及其在筛选伴侣动物OX40L抗体的方法中的应用。
本发明在以下非限制性附图和表格中描述。
附图
图1.OX40和OX40L核苷酸序列。A.狗基因组中外显子的预测数量和排列。外显子用方框表示。线上方的数字表示核苷酸中每个外显子的预测大小。线下方的数字表示核苷酸中内含子的预测大小，5'UTR和3'UTR(阴影框)。使用NCBI Assembly ID:(CanFam3.1)进行预测。通过RT-PCR确认预测的编码序列的大小和序列。B.本研究中使用的一些构建体的草图表示。
图2.两个OX40剪接变体的核苷酸序列。A.由外显子1-7(SEQ ID NO.157)组成的全长剪接变体的核苷酸序列。B.第二个剪接变体缺少外显子6(大写文本)(SEQ ID NO.158)。C.相应氨基酸(SEQ ID No.4和6)的比对如下所示。基于与其他物种OX40蛋白的同源性，预测外显子6含有跨膜结构域。在两个图中，预测的5’UTR和3’UTR以小写斜体显示。这些序列的草图表示如图1所示。
图3.PHA激活的狗PBMC中两个剪接变体的相对丰度，如通过无偏性亚克隆RT-PCR产物的诊断PCR所确定的。在活化后1天和4天对独立的PBMC样品进行测量。插入：短(S)和长(L)剪接变体的PCR辨别。+ve＝阳性对照。1kb Plus DNA序列梯(NEB)，在0.5、1.0和3.0bp处具有较亮的带。
图4.使用流式细胞仪测量免疫和未免疫小鼠的血清抗体滴度。A.在未免疫的小鼠中，没有明显的抗体与未转染细胞(△)或稳定表达OX40L的细胞(○)结合。B.在第一次加强后10天收集免疫小鼠的血清，并在未转染细胞
Figure BDA0004113515770000051
和稳定表达OX40L的细胞(□)之间产生了明显的区别。在本实施例中，水动力尾静脉注射用于初级免疫，OX40L在小鼠胚胎成纤维细胞中稳定表达，用于随后的基于细胞的加强。
图5.测定OX40-OX40L相互作用的功能测定。A.代表性曲线显示了分泌的碱性磷酸酶的酶活性，碱性磷酸酶在HEK-蓝-OX40与HEK-OX40L细胞混合后6小时、24小时和48小时释放。所有曲线都是用单独用培养基获得的信号减去基线。
图6.OX40L的核苷酸序列。A.克隆自狗的全长序列，预测的UTR以斜体显示(SEQ IDNO.159)。B.分泌的OX40L构建体，其包含IL-2信号序列(大写字母，下划线)、His标签(大写字母、阴影)、AviTag(大写字母，粗体)、亮氨酸拉链(小写字母，阴影)、GS接头(大写字母，粗体，下划线)和在细胞外跨膜结构域连接处被截短的OX40L的细胞外结构域(SEQ IDNO.160)。这些序列的草图表示如图1所示。
图7.含有OX40L细胞外结构域(ECD)的可溶性蛋白质的示意图。A.含有单体人IgG1(mvhfc)、6×组氨酸(HIS)标签和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割肽的单体OX40L探针。B.含有鸡生腱蛋白C三聚体结构域和人IgG1 Fc或HIS标签的三聚体OX40L探针。术语三聚体是指OX40L细胞外结构域的构象。
图8.候选OX40L抗体的单剂量细胞结合测定。直方图显示了通过表达OX40L的HEK293细胞或亲本系的流式细胞术获得的信号的重叠强度，所述表达OX40L的HEK293细胞或亲本系用候选OX40L抗体染色，随后用荧光标记的二级抗体染色。与亲本系相比，图中所示的所有抗体以更高的亲和力结合表达OX40L的HEK细胞。
图9.密度图显示了负载有PMX014和PMX020(或无抗体作为对照，左图)并随后用OX40L单体(上图)或三聚体(Fc融合)探针(下图)染色的OneComp eBeads的流式细胞术。虽然PMX014结合两种探针，但PMX020仅结合三聚体探针。
图10.结合表达OX40L的HEK细胞上的OX40L的抗体的亲和力测定。通过绘制几何均值任意单位(AU)相对于Log10[浓度]来生成图表。使用Prism计算Kd(EC50)。Kd(PMX 012)＝3.0017e-9M；Kd(PMX 013)＝1.653e-7M；Kd(PMX 014)＝5.122e-9M；Kd(PMX 016)＝3.743e-8M；Kd(PMX 017)＝3.004e-8M；Kd(PMX 018)＝2.360e-8M；Kd(PMX 019)＝4.488e-9M；Kd(PMX020)＝2.803e-9M。
图11.结合表达OX40L的MEF细胞上的OX40L的抗体的亲和力测定。通过绘制几何均值任意单位(AU)相对于Log10[浓度]来生成图表。使用Prism计算Kd(EC50)。Kd(PMX 013)＝2.272e-8M；Kd(PMX 014)＝1.111e-9M；Kd(PMX 016)＝1.078e-7M；Kd(PMX 017)＝1.068e-8M；Kd(PMX 019)＝3.826e-8M；Kd(PMX 020)＝7.101e-10M。
图12.结合犬IgGB Def2和Def7骨架中配制的OX40L的抗体的亲和力测定。实验使用表达OX40L的HEK细胞进行。通过绘制几何均值任意单位(AU)值相对于Log10[浓度]来生成图表。使用Prism计算Kd(EC50)。Kd(PMX014 Def2)＝7.462e-008M；Kd(PMX014 Def7)＝7.424e-008M；Kd(PMX020 Def2)＝4.539e-008M；Kd(PMX020 Def7)＝5.813e-008M。Def2或Def7骨架不改变可变区的亲和力。
图13.结合OX40L的抗体的单浓度阻断测定(HEK蓝测定)。数据用最大信号(100％)和最小信号(0％)进行归一化，最大信号由在无抗体的情况下获得的响应定义，最小信号(0％)在单独存在HEK-蓝-OX40细胞的情况下测量。统计检验，Dunnett多重比较检验，adj p<0.0001(***)，adj p＝0.0063(**)。
图14.结合OX40L的抗体的浓度依赖性阻断(HEK蓝测定)。数据用最大信号(100％)和最小信号(0％)进行归一化，最大信号由在无抗体的情况下获得的响应定义，最小信号(0％)在单独存在HEK-蓝-OX40细胞的情况下测量。
图15.PMX012至PMX023的重链可变区蛋白序列的比对。灰色的残基在所有比对的序列中都是保守的。
图16.PMX012至PMX023的轻链可变区蛋白序列的比对。灰色的残基在所有比对的序列中都是保守的。
图17.结合OX40L的抗体的重链可变区蛋白序列的比对，按同源性分类。灰色的残基在各组中所有比对的序列中都是保守的。
图18.结合OX40L的抗体的轻链可变区蛋白序列的比对，按同源性分类。灰色的残基在各组中所有比对的序列中都是保守的。
图19.显示了IgG B突变体的CDC活性：Def突变体抑制IgG-B CDC活性。补体依赖性细胞毒性测定显示，与野生型(WT)犬IgG-B相比，效应子功能缺陷型IgG-B突变体Def1、2、3、5、6、7、8和9对表达人CD20的犬T细胞(CLBL1 hCD20)的补体依赖性杀伤降低。本测定中使用的所有抗体都具有奥法木单抗(Ofatumumab)可变区。数据以杀死百分比绘制，其中100％表示所有细胞都被杀死，0％表示信号与在对照细胞(未添加抗体)中获得的相同。
表1.氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例。
表2.核酸和氨基酸序列。
表3.在所示实验中测定的PMX012、PMX014和PMX023的亲和力(Kd)。SPR数据仅显示平衡时的Kd值。
表4.IC50值，其来源于浓度依赖性HEK蓝测定中OX40信号激活的抑制，如图14所描述的。
表5：PMX012至PM024抗体(全部)重链可变区中或如图17所描述的各组内保守氨基酸的百分比。在各组中观察到更高的同源性。
表6：PMX012至PM024抗体(全部)轻链可变区中或如图18所描述的各组内保守氨基酸的百分比。在各组中观察到更高的同源性。
详细说明
OX40在T细胞表面上表达，OX40L在T细胞和抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞的表面上都表达。OX40和OX40L均不组成型表达，而是在其各自的细胞激活后24-72小时增加。与T细胞上的OX40受体结合的OX40L增加T细胞细胞因子的产生，并防止T细胞随后死亡。因此，OX40在建立和维持免疫应答方面具有关键作用。
在人类中，在特应性皮炎中，病变真皮中OX40L的密度和OX40阳性细胞的数量都明显大于看起来健康的真皮，OX40/OX40L信号传导的阻断调节多种促炎性反应。OX40L还控制树突状细胞对胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的应答，导致IL-21和CXCL13产生。因此，OX40/OX40L轴提供了调节多种促炎反应的可能性，因为其共刺激信号位于释放促炎细胞因子的几个细胞过程的上游。
OX40信号传导已与各种疾病相关，如过敏、哮喘和与自身免疫和炎症相关的疾病，包括多发性硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克罗恩氏病和格雷夫氏病。人类中的证据表明，OX40/OX40L轴的破坏减少增殖性反应，并可用于治疗或改善许多疾病，包括特应性皮炎和癌症的症状。OX40或OX40L的抗体可用于实现这种破坏。
然而，以前没有研究过抗体治疗在伴侣动物中(例如在狗中)OX40/OX40L介导的疾病(如特应性皮炎)的作用。
因此，在第一方面，本发明涉及抗体或其片段，其特异性结合伴侣动物OX40L或伴侣动物OX40。
本发明的伴侣动物适当地选自狗、猫、马、鸟、兔子、山羊、爬行动物、鱼和两栖动物。狗是本发明的优选伴侣动物。猫是本发明的优选伴侣动物。马是本发明的优选伴侣动物。为了避免疑问，人类不是伴侣动物。
在一个方面，伴侣动物是狗。
在一个方面，伴侣动物是猫。
在一个方面，伴侣动物是马。
在一个实施方案中，本文所述的抗体和片段特异性结合野生型犬OX40L。野生型犬OX40L的氨基酸序列(SEQ ID No.1)和核苷酸序列(SEQ ID No.2)如表2所示。本文所述的抗体和片段特异性结合SEQ ID No.1。在一个实施方案中，本文所述的抗体和片段特异性结合SEQ ID No.1的变体。
在一个实施方案中，本文所述的抗体和片段特异性结合野生型犬OX40。野生型犬OX40的氨基酸序列(SEQ ID No.4和6)和核苷酸序列(SEQ ID No.3和5)如表2所示。如实施例中所述，鉴定了两种不同的剪接变体。本文所述的抗体和片段特异性结合由SEQ ID No.3和/或5编码的蛋白质。在一个实施方案中，本文所述的抗体和片段特异性结合由SEQ IDNo.3和/或5的变体编码的蛋白质(SEQ ID No.4和6)。
上述序列的变体可与上述序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。
如本文所使用的，术语“同源性”或“同一性”通常指的是序列中氨基酸残基的百分比，所述氨基酸残基在比对所述序列之后与所比较的参考多肽的残基相同，并且在一些实施方案中，在必要时引入空位之后，以实现最大同源性百分比，并且在一些实施方案中，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。因此，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。N末端或C末端延伸、标签或插入均不得被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用公知的数学算法来确定。
除非另有规定，否则本文使用的术语OX40L是指伴侣动物OX40L，例如狗或猫OX40L。OX40L也被称为“OX40抗原配体”、“OX40配体”、“CD252”、“TNFSF4”和“CD134配体”。在一个实施方案中，抗体或其片段结合狗OX40L。在一个实施方案中，抗体或其片段结合猫OX40L。
除非另有规定，否则本文中使用的术语OX40是指伴侣动物OX40，例如狗或猫OX40。OX40也被称为“TNFR超家族成员4”、“TNFRSF4”，“OX40抗原”和“CD134”。在一个实施方案中，抗体或其片段结合狗OX40L。在一个实施方案中，抗体或其片段不结合猫OX40L。在一个实施方案中，抗体或其片段不是如Willett等人所公开的7D6。
术语“OX40L结合分子/蛋白质/多肽/试剂/部分”、“OX40L抗原结合分子/蛋白/多肽/试剂/部分”，“抗OX40L抗体”、“抗OX40L抗体片段”均指能够特异性结合伴侣动物OX40L，例如狗或猫OX40L抗原的分子。结合反应可通过标准方法显示，例如参考使用不具有相关特异性的抗体的阴性对照试验。
术语“OX40结合分子/蛋白质/多肽/试剂/部分”、“OX40抗原结合分子/蛋白/多肽/试剂/部分”，“抗OX40抗体”、“抗OX40抗体片段”均指能够特异性结合伴侣动物OX40，例如狗或猫OX40抗原的分子。结合反应可通过标准方法显示，例如参考使用不具有相关特异性的抗体的阴性对照试验。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或片段结合作为OX40L多肽的三维表面特征的OX40L表位。在一些实施方案中，本文提供的抗体或片段与包含来自单个亚基的多肽的表位或源自多聚体形式的构象表位(例如，OX40L多肽的单体或三聚体形式的表位)结合。OX40L多肽的起表位作用的区域可以是该多肽的相邻氨基酸，或者该表位可以来自该多肽的两个或多个非相邻区域。OX40L表位可存在于(a)OX40L的三聚体形式(“三聚体OX40L表位”)，(b)OX40L的单体形式(“单体OX40L表位”)，(c)OX40L的三聚体和单体形式，(d)OX40L的三聚体形式，但不是单体形式；或(e)OX40L的单体形式，但不是三聚体形式。
例如，在一些实施方案中，表位仅以三聚体形式存在或用于以三聚体形式结合，但不存在单体形式或不可用于以单体形式被抗OX40L抗体结合。在其他实施方案中，OX40L表位是OX40L多肽的线性特征(例如，OX40L多肽的三聚体形式或单体形式)。本文提供的抗体可特异性结合(a)OX40L的单体形式的表位，(b)OX40L的三聚体形式的表位，(c)OX40L的单体而非三聚体形式的表位，(d)OX40L的三聚体而非单体形式的表位，或(e)OX40L的单体形式和三聚体形式两者。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合OX40L的三聚体形式的表位，但不特异性结合OX40L的单体形式的表位。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合OX40L单体形式的表位，并且可以结合或不结合三聚体形式。
“结合”或“能够结合”目标抗原(例如，分别为伴侣动物OX40L或伴侣动物OX40)的抗体或其片段是以足够的亲和力结合抗原的抗体或其片段，使得该抗体或片段可用作靶向分别表达本文所述抗原OX40或OX40L的细胞或组织的治疗剂。
如本文所述的抗体及其片段分别特异性结合靶标伴侣动物OX40L或靶标伴侣动物OX40。例如，在一个实施方案中，如本文所述的抗体及其片段特异性结合犬OX40L。在另一个实施方案中，如本文所述的抗体及其片段特异性结合猫OX40L。例如，在一个实施方案中，如本文所述的抗体及其片段特异性结合犬OX40。在另一个实施方案中，如本文所述的抗体及其片段特异性结合猫OX40。在抗体结合的上下文中，术语“特异性”是指抗体与特异性抗原(即多肽或表位)的高亲合力(avidity)和/或高亲和力结合。在许多实施方案中，特异性抗原是用于免疫分离抗体产生细胞的动物宿主的抗原(或抗原的片段或亚组分)。
换句话说，与OX40L或OX40抗原的结合比同一抗体与其他抗原的结合更强，即与非特异性相互作用明显不同。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体或片段不与小鼠或人OX40L或OX40抗原交叉反应。
如本文所使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”或对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”可以通过例如对靶标具有至少约10-6M、或者至少约10-7M、或者至少约10-8M、或者至少约10-9M、或者至少约10-10M、或者至少约10-11M、或者至少约10-12M，或者更低的KD(Kd)的分子来表现。在一个实施方案中，KD(Kd)为10-9M或更低。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体是特异性结合伴侣动物OX40L(例如犬OX40L)的拮抗性抗体。
如本文所用，OX40L/OX40的“拮抗剂”或“抑制剂”是指能够抑制或以其他方式降低OX40L/OX40一种或多种生物学活性的配体(例如抗体或片段)，例如在表达OX40L/OX40或表达OX40配体的细胞中。例如，在某些实施方案中，本发明的抗体是拮抗剂抗体，当所述抗体与所述细胞接触时，所述拮抗剂抗体抑制或以其他方式减少来自具有细胞表面表达的OX40L/OX40的细胞的细胞因子的分泌。在一些实施方案中，OX40L的拮抗剂(例如，本发明的拮抗抗体)可以例如通过抑制或以其他方式降低表达OX40L/OX40的细胞的激活和/或细胞信号通路而起作用，从而相对于在没有拮抗剂的情况下OX40L/OX40所介导的生物学活性，抑制细胞的OX40L/OX40介导的生物学活性。在某些实施方案中，本文提供的抗体是完全犬拮抗性抗OX40L/OX40抗体，优选完全犬、单克隆拮抗性抗OX40L/OX40抗体。
本文中使用的术语“抗体”广义地指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留了Ig分子的基本表位结合特征。
在全长抗体中，每个重链由重链可变区或结构域(本文缩写为HCVR)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每个轻链由轻链可变区或结构域(本文缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。
重链和轻链可变区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个重链和轻链可变区由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
免疫球蛋白分子可以是任何类型、类别或亚类(例如，对于犬IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY；例如犬IgG亚型，例如IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D)。在犬中，有四条IgG重链，分别称为A、B、C和D。这些重链代表狗IgG的四个不同亚类，分别称IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。这四条重链的DNA和氨基酸序列首先由Tang等人(Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001))鉴定。这些重链的示例性氨基酸和DNA序列也可从GenBank数据库中获得(IgGA：登录号AAL35301.1，IgGB：登录号AAL35302.1，IgGC：登录号AAL35303.1，IgGD：登录号AAL35304.1)。犬抗体还含有两种类型的轻链，κ和λ(GenBank登录号κ轻链氨基酸序列ABY57289.1，GenBank登录号ABY 55569.1)。发明人使用的以及根据本发明的方面和实施方案的IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D的氨基酸序列示于表2中。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，对于每个可变区，它们被称为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR集”是指一组三个CDR，它们出现在能够结合抗原的单个可变区中。根据本领域已知的不同系统，可以不同地定义这些CDR的确切边界。
Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性的，是最常用的(Kabat et al.,(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat,et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。相反Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901 -917(1987))。当指代可变结构域中的残基(约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统。另一个系统是ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案。Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005)中描述了IMGT编号方案。本领域中公认的这些术语是指对在抗体或抗原结合部分的重链和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变(即，高变)的氨基酸残基进行编号的系统。
除非另有规定，否则本文使用IMGT编号方案。
根据本发明的针对OX40L或OX40的抗体可以是犬、人源化、猫、嵌合抗体、猫源化或犬源化抗体。
“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其包含可变结构域，所述可变结构域包含来自一种物种的抗体的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来自另一种物种，例如犬抗体。示例性的嵌合抗体是嵌合犬-人抗体。
“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中CDR来自一个物种的抗体；例如，啮齿类动物抗体，从啮齿类动物抗体的重可变链和轻可变链转移到人的重可变结构域和轻可变结构域(例如，框架区序列)。抗体分子的恒定结构域源自人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，来自亲本(啮齿类动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基可以被置换为人抗体框架区序列。
如本文所用，术语“犬源化抗体”是指含有犬和非犬(例如，鼠)抗体的序列的重组抗体的形式。通常，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或多个典型的两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非犬免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有的框架(FR)区(以及通常所有或基本所有的剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。犬源化抗体可包含来自鼠或人抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个氨基酸变化，其可进一步优化犬源化抗体的有效性，例如增加其与靶标的结合。例如，高变环的非犬序列可以进一步与犬序列进行比较，并且尽可能多的残基被改变为与真实的犬序列相似。
“物种化的(speciated)”抗体(例如人源化、犬源化、嵌合、猫源化)是一种改造为使其与靶标物种的抗体相似的抗体。在一个实施方案中，“物种化的”抗体与靶标物种的抗体相似性大于约80％、85％或90％。
在一个实施方案中，抗体或抗体片段是犬。犬是指完全犬。术语“完全犬”和“犬”在本文中可互换使用。
与物种化的抗体相反，本发明的完全犬抗体具有犬可变区，并且不包括来自另一物种的全部或部分CDR或FR。有利地，本文所述的完全犬抗体已从包含犬免疫球蛋白序列的转基因小鼠获得。这些免疫小鼠中产生的抗体通过体内B细胞信号传导和发育来开发，以允许天然亲和力成熟，包括体内V(D)J重组、体内连接多样化、体内重链和轻链配对以及体内超突变。以这种方式生产的完全犬抗体产生具有最佳可开发特性的抗体，从而在大规模生产之前将冗长的前导优化降至最低。有利地，当将这种完全犬抗体引入患者动物时，其呈现出最低可能的免疫原性风险，这反过来促进了重复的给药方案。例如，可以通过测定来评估体内免疫原性的副作用，以确定抗药物抗体(ADA)的产生或体内药效随时间的丧失。鉴于体外mAb工程化存在引入开发责任、免疫原性和降低的亲和力的风险(如上所述)，因此，本发明的完全犬抗体最有可能是临床背景下的有效疗法。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指源自单个B细胞或浆细胞的抗体。单克隆抗体制剂中的所有抗体分子都是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的翻译后修饰(例如异构化、酰胺化、碳水化合物添加)。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原表面上的位点(免疫球蛋白、抗体或抗体片段与之特异性结合)。通常，抗原具有几个或多个不同的表位，并与许多不同的抗体反应。该术语具体包括线性表位和构象表位。蛋白质抗原内的表位既可以由连续氨基酸(通常是线性表位)形成，也可以由蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括具有独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定哪些表位被给定抗体或抗体片段结合(即，表位映射)的方法是本领域公知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试重叠或连续肽与给定抗体或抗体片段的反应性。
当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间重叠的表位结合的最广泛使用的和快速的方法是竞争分析，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。表位可以是或不是抗原的三维表面特征。在某些实施方案中，OX40L表位是OX40L多肽的三维表面特征(例如，OX40L多肽的三聚体形式)。在其他实施方案中，OX40L表位是OX40L多肽的线性特征(例如，OX40L多肽的三聚体形式或单体形式)。本文提供的抗体可特异性结合OX40L单体形式的表位、OX40L三聚体形式的表位或OX40L的单体形式和三聚体形式的表位两者。在特定实施方案中，本文提供的抗体特异性结合OX40L三聚体形式的表位，但不特异性结合OX40L的单体形式的表位。在一些实施方案中，抗体可以例如与单体/单亚基结合并阻断活性三聚体形式的形成。合适地，抗体结合OX40L的细胞外结构域。
术语“抗原结合位点”是指抗体或抗体片段中包含特异性结合抗原的区域的部分。抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合位点通常包含在抗体或抗体片段的相关VH和VL内。
本文所用的术语抗体还包括抗体片段。具体地，本发明还延伸到抗体片段。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(VH)链、可变轻(VL)链、CDR区、单个VH或VL结构域、大抗体、小抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体和双scFv，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述至少一部分免疫球蛋白足以向多肽赋予特异性抗原结合。因此，抗体片段包含抗原结合部分。
抗体片段是全长抗体的功能性片段，也就是说，它们保留了完整抗体的靶标特异性。因此，重组功能性抗体片段，例如Fab(片段，抗体)、scFv(单链可变链片段)和单域抗体(dAbs)已被用于开发治疗剂，作为基于mAb的治疗剂的替代品。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(H和L链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含对抗原特异的三个HVR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。
scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域VH和VL组成。天然地，VH和VL结构域通过疏水相互作用非共价关联，并倾向于解离。然而，稳定的片段可以通过将结构域与亲水性柔性接头连接来构建单链Fv(scFv)。
最小的抗原结合片段是单个可变片段，即可变重链(VH)或可变轻(VL)链结构域。VH和VL结构域分别能够结合抗原。靶向结合不需要分别与轻链/重链配偶体结合，或者实际上不需要存在完整抗体的其他部分。抗体的抗原结合实体，其大小减小为一个单结构域(对应于VH或VL结构域)，通常称为“单域抗体”或“免疫球蛋白单个可变结构域”。因此，单域抗体(约12至15kDa)具有VH或VL结构域。
因此，在一个实施方案中，片段选自F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(VH)链、可变轻(VL)链、CDR区、单个VH或VL结构域、大抗体、小抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体和双scFv，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述至少一部分免疫球蛋白足以赋予对多肽的特异性抗原结合。
在一个实施方案中，本发明不涉及与伴侣动物(例如犬)OX40L细胞外结构域多肽片段或其生物等价物融合的免疫球蛋白结构域，例如Fc结构域。
本发明的抗体和抗体片段是分离的。本文使用的术语“分离的”是指与其自然环境分离的部分。例如，术语“分离的”是指基本上不含其他单域抗体、抗体或抗体片段的单域抗体。此外，分离的单域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
在一个方面，本发明涉及特异性结合伴侣动物例如犬OX40L的抗体或其片段，其中所述抗体阻断OX40L与OX40的结合和/或抑制与OX40L与OX40的结合相关的一种或多种功能。抗体适当地减少、抑制或中和伴侣动物中的OX40活性。在一个实施方案中，抗体或其片段表现出一种或多种以下性质：
a)能够改变细胞或动物中细胞因子的分泌，和/或
b)能够减少伴侣动物(如狗)中白细胞的增殖。
“改变”是指与对照相比，在抗体存在下增加或减少化合物的量。本文所用的“减少(decreasing)”或“减少(decreases)”指的是降低，并且减少量可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
例如，抗体或片段能够：
a)减少伴侣动物或伴侣动物细胞中炎性细胞因子的分泌和/或
b)减少伴侣动物或伴侣动物细胞中炎性趋化因子或趋化因子受体的分泌和/或
c)增加伴侣动物或伴侣动物细胞中抑制性细胞因子的分泌和/或
d)增加伴侣动物或伴侣动物细胞中抑制性趋化因子或趋化因子受体的分泌和/或
e)减少伴侣动物中白细胞的增殖。
细胞因子可选自TNFα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、RANTES、GM-CSF、TGF-β和干扰素γ。
“炎性”化合物是一种参与促进炎症的化合物，而“抑制性”化合物是参与抑制或调节炎症的化合物。炎症细胞因子包括白介素-1(IL-1)、IL-12和IL-18、TNFα、干扰素γ(IFNγ)和GM-CSF。抑制性或抗炎细胞因子或受体包括IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGF-β。细胞因子可以是趋化因子。在一个实施方案中，趋化因子可以选自例如CXCL13、CXCR5。根据本发明的抗体还可以改变细胞因子或趋化因子受体的表达。
可在体外(例如使用细胞、多个细胞或组织)或体内进行测定。
在一个实施方案中，例如，可以在SPR(表面等离振子共振)测定中测定在根据本发明的抗体的存在下OX40L与OX40的结合。用于确定OX40L/OX40相互作用的抑制的其他方法描述于例如WO2016/139482或WO2013/008171中，并且包括例如流式细胞术监测抗体与重组表达OX40L的细胞的结合。
在一个实施方案中，可以通过测量NFkB活性的抑制来测量针对OX40L的抗体阻断OX40L与OX40的结合的能力。用于测量NFkB活性的合适测定包括本文所述的HEK-蓝测定。因此，在一个实施方案中，特异性结合伴侣动物如犬OX40L的抗体或其片段在基于细胞的测定中降低、抑制或中和OX40R介导的NFkB活性。
在一个实施方案中，该测定是异源测定，其中伴侣动物(例如狗)OX40用于源自不同物种的细胞系，例如人类细胞系，如HEK，基本上如本文实施例7中所述。
在一个实施方案中，与在没有抗体的情况下观察到的相比，可以通过测量细胞中细胞因子的减少的分泌来测量针对OX40L的抗体阻断OX40L与OX40的结合的能力。在一个实施方案中，可以通过测量IL-2或INFγ从PBMC的分泌的抑制来测量针对OX40L的抗体阻断OX40L与OX40的结合的能力。因此，在一个实施方案中，特异性结合伴侣动物如犬OX40L的抗体或其片段减少、抑制或中和OX40R介导的IL-2或INF-γ(INFγ)从PBMC的分泌。在另一个实施方案中，可通过测量IL-13从PBMC的分泌的抑制来测量针对OX40L的抗体阻断OX40L与OX40的结合的能力。应当理解，可以以类似的方式测量针对OX40的抗体阻断OX40L与OX40的结合的能力。
抗体或片段能够在体外测定中减少白细胞(例如单核细胞)的增殖，其中抗体或片段拮抗OX40L/OX40L受体相互作用。
如本领域已知的，术语“白细胞”包括例如淋巴细胞、多形核白细胞和单核细胞中的一种或多种。本领域技术人员也很容易理解，术语“单核细胞”包括例如外周血单核细胞(PBMC)或单核细胞衍生的细胞，例如树突状细胞(DC)。
可以例如在本文所述的混合淋巴细胞反应(MLR)中测量白细胞增殖。根据本发明的抗体减少增殖的能力可以通过与不存在抗体的情况下的增殖进行比较来测量。
白细胞，例如固有层淋巴细胞(LPL)的增殖，可以使用组织活检、染色和组织学来评估，这对于技术人员来说是显而易见的。例如，苏木精和伊红染色(H&E染色或HE染色)通常在组织学中用于寻找整个人体组织的浸润淋巴细胞，是组织学中的主要染色之一。它是医学诊断中使用最广泛的染色，通常是金标准，因此可用于根据本发明评估白细胞的增殖。例如，可以获得患有或有风险患有OX40L介导的疾病或病症的伴侣动物的胃肠道组织(例如，肠道组织)，并染色和评估LPL的浸润程度。
可以将来自已接受本发明的抗体的伴侣动物的这种组织与在施用抗体之前从同一动物获得的组织中的浸润程度或来自未接受治疗且处于疾病或病症风险或患有疾病或病症的另一伴侣动物获得的组织的浸润程度进行比较。例如，比较来自患有例如IBD的相同(或不同)伴侣动物的伴侣动物肠道组织。抗OX40L抗体结合OX40L并调节细胞因子和细胞受体的表达，导致非疾病状态的细胞因子水平特征。抗OX40抗体结合OX40并调节细胞因子和细胞受体的表达，导致非疾病状态特征性的细胞因子水平。
细胞因子是黏膜相关免疫系统维持正常肠道稳态的不可或缺的信号。有利于炎症起始的它们的分布不平衡可能导致疾病状态，如在炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)中观察到的。促炎细胞因子如IL-la、IL-1β、IL-2、-6、-8、-12、-17、-23、IFN-γ或TNF-α在IBD中的作用与UC和CD的发生和发展相关。CD通常被描述为T辅助(Th)1介导的疾病的原型，因为主要炎症介质是Thl细胞因子，如白介素(IL)-12、干扰素(IFN)-y和肿瘤坏死因子(TNF)-α。细胞因子或细胞因子受体可选自TNFα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、RANTES、GM-CSF、TGF-β和干扰素γ。
在实施例中提供了关于评估抗体性质的合适测定的进一步信息。
在一个实施方案中，结合犬OX40L的抗体可以选自以下抗体之一：
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:15或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:16或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:17或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:18或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:19或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:20或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:25或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:26或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:27或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:28或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:29或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:30或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:35或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:36或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:37或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:38或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:39或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:40或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:45或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:46或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:47或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:48或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:49或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:50或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:55或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:56或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:57或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:58或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:59或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:60或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:65或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:66或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:67或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:68或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:69或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:70或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:75或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:76或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:77或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:78或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:79或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:80或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:85或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:86或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:87或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:88或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:89或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:90或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:95或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:96或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:97或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:98或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:99或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:100或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:105或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:106或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:107或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:108或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:109或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:110或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:115或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:116或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:117或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:118或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:119或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:120或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:125或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:126或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:127或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:128或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:129或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:130或与其具有至少80％的序列同一性的序列；或
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HCCDR1包含SEQ ID No:135或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQID No:136或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:137或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:138或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:139或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:140或与其具有至少80％的序列同一性的序列。
在一个实施方案中，所述抗体选自上文所述的那些中的一种，但与上述SEQ IDNo.中定义的序列相比，包含一个或多个具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的HC和/或LC CDR1、2和/或CDR3序列。
还提供了上述抗体的片段，其在本发明的范围内。
在一个实施方案中，抗体可以选自以下抗体之一：
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.12或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.14或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.22或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.24或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.32或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.34或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.42或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.44或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.52或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.54或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.62或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.64或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.72或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.74或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.82或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.84或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.92或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.94或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.102或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.104或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.112或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.114或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.122或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.124或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；或
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.132或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.134或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体选自上述那些中的一种，并且包含HC可变区和/或LC可变区，与上述SEQ ID No.所定义的序列相比，所述HC可变区和/或LC可变区包括1至20个，例如1至10个，例如2、3、4或5个氨基酸取代。
还提供了上述抗体的片段。
抗体的VH和VL区的氨基酸序列如图15和16所示。因此，抗体或片段可选自包含这些图中所示序列或由这些图中所示序列组成的抗体。在一个实施方案中，抗体选自PMX012、PMX013、PMX014、PMX015、PMX016、PMX017、PMX018、PMX019、PMX020、PMX021、PMX022、PMX023或PMX024。在一个实施方案中，抗体是PMX023或PMX012。序列也如表2所示。
图17和18显示，抗体的VH和VL区可分为不同的组，即基于序列比较的家族，每个家族共享显著的序列同一性。A组包括PMX016、PMX018、PMX020和PMX023。B组包括PMX017、PMX021、PMX022。C组包括PMX019和PMX024。本文所述的其他抗体不属于这些家族。在一个实施方案中，抗体或片段可选自A组所示的抗体或与其具有至少80％的序列同一性的抗体、B组所示抗体或与其至少80％的序列同一性的抗体或C组所示的抗体或与其具有至少80％的序列同一性的抗体。
如本文附图和表2中所示的被指定为PMX的抗体和抗体片段的所有序列都在本发明的范围内。
如以上各种实施方案中所描述的序列同一性为至少80％。在一个实施方案中，序列同一性为至少79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述序列同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如上所述，通过参考序列定义的抗体或片段可包含一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，该修饰是保守序列修饰。如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的抗体或片段的一个或多个CDR区和/或一个或一多个框架区内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基取代，且经改变的抗体可被测试保留的功能(使用本文所述或本领域已知的功能测定)。
因此，这些氨基酸变化通常可以在不改变多肽的生物学活性、功能或其他期望性质(例如其对抗原的亲和力或特异性)的情况下进行。通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性。此外，结构或功能相似的氨基酸的取代不太可能破坏多肽的生物学活性。本文所述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写，以及这些氨基酸残基的保守取代如下表1所示。
表1氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例
Figure BDA0004113515770000271
/>
Figure BDA0004113515770000281
本文所述的抗体包含合适的Fc区。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含Fc区，例如犬Fc区、例如犬IgGB Fc区。在一个实施方案中，抗体的Fc部分可以被修饰。例如，可以对Fc区进行修饰以改善某些性质，例如提供减少的补体和FcγR介导的效应子功能。
基于犬IgG-B Fc区的本发明的犬抗体的示例性修饰的Fc区在SEQ IDNo.142至150中提供，所述SEQ ID No.142至150显示IgG-B恒定区，包括Fc区。与野生型Fc IgG-B区相比，这些序列包含修饰。当与包含野生型IgG-B Fc结构域的相同多肽相比时，修饰的Fc区降低或消除犬IgG-B效应子功能。实施例中显示了这一点。氨基酸取代位于下铰链、脯氨酸夹心区和SHED区。因此，本发明的抗体可包括具有修饰的修饰的Fc区，如SEQ ID No.142至150所示。修饰参照SEQ ID NO.141中所示的wt序列。
因此，参照犬IgG-B恒定区(SEQ ID NO:141)中的野生型残基，抗体可在Fc结构域中的以下位置具有以下氨基酸取代：
E119G；
M120S或A；
L121A；
D153G；
P154R；
D156N；
N211H；
K212I；
A213G；
P215G和/或
P217S。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至S的氨基酸取代，和
b)在SEQ ID NO:141的位置211处至H的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置212处至I的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置213处至G的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至S的氨基酸取代，
b)在SEQ ID NO:141的位置153处至G的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置154处至R的氨基酸取代，和
c)在SEQ ID NO:141的位置211处至H的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置212处至I的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置213处至G的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至S的氨基酸取代，
b)在SEQ ID NO:141的位置153处至G的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置154处至R的氨基酸取代，和
c)在SEQ ID NO:141的位置211处至H的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置212处至I的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置213处至G的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置217处至S的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至S的氨基酸取代，
b)在SEQ ID NO:141的位置153处至G的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置154处至R的氨基酸取代，和
c)在SEQ ID NO:141的位置211处至H的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置212处至I的氨基酸取代、在SEQ ID NO:141的位置213处至G的氨基酸取代和在SEQ ID NO:141的位置215处至G的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含在SEQ ID NO:141的位置120处至A和在位置121处至A的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至A和在位置121处至A的氨基酸取代，和
b)在SEQ ID NO:141的位置217处至S的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至A和在位置121处至A的氨基酸取代，和
b)在SEQ ID NO:141的位置215处至G的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置119处至G的氨基酸取代，和
b)在SEQ ID NO:141的位置156处至N的氨基酸取代。
在一个实施方案中，Fc区包含：
a)在SEQ ID NO:141的位置120处至A和在位置121处至A的氨基酸取代；
b)在SEQ ID NO:141的位置156处至N的氨基酸取代，和
c)在SEQ ID NO:141的位置217处至S的氨基酸取代。
在另一方面，提供了结合分子，例如抗体、抗体片段或抗体模拟物，所述结合分子与本发明的任一OX40L/OX40抗体(即具有与本发明的抗体交叉竞争结合OX40L/OX40的能力的抗体)分别结合伴侣动物OX40L或OX40(例如，狗OX40或OX40L)上的相同表位或重叠表位或接近伴侣动物OX40L或OX40上的相同表位或重叠表位。因此，本发明的抗体可以用作参考抗体。
这种交叉竞争抗体可基于它们与本文所述抗体在标准OX40L/OX40结合测定中交叉竞争的能力来鉴定。例如，SPR分析(如
Figure BDA0004113515770000301
分析)、BLI分析(如FortBio/>
Figure BDA0004113515770000311
)、ELISA分析或流式细胞术可用于证明与抗体的交叉竞争。
在一个实施方案中，提供了能够分别结合伴侣动物OX40L或OX40(例如狗OX40或OX40L)的结合剂，其中本发明的抗体在竞争性测定中取代结合剂。
抗体衍生物包括在本发明的范围内。抗体的“衍生物”含有额外的化学部分，通常不是蛋白质的一部分。蛋白质的共价修饰包括在本发明的范围内。这种修饰可以通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而引入分子中。例如，本领域公知的用双功能试剂的衍生化可用于将抗体或片段交联至水不溶性支撑基质或其他大分子载体。
本文所述的抗体或其片段可用作多特异性(例如双特异性或三特异性)结合剂的结构单元，其分别提供伴侣动物OX40L或OX40(例如狗OX40或OX40L)表达细胞的双重靶向。因此，本文所述的抗体或其片段与靶向不同抗原的另一治疗实体连接。该其他治疗实体例如选自抗体或抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单域抗体，例如VH或VHH结构域)、CDR区或抗体模拟蛋白。合适的非免疫原性接头肽是本领域已知的，例如，包括G和/或S残基的接头、(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常是1到10之间的数字。
在另一个实施方案中，根据本发明的抗体或其片段与可用于延长分子半衰期的另一部分连接。所述另一部分可包含结合血清白蛋白(例如狗或猫血清白蛋白)的蛋白质，例如抗体或其部分。延长半衰期的其他修饰也是已知的，包括例如通过PEG修饰或通过掺入脂质体进行修饰。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其片段用可检测或功能性标记进行标记。标记可以是产生或可以被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光团、荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂、核磁共振活性标记或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合。
在其他实施方案中，根据本发明的抗体或其片段与毒素偶联。在一个实施方案中，治疗部分是毒素，例如细胞毒性放射性核素、化学毒素或蛋白质毒素。
本文中使用的术语“半衰期”是指氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内降低50％所需的时间，例如由于序列或化合物的降解和/或通过天然机制清除或螯合序列或化合物。半衰期可比本发明的相应抗体的半衰期增加至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如，至少10倍或超过20倍。例如，与本发明的相应抗体相比，增加的半衰期可以大于1小时，优选大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、48或72小时。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式测定，例如通过药代动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员来说是清楚的。半衰期可以例如使用诸如t1/2-αt1/2-β和曲线下面积(AUC)的参数来表示。
本发明的抗体和片段也可用于细胞治疗，例如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
核酸
在另一方面，本发明涉及核酸序列，其编码如本文所述的抗体或抗体片段的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述核酸编码HC可变区，所述HC可变区包含或由选自SEQ IDNo.11、SEQ ID No.21、SEQ ID No.31、SEQ ID No.41、SEQ ID No..51、SEQ ID No.61、SEQID NO.71、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.91、SEQ ID No.101、SEQ ID No.111、SEQ ID No.121或SEQ ID No.131的序列组成。
在一个实施方案中，所述核酸编码LC可变区，所述LC可变区包含或由选自SEQ IDNo.13、SEQ ID No.23、SEQ ID No.33、SEQ ID No.43、SEQ ID No.53、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.73、SEQ ID No.83、SEQ ID No.93、SEQ ID No.103、SEQ ID No.113、SEQ ID No.123或SEQ ID No.133的序列组成。
制备抗体的示例性方法
本文所述的抗体或片段可从哺乳动物获得，例如啮齿类动物，例如转基因动物，其在用靶标伴侣动物的OX40L或OX40抗原例如狗或猫OX40L或OX40刺激时表达抗体。已引入合适的伴侣动物抗体基因，以产生伴侣动物抗体。转基因啮齿动物，例如小鼠，优选具有表达内源性抗体基因的降低的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿动物具有表达内源性轻链和/或重链抗体基因的降低的能力。因此，啮齿类动物，例如小鼠，可以包括破坏内源性κ和λ轻链和/或重链抗体基因表达的修饰，从而产生不具有功能性的小鼠轻链和/或重链，例如如下进一步解释的。这种转基因啮齿类动物在本领域中进行了描述，这在下面的实施例中进一步解释。
其他方法可能涉及小鼠单克隆的物种化，通常遵循以下步骤：用靶标伴侣动物的OX40L或OX40抗原免疫小鼠，分离B细胞并将其融合到融合配偶体细胞系，通过选择分离小鼠单克隆抗体。然后通过嵌合和/或进一步的信息引导物种化来进行物种化。物种化的策略，例如犬科化或猫科化的策略，描述于例如WO2013/011407中，参见实施例5。
在其他方法中，氨基酸序列的集合、集或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)上，以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列的(集合、集或文库的)合适方法、技术和宿主生物对本领域技术人员来说是清楚的(例如参见PhageDisplay of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press；1stedition(October 28,1996)Brian K.Kay,Jill Winter,John McCafferty)。
还可以通过分离表达抗原特异性、仅重链抗体的细胞或组织、从衍生自分离的细胞或组织的mRNA克隆编码VH结构域的序列并使用文库展示编码的蛋白质来生成文库，例如噬菌体文库。抗体或片段可以在细菌、酵母或其他表达系统中表达。
示例性治疗应用
在一个方面，我们提供如本文所述的抗体或片段用于治疗疾病。
在另一方面，提供了药物组合物，其包含如本文所述的抗体或片段和任选的药学上可接受的载体。本文所用的术语药物组合物是指用于治疗伴侣动物的组合物，即用于兽医用途的组合物，也就是兽医组合物。在优选实施方案中，被治疗的动物是狗或猫。
本文所述的抗体或其片段或本发明的药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、大脑内、经皮、经粘膜、通过吸入或局部，特别是耳、鼻、眼或皮肤，或通过吸入。
在一个实施方案中，皮下施用。抗体或抗体片段的浓度可以是10至50mg/ml，例如10、20、30、40或50mg/ml。在一个实施方案中，浓度为25至35mg/ml，例如约30mg/ml。在一个实施方案中，抗体以1ml溶液中的剂量提供。
肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，所述组合物经肠胃外施用。
药学上可接受的载体或运载体可以是颗粒，使得组合物例如为片剂或粉剂形式。术语“载体”是指与本发明的药物抗体缀合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这些药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，还可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至动物时，本发明的抗体或其片段或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内施用本发明的药物抗体缀合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
本发明的药物组合物可以是液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于通过注射、输注(例如，IV输注)或皮下递送。
当用于口服施用时，该组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文所认为的固体或液体的形式内。
作为口服施用的固体组合物，该组合物可以配制成粉剂、颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、膜片剂等形式。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或多种：粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂；和着色剂。当组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
该组合物可以是液体的形式，例如酏剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。该液体可用于口服施用或通过注射递送。当用于口服施用时，组合物可包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。
在特定实施方案中，期望将组合物局部施用到需要治疗的区域，或通过注射、静脉内注射或输注。
在特定疾病或病症的治疗中有效/有活性的治疗剂的量将取决于疾病或病症的性质和待治疗的动物，并可通过标准临床技术确定。此外，可以任选使用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并应根据医生的判断和每个受试者的情况来决定。应考虑年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度等因素。
典型地，该量以组合物重量计为至少约0.01％的本发明的抗体。当用于口服施用时，该量可变化至组合物重量的约0.1％至约80％。优选的口服组合物可包含组合物重量的约4％至约50％的本发明的抗体。
制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01重量％至约2重量％的本发明的抗体。
对于注射施用，组合物可包含通常约0.1mg/kg至约250mg/kg的受试者的体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg的动物的体重，更优选约1mg/kg至约10mg/kg的动物的体重。在一个实施方案中，组合物以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。施用时间表可以从例如一周一次到每2、3、4、5、6、7、8或更多周一次变化。
在一个实施方案中，在治疗后，受试者具有至少7天、或至少14天、或至少21天、或至少28天、或至少40天、或至少50天、或至少60天的无疾病进展期。
在一个实施方案中，存活天数、无疾病天数或无疾病进展天数为至少2个月，或至少3个月，或至少4个月，例如至少5个月，例如至少6个月。
在一个实施方案中，存活天数、无疾病天数或无疾病进展天数为至少9个月或至少一年。本发明提供治疗或预防伴侣动物(例如狗、猫或马)中OX40L/OX40介导的疾病或病症的方法，其包括向需要的动物施用有效量的本发明的抗体或片段。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或缓解疾病或病症。例如，治疗可以包括推迟与疾病或病症相关的症状的发展，和/或减少将伴随或预计伴随所述疾病发展的此类症状的严重程度。这些术语包括改善现有症状，预防另外的症状，以及改善或预防此类症状的根本原因。因此，这些术语表示正在治疗的至少一些哺乳动物，例如伴侣动物患者，正在获得有益的结果。许多医学治疗对接受治疗的部分患者(但不是所有患者)有效。
适当地，对于治疗诸如特应性皮炎的病症，在治疗后，观察到瘙痒评分的降低。本领域技术人员将知道测量瘙痒评分的合适方法。
在一个实施方案中，根据本发明的拮抗抗体或其片段抑制异种移植物抗宿主反应中的GVHD反应，如WO2013/0008171中所述。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的伴侣动物。仅作为实例，受试者包括但不限于狗、猫或马。为避免疑义，不包括对人类的治疗。
如本文所用，术语“有效量”是指抗OX40L/OX40抗体的量，当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，其在施用条件下有效地达到所需的治疗或预防效果。
在另一方面，本发明涉及如本文所述的抗体或片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防如本文所定义的疾病的药物中的用途。
如上所述，根据本发明的抗体或片段可用于治疗或预防OX40L/OX40介导的疾病。
术语OX40L/OX40介导的疾病是指由OX40L/OX40信号通路介导的并且可以通过靶向OX40L/OX40抗原来治疗/缓解的任何疾病或病症。OX40L介导的疾病和OX40介导的疾病是指分别由OX40L或OX40完全或部分引起的或由OX40L或OX40导致的任何疾病或病症。在某些实施方案中，OX40L或OX40在细胞表面异常(例如高度)表达。在一些实施方案中，OX40L或OX40可在特定细胞类型上异常上调。在其他实施方案中，正常、异常或过量的细胞信号传导是由OX40与OX40L的结合引起的。
在一个实施方案中，该疾病是炎症状态，所述炎症状态指的是导致炎症或自身免疫性疾病的病理状态。特别地，该疾病选自以下非限制性列表：炎症性皮肤病，包括特应性皮炎(特应性)、过敏性皮炎、瘙痒、银屑病、硬皮病或湿疹；与炎症性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)相关的反应；缺血再灌注；成人呼吸窘迫综合征；哮喘；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、血管炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎症性疾病、继发于败血症或创伤的多器官损伤综合征；细菌性肺炎、抗原抗体复合物介导的疾病；肺部的炎症，包括胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维化等。其他疾病包括马的适应症，如库蚊叮痒综合症(sweetitch)、夏季复发性皮炎或马的昆虫叮咬过敏。
与其他试剂的示例性组合
本发明的抗体、抗体片段或药物组合物可作为唯一活性成分或与一种或多种其他治疗剂组合施用。治疗剂是用于治疗疾病的化合物或分子。
治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、抗炎剂、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光活性剂或染料和放射性同位素。抗体分子包括完整抗体或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单域抗体，例如VH结构域或抗体模拟蛋白)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体或抗体片段或药物组合物与现有的治疗或治疗剂组合使用。因此，在另一方面，本发明还涉及组合疗法，其包括施用本文所述的抗体或抗体片段或药物组合物和另一种疗法。
在一个实施方案中，治疗剂选自以下非限制性列表：雷帕霉素(西罗莫司)、他克莫司、环孢菌素、皮质类固醇(例如甲基强的松龙)、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、抗CD28抗体、抗IL-12/IL-23抗体、抗CD20抗体、抗CD30抗体、CTLA4-Fc分子、CCR5受体拮抗剂、抗CD40L抗体、抗VI_A4抗体、抗LFA1抗体、氟达拉滨、抗CD52抗体、抗CD45抗体、环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、抗补体C5抗体、抗a4b7整联蛋白抗体、抗IL6抗体、抗IL6-R抗体、抗IL2R抗体、抗CD25抗体、抗TNFa/TNFa-Fc分子、HDAC抑制剂、JAK抑制剂，如JAK-1和JAK-3抑制剂、抗IL-31抗体、SYK抑制剂、抗IL-4Ra抗体、抗IL-13抗体、抗TSLP抗体、PDE4抑制剂、lokietmab
Figure BDA0004113515770000381
环孢菌素(例如/>
Figure BDA0004113515770000382
)和奥拉替尼/>
Figure BDA0004113515770000383
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗体片段或药物组合物可与两种或多种治疗剂一起施用。
本文所述的抗体或抗体片段或药物组合物可与其他治疗或治疗化合物或治疗同时或不同时间施用，例如同时、单独或顺序施用。
示例性试剂盒
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防例如本文所列疾病和/或用于检测OX40L/OX40用于诊断、预后或监测疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体或片段。这种试剂盒可以包含其他成分、包装、说明书或材料，以帮助检测OX40L/OX40蛋白。试剂盒可包括结合OX40L/OX40的标记抗体或包含结合OX46L/OX40的抗体的结合分子和一种或多种用于检测标记的化合物。
在另一方面，本发明提供了结合OX40L/OX40的抗体或其片段，或以冻干形式包装或包装在水性介质中的本文所述的药物组合物。
示例性非治疗应用
在另一方面，如本文所述的结合OX40L/OX40的抗体或片段用于非治疗目的，例如诊断测试和测定。一种用于检测测试样品中伴侣动物OX40L/OX40的存在的方法，包括使所述样品与本文所述的抗体或其片段以及至少一种可检测标记物接触，并检测所述抗体与伴侣动物OX40L/OX40的结合。
用于诊断目的的抗体的修饰是本领域公知的。例如，抗体可以用配体基团如生物素或可检测标记基团如荧光基团、放射性同位素或酶修饰。本发明的化合物可用于诊断目的，例如使用常规技术标记。合适的可检测标记包括但不限于荧光团、发色团、放射性原子、电子致密试剂、酶和具有特定结合配偶体的配体。
在一些实施方案中，在不使用固相载体的情况下检测抗原与抗体的结合。例如，可以以液体形式检测抗原与抗体的结合。
在其他实施方案中，抗体或片段可以例如固定到硝酸纤维素或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的另一种固相支持体上。然后可以用合适的缓冲液洗涤载体，然后用可检测地标记的抗体处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持体以去除未结合的肽或抗体。然后可以通过已知的方法步骤检测固相支持体上结合的标记的量。“固相支持体”或“载体”是指能够结合肽、抗原或抗体的任何支持体。众所周知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。对于本发明的目的，载体的性质可以在某种程度上是可溶的或不可溶的。支持体材料实际上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合OX40L/OX40或抗OX40L/OX40抗体。因此，支持体结构可以是球形的，如珠状，或圆柱形的，如试管的内表面或杆的外表面。或者，表面可以是平的，例如片材、培养皿、试纸条等。例如，支持体可以包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体、肽或抗原的许多其他合适的载体，或者可以通过常规实验来确定合适的载体。众所周知的方法步骤可以确定给定批次的抗OX40L/OX40抗体的结合活性。本领域技术人员可以通过常规实验确定操作和最佳测定条件。
为了本发明的目的，通过上述测定检测的OX40L/OX40可以存在于生物学测试样品中。可以使用任何含有OX40L/OX40的样品。例如，样品是生物流体，例如血液、血清、淋巴液、尿液、粪便、炎性渗出物、脑脊液、羊水、组织提取物或匀浆等。
OX40蛋白和核酸序列
本发明人已在狗中鉴定并分离出OX40的剪接变体。
在另一方面，本发明涉及分离的犬OX40氨基酸序列。本发明还涉及分离的核酸序列，其编码犬OX40蛋白。
在一个实施方案中，分离的犬OX40蛋白包含SEQ ID NO.4或6或其变体。
在一个实施方案中，编码上述蛋白质的分离的核酸分子任选地包含SEQ ID NO.3或5或其变体。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA，并且可以是完全或部分地合成或重组产生的。除非上下文另有要求，否则本文所述核苷酸序列的引用包含具有特定序列的DNA分子，并且包含具有其中U取代T的特定序列的RNA分子。
在另一方面，本发明涉及三聚体可溶性伴侣动物，例如犬OX40L细胞外结构域探针及其在筛选伴侣动物例如犬OX40L抗体的方法中的应用。术语三聚体是指OX40L细胞外结构域的构象。筛选样品中伴侣动物(例如犬)OX40L抗体的存在的方法也在范围内。这种方法包括将样品暴露于探针并评估OX40抗体的存在。样品可以是来自动物的任何样品，例如细胞、组织、血液、唾液或其他合适的样品。
三聚体可溶性OX40L细胞外结构域探针如本文图7的示意图所示。这包含鸡生腱蛋白C三聚结构域和人IgG1 Fc或HIS标签。还提供了适当的序列，如图6所示。
核酸构建体和宿主细胞
此外，本发明涉及核酸构建体，其包含至少一种如本文所定义的核酸，即编码本发明抗体的核酸分子或编码OX40蛋白的核酸分子。构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式。
表达载体可以是例如质粒，如pBR322、pUC或Co1E1，或腺病毒载体，如腺病毒2型载体或5型载体。适用于本发明的载体包括例如细菌载体、哺乳动物载体、病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体)和用于昆虫细胞的杆状病毒衍生载体。这种载体中的多核苷酸优选与启动子可操作地连接，该启动子基于例如在其中寻求表达的细胞类型来选择。
表达载体可以通过常规技术转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的抗体。本发明包括宿主细胞，其含有编码与异源启动子可操作地连接的本发明的抗体(例如，全抗体、其重链或轻链、或其部分、或本发明的单链抗体、或其片段或变体)的多核苷酸。对于整个抗体分子的表达，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达，以表达整个免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，表达载体是能够异源表达的载体，例如在来自不同物种的宿主生物体中表达的载体。
本发明还涉及分离的重组宿主细胞，其包含一种或多种如本文所述的核酸构建体，即编码本发明的抗体的核酸分子或编码OX40蛋白的核酸分子。用于本发明的宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或更高级的真核细胞，并且包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属、毕赤酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，其含有源自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体。
在本发明中用作宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠杆菌属、埃文氏菌属、克雷白氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是合适的。这些实例是说明性的，而不是限制性的。在一个实施方案中，提供了如本文所述的制备抗OX40抗体的方法，其中该方法包括在适于表达编码抗体的多核苷酸的条件下培养宿主细胞并分离抗体。
在一些实施方案中，核酸还可包含前导序列。可以使用任何合适的前导序列，包括天然免疫球蛋白种系前导序列，或者可以选择其他序列，例如Campath前导序列(参见US 8,362,208B2)，以增强蛋白质表达。
测定和表达系统
本发明还涉及异源测定或表达系统，其包含伴侣动物(例如狗)OX40和源自不同物种的细胞系，例如人类细胞系，如HEK。
该测定包括使伴侣动物(例如狗)OX40与源自不同物种的细胞系，例如来自不同哺乳动物的细胞系，例如啮齿动物细胞系或人类细胞系，如HEK接触。例如，用伴侣动物(例如狗)OX40转染细胞系，使得其以稳定或瞬时的方式表达伴侣动物(如狗)OX40。
细胞系可以包含报告基因，并且OX40L对OX40的激活可以使用报告基因例如通过定量报告基因表达来评估。合适的报告基因是本领域技术人员已知的，并且可以包括荧光标记物或碱性磷酸酶(SEAP)。
应当理解，本文描述的特定实施方案是通过说明的方式示出的，而不是作为本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规研究来确定本文所述特定程序的许多等价物。这些等价物被认为在本发明的范围内，并被权利要求所涵盖。说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入的程度相同。当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”一起使用时，单词“一(a)”或“一个(an)”的使用可能意味着“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个以上”的含义一致。权利要求中术语“或”的使用是指“和/或”，除非明确表示仅指替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。在本申请中，术语“约”用于表示一个值，其包括设备、用于确定该值的方法的固有误差变化、或研究对象之间存在的变化。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含的或开放的，不排除另外的、未引用的要素或方法步骤。
本文使用的术语“或其组合”是指该术语之前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少一项：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果顺序在特定上下文中很重要，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、ABAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文中另外是显而易见的，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
本公开的任何部分可以与本公开的其他部分结合阅读，除非从上下文中另外是显而易见的。
本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下根据本公开进行制备和实施。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文所述组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序中。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，所有此类类似取代和修饰都被视为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
在以下非限制性实施例中更详细地描述了本发明。
实施例
实施例1：克隆犬OX40L和OX40
OX40L序列预测
根据与人OX40L核苷酸序列的同源性，从UCSC基因组浏览器(圣克鲁斯大学)比格犬参考基因组预测犬OX40L的核苷酸序列。与许多由5’末端和随后的细胞外结构域组成的跨膜蛋白不同，OX40L结构是反向的(见图1A)。这给出了3个预测的外显子。图1B显示了可溶性形式的OX40L(“OX40LEXT”)的示意图，其通过用IL-2信号序列替换N末端细胞内区域以促进从细胞分泌而形成。相应的核苷酸序列如图6B所示。
OX40序列预测
从犬参考基因组与人OX40的同源性预测犬OX40的核苷酸序列。这给出了7个在N末端具有胞外结构域的预测的外显子(图1A)。
OX40L和OX40的克隆
OX40L和OX40的序列通过使用标准方案从比格犬血液中分离的PBMC中克隆来确认。简言之，比格犬的全血由Envigo RMS(Alconbury,Huntingdon,UK)提供，PBMC使用Ficoll梯度分离。简言之，将10ml全血用25ml磷酸缓冲盐水(PBS)稀释并分层到15mlFicoll Paque Plus(Sigma Aldrich)上，然后在室温下以800rcf离心10分钟，缓慢加速且无制动。将中间相(interphase)盘收集到PBS中，计数PBMC，然后在RPMI培养基(SigmaAldrich)+1μg ml-1IL-2中以106个细胞ml-1稀释。
为了刺激OX40和OX40L的表达，加入5mg ml-1植物凝血素-L(PHA-L；FisherScientific)，1天后和4天后收获PBMC。使用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN，Hilden，DE)和标准程序从活化的PBMC中分离总RNA，在柱上DNA酶消化后产生160μg–440μg RNA。OX40和OX40L的特异性cDNA扩增是使用SuperScript IV一步RT-PCR试剂盒(ThermoFisher，Massachusetts,US)进行的，3'和5'末端引物从预测的OX40和OX40L的核苷酸序列产生。引物序列如表2所示。
使用CloneJET PCR克隆试剂盒(ThermoFisher)将OX40和OX40LPCR产物亚克隆到pJET中，然后转移到pcDNA3.1中用于哺乳动物表达。
犬OX40L的核苷酸和氨基酸序列(用于细胞表达的克隆的OX40L/全长膜形式的序列显示在表2中(SEQ ID NO:1和2)。
对于OX40，观察到RT-PCR产物中潜在的剪接变体的存在。为了分离单个剪接变体转录物，亚克隆RT-PCR产物，并用表2所示的序列(核苷酸、氨基酸翻译)、短变体和长变体(SEQ ID NO:3至6)鉴定两种不同的转录物。
图2C显示了这些剪接变体的比对。OX40的长剪接变体由以1-2-3-4-5-6-7的顺序排列的外显子组成。短剪接变体不含外显子6，排列为1-2-3-4-5-7。
使用pJET-OX40菌落的单步PCR评估OX40剪接变体的相对丰度。简言之，从LB-amp板中挑取单个菌落到10μl OneTaq Quick-Load PCR mix(NEB)中，并用以下PCR循环进行扩增：94℃30秒，1个循环；94℃30秒，61℃30秒和68℃2分钟，30个循环；68℃5分钟，1个循环。通过评估所得PCR产物的相对长度来确定两个剪接变体的丰度(图3)。短剪接变体编码截短的产品。由于该产物整体上缺少跨膜区，因此似乎最有可能产生的短变体将被分泌。
实施例2：表达犬OX40和OX40L
将人胚胎肾(HEK)293细胞作为单层在90mm圆形组织培养板上，在补充有10％胎牛血清(FBS；Sigma Aldrich)的DMEM/F12(Life Technologies，California，US)中，在37℃，含5％ CO2的潮湿环境中生长为单层。使用聚乙烯亚胺(PEI MAX:40kDa，PolysciencesInc.，Eppelheim，Germany)用编码OX40(SEQ.ID 5)或OX40L(SEQ.ID 1)cDNA的质粒转染HEK293细胞。将30μl PEI MAX(1mg ml-1)、5μg cDNA和1ml DMEM/F12在室温下孵育10分钟，将其滴加到70-80％汇合度的HEK293细胞的90mm平板中，孵育2-3天。48小时后使用合适的抗生素选择稳定转染的细胞。
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为单层在90mm圆形组织培养板上，在补充有10％FBS、10％β-巯基乙醇和10％非必需氨基酸的DMEM高糖(Life Technologies)中，在37℃、潮湿大气和5％ CO2条件下生长。根据制造商的推荐说明书，使用Lipofectamine LTX(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)用编码OX40L cDNA(SEQ ID 1)的质粒转染细胞。48小时后使用合适的抗生素选择稳定转染的细胞。
实施例3：免疫–使用DNA和MEF
例如，基本上如WO2018/189520和WO2020/074874中所述的免疫Ky9TM小鼠。与野生型小鼠相比，通过将来自狗的免疫球蛋白重链(IGH)和轻链(IGL)可变(V)区基因、IGH D区基因以及IGH和IGL J区基因插入小鼠，允许产生抗体重链，所述抗体重链包含源自小鼠中犬DNA表达的可变抗体区，结合恒定区，来修饰转基因小鼠。恒定区可以是啮齿类免疫球蛋白(IG)恒定区，导致具有犬可变区和啮齿类恒定区的嵌合体重链的产生。关于这种嵌合抗体链的可变区的信息或包含该可变区的核酸可用于产生完全犬抗体，例如用于狗的治疗用途。含有犬DNA的啮齿类动物也可以作为了解疾病和测试药物的动物模型。
对于DNA免疫，使用水动力尾静脉注射(HTVI)进行引发和加强方案，并收获组织。
对于基于细胞的免疫，使用稳定表达OX40L的MEF细胞进行引发和加强方案，并收获组织。
使用HTVI DNA免疫引发结合OX40L表达MEF细胞加强进行进一步的免疫方案。
血清效价测定：在免疫前和每次随后的加强后10天，从小鼠取血。使用microvette200Z-gel管(Starstedt AG&Co.KG,Germany)分离血清和红细胞，并使用BD Accuri C6流式细胞仪(Becton Dickinson，NJ，USA)或Beckman Coulter's CytoFLEX S评估OX40L特异性抗体应答的滴度。免疫后血清在FACS缓冲液(PBS+3％ FBS)中连续稀释，并添加到105个野生型细胞或105个稳定表达OX40L的相同细胞中。用1/200稀释的BB700缀合的抗同种型IgG1、IgG2a、IgG2b的2°单克隆抗体(BD OptiBuildTM,Becton Dickinson)检测小鼠抗体，并将这些细胞上的结合与免疫前血清进行比较(图4)。
实施例4：抗体产生细胞的分离
组织分离：
从小鼠采集脾脏、淋巴结和骨髓。通过将脾切成块，并在冰上用RPMI-1640(Lonza，Basel，CH)+10％ FBS冲洗的同时，迫使其通过45μm细胞过滤器(Falcon)来制备脾细胞。对来自淋巴结的淋巴细胞也采用了类似的方法。从股骨和胫骨采集骨髓，并使用21号针头，用RPMI-1640冲洗骨髓通过预先用RPMI-1640润湿的45μm细胞过滤器。所有细胞类型在300g下沉淀5分钟，然后直接用于流式分选或再悬浮在FBS+10％二甲基亚砜(DMSO)中，并在-150℃下冷冻。
细胞分选：
通常，抗原特异性脾B细胞可以被标记的抗原VLP或抗原蛋白探针捕获，因为它们在细胞表面表达跨膜抗体。另一方面，抗原特异性浆细胞不易被抗原探针标记，因为它们主要表达分泌的抗体。因此，从脾脏或骨髓分离的浆细胞进行下一步抗体序列恢复，而不使用抗原探针分离这些群体的抗原特异性亚群。CD138和CD267的细胞表面共表达(TACI)用于鉴定骨髓和脾脏中的成浆细胞和浆细胞群。在抗原特异性细胞分选之前，根据制造商的说明(StemCell Technologies UK)使用小鼠pan-B细胞分离试剂盒进行B细胞富集。
抗原特异性细胞可由在其表面表达靶抗原的标记的VLP捕获。VLP从用OX40L稳定转染的HEK细胞产生，随后用逆转录病毒gag蛋白和荧光标记的MA(gag基质片段p15-GFP融合蛋白)瞬时转染；gag表达使VLP能够从细胞出芽，MA标记VLP用于荧光检测。VLP上的表面抗原直接从重组细胞表达，无需任何纯化或修饰步骤，并以天然形式呈现。其他哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)也可用于VLP生产。
抗原特异性B细胞也可以由标记的抗原蛋白探针捕获。含有OX40L细胞外结构域(ECD)的单体OX40L蛋白，或三聚体可溶性OX40L细胞外结构域探针(如图7中的示意图所示，并参考Willett et al.Mol Immunol.2009,46(6)；1020-1030)在表达载体中合成并在CHO细胞中表达。Fc标记的探针使用Mab选择蛋白A树脂(Cytiva)或使用Mab Select SuRe柱(Cytiva)通过AKTA从培养上清液中纯化。使用HIS-Pur Ni-NTA树脂(ThermoFisher)纯化HIS标记的三聚体OX40L蛋白。
OX40L ECD TNCc HIS(MW＝62.143kDa；三聚体)与Alexa Fluor 647的缀合是使用微尺度蛋白质标记试剂盒(分子探针–Invitrogen目录号A30009)根据制造商的方案进行的。使用NanoDrop分光光度计测定标记程度。
类似地，单体dOX40L-mvhfc(MW＝40.435kDa)和OX40L ECD TNCc Fc(MW＝280.980kDa；六聚体)与Alexa Fluor 647的缀合是使用Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒(分子探针–Invitrogen目录号A20186)按照制造商的抗体标记方案进行的。使用NanoDrop分光光度计测定标记程度。
在用OX40L或用不相关免疫原免疫的小鼠的脾细胞上与OX40L过表达HEK 293衍生的Gag-GFP病毒样颗粒(VLP)结合测试两种探针的不同稀释度，以通过流式细胞术鉴定和分选抗原特异性B细胞。然后，在非相关材料上显示最小背景染色的最佳稀释液用于通过BDFACSAria融合细胞分选器(BD Biosciences)进行抗原特异性B细胞鉴定和分选。
然后使用包括CD19、IgM、IgA、IgD和CD138的标记物来鉴定细胞中富含的对免疫进行应答的同种型转换的B细胞。
根据制造商的说明，使用10×Genomics铬单细胞免疫分析系统和V(D)J试剂盒(10×Genomics)制备分选细胞用于抗体分析。表达的抗体的核苷酸序列通过Illumina MiSeq测序以600个循环(2×300个循环)或通过llumina iSeq,Miseq,MiniSeq,Nextseq,Hiseq4000或Novaseq测序以2×150个循环测定。使用基于pRESTO/Change-O(耶鲁大学)/IgBlast(NCBI,USA)软件的定制工具分析序列，以预测每个细胞的种系序列和超突变。可变免疫球蛋白区包括重基因免疫球蛋白核苷酸序列的VDJ区和Igκ和Igλ免疫球蛋白核苷酸序列的VJ区。在克隆家族中，在免疫球蛋白基因重组和体细胞超突变过程中，存在V(D)J片段内具有共同突变的亚家族。显示独特V(D)J片段使用的不同克隆家族通常表现出不同的结合特性。在重组和超突变过程中，选择抗体对抗原具有较高亲和力的细胞，如果来自同一谱系的低亲和力克隆具有中和功能，则亲和力通常随着进一步突变而增加；例如，WO2015/0040401的图6中显示了成簇的家族。
克隆家族通常由两个或多个克隆细胞的相关免疫球蛋白重链和/或轻链V(D)J序列定义。相关免疫球蛋白重链V(D)J序列可以通过其V(D)J基因片段的共同使用来鉴定。WO2015/040401的图5显示了分选的Ag特异性单B细胞的抗体序列分析的实例，并显示了按重链V基因家族用途排列的抗体序列，并聚类以生成所显示的系统发育树。从这些系统发育树中选择候选的克隆。候选的克隆VH和VL的核酸和氨基酸序列及其相应的CDR在下面的序列表2中给出。
例如，抗犬OX40L单抗PMX012、PMX014-018、PMX020-023均由相同的重链V基因(cIGHV3-5)和轻链V基因(cIGLV3-3)编码。抗犬OX40L mAb PMX013由重链V基因cIGHV4-1和轻链V基因cIGLV3-3编码。PMX019和PMX024由重链V基因cIGHV3-2和轻链V基因cIGLV3-3编码。
PMX012至PMX024具有列于下表2中的序列。
实施例5：从单个细胞产生单克隆抗体
在一些实施例中，合成所选候选克隆的重链和轻链V(D)J序列，并克隆到分别含有人IgG4、狗IgG恒定区(例如IgGB恒定区)或狗IGK或IGL恒定区的基因组序列的表达载体中。在一些实例中，IgG B恒定区包括使恒定区效应子缺陷的突变。这些突变的Fc区的合适序列在下面的序列表中给出。
将编码如上所述选择的犬重链可变区的DNA克隆到表达载体中人IgG4或犬IgGBDef2(SEQ ID NO:143)或Def7(SEQ ID NO:148)的上游恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)中。将编码犬轻链可变区的DNA克隆到表达载体中人κ轻链或犬κ或λ轻链的上游恒定区中。
将编码重链和轻链的表达载体共转染到合适的哺乳动物细胞系例如CHO细胞中以获得稳定的表达。为了产生抗体，将6×106个选定的CHO细胞接种在3ml培养基中，并在32℃、5％ CO2下以200rpm振荡培养。在第1天、第4天、第7天和第10天，向培养基中添加4％HyClone Cell Boost7a补充剂+0.4％ HyClone Cell Boost 7b补充剂+1％葡萄糖。在第12天收集培养上清液，并使用表面等离振子共振(Biacore 8K，Cytiva Life Sciences)在蛋白A芯片上测定IgG浓度。
实施例6：OX40L候选抗体的结合测定
结合测定：OX40L候选抗体与细胞表面表达的犬OX40L蛋白的结合。
将含有候选抗体的CHO细胞上清液在FACS缓冲液(含3％FBS的PBS)中稀释至1、5或10μg/ml，并筛选其结合在细胞表面表达的犬OX40L蛋白的能力。简而言之，将在细胞表面表达犬OX40L的HEK293或MEF细胞(或任何其他常用细胞系)与100μl含有候选抗体的FACS缓冲液在冰上孵育30分钟。作为对照，亲代细胞系(不表达OX40L的HEK293或MEF细胞)也用相同的抗体溶液染色。染色后，用150μl FACS缓冲液洗涤细胞，然后以300g离心3min。去除上清液，将细胞沉淀在黑暗中重新悬浮在FACS缓冲液中30分钟，该缓冲液含有1:1000稀释的荧光标记的二级抗体，所述二级抗体识别测试抗体的人或犬Fc区，然后用150μl FACS缓冲溶液洗涤，并在300g离心3分钟。将细胞重新悬浮在FACS缓冲液中，使用Cytoflex(BecktonDickinson)或Accuri(Beckman Coulter)细胞仪进行流式细胞术，然后使用FlowJo进行数据分析(图8)。
候选抗体与单体或三聚体抗原探针的结合。
OneComp eBeads(Invitrogen-ThermoFisher Cat#:01-1111-4)是与来自不同物种的抗体反应的球形颗粒，并且是免疫球蛋白轻链无关的。珠子溶液包含两个珠子群体：一个能够捕获任何抗体的群体和一个不结合抗体的对照群体，导致双峰式分布。因此，理论上的最大结合率为50％，因为只有一半的珠子可以结合测试抗体。
OneComp eBeads与OX40L抗体孵育。一次洗涤后，随后用OX40L三聚AlexaFluor647缀合的探针孵育珠子，并在Beckman Coulter'sCytoFLEX S上采集之前再次洗涤。使用FlowJo分析数据(图9)。当PMX014结合两种探针时，PMX020仅结合三聚体探针，这概括了在细胞表面表达的OX40L的天然构象。该实验证实，三聚体OX40L探针更适合用作分类和筛选探针，用于识别和筛选OX40L候选物。
通过结合在细胞表面表达的OX40L测定抗体亲和力
通过使用蛋白A树脂(MabSelect，Cytiva)从CHO上清液中纯化mAb来确认与表达OX40L的细胞的特异性结合。简而言之，将MabSelect树脂在PBS中洗涤并稀释成10％的浆液。将适当体积的10％浆液加入上清液中，并在RT下孵育5-10’，然后装入过滤柱中。用PBS洗涤3次后，使用IgG洗脱缓冲液(Pierce)将抗体直接洗脱到中和缓冲液(10mM TRISpH8.0)中，IgG洗脱液：中和缓冲液比为8:1。使用Nanodrop One(Thermo Fisher)测量280nm处的吸光度，对抗体溶液进行定量。在FACS缓冲液中制备范围为6.6μM至66pM的纯化抗体的1:3系列稀释液，用于染色表达犬OX40L的HEK293或MEF细胞(或任何其他常用细胞系)。根据抗体浓度绘制几何平均值，并使用GraphPad Prism使用四参数逻辑方程和可变斜率计算亲和力(Kd)(图10至12)。
通过表面等离振子共振(SPR)测定抗体亲和力
OX40L抗体的亲和力(Kd)也通过SPR测量，使用CHO细胞中表达的重组OX40L ECD-TNCc-HIS蛋白(图7B)。
使用HIS-Pur Ni NTA树脂(ThermoFisher)从CHO上清液中纯化OX40L ECD-TNCc-HIS蛋白。简言之，使用PD10脱盐柱将CHO上清液缓冲液交换到pH 8.0的含有10mM咪唑的PBS。然后将缓冲液交换的上清液与HIS-Pur Ni NTA树脂旋转中在4℃孵育1小时。将树脂应用于重力过滤柱，并用含有10mM咪唑的PBS pH 8.0洗涤3次，然后用2.5ml含有500mM咪唑的pH 8.0PBS洗脱，并使用PD10脱盐柱将缓冲液交换至PBS pH7.4。
为了通过SPR(Biacore 8K，Cytivia)测定亲和力，使用制造商推荐的方案，将纯化的OX40L ECD-TNCc-HIS蛋白通过胺偶联以低密度共价结合至CM5传感器芯片(Cytivia)的表面。候选抗体随后以一系列浓度通过芯片表面，并使用专用软件(Biacore InsightEvaluation Software)确定亲和力。结果汇总在表3SPR实验1和2中。
备选地，OX40L蛋白的细胞外结构域(OX40LEXT)在HEK293细胞中表达，并在IL-2启动子的控制下分泌到细胞外介质中(图1B)。这是通过使用HIS标签使用Ni+柱纯化的。然而，哺乳动物细胞含有许多含His的蛋白质，并且通常与目标HIS标记的蛋白质共洗脱。为了进一步纯化样品，含OX40LEXT的洗脱液随后通过Biacore 8K中的链霉亲和素传感器芯片(S系列SA传感器芯片，GE Healthcare；Cat#BR100531)，该芯片捕获OX40LEXT的生物素化Avi标签，并允许洗去剩余的含HIS的蛋白质。传感器芯片加载继续，直到看到约500-1500个响应单元。OX40LEXT与Biacore的S系列CM5传感器芯片(Cat#BR100530)的胺偶联也可以使用，但由于反应是非特异性的，它将导致非靶标蛋白的固定化，并可能阻塞潜在的OX40L靶标位点，其中固定化发生在表位位置。
含有分泌的抗体的CHO细胞培养基或条件培养基(对照)随后通过传感器并监测结合。从这些测量，可以评估Ab与靶标蛋白的结合。
纯化的OX40短剪接变体的随后注射(图1)能够接合或抑制OX40和OX40LEXT。这种测量可以用作Ab接合是否阻止配体-受体相互作用的指示。
或者，可通过使CHO细胞培养基穿过S系列蛋白G传感器芯片(Cat#29179315)的表面来进行分泌的抗体的浓缩和纯化。这种方法允许使用不改变Ab的条件在实验之间再生传感器芯片，但可能不允许随后评估OX40L-OX40R的结合，因为与Ab的接合可能诱导OX40L的非天然取向，并通过空间位阻减少与传感器芯片的结合。
实施例7：候选抗体的OX40和OX40L活性的功能测定
HEK-蓝-NFKB功能测定：
OX40通过NFKB信号通路发出信号，使能够使用人HEK蓝TMNull1-v细胞。HEK蓝TMNull1-v细胞在融合到五个NF-κB和AP-1结合位点的IFN-β最小启动子的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。用NF-κB和/或AP-1激活剂刺激HEK蓝TMNull1-v细胞诱导SEAP的产生。
通过用犬OX40稳定转染Null-1-v细胞(hkb-null1v，InVivoGen)创建HEK蓝NF-kB报告细胞系。通过用OX40long(HEK-OX40L)转染产生稳定的HEK293细胞系。将1×105个HEK-蓝-OX40细胞悬浮在2ml DMEM+10％热灭活的FBS中，并将100μl转移到96孔板的每个孔中。对于激动剂反应，将105个HEK-OX40L细胞类似地悬浮在2ml DMEM+10％灭活的FBS中，并将100μl添加到相同96孔板的每个孔中的HEK-蓝-OX40细胞上。OX40L对OX40的激活通过使用QuantiBlue检测试剂盒(Invivogen，San Diego，USA)进行的诱导的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因表达的定量来评估(图5)。
通过将特异性抗OX40L抗体或条件CHO细胞培养基添加到HEK-OX40L中，10分钟或将其添加到HEK-蓝-OX40来确定OX40-OX40L信号传导的单点抑制。在37℃孵育过夜后，最大峰值应答归一化为对单独OX40L的应答。通过将应答归一化为在没有抑制剂的情况下的最大应答，并根据以下等式迭代拟合一系列应答的平均值±SEM，确定纯化的Ab的浓度依赖性：
Figure BDA0004113515770000531
其中Amin是基线应答，Amax是激动剂诱发的峰值应答，A50是产生等于(Amax+Amin)/2的应答的A的浓度，x是Ab浓度，nH是Hill坡度(Hill Slope)。
为了确定OX40L选择的候选者降低OX40信号传导的能力，在固定浓度为6.6μM(图13)或一系列浓度范围(2.2μM-220pM，图14)的蛋白A纯化的候选者存在下，将5000个HEK-蓝-OX40细胞和5000个HEK-OX40L细胞接种在96孔板中。在37℃孵育24小时后，收集20μl上清液，通过添加180μl的QuantiBlue试剂并在37℃下再孵育4小时来评估SEAP的存在，然后使用ClarioStar平板读取器(BMG Labtech)测量630nm处的吸光度。使用专用MARS软件3.40R2版(BMG Labtech)和GraphPad Prism 9.1版分析数据。(图13和图14)。在抗体存在下，相对信号降低至0％表明降低的OX40信号传导。相应的IC50值如下表4所示。
PBMC单向混合淋巴细胞反应(MLR)：
在存在或不存在抗体的情况下，从两个供体分离PBMC。用丝裂霉素C(40μg/ml，25分钟)处理刺激细胞以抑制DNA合成。将50,000个刺激细胞与应答细胞在96孔板中1:1混合，所述96孔板中含有抗体稀释液或仅培养基，最终体积为200μl。将平板在37℃下孵育5-7天。
通常通过0.5μCi脉冲后的3[H]胸苷掺入来测量应答。18小时后收获细胞并进行β计数。或者，可以使用非放射性测试。细胞计数试剂盒-8(CCK-8；Dojindo MolecularTechnologies；Cat#CK04-11)允许在细胞增殖和细胞毒性测定中进行灵敏的比色测定，以测定细胞活力。Dojindo的水溶性四唑盐(WST-8)被细胞中的脱氢酶活性还原，生成黄色甲
Figure BDA0004113515770000532
染料，该染料可溶于组织培养基。由细胞内脱氢酶活性产生的甲/>
Figure BDA0004113515770000533
染料的量与活细胞的数量成正比。
将CCK-8溶液添加到MLR的每个孔中，并孵育4小时，然后在450nm的微板读数器中测量OD值。刺激指数计算如下：
添加刺激细胞的孔中应答细胞的OD/仅含有应答细胞的孔内相同应答细胞的OD。
进一步的实验方案如下所示：
使用Ficoll-Paque plus(GE Healthcare)密度梯度离心从leukoreduction系统室(NHSBT)分离PBMC。PBMC与在PBS中10Mg/mL的丝裂霉素C(Sigma)在37℃下预孵育1小时。然后在PBS中洗涤细胞3次，以300×g离心3分钟，每次洗涤后吸出上清液。将同种异体PBMC(未用丝裂霉素C处理)以浓度2×l06/ml、50pL/孔添加到96孔板中补充有10％v/vFBS的RPMI中。将抗OX40L抗体在培养基中稀释，并以50pL/孔的速度添加到含有PBMC(未经丝裂霉素C处理的)的96孔板中。然后将丝裂霉素C处理的PBMC添加到96孔板中的同种异体PBMC(未用丝裂霉素C处理的)中，基于每孔的细胞数目，最终细胞比例为丝裂霉素C处理的细胞与未经丝裂霉素C处理的细胞为1:1至4:1。将细胞在37℃/5％CO2下培养5天。五天后，根据制造商的建议，通过双组ELISA(R&D Systems)测量TNF-o、IFN-γ和IL-2。根据制造商的建议，通过CFSE稀释来测量增殖。
体外PBMC活化。
使用Ficoll-Paque plus(Cytiva，GE17-1440-02)密度梯度离心法，用肝素钠抗凝剂从新鲜抽取的全血中分离PBMC。简而言之，犬血用磷酸缓冲盐水(PBS)1:1稀释，并在Ficoll-paque plus上小心分层，以800rcf离心20'，缓慢加速，最后无制动。顶层和中间相盘用PBS稀释，并以1300rpm离心10’，以收集沉淀中的PBMC，将PBMC在PBS中第二次洗涤以除去Ficoll的所有残余物。第二次离心后，将PBMC重新悬浮于补充有50ng/ml重组犬IL-2(R&Dsystems)的培养基(PBMC培养基＝RPMI+10％热灭活胎牛血清+1％青霉素-链霉素+1％非必需氨基酸+1％L-谷氨酰胺+1％丙酮酸钠+1％HEPES)中，并在使用或冷冻前在37℃、5％CO2下孵育24小时。
第二天，将PBMC接种在96孔板中的200μl/孔的PBMC培养基中，该PBMC培养基补充有PHA(Sigma Aldrich)或ConA(ThermoFisher)，并与或不与额外的OX40L三聚体蛋白和/或OX40L抗体在不同浓度下在37℃、5％CO2一起培养。然后在第3-5天收集20μl上清液用于细胞因子定量。根据制造商的建议，通过ELISA(MABtech)测量IFN-γ。
或者，如上所述分离PBMC，并在使用前在37℃、5％CO2下孵育24小时，第二天将其接种在预涂有抗犬CD3(Biorad)和CD28(eBioscience)抗体组合的96孔板中，并在37℃和5％ CO2下与或不与额外的OX40L三聚体蛋白和/或OX40L抗体以不同浓度一起培养。然后在第3-5天收集20μl上清液用于细胞因子定量。根据制造商的建议，通过ELISA(MABtech)测量IFN-γ。
实施例8Fc变体
Fc变体构建
为了产生抗体，产生DNA构建体以编码嵌合抗体，所述嵌合抗体包含与抗人CD20抗体、利妥昔单抗(参见US 5,736,137)或奥法木单抗(Ofatumumab)(序列可在Drugbank上获得，https://go.drugbank.com/drugs/DB06650)的可变区融合的选定的犬IgG恒定区。
犬IgG-B突变变体(Def 1至9，Seq ID 142至150)通过定点诱变产生。具体而言，使用Q5高保真DNA聚合酶PCR扩增人奥法木单抗或利妥昔单抗可变区和犬IgG-B突变变体，并使用NEBuilder HIFI DNA Assembly(New England Biolabs)将其组装到哺乳动物表达载体PetML5中。Ofa-VH-cIgGB WT奥法木单抗序列如SEQ ID NO.151所示。在表达载体中，重链和抗生素抗性基因表达元件两侧是DNA转座子piggyBac末端反向重复序列，以在piggyBac转座酶存在下介导稳定整合到宿主细胞中。将编码重链和轻链的表达载体与PiggyBac转座酶一起共转染到合适的哺乳动物细胞系如CHO细胞中，以获得稳定的表达。为了产生抗体，将3×106个选定的CHO细胞接种在3ml培养基中，并在32℃、5％ CO2下以200rpm振荡培养。在第1天、第4天、第7天和第10天，向培养基中添加4％ HyClone Cell Boost 7a补充剂+0.4％HyClone Cell Boost 7b补充剂+1％葡萄糖。在第12天收集培养上清液，并使用蛋白质A芯片(Biacore 8K，Cytiva Life Sciences)使用表面等离振子共振测定IgG浓度。
补体依赖性细胞毒性(CDC)活性
犬淋巴肿瘤细胞系，如CLBL1(维也纳兽医大学)或CLC(Umeki S.et alJ.Vet.Med.Sci.,75:467-474(2013)PubMed＝23196801；DOI＝10.1292/jvms.12-0448)可以用作靶标细胞。用编码人CD20蛋白(Seq ID 152)的表达构建体稳定转染或核转染这些细胞，以产生表达hCD20的细胞。使用与上述抗体表达相同的方法产生表达构建体。
针对嘌呤霉素抗性选择转染的细胞，通过使用抗人CD20抗体(克隆：2H7，BioLegend)对hCD20表达进行染色，FACS分选hCD20高(前5％)细胞。
为了评估CDC活性，在细胞杀伤测定中使用未转染的(野生型)靶向淋巴细胞或等效的hCD20表达细胞，其中每孔5000个靶细胞的96孔板与如上所述的抗人CD20犬Fc嵌合抗体和犬补体保存血清(BioIVT)以1:12的最终稀释度在37℃、5％ CO2下孵育2小时。使用热灭活血清制备的CLBL-1细胞培养基(RPMI+1％L-谷氨酰胺+20％胎牛血清)建立测定，使得犬补体保存血清将是唯一的补体来源。
然后使用CellTitre-
Figure BDA0004113515770000561
发光细胞活力测定(Promega)按照测定方案对活细胞进行定量。该测定使用活细胞的ATP含量作为细胞活力的指示。在CLARIOstar(BMGLabtech)上测量发光。使用MARS软件(BMG Labtech)分析数据，并使用Microsoft Excel使用剩余的活细胞数计算抗体存在时的杀伤百分比。背景信号从用1％triton处理的细胞样品(其中没有细胞存活)中获得，并从从每个测试样品获得的信号中减去。最大信号(0％杀伤)是从相同处理的细胞样品中获得的，但其中省略了抗体。图在Microsoft Excel或GraphPad Prism中绘制。图19显示了使用表达hCD20的CLBL1细胞和WT CLBL1细胞和犬IgGBWT或含有突变Def1、2、3、5、6、7、8、9的犬IgGB进行的示例性CDC测定的结果。抗体以10μg/ml至0.01 10μg/ml的连续1:3稀释度使用。所有测试的Def突变体(Def1、2、3、5、6、7、8、9)完全消除了犬IgGB WT通过补体依赖性细胞毒性杀死hCD20 CLBL1细胞的能力(图19)。
表2序列被指定为PMX并显示在下面的抗体和抗体片段的所有序列都在本发明的范围内。
Figure BDA0004113515770000562
/>
Figure BDA0004113515770000571
/>
Figure BDA0004113515770000581
/>
Figure BDA0004113515770000591
/>
Figure BDA0004113515770000601
/>
Figure BDA0004113515770000611
/>
Figure BDA0004113515770000621
/>
Figure BDA0004113515770000631
/>
Figure BDA0004113515770000641
/>
Figure BDA0004113515770000651
/>
Figure BDA0004113515770000661
/>
Figure BDA0004113515770000671
/>
Figure BDA0004113515770000681
/>
Figure BDA0004113515770000691
/>
Figure BDA0004113515770000701
/>
Figure BDA0004113515770000711
/>
Figure BDA0004113515770000721
表3：
Figure BDA0004113515770000722
表4：
候选者 IC50
PMX012 7.41e-8
PMX014 2.26e-8
PMX020 2.01e-8
PMX023 2.82e-9
表5：
候选者 总体同一性(％) 平均对同一性(％)
全部 29.20 76.60
组1 82.5 89.72
组2 89.26 92.84
组3 92.37 92.37
表6：
候选者 总体同一性(％) 平均对同一性(％)
全部 81.65 96.38
组1 95.37 98.43
组2 97.22 98.15
组3 97.17 97.17
序列表
<110> 佩特迈迪有限公司
<120> 治疗性抗体
<130> P37341WO1
<150> GB 2012331.1
<151> 2020-08-07
<160> 160
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 1
Met Glu Gly Val Gln Pro Leu Asp Gln Asn Val Gly Asn Thr Pro Gly
1 5 10 15
Arg Arg Phe Gln Lys Asn Lys Val Leu Leu Val Ala Ala Ile Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Tyr
35 40 45
Ala Ser Gln Val Pro Pro Gln Tyr Pro Pro Ile Gln Ser Ile Arg Val
50 55 60
Gln Phe Thr Arg Cys Glu Asn Glu Lys Gly Cys Ile Ile Thr Ser Pro
65 70 75 80
Ser Lys Asp Glu Thr Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Ile Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Glu Glu
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Gly Arg Gly Pro Leu Phe Ser
115 120 125
Leu Ser Lys Val Thr Ser Val Asp Ser Ile Gly Val Ala Tyr Leu Ala
130 135 140
Phe Lys Asp Lys Val Tyr Phe Asn Val Thr Thr His Ser Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Lys Asp Ile Gln Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Gly Phe Cys Ala Tyr
180
<210> 2
<211> 552
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 2
atggaagggg tccaacccct ggaccagaat gtgggaaaca caccagggcg aagattccag 60
aagaacaagg tattgctggt ggcagccata attcaggggc tgggtctgct cctgtgtttc 120
acctacatct gcctgcactt ctatgcttct caggtgccgc ctcagtatcc tccaattcaa 180
agtatcagag tacaatttac caggtgtgag aatgagaaag gttgcatcat cacatcccca 240
agcaaggatg aaactatgaa ggtgcaagac aactcaatca tcattaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ttacttctct gaggagctca gcctcagcct ttattaccga 360
aagggtcggg gacccctctt ctctctgagc aaggtcacat ctgttgactc cattggagtg 420
gcctatctgg ctttcaagga caaagtctac tttaatgtga ccactcacag tacctcctac 480
aaagacatcc aggtgaatgg tggggaattg attctcattc atcaaaatcc tggtggcttc 540
tgtgcctact ga 552
<210> 3
<211> 708
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 3
atgaggatgt tcgtggagtc cctgcggctc agcggtcctc actcagccct cctgctcctg 60
gggcttgtgc tgggtgccgt agctgagcac aactgtttcg ggaacaccta ccccaaagac 120
ggcaagtgct gcaatgactg cccaccaggt tatggaatgg agagccgctg cagtaggagc 180
catgacacca aatgtcatca gtgtccatct ggcttctaca atgaggctac aaattacgaa 240
ccctgcaagc cctgcactca gtgcaatcag agaagtggga gtgaacccaa gaggagatgc 300
acacccacgc aggacaccat ctgcagctgt aagccaggca cagagccccg ggacggctac 360
aagcgtggag tcgactgtgc cccatgccca cccggacact tctccccagg ggatgaccag 420
gcctgcaagc cctggaccaa ctgtaccttg atgggaaggc gtacaatgca gccggccagc 480
aagagctcag acgctgtctg tgaggacagg agcctccccg ccacactgcc atgggagacc 540
cagagccccc tgacccggcc ccctacccct cagcccacta tggcctggcc caggacctcg 600
caggggccct tcacaccccc tacggagccc cccaggggtg gaaatagctt ccggaccccc 660
atccaagagg agcatgctga cgccaactcc accctggcca agatctga 708
<210> 4
<211> 235
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 4
Met Arg Met Phe Val Glu Ser Leu Arg Leu Ser Gly Pro His Ser Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Leu Gly Ala Val Ala Glu His Asn Cys
20 25 30
Phe Gly Asn Thr Tyr Pro Lys Asp Gly Lys Cys Cys Asn Asp Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Tyr Gly Met Glu Ser Arg Cys Ser Arg Ser His Asp Thr Lys
50 55 60
Cys His Gln Cys Pro Ser Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Thr Asn Tyr Glu
65 70 75 80
Pro Cys Lys Pro Cys Thr Gln Cys Asn Gln Arg Ser Gly Ser Glu Pro
85 90 95
Lys Arg Arg Cys Thr Pro Thr Gln Asp Thr Ile Cys Ser Cys Lys Pro
100 105 110
Gly Thr Glu Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Arg Gly Val Asp Cys Ala Pro
115 120 125
Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asp Gln Ala Cys Lys Pro
130 135 140
Trp Thr Asn Cys Thr Leu Met Gly Arg Arg Thr Met Gln Pro Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ser Ser Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu
165 170 175
Pro Trp Glu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Arg Pro Pro Thr Pro Gln Pro
180 185 190
Thr Met Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Phe Thr Pro Pro Thr
195 200 205
Glu Pro Pro Arg Gly Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu
210 215 220
His Ala Asp Ala Asn Ser Thr Leu Ala Lys Ile
225 230 235
<210> 5
<211> 813
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 5
atgaggatgt tcgtggagtc cctgcggctc agcggtcctc actcagccct cctgctcctg 60
gggcttgtgc tgggtgccgt agctgagcac aactgtttcg ggaacaccta ccccaaagac 120
ggcaagtgct gcaatgactg cccaccaggt tatggaatgg agagccgctg cagtaggagc 180
catgacacca aatgtcatca gtgtccatct ggcttctaca atgaggctac aaattacgaa 240
ccctgcaagc cctgcactca gtgcaatcag agaagtggga gtgaacccaa gaggagatgc 300
acacccacgc aggacaccat ctgcagctgt aagccaggca cagagccccg ggacggctac 360
aagcgtggag tcgactgtgc cccatgccca cccggacact tctccccagg ggatgaccag 420
gcctgcaagc cctggaccaa ctgtaccttg atgggaaggc gtacaatgca gccggccagc 480
aagagctcag acgctgtctg tgaggacagg agcctccccg ccacactgcc atgggagacc 540
cagagccccc tgacccggcc ccctacccct cagcccacta tggcctggcc caggacctcg 600
caggggccct tcacaccccc tacggagccc cccaggggcc cccagctggc tgctgtcctg 660
ggcttgggcc taggcttgct ggcccccgtg gcagccgcac tggccttgct cctgcaccac 720
agagcctggc ggctgccccc cggtggaaat agcttccgga cccccatcca agaggagcat 780
gctgacgcca actccaccct ggccaagatc tga 813
<210> 6
<211> 270
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 6
Met Arg Met Phe Val Glu Ser Leu Arg Leu Ser Gly Pro His Ser Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Leu Gly Ala Val Ala Glu His Asn Cys
20 25 30
Phe Gly Asn Thr Tyr Pro Lys Asp Gly Lys Cys Cys Asn Asp Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Tyr Gly Met Glu Ser Arg Cys Ser Arg Ser His Asp Thr Lys
50 55 60
Cys His Gln Cys Pro Ser Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Thr Asn Tyr Glu
65 70 75 80
Pro Cys Lys Pro Cys Thr Gln Cys Asn Gln Arg Ser Gly Ser Glu Pro
85 90 95
Lys Arg Arg Cys Thr Pro Thr Gln Asp Thr Ile Cys Ser Cys Lys Pro
100 105 110
Gly Thr Glu Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Arg Gly Val Asp Cys Ala Pro
115 120 125
Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asp Gln Ala Cys Lys Pro
130 135 140
Trp Thr Asn Cys Thr Leu Met Gly Arg Arg Thr Met Gln Pro Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ser Ser Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu
165 170 175
Pro Trp Glu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Arg Pro Pro Thr Pro Gln Pro
180 185 190
Thr Met Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Phe Thr Pro Pro Thr
195 200 205
Glu Pro Pro Arg Gly Pro Gln Leu Ala Ala Val Leu Gly Leu Gly Leu
210 215 220
Gly Leu Leu Ala Pro Val Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu His His
225 230 235 240
Arg Ala Trp Arg Leu Pro Pro Gly Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile
245 250 255
Gln Glu Glu His Ala Asp Ala Asn Ser Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40正向引物
<400> 7
ggcagagatg aggatgttcg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40反向引物
<400> 8
cactggctgc tcagatcttg g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L正向引物
<400> 9
gccacagttt tcatctccct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L反向引物
<400> 10
gcttggctta ggtgcagc 18
<210> 11
<211> 364
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 11
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
gcctgtgtga cctctggatt caccttcagt agctatcaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcttac attaacactg gtggaactgt cacaacctat 180
gcagacgcta tgaatgcaga cgctgtgagg ggccgattca ccatctccag agacaacgtc 240
aagaacacgc tgtatcttca gatgaataga ctgagagccg aggacacggc cgtatattac 300
tgtgcgcgcg ggtatggggt ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
ccgg 364
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Thr Gly Gly Thr Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Met
50 55 60
Asn Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 13
<211> 328
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 13
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agccgtaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacaacagtg atagggctag ttgggtattc 300
ggtgaaggga cccagctgac cgtcctcg 328
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 14
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Ser Asp Arg Ala
85 90 95
Ser Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 16
Asn Thr Gly Gly Thr Val
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 17
Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Val Phe Asp Tyr Trp
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 18
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 19
Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr
1 5
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 20
Cys Gln Val Trp Asp Asn Ser Asp Arg Ala Ser Trp Val Phe
1 5 10
<210> 21
<211> 370
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 21
gaactcacac tgcaggagtc agggccagga ctggtgaagc cctcacagac cctctctctc 60
acctgtgttg tgtccggagg ctccgtcacc agcagtcact actggaactg gatccgccag 120
cgccctggga ggggactgga atggatgggg tcctggacag gcggaacaaa ctacaacccg 180
gcattccagg gacgcatctc tgtcacttct gacacggcca agaaccaatt ctccctgcaa 240
ctgagttcct tgaccaccga ggacacggcc gtgtattatt gtgcacgagg aggcggatat 300
agtggcacct ggaaggatta ctatgttatg gactactggg gccatggcac ctcagtcatc 360
gtgtcctcag 370
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 22
Glu Leu Thr Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
His Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Ser Trp Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Phe Gln Gly
50 55 60
Arg Ile Ser Val Thr Ser Asp Thr Ala Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Gly Gly Gly Tyr Ser Gly Thr Trp Lys Asp Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly His Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 23
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaaccagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacct tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattttgat accagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 24
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Asn Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Phe Asp Thr Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 25
Gly Gly Ser Val Thr Ser Ser His
1 5
<210> 26
<211> 3
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 26
Thr Gly Gly
1
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 27
Cys Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Ser Gly Thr Trp Lys Asp Tyr Tyr Val
1 5 10 15
Met Asp Tyr Trp
20
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 28
Gly Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 29
Phe Asp Thr Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 30
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 31
<211> 367
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 31
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt cacattcagt aacttccaca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaacagtg gtggatttaa cataaattat 180
gaagacgctg tgaggggccg cttcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgttgtat 240
cttcagatga acagcctgag agccgaagac acggccattt attactgtgc gcgtgattgg 300
gatacacatt tggatacgaa ctggttctac tactggggcc aagggaccct ggtcactgtg 360
tcctcag 367
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Phe Asn Ile Asn Tyr Glu Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Asp Thr His Leu Asp Thr Asn Trp Phe Tyr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 33
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagtc ggcccacatc 60
acctgtcggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacatcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 34
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 34
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ser Ala His Ile Thr Cys Arg Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 36
Asn Ser Gly Gly Phe Asn
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 37
Cys Ala Arg Asp Trp Asp Thr His Leu Asp Thr Asn Trp Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
Trp
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 38
Arg Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 39
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 40
Cys Gln Val Trp Asp Ile Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 41
<211> 367
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagaatt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt tactaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatat atcaacagtg gtggatttag tacaaactat 180
gcagacgctg tgaagggccg atgctccatc tccagagaca atggcaagaa cacgctgtat 240
cttcagatga acagcctgag acccgaggac acgggcgttt attattgtgc gagtgaaagt 300
cgttgggggg attcttacag tggtatgacc tactggggcc atggcacttc actcttcgtg 360
tcctcag 367
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Phe Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Cys Ser Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Ser Arg Trp Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Met Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Ser Leu Phe Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 43
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg ttctgattat ctattatgat aacagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaagtcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 44
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Asn Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 45
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 46
Asn Ser Gly Gly Phe Ser
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 47
Cys Ala Ser Glu Ser Arg Trp Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Met Thr Tyr
1 5 10 15
Trp
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 48
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 49
Tyr Asp Asn Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 50
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 51
<211> 361
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 51
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc cgggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aattaccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaccagtg atggaattgt ttcaagctac 180
gcagacgttg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgcttttt 240
cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc gagtgggttg 300
tttttagtag ttgggggggg gaccttctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Asp Gly Ile Val Ser Ser Tyr Ala Asp Val Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Thr Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 53
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattctgat agtagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 54
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 54
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 55
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 56
Thr Ser Asp Gly Ile Val
1 5
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 57
Cys Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Thr Phe Trp
1 5 10 15
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 58
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 59
Ser Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 60
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 61
<211> 364
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 61
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac cttgtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agttaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attgccagtg gtggtactgt cacaacctat 180
gcagacgctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tatgttgtat 240
cttcagatga acagcctgag agccgaggac tcggccgtat attactgtac gaggtggaag 300
ggtgggactt ttggctatgg tatggactac tggggccatg gcacctcact cttcgtgtcc 360
tcag 364
<210> 62
<211> 121
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ala Ser Gly Gly Thr Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Lys Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
His Gly Thr Ser Leu Phe Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 63
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat aacaacaggc cggcagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 64
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 66
Ala Ser Gly Gly Thr Val
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 67
Cys Thr Arg Trp Lys Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 68
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 69
Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ala
1 5
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 70
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 71
<211> 361
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 71
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aactaccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaccaatg atggaattgt ttcaagctac 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctttat 240
cttcagatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtggattg 300
tttctagtag ttgggggggg gaccttctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Asn Asp Gly Ile Val Ser Ser Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Thr Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 73
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca taagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 74
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 74
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln His Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 75
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 76
Thr Asn Asp Gly Ile Val
1 5
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 77
Cys Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Thr Phe Trp
1 5 10 15
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 78
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 79
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 80
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 81
<211> 355
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 81
gaggtacaac tggtggagtc ggggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agcaactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctgcagtg ggtctcacaa attagcggtg atggaattta cacaaactac 180
gcagacgcta tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agatgaggac acggcactat attactgtgc aactgggata 300
taccccaatg cttttggtta ctggggccag ggcaccctgg tcactgtctc ctcag 355
<210> 82
<211> 118
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ser Gln Ile Ser Gly Asp Gly Ile Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Ile Tyr Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 83
tcctatgtgc tgacacagtt gtcatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagcg ctaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 84
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Ser Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 85
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 86
Ser Gly Asp Gly Ile Tyr
1 5
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 87
Cys Ala Thr Gly Ile Tyr Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Trp
1 5 10
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 88
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 89
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 90
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val Phe
1 5 10
<210> 91
<211> 361
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 91
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagaatt 60
tcctgtgtgg cttctggatt caccttcagt agctaccaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcacac attagcagtg gtggaacttt cacaagttat 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctctat 240
cttcagatga tcagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgggttg 300
tttctagtag ttgggggggg gaactactgg ggccggggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Asn Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 93
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattctgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctagtgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 94
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 94
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Ser Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 95
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 96
Ser Ser Gly Gly Thr Phe
1 5
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 97
Cys Ala Ser Gly Leu Phe Leu Val Val Gly Gly Gly Asn Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 98
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 99
Ser Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 100
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 101
<211> 364
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 101
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aactaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaacagtg atgggagagt caccacctat 180
tcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtgt 240
cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtggagg 300
ggtgggactt ttggctatgg tatggactac tggggccatg gcacctcact cttcgtgtct 360
tcag 364
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Ser Asp Gly Arg Val Thr Thr Tyr Ser Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Cys
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Arg Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
His Gly Thr Ser Leu Phe Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 103
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaatat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 104
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 104
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 106
Asn Ser Asp Gly Arg Val
1 5
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 107
Cys Ala Arg Trp Arg Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 108
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 109
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 110
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 111
<211> 364
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 111
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt aactaccaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcttcagtg ggtcgcatac attaatagtg atggaagaat tacaacctat 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
cttcagatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtggagg 300
ggtgggactt ttggctatgg tatggactac tggggccatg gcacctcact cttcgtgtcc 360
tcag 364
<210> 112
<211> 121
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Ser Asp Gly Arg Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Arg Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
His Gly Thr Ser Leu Phe Val Ser Ser
115 120
<210> 113
<211> 325
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 113
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaaggctag tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctcg 325
<210> 114
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 114
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 115
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 116
Asn Ser Asp Gly Arg Ile
1 5
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 117
Cys Ala Arg Trp Arg Gly Gly Thr Phe Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 118
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 119
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 120
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 121
<211> 361
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 121
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctgatgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttccat aactatcaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gacttcagtg ggtcgcacac attagcagtg atgggagatt cataagctat 180
gcagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaatggattg 300
tttctggtac ttggggggga gaactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asn Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Asp Gly Arg Phe Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Gly Leu Phe Leu Val Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 123
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggccccta tattgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctagtgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 124
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 124
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Ile Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Ser Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 125
Gly Phe Thr Phe His Asn Tyr
1 5
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 126
Ser Ser Asp Gly Arg Phe
1 5
<210> 127
<211> 15
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 127
Cys Ala Asn Gly Leu Phe Leu Val Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 128
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 129
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 130
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Ser Val Phe
1 5 10
<210> 131
<211> 355
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 131
gaggtgctac tgatggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agcaactaca tgtactggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctgcagtg ggtctcacaa attagcggtg atggaagttt cacaaactac 180
gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacactgtat 240
ctccagatga acagcctgag agatgaggac acggcagttt tttactgtgc aagtgggata 300
taccccaatg cttttggtta ctggggccag ggcaccctgg tcactgtctc ctcag 355
<210> 132
<211> 118
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 132
Glu Val Leu Leu Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ser Gln Ile Ser Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ile Tyr Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 133
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 133
tcctatgtgc tgacacagcc gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtggcg gagacaatat tggaagtaaa agtgttcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgagg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 134
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 134
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Ser Ser Ala Asn Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 135
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
1 5
<210> 136
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 136
Ser Gly Asp Gly Ser Phe
1 5
<210> 137
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 137
Cys Ala Ser Gly Ile Tyr Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Trp
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 138
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 139
Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr
1 5
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 140
Cys Gln Val Arg Asp Ser Ser Ala Asn Val Phe
1 5 10
<210> 141
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 141
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 142
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 142
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 143
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 143
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 144
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 144
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 145
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 145
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn His Ile Gly Leu Gly Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 146
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 146
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 147
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 147
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 148
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 148
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Gly Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 149
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 149
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Gly Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 150
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 150
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 151
<211> 476
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 151
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys
210 215 220
Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro
225 230 235 240
Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp
290 295 300
Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly
355 360 365
Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe
385 390 395 400
Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro
405 410 415
Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser
420 425 430
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg
435 440 445
Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 152
<211> 894
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc ttaa 894
<210> 153
<211> 475
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 153
Met Glu Phe Val Leu Gly Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ala Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Val Ile Gly Asn Trp Ile Ala Thr Ser Asp Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn
210 215 220
Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys
225 230 235 240
Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe
290 295 300
Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
355 360 365
Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu
370 375 380
Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro
385 390 395 400
Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu
405 410 415
Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly
435 440 445
Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 154
<211> 471
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 154
Met Glu Phe Val Leu Gly Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ala Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Val Ile Gly Asn Trp Ile Ala Thr Ser Asp Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn
210 215 220
Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn
225 230 235 240
Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu
260 265 270
Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly
275 280 285
Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu
290 295 300
Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr
325 330 335
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro
340 345 350
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser
355 360 365
Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr
370 375 380
Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp
385 390 395 400
Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg
405 410 415
Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr
435 440 445
Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser
450 455 460
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 155
<211> 473
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 155
Met Glu Phe Val Leu Gly Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ala Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Val Ile Gly Asn Trp Ile Ala Thr Ser Asp Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ser Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn
210 215 220
Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Val Lys
225 230 235 240
Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys
245 250 255
Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp
290 295 300
Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser
305 310 315 320
Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His
355 360 365
Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys
370 375 380
Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu
385 390 395 400
Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys
405 410 415
Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr
435 440 445
Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 156
<211> 471
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 156
Met Glu Phe Val Leu Gly Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ala Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Val Ile Gly Asn Trp Ile Ala Thr Ser Asp Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Ser Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ser Val Leu Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Leu Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn
210 215 220
Val Val His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu
260 265 270
Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly
275 280 285
Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu
290 295 300
Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr
325 330 335
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro
340 345 350
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Gly
355 360 365
Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr
370 375 380
Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp
385 390 395 400
Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His
405 410 415
Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr
435 440 445
Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser
450 455 460
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 157
<211> 737
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 157
ctgctggcag agatgaggat gttcgtggag tccctgcggc tcagcggtcc tcactcagcc 60
ctcctgctcc tggggcttgt gctgggtgcc gtagctgagc acaactgttt cgggaacacc 120
taccccaaag acggcaagtg ctgcaatgac tgcccaccag gttatggaat ggagagccgc 180
tgcagtagga gccatgacac caaatgtcat cagtgtccat ctggcttcta caatgaggct 240
acaaattacg aaccctgcaa gccctgcact cagtgcaatc agagaagtgg gagtgaaccc 300
aagaggagat gcacacccac gcaggacacc atctgcagct gtaagccagg cacagagccc 360
cgggacggct acaagcgtgg agtcgactgt gccccatgcc cacccggaca cttctcccca 420
ggggatgacc aggcctgcaa gccctggacc aactgtacct tgatgggaag gcgtacaatg 480
cagccggcca gcaagagctc agacgctgtc tgtgaggaca ggagcctccc cgccacactg 540
ccatgggaga cccagagccc cctgacccgg ccccctaccc ctcagcccac tatggcctgg 600
cccaggacct cgcaggggcc cttcacaccc cctacggagc cccccagggg tggaaatagc 660
ttccggaccc ccatccaaga ggagcatgct gacgccaact ccaccctggc caagatctga 720
gcagccagtg ctcccac 737
<210> 158
<211> 842
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 158
ctgctggcag agatgaggat gttcgtggag tccctgcggc tcagcggtcc tcactcagcc 60
ctcctgctcc tggggcttgt gctgggtgcc gtagctgagc acaactgttt cgggaacacc 120
taccccaaag acggcaagtg ctgcaatgac tgcccaccag gttatggaat ggagagccgc 180
tgcagtagga gccatgacac caaatgtcat cagtgtccat ctggcttcta caatgaggct 240
acaaattacg aaccctgcaa gccctgcact cagtgcaatc agagaagtgg gagtgaaccc 300
aagaggagat gcacacccac gcaggacacc atctgcagct gtaagccagg cacagagccc 360
cgggacggct acaagcgtgg agtcgactgt gccccatgcc cacccggaca cttctcccca 420
ggggatgacc aggcctgcaa gccctggacc aactgtacct tgatgggaag gcgtacaatg 480
cagccggcca gcaagagctc agacgctgtc tgtgaggaca ggagcctccc cgccacactg 540
ccatgggaga cccagagccc cctgacccgg ccccctaccc ctcagcccac tatggcctgg 600
cccaggacct cgcaggggcc cttcacaccc cctacggagc cccccagggg cccccagctg 660
gctgctgtcc tgggcttggg cctaggcttg ctggcccccg tggcagccgc actggccttg 720
ctcctgcacc acagagcctg gcggctgccc cccggtggaa atagcttccg gacccccatc 780
caagaggagc atgctgacgc caactccacc ctggccaaga tctgagcagc cagtgctccc 840
ac 842
<210> 159
<211> 620
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 159
tgccacagtt ttcatctccc ttacatctaa actgtgaaga tggaaggggt ccaacccctg 60
gaccagaatg tgggaaacac accagggcga agattccaga agaacaaggt attgctggtg 120
gcagccataa ttcaggggct gggtctgctc ctgtgtttca cctacatctg cctgcacttc 180
tatgcttctc aggtgccgcc tcagtatcct ccaattcaaa gtatcagagt acaatttacc 240
aggtgtgaga atgagaaagg ttgcatcatc acatccccaa gcaaggatga aactatgaag 300
gtgcaagaca actcaatcat cattaactgt gatgggtttt atctcatctc cctgaagggt 360
tacttctctg aggagctcag cctcagcctt tattaccgaa agggtcgggg acccctcttc 420
tctctgagca aggtcacatc tgttgactcc attggagtgg cctatctggc tttcaaggac 480
aaagtctact ttaatgtgac cactcacagt acctcctaca aagacatcca ggtgaatggt 540
ggggaattga ttctcattca tcaaaatcct ggtggcttct gtgcctactg aggacctgag 600
ggctgcacct aagccaagca 620
<210> 160
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌的OX40L构建体，其含有IL-2信号序列、
His标签、AviTag、亮氨酸拉链、GS接头和
OX40L的胞外结构域，在
细胞外跨膜结构域连接处截短。
<400> 160
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
caccaccacc accaccacgg gttgaatgat attttcgaag cacagaaaat tgaatggcat 120
gagcgtatga aacagatcga agataaaatt gaagagatct tgagcaaaat ctatcatatc 180
gaaaacgaaa ttgcgcgtat caaaaagctg attggcgaac gtggcggtgg cagcggtggc 240
ggtagcggcg gtggcagcgc ttctcaggtg ccgcctcagt atcctccaat tcaaagtatc 300
agagtacaat ttaccaggtg tgagaatgag aaaggttgca tcatcacatc cccaagcaag 360
gatgaaacta tgaaggtgca agacaactca atcatcatta actgtgatgg gttttatctc 420
atctccctga agggttactt ctctgaggag ctcagcctca gcctttatta ccgaaagggt 480
cggggacccc tcttctctct gagcaaggtc acatctgttg actccattgg agtggcctat 540
ctggctttca aggacaaagt ctactttaat gtgaccactc acagtacctc ctacaaagac 600
atccaggtga atggtgggga attgattctc attcatcaaa atcctggtgg cttctgtgcc 660
tactga 666

Claims (27)

1.抗体或其片段，其特异性结合伴侣动物OX40L。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述伴侣动物是狗或猫。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段结合犬OX40L。
4.根据权利要求3所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段能够：
a)降低、抑制或中和伴侣动物或伴侣动物细胞中的OX40活性或活化；
b)改变伴侣动物或伴侣动物细胞中细胞因子的分泌和/或
c)减少伴侣动物中白细胞的增殖。
5.根据前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述抗体是犬或犬源化抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体或片段，其中所述抗体选自以下抗体中的一个：
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:15或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:16或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:17或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:18或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:19或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:20或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:25或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:26或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:27或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:28或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:29或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:30或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:35或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:36或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:37或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:38或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:39或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:40或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:45或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:46或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:47或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:48或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:49或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:50或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:55或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:56或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:57或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:58或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:59或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:60或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:65或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:66或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:67或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:68或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:69或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:70或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:75或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:76或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:77或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:78或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:79或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:80或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:85或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:86或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:87或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:88或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:89或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:90或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:95或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:96或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:97或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:98或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ ID No:99或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ IDNo:100或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:105或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:106或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:107或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:108或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:109或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:110或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:115或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:116或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:117或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:118或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:119或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:120或与其具有至少80％的序列同一性的序列；
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:125或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:126或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:127或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:128或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:129或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:130或与其具有至少80％的序列同一性的序列；或
抗体，其包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述HC CDR1包含SEQ ID No:135或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR2包含SEQ ID No:136或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述HC CDR3包含SEQ ID No:137或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR1包含SEQ ID No:138或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR2包含SEQ IDNo:139或与其具有至少80％的序列同一性的序列，所述LC CDR3包含SEQ ID No:140或与其具有至少80％的序列同一性的序列。
7.根据权利要求5或6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体选自以下抗体中的一个：
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.12或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.14或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.22或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.24或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.32或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.34或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.42或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.44或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.52或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.54或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.62或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.64或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.72或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.74或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.82或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.84或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.92或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.94或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.102或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.104或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.112或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.114或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.122或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.124或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成；或
抗体，其包含HC可变区和LC可变区，所述HC可变区包含SEQ IDNo.132或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成，所述LC可变区包含SEQ ID No.134或与其具有至少80％的序列同一性的序列或由其组成。
8.根据前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述片段选自F(ab')2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重链(VH)、可变轻(VL)链、CDR区、单个VH或VL结构域、大抗体、小抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体和双scFv，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述至少一部分免疫球蛋白足以赋予所述多肽特异性抗原结合。
9.根据前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与另一部分缀合。
10.根据前述权利要求所述的抗体或片段，其包含治疗部分、半衰期延长部分或标记。
11.结合分子，其包含根据前述权利要求的抗体或片段。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段或权利要求11所述的结合分子，其用于治疗疾病。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或其片段或权利要求11所述的结合分子。
14.根据权利要求1-10中任一项的抗体或其片段、权利要求11所述的结合分子或根据权利要求13的药物组合物，其用于治疗OX40或OX40L介导的疾病。
15.治疗或预防OX40或OX40L介导的疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-10中任一项的抗体或片段、权利要求11所述的结合分子或权利要求13所述的药物组合物。
16.根据权利要求14所述的抗体或片段、结合分子或药物组合物或权利要求15所述的方法，其中所述疾病选自炎症性或自身免疫性疾病。
17.根据权利要求16所述的抗体或片段、结合分子、药物组合物或方法，其中所述疾病选自炎症性皮肤病，包括特应性皮炎、过敏性皮炎、瘙痒症、银屑病、硬皮病或湿疹；与炎症性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)相关的反应；缺血再灌注；成人呼吸窘迫综合征；哮喘；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、血管炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎症性疾病、继发于败血症或创伤的多器官损伤综合征、细菌性肺炎、抗原抗体复合物介导的疾病；肺部的炎症，包括胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维化。
18.根据权利要求14、16或17中任一项所述的抗体或片段、结合分子、药物组合物或根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与一种或多种治疗剂一起施用。
19.根据权利要求18所述的抗体或片段、结合分子、药物组合物或方法，其中所述一种或多种治疗剂选自雷帕霉素(西罗莫司)、他克莫司、环孢菌素(例如
Figure FDA0004113515760000071
)、皮质类固醇(例如甲基强的松龙)、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、抗CD28抗体、抗IL-12/IL-23抗体、抗CD20抗体、抗CD30抗体、CTLA4-Fc分子、CCR5受体拮抗剂、抗CD40L抗体、抗VI_A4抗体、抗LFA1抗体、氟达拉滨、抗CD52抗体、抗CD45抗体、环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、抗补体C5抗体、抗a4b7整联蛋白抗体、抗IL6抗体、抗IL6-R抗体、抗IL2R抗体、抗CD25抗体、抗TNFa/TNFa-Fc分子、HDAC抑制剂、JAK抑制剂，如JAK-1和JAK-3抑制剂、抗IL-31抗体、SYK抑制剂、抗IL-4Ra抗体、抗IL-13抗体、抗TSLP抗体、PDE4抑制剂、lokietmab/>
Figure FDA0004113515760000081
和奥拉替尼
Figure FDA0004113515760000082
20.减少细胞因子分泌的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-10中任一项的抗体或片段、权利要求11的结合分子或权利要求13的药物组合物。
21.多特异性结合剂，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或其片段或权利要求11的结合分子。
22.组合疗法，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或片段、权利要求11的结合分子或权利要求13的药物组合物。
23.免疫缀合物，其包含权利要求1-10中任一项的抗体或片段或权利要求11的结合分子。
24.试剂盒，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或其片段、权利要求11所述的结合分子或权利要求13的药物组合物。
25.分离的犬OX40蛋白质，其包含SEQ ID NO.4或6或其变体。
26.分离的核酸分子，其编码根据权利要求25的蛋白质，任选地包含SEQ ID NO.3或5或其变体。
27.用于检测伴侣动物中OX40L或OX40的方法，其包括使测试样品与根据权利要求1-10中任一项的抗体或片段或权利要求11的结合分子接触。
CN202180058009.6A 2020-08-07 2021-08-06 治疗性抗体 Pending CN116249710A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB2012331.1 2020-08-07
GBGB2012331.1A GB202012331D0 (en) 2020-08-07 2020-08-07 Therapeutic antibodies
PCT/GB2021/052043 WO2022029447A1 (en) 2020-08-07 2021-08-06 Therapeutic antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116249710A true CN116249710A (zh) 2023-06-09

Family

ID=72520053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180058009.6A Pending CN116249710A (zh) 2020-08-07 2021-08-06 治疗性抗体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230272097A1 (zh)
EP (1) EP4192867A1 (zh)
JP (1) JP2023540444A (zh)
CN (1) CN116249710A (zh)
AU (1) AU2021319941A1 (zh)
CA (1) CA3186391A1 (zh)
GB (1) GB202012331D0 (zh)
WO (1) WO2022029447A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
WO2023152486A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO2005094879A2 (en) * 2004-03-23 2005-10-13 Amgen, Inc. Monoclonal antibodies specific for human ox40l (cd 134l)
AR057253A1 (es) * 2005-12-16 2007-11-21 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40l y metodos que los utilizan
GB0525662D0 (en) 2005-12-16 2006-01-25 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
CA2840460C (en) 2011-07-11 2022-08-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to ox40 and their uses
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US9567606B2 (en) * 2012-02-14 2017-02-14 Merial Inc. Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and OX40 proteins, and vaccines made therefrom
GB201316644D0 (en) 2013-09-19 2013-11-06 Kymab Ltd Expression vector production & High-Throughput cell screening
US10196435B2 (en) 2013-11-18 2019-02-05 University Of Southern California OX40L fusion protein for the immunotherapy of tumors of veterinary animals
FI3265123T3 (fi) 2015-03-03 2023-01-31 Vasta-aineita, käyttöjä & menetelmiä
GB2561352B (en) 2017-04-10 2023-01-18 Genome Res Ltd Animal models and therapeutic molecules
EP3765500A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Zoetis Services LLC Interleukin-31 monoclonal antibodies for veterinary use
GB2578867A (en) 2018-10-09 2020-06-03 Genome Res Ltd Animal models and therapeutic molecules

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022029447A1 (en) 2022-02-10
US20230272097A1 (en) 2023-08-31
AU2021319941A1 (en) 2023-02-16
CA3186391A1 (en) 2022-02-10
JP2023540444A (ja) 2023-09-25
EP4192867A1 (en) 2023-06-14
GB202012331D0 (en) 2020-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7061235B2 (ja) 抗ｃｌｄ１８ａ２ナノ抗体及びその応用
CN109414455B (zh) Bcma结合分子及其使用方法
TWI779479B (zh) 抗原結合分子類和使用彼等之方法
JP6938383B2 (ja) イヌインターロイキン４受容体アルファに対する抗体
CN110545883A (zh) 针对cd19的人源化抗原结合结构域及其使用方法
KR20210040827A (ko) 항 tigit 항체 및 그 용도
CN117024588A (zh) 抗cd19抗体在制备白血病治疗药物中的用途
CN104822704A (zh) 针对分化簇3(cd3)的人源化的抗体
TWI787594B (zh) 抗原結合分子和使用彼之方法
US20230272097A1 (en) Therapeutic antibodies
WO2022007543A1 (zh) 一种抗fgl1抗体及其应用
JP2022507487A (ja) Ｃｄ２５抗体
CN113621065B (zh) 靶向4-1bb的全人源抗体及其制备方法和应用
US20240150460A1 (en) Anti-nkp30 antibody and application thereof
US20230312709A1 (en) Antibody targeting CD47 and application thereof
CN113501873B (zh) Rbv的蛋白结合分子及其用途
US20230147657A1 (en) Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof
WO2023152486A1 (en) Therapeutic antibodies
TW202041862A (zh) 用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法
CN114075284B (zh) Cd47结合分子及其用途
CN116640216B (zh) 抗cd19抗体的抗体、抗cd22抗体的抗体及其应用
WO2023193767A1 (zh) 一种抗原结合蛋白及其应用
US20210405026A1 (en) Method for evaluating the presence of a viral reservoir, and evaluating the efficacy of a drug against said reservoir
EP4353746A1 (en) Anti-pd-1 humanized antibody or antigen-binding fragment thereof and application thereof
WO2024012513A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination