CN116240283A - Oma1在逆转急性淋巴细胞白血病耐药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了OMA1在逆转急性淋巴细胞白血病耐药中的应用。本发明通过检测儿童ALL中OMA1基因表达情况，发现其表达水平明显降低，OMA1对ALL初发诊断的工作特征曲线的AUC＝0.775；OMA1对ALL复发诊断的工作特征曲线的AUC＝0.822；因此OMA1可作为儿童ALL的诊断、复发及耐药判别的良好的分子标志物。本发明还通过构建过表达OMA1质粒载体，将其转染到多种ALL耐药细胞中，验证了OMA1能显著抑制人ALL耐药细胞的恶性增殖，促进其凋亡，进而逆转耐药细胞的耐药性。因此，说明OMA1可以是作为人ALL，尤其是耐药复发型ALL治疗的新靶点。

Description

OMA1在逆转急性淋巴细胞白血病耐药中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及OMA1在逆转急性淋巴细胞白血病耐药中的应用。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，占19岁前肿瘤发病的19％。在过去的50年里，由于多种新药的开发，更适宜的化疗方案的提出，预防中枢神经系统受累方案的改进，以及判定治疗反应的标记物的筛查，ALL患儿的预后有了极大的改善。目前5年存活率最高达90％以上，但仍有10-20％儿童复发，复发患者预后较差。尽管同种异体造血干细胞移植的应用，但是这些患儿中的绝大多数还是无法长期生存。骨髓早期复发(＜36个月)的B型ALL患者(如前体B型ALL))的长期生存率仅15％左右，而晚期复发(＞36个月)的挽救率相对较高，但依旧只有40-50％患儿能被挽救回来。另一方面，复发的T-ALL患者预后均较差，5-10年无事件生存率仅为15-20％。
临床上采用发病年龄、初始白细胞计数、是否存在髓外浸润、免疫表型、基因型和微小残留病等参数对初诊的患儿进行危险度分级。复发后最重要的预后预测指标是表型、初始缓解时间和复发部位等。目前治疗复发性ALL的方法与一线治疗有许多相似之处。所有患者，无论复发部位，都需要再诱导化疗。再诱导化疗方案通常包含许多与治疗初诊患者相同的药物。然而，它们往往会增加剂量或使用替代方案。在达到第二次完全缓解后，根据复发的时间和部位、免疫表型和微小残留评估患儿对再诱导治疗的反应，以决定患者将继续接受或不接受放疗、或进行同种异体造血干细胞移植。同种异体造血干细胞移植可改善早期复发和微小残留不满意的患者的预后。尽管有这些方法，复发性ALL的总生存率仍然在25-40％之间。已有的研究表明，耐药性复发是导致ALL患者死亡的最主要原因。因此，深入研究儿童ALL的耐药机制具有重要的医学价值，寻找能逆转耐药的分子对于儿童ALL的临床治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供OMA1在儿童ALL的逆转耐药方面的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供定量检测OMA1的物质在制备急性淋巴细胞白血病预后和/或复发和/或耐药评估的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包含在基因和/或蛋白水平上定量检测OMA1的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测OMA1基因表达水平的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测OMA1基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片、抗体中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述引物的序列为：
上游引物Q-OMA1-F：5’-CCATACTTCTCCACGGTTTC-3’；
下游引物Q-OMA1-R：5’-ATGCTTCGTGCTGAGTTTGA-3’。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
本发明的第二方面，提供一种诊断试剂，所述诊断试剂包含定量检测OMA1的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包含在基因和/或蛋白水平上定量检测OMA1的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测OMA1基因表达水平的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测OMA1基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片、抗体中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述引物的序列为：
上游引物Q-OMA1-F：5’-CCATACTTCTCCACGGTTTC-3’；
下游引物Q-OMA1-R：5’-ATGCTTCGTGCTGAGTTTGA-3’。
本发明的第三方面，提供OMA1在制备产品中的应用；所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡；
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发。
本发明的第四方面，提供物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡；
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发；
所述物质包含(b1)～(b3)中的至少一种：
(b1)提高或增强OMA1基因表达的物质；
(b2)提高或增强OMA1蛋白活性的物质；
(b3)提高或增强OMA1蛋白含量的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述提高或增强OMA1基因表达的物质、提高或增强OMA1蛋白活性的物质或提高或增强OMA1蛋白含量的物质为与OMA1蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述(c1)至(c4)中的任一种：
(c1)编码OMA1的核酸分子；
(c2)含有(c1)所述核酸分子的表达盒；
(c3)含有(c1)所述核酸分子的重组载体、或含有(c2)所述表达盒的重组载体；
(c4)含有(c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(c2)所述表达盒的重组微生物、或含有(c3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体包括真核表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述真核载体包括pcDNA3.1，但并对此进行限定，本领域常用的真核表达载体可以起到同样的效果。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体包如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的第五方面，提供一种产品，包含(b1)～(b3)中的至少一种：
(b1)提高或增强OMA1基因表达的物质；
(b2)提高或增强OMA1蛋白活性的物质；
(b3)提高或增强OMA1蛋白含量的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述提高或增强OMA1基因表达的物质、提高或增强OMA1蛋白活性的物质或提高或增强OMA1蛋白含量的物质为与OMA1蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述(c1)至(c4)中的任一种：
(c1)编码OMA1的核酸分子；
(c2)含有(c1)所述核酸分子的表达盒；
(c3)含有(c1)所述核酸分子的重组载体、或含有(c2)所述表达盒的重组载体；
(c4)含有(c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(c2)所述表达盒的重组微生物、或含有(c3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体包括真核表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述真核载体包括pcDNA3.1，但并对此进行限定，本领域常用的真核表达载体可以起到同样的效果。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体包如SEQ ID NO.1所示的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡；
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物和/或试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。
本发明的第六方面，提供一种逆转急性淋巴细胞白血病细胞耐药的方法，通过提高或增强OMA1基因表达和/或提高或增强OMA1蛋白活性和/或提高或增强OMA1蛋白含量。
在本发明的一些实施方式中，可以通过含有OMA1基因的病毒载体、调控OMA1表达的上游基因及其分子信号途径的激活剂、潜在的促进OMA1蛋白表达的激活剂等方式提高或增强OMA1基因表达；通过外源OMA1蛋白直接给药、OMA1功能模拟物等方式提高或增强OMA1蛋白含量。
本发明的有益效果是：
本发明通过检测儿童ALL中OMA1基因表达情况，发现其表达水平明显降低，OMA1对ALL初发诊断的工作特征曲线的AUC＝0.775，具有诊断价值；而且还发现OMA1对ALL复发诊断的工作特征曲线的AUC＝0.822，最佳诊断阈值为△Ct＞10.82，敏感性为91.3％(95％CI,0.72-0.99)，特异性为0.56(95％CI,0.41-0.70)；因此OMA1可作为儿童ALL的诊断、复发、耐药判别的良好的分子标志物。
本发明还通过构建过表达OMA1质粒载体，将其转染到多种ALL耐药细胞中，验证了OMA1能显著抑制人ALL耐药细胞的恶性增殖，促进其凋亡，进而逆转耐药细胞的耐药性。因此，说明OMA1可以是作为人ALL，尤其是耐药复发型ALL治疗的新靶点。
本发明还提供了一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株Nalm6/DNR2为复发难治型ALL的研究和生物医疗研发提供了新的细胞模型，在探索儿童ALL柔红霉素耐药复发的机制以及逆转耐药的药物研发应用中具有较好的实用价值。
附图说明
图1为倒置相差显微镜下Nalm6/DNR2细胞和其亲本细胞Nalm6在培养过程中的形态图(×400)。
图2为普通光学显微镜下Nalm6/DNR2细胞和其亲本细胞Nalm6瑞氏-吉姆萨染色图(×1000)。
图3为柔红霉素(DNR)对Nalm6、Nalm6/DNR1及Nalm6/DNR2作用48小时的细胞活力曲线。
图4为喜树碱(CPT)对CEM/C1耐药株和CCRF-CEM敏感株作用48h后的细胞活力曲线。
图5为OMA1在Nalm6/DNR2细胞和其亲本细胞株Nalm6中的mRNA和蛋白表达水平(*,P＜0.05)。
图6为OMA1在CEM/C1耐药株和CCRF-CEM敏感株中的mRNA和蛋白表达水平(***,P＜0.001)。
图7为OMA1在儿童ALL患者中的mRNA表达图(*,P＜0.05；***,P＜0.001)。其中图7A为新诊断的AML患者中OMA1的表达水平；图7B为复发难治性患者中OMA1的表达水平。
图8为OMA1的mRNA表达水平的诊断工作曲线，其中图8A为作为儿童ALL诊断的分子标志物的工作曲线；图8B为预测儿童ALL耐药复发的分子标志物的工作曲线。
图9为表达载体。图9A为OMA1过表达载体构建时所用载体示意图；图9B为构建的OMA1过表达载体(NheI和ApaI为酶切位点)。
图10为pcDNA3.1+OMA1载体上新插入的序列验证。
图11为OMA1载体的表达效率验证(***,P＜0.001)。图11A为CEM/C1中的验证结果；图11B为Nalm6/DNR2中的验证结果。
图12为耐药细胞过表达OMA1后增殖活力变化(*,P＜0.05；**,P＜0.01)。图12A为CEM/C1耐药株过表达OMA1后增殖活力变化；图12B为Nalm6/DNR2耐药株过表达OMA1后增殖活力变化。
图13为过表达OMA1对耐药细胞凋亡的影响(**,P＜0.01；***,P＜0.001)。图13A为CEM/C1耐药株过表达OMA1对耐药细胞凋亡的影响；图13B为Nalm6/DNR2耐药株过表达OMA1对耐药细胞凋亡的影响。
图14为耐药细胞过表达OMA1后对药物的增敏的影响。图14A为CEM/C1耐药株过表达OMA1后对药物的增敏的影响；图14B为Nalm6/DNR2耐药株过表达OMA1后对药物的增敏的影响。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
本发明首先通过药物筛选法获得儿童ALL耐药细胞株(Nalm6/DNR1和Nalm6/DNR2)，为复发难治型ALL的研究和生物医药开发提供了新的细胞模型。结合本实验室已有的ALL耐药细胞株(CEM/C1)筛选出与儿童ALL耐药相关的蛋白OMA1。进一步，本发明采用实时荧光定量PCR法检测OMA1在儿童ALL患者样本中的mRNA的表达差异，并分析验证了OMA1的表达对儿童ALL预后判断的工作特征曲线；此外，本发明还构建了OMA1的表达载体，明确了OMA1可抑制ALL耐药细胞生长，并促进ALL耐药细胞的凋亡，从而逆转ALL耐药，故以此可作为靶点设计分子药物用于治疗儿童ALL。
实施例1 qRT-PCR和Western Blotting验证儿童ALL耐药细胞中OMA1的表达
1.Nalm6/DNR耐药细胞株的建立
为了获得稳定的白血病耐药细胞株，申请人对来源于人急性淋巴细胞白血病的细胞株Nalm6进行了药物诱导。在临床上，柔红霉素DNR是一个常用的化疗药物，因此用柔红霉素来诱导对药物敏感的细胞株Nalm6并使其变得耐药，而柔红霉素的作用会在短时间内使细胞死亡，要使敏感的细胞变得对药物耐受需要一个长期的过程。使用浓度梯度递增和间歇诱导的方法对细胞进行诱导。首先，分别用不同浓度的药物来诱导细胞，看细胞对10nM，50nM和150nM柔红霉素的承受能力，如果细胞死亡比较多就减低药物浓度，直到细胞在某个浓度维持比较好的状态再对其提高药物浓度。细胞常规置于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，放在37℃、5％CO2孵箱中培养。表1总结了2种不同耐药浓度的细胞的耐药诱导过程：
表1白血病耐药细胞获得的过程
Figure BDA0003867504970000071
Figure BDA0003867504970000081
经过长达4个月左右的时间，Nalm6/DNR1和Nalm6/DNR2均维持在一个比较好的状态。敏感型的Nalm6细胞，加入药物后，细胞在3～5天会死亡；而耐药细胞的形态有些许变化，耐药细胞的体积偏大，细胞大小不均匀，可见多形态细胞，如图1。取对数生长期的Nalm6/DNR1细胞、Nalm6/DNR2细胞和亲本细胞Nalm6，常规涂片固定，瑞氏-吉姆萨染色，结果如图2所示，三者的细胞大小、形态结构大体相似，但是Nalm6/DNR1细胞、Nalm6/DNR2细胞略大，其形态不匀。
2.NALM6/DNR耐药细胞株的验证
(1)上述建立的耐药细胞系在不含药物的培养基中反复传代一个月后采用CCK-8法进行药物敏感实验。将DNR的多个不同浓度的药物加到Nalm6/DNR2细胞中，当最高浓度的细胞死亡约90％时，采用CCK-8法检测细胞的存活率，并计算此时细胞的半数抑制率(50％inhibitory concentration,IC50)。
(2)CCK-8法具体操作步骤(采用日本同仁CCK-8试剂盒完成)。取对数生长期的各细胞(细胞密度为5×104/孔)接种于96孔板。把DNR稀释成10个浓度，分别为0﹑5﹑10﹑25﹑50﹑100、200、400、800及1200nM，每个浓度设3个平行孔。继续培养48h。中止培养前2小时加入CCK-8 10μL，继续在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养2小时，多功能酶标仪检测450nm的吸光(A)值，630nm作为参比波长。每个药物浓度设置3复孔，并重复3次。
(3)细胞存活率及耐药指数计算：细胞活力(％)＝[(A450nm实验组平均值-A630nm实验组平均值)/(A450nm对照组平均值-A630nm对照组平均值)]×100％(实验组即为药物度刺激组，对照组即为不加药物刺激组)，并绘制细胞活力曲线(图3)。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞抑制率＝[1-(A450nm实验组平均值-A630nm实验组平均值)/(A450nm对照组平均值-A630nm对照组平均值)]×100％。运用GraphPad prism 8软件计算各组IC50。耐药指数(resistant index，RI)＝IC50耐药细胞系/IC50亲本细胞系。结果见表2。据报道，RI在5以内为低度耐药，5～15之间为中度耐药，＞15则为高度耐药。因此后续实验采用高度耐药的Nalm6/DNR2进行。
表2 Nalm6/WT及NALM6/DNR细胞的半数抑制浓度和耐药指数
细胞系名称 IC50(nM) RI
Nalm6/WT 12.13 /
Nalm6/DNR1 79.74 6.6
Nalm6/DNR2 229.0 18.88
3.CEM/C1耐药株验证
CEM/C1耐药株及其对应的CCRF-CEM敏感株均购自中国科学院细胞库，CCK-8法验证(具体操作同上)。CEM/C1耐药株存在喜树碱(CPT)耐药性。为了验证这一结论，绘制CEM/C1耐药株和CCRF-CEM敏感株在CPT不同浓度下的细胞活力曲线(图4)，并计算了CEM/C1细胞株对CPT的半数抑制浓度和耐药指数碱(表3)。
表3 CCRF-CEM及CEM/C1细胞的半数抑制浓度和耐药指数
Figure BDA0003867504970000091
4.细胞样本收集和预处理
取对数生长期的耐药细胞株和敏感株，2×106个细胞每孔，冰冷PBS清洗2遍，1000rpm离心收集细胞沉淀。分为两份，一份RNAiso Plus试剂1ml(TaKaRa)，反复吹打混匀，-80℃保存待提取RNA；一份加入200μl RIPA裂解液，待提取蛋白。
5.细胞系中RNA提取
向上述4的RNAiso Plus裂解液中直接加入200μl氯仿，上下用力震荡混匀15，静置3分钟后，4℃，12000g离心15分钟。取上清液到新的EP管内，加入等体积的异丙醇混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。去掉上清，加入1ml 75％乙醇颠倒清洗，4℃，7500g离心5分钟。去掉上清，再加入1ml无水乙醇颠倒清洗，4℃，7500g离心5分钟；去掉上清，真空抽干。根据RNA沉淀的量加入适量体积(20-50μl)的DEPC水溶解RNA，测RNA浓度(A260/A280＝1.8～2.1)，-80℃储存备用。
6.cDNA逆转录
采用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)进行cDNA逆转录。
(1)按照表4处理以去除基因组DNA。反应程序42℃，2分钟。4℃，放置备用。
表4
Figure BDA0003867504970000092
Figure BDA0003867504970000101
(2)按照表5进行反转录反应，反应程序37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃，备用。
表5
试剂 使用量
步骤1的反应液 10.0μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl
RT Primer Mix 1.0μl
5×PrimeScript Buffer 2 4.0μl
RNase Free dH2O 4.0μl
Total 20μl
7.实时荧光定量PCR(qPCR)反应
采用qPCR扩增OMA1及内参GAPDH。采用TaKaRa的TB
Figure BDA0003867504970000102
Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)试剂盒完成。按照表6实验体系完成。
OMA1的上游引物Q-OMA1-F：5’-CCATACTTCTCCACGGTTTC-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物Q-OMA1-R：5’-ATGCTTCGTGCTGAGTTTGA-3’(SEQ ID NO.3)。
以GAPDH作为内参：
GAPDH的上游引物Q-GAPDH-F：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物Q-GAPDH-R：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQ ID NO.5)。
表6
试剂 使用量
TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10.0μl
PCR Forward Primer(10uM) 0.8μl
PCR Reverse Primer(10uM) 0.8μl
ROX Reference Dye II(50×) 0.4ul
DNA模板 1.0μl
RNase Free dH2O 7.μl
Total 20.0μl
反应程序为两步法：PCR扩增标准程序：预变性95℃，30秒；第二步95℃变性5秒，60℃延伸30秒，该步骤进行40个循环。
Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，
Figure BDA0003867504970000112
表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。目标基因的相对表达量计算公式为：/>
Figure BDA0003867504970000111
8.细胞系蛋白提取及定量
细胞沉淀加入200μl RIPA裂解液后，冰上放置30分钟，期间多次震荡混匀，然后14000g，4℃离心15分钟。取上清，BCA法进行总蛋白定量。测定蛋白浓度的具体步骤如下：稀释蛋白裂解液2～5倍。分别取BCA(Pierce BCA protein assay kit)中A液200μl，B液4μl(A:B＝50:1)，混合。按蛋白质：BCA混液＝1:20的比例，取10μl蛋白液加200μl BCA液，剩余的BCA液用做blank。37℃，混浴30min，用多功能酶标仪上进行检测。将准备上样实验的所有蛋白样品调至等浓度或等质量，蛋白与NuPAGETM LDS Sample Buffer(4×)以3:1混匀，RNase Free dH2O补充至等体积，100℃干热变性10min，离心后置于冰上准备后续实验或-80℃冰箱保存。
9.Western Blotting检测耐药细胞株和敏感株中OMA1蛋白表达
已处理好的蛋白与预染蛋白Marker一起进行适当胶浓度的SDS-PAGE电泳，在含20％甲醇的缓冲液中将蛋白转移到PVDF(Millipore)膜上。用含5％的脱脂奶粉(BD)的1×TBST封闭，洗膜后加入稀释的一抗OMA1(Bioss)(1:500)，GAPDH(Proteintech)(1：2000)过夜。第二天洗膜后，加入稀释的二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，(Proteintech)(1：2000)，室温作用1小时，然后用Super ECL Detection Reagent ECL(MilliporeYEASEN)显色液，并用蛋白印迹成像系统显影。
10.结果
结果如图5所示，与亲本细胞株Nalm6相比，OMA1在耐药细胞株Nalm6/DNR2中的mRNA和蛋白水平都表达明显降低(P＜0.05)；如图6所示，与亲本细胞株CCRF-CEM相比，OMA1在耐药细胞株CEM/C1中的mRNA和蛋白水平都表达明显降低(P＜0.001)。
实施例2qRT-PCR验证耐药复发的儿童ALL患者中OMA1的表达
1.临床样本收集和预处理
收集广州市妇女儿童医疗中心2015年1月-2018年10月初发的儿童ALL骨髓标本85例，完全缓解病例52例，复发患者29例，正常儿童对照骨髓5例。所有参加者均签署知情同意书。EDTA抗凝管采骨髓标本，记录患者信息。采用红细胞裂解的方式收集白细胞。最后加入RNAiso Plus试剂(TaKaRa，)，反复吹打混匀，-80℃保存待用；
2.临床样本RNA提取：实验操作同实施例1；
3.临床样本cDNA逆转录：实验操作同实施例1；
4.临床样本qPCR扩增实验：实验操作同实施例1。
5.结果
如图7A所示，新诊断的AML患者中OMA1的表达水平明显低于健康对照组(P＜0.05)。与治疗后达到完全缓解的患者中相比，复发难治性患者中OMA1的表达显著减低(图7B，P＜0.001)。这些结果显示OMA1会根据儿童AML进展阶段的动态表达，提示OMA1在儿童AML发生和复发过程中起重要作用。
实施例3 OMA1 mRNA表达水平诊断ALL及预测儿童ALL复发的特异度和灵敏度分析
1.判别依据：
绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC来评价OMA1判断儿童ALL耐药复发的灵敏度和特异度。当AUC＜0.5时，表示诊断无意义；AUC＝0.5-0.7时，表示诊断准确性较低；AUC＝0.7-0.9时，表示诊断准确性较好；AUC＞0.9时，表示诊断准确性高。灵敏度为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率。
2.结果
诊断工作曲线(ROC)分析显示(图8)，OMA1表达在诊断ALL患者方面具有的潜在临床价值(图8A)。曲线下面积AUC为0.775，估计的最佳诊断阈值为△Ct＞9.87，敏感性为88.64(95％CI,0.80-0.94)，特异性为0.60(95％CI,0.23-0.93)，具有诊断价值。OMA1表达在预测ALL患者预后方面更具有的潜在临床价值(图8B)，其曲线下面积AUC为0.822，估计的最佳诊断阈值为△Ct＞10.82，敏感性为91.3％(95％CI,0.72-0.99)，特异性为0.56(95％CI,0.41-0.70)。说明OMA1在儿童ALL样本中作为预后判定标志物具有相当大的潜力。
实施例4 OMA1过表达载体构建及转染效率验证
1.OMA1过表达载体构建
采用真核表达体系pcDNA3.1+质粒进行过表达载体构建(图9A)。设计扩增OMA1的编码区，所采用的上游扩增引物为p-OMA1-F：5’-GGGGCTAGCTTCGCTTCTGCTTGAGTAAT-3’(SEQID NO.6)；下游扩增引物为p-OMA1-R：5’-GGGGGGCCCGATTTGACCCTGAATATCC-3’(SEQ IDNO.7)。将OMA1的开放阅读框序列扩增出来后从NheI和ApaI酶切位点处插入pcDNA3.1+质粒上，形成过表达OMA1的质粒pcDNA3.1+OMA1(图9B)。
pcDNA3.1+OMA1的核苷酸序列包括(加粗序列为插入的CDS区序列)：
GTCACCGCTTTCGCTTCTGCTTGAGTAGTCAAGTGAAAAAATGAGCTTCATCTGTGGATTGCAGTCTGCTGCTAGAAACCATGTTTTCTTCCGATTTAATTCACTGTCTAACTGGAGAAAATGTAACACATTAGCATCCACCTCACGGGGCTGTCATCAAGTACAAGTTAACCATATAGTAAATAAGTATCAGGGACTGGGAGTAAATCAGTGTGACAGGTGGAGTTTTCTGCCTGGAAACTTTCATTTTTATAGTACTTTTAACAACAAAAGAACAGGAGGCCTCTCAAGTACCAAAAGTAAGGAAATTTGGAGGATTACCAGCAAATGTACTGTATGGAATGATGCTTTTTCAAGACAGCTGCTAATAAAAGAAGTTACAGCAGTCCCTAGTCTGTCAGTATTGCATCCTCTAAGCCCTGCTTCCATAAGAGCTATTAGGAATTTCCATACTTCTCCACGGTTTCAAGCTGCTCCGGTTCCTCTCTTGTTGATGATTCTTAAACCAGTACAGAAGTTATTTGCAATCATTGTAGGCAGGGGCATAAGGAAATGGTGGCAGGCACTTCCTCCTAACAAGAAGGAAGTAGTTAAAGAAAATATAAGGAAGAATAAATGGAAGCTATTCCTTGGTTTGAGTAGTTTTGGATTGCTCTTTGTGGTGTTTTATTTTACTCACCTGGAAGTAAGTCCAATCACAGGAAGGAGCAAGCTACTATTATTGGGGAAAGAACAGTTCAGACTTTTATCGGAACTGGAATATGAAGCATGGATGGAAGAATTTAAAAATGATATGCTAACTGAGAAAGATGCCCGATACCTGGCTGTTAAAGAAGTGCTTTGTCATCTAATTGAATGCAATAAAGATGTTCCAGGGATCTCTCAGATCAATTGGGTTATTCATGTGGTTGATTCCCCAATTATTAATGCCTTCGTGCTTCCAAATGGACAAATGTTTGTTTTCACTGGATTTTTAAATAGTGTAACCGATATTCATCAACTTTCTTTCCTTCTGGGCCATGAAATAGCACATGCAGTACTTGGGCATGCTGCAGAAAAGGCTGGCATGGTTCATTTGTTGGATTTCCTAGGTATGATTTTCCTCACAATGATTTGGGCCATTTGTCCTCGAGATAGCTTGGCACTTTTGTGCCAGTGGATACAGTCTAAATTGCAGGAGTATATGTTTAATAGACCATACAGCAGAAAATTGGAGGCCGAAGCTGACAAAATTGGACTACTGCTTGCTGCAAAGGCTTGTGCAGACATAAGAGCCAGTTCAGTGTTTTGGCAGCAAATGGAGTTCGTTGATAGCCTGCATGGCCAACCCAAGATGCCAGAATGGTTATCTACACACCCTTCTCATGGCAATCGAGTTGAGTACTTGGATAGACTTATACCTCAGGCTCTCAAAATTAGAGAGATGTGTAATTGTCCACCACTGTCTAATCCAGACCCTCGATTACTATTCAAACTCAGCACGAAGCATTTTCTTGAAGAATCAGAGAAAGAAGACCTAAATATCACGAAGAAACAGAAAATGGATACTCTTCCTATTCAAAAACAGGAGCAAATACCATTAACATACATAGTTGAGAAAAGAACGGGCAGTTGAATTAAAATTTATGAGACACAAGATATATGAAGAATGTTGCAGTCCTTATCATTTTATGTTACTTTTTAAAAAATGATGTTTGAAGTGAAAAAAAAAAGGATATTCAGGGTCAAATCATGTACATTACAGATATTATCTAAATTCTTCTAGAATTTATTTTTCATGAAATATTGATGTATTTTAATCTATGTTAAAATATCTTCAATGAGGAAAATGTCACAGAATAAATTTATATTACACATTTTA(SEQ ID NO.1)。
经测序验证其序列的准确性。经验证，序列完全正确(图10)。
2.过表达质粒的转染(Invitrogen的LipofectamineTM Stem TransfectionReagent)
利用电转系统(Neon Transfection System，Invitrogen)将过表达质粒载体转染到细胞内。准备细胞，细胞计数(ALL细胞系按每孔5×105细胞)，PBS清洗后，用T buffer(Tbuffer可用R buffer代替)重悬细胞，加入相应质粒，终体积为10μL或10μL×N。仪器开机后，机器自检。换新的电转杯，加入3mL的E buffer。设定电转条件后，换新枪头，轻轻的吹打(T buffer+细胞+质粒或小分子)重悬液，吸取重悬液，电击。电转条件如下：CEM/C1细胞，1350伏特,35毫秒，1次脉冲；Nalm6/DNR2细胞：1400伏特，10毫秒和3次脉冲。将电击完毕的细胞接种于24孔板中，0.5mL完全培养基放置在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
3.RNA提取：实验操作同实施例1。
4.cDNA逆转录：实验操作同实施例1。
5.qPCR扩增实验：实验操作同实施例1。
6.蛋白提取：实验操作同前实施例1。
7.Western Blotting检测：实验操作同前实施例1。
8.结果
结果如图11所示，在CEM/C1细胞(图11A)和Nalm6/DNR2细胞(图11B)中过表达OMA1后，其mRNA和蛋白表达水平显著升高(P＜0.001)。说明构建的载体是成功的。
实施例5 OMA1能抑制ALL耐药细胞恶性增殖，促进其凋亡
1.CCK-8法检测OMA1对耐药细胞的恶性增殖的作用
将OMA1过表达质粒载体转染到CEM/C1及Nalm6/DNR2细胞中(实验操作同实施例4)。在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，采用CCK-8法分别在24h，48h，72h及96h时间点检测细胞增殖情况。CCK-8法操作见实施例1。
结果如图12所示，过表达OMA1后，耐药细胞CEM/C1(图12A)及Nalm6/DNR2(图12B)增殖明显受到抑制，说明OMA1能显著抑制白血病耐药细胞恶性增殖。
2.Annexin V-kFluor647联合PI再次验证OMA1对耐药细胞的促凋亡作用
将OMA1过表达质粒载体转染到CEM/C1及Nalm6/DNR2细胞中(实验操作同实施例4)。37℃,5％CO2细胞培养箱中培养60h。收集106个细胞，离心，PBS洗涤5分钟。参照AnnexinV-kFluor647细胞凋亡检测盒说明书进行操作，大致流程如下：先加入500uL的BindingBuffer悬浮细胞；然后加入5uL Annexin V-kFluor647和PI,混匀；室温、避光、反应5～15min；最后通过流式细胞仪检测凋亡情况。数据应用FlowJo V10软件分析。
结果见图13。从图可以看出：过表达OMA1后，CEM/C1(图13A)及Nalm6/DNR2(图13B)细胞发生凋亡的数量比对照组显著增多。换而言之，OMA1能显著促进白血病耐药细胞CEM/C1凋亡(P＜0.001)及Nalm6/DNR2凋亡(P＜0.01)。
实施例6OMA1逆转儿童ALL耐药细胞对化疗药物的敏感性
1.耐药细胞株中过表达OMA1
将过表达OMA1的质粒载体及相应的对照载体采用电穿孔方法(实验操作同实施例4)转染到耐药细胞株CEM/C1及Nalm6/DNR2中，分别将CPT稀释成8个浓度：0.01、0.1、1、10、100、1000、10000及100000ng/ml。DNR稀释成12个浓度：0.1﹑3﹑6.25﹑12.5﹑25﹑50、100、200、400、800、1600及3200nM；将CPT的8个不同浓度的药物加到CEM/C1细胞当中，而DNR的12个不同浓度的药物加到Nalm6/DNR2细胞中。当最高浓度的细胞死亡达到80％以上时，采用CCK-8法检测细胞的存活率，并计算此时细胞的IC50。
2.结果
如图14所示，转染了OMA1过表达质粒载体的耐药细胞相对于只转染了pcDNA3.1+对照质粒载体的耐药细胞对药物变得敏感，IC50值下降明显。表7更直观了显示了OMA1这个分子对白血病药物的敏感程度的影响。上述结果说明OMA1能够逆转白血病耐药细胞的耐药性。
表7转染OMA1后ALL耐药细胞的半数抑制浓度和耐药指数
Figure BDA0003867504970000161
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.检测OMA1的物质在制备急性淋巴细胞白血病诊断和/或预后和/或复发和/或耐药评估的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质包含在基因和/或蛋白水平上定量检测OMA1的物质；
优选地，所述定量检测OMA1基因表达水平的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的物质；
优选地，所述定量检测OMA1基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片、抗体中的至少一种；
优选地，所述引物的序列为：
上游引物Q-OMA1-F：5’-CCATACTTCTCCACGGTTTC-3’；
下游引物Q-OMA1-R：5’-ATGCTTCGTGCTGAGTTTGA-3’。
3.一种诊断试剂，所述诊断试剂包含在基因和/或蛋白水平上定量检测OMA1的物质。
4.根据权利要求3所述的诊断试剂，其特征在于，所述定量检测OMA1基因表达水平的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的物质；优选地，所述定量检测OMA1基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片、抗体中的至少一种；
优选地，所述引物的序列为：
上游引物Q-OMA1-F：5’-CCATACTTCTCCACGGTTTC-3’；
下游引物Q-OMA1-R：5’-ATGCTTCGTGCTGAGTTTGA-3’。
5.OMA1在制备产品中的应用，所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡；
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发。
6.物质在制备产品中的应用，所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡；
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发；
所述物质为(b1)～(b3)中的至少一种：
(b1)提高或增强OMA1基因表达的物质；
(b2)提高或增强OMA1蛋白活性的物质；
(b3)提高或增强OMA1蛋白含量的物质。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提高或增强OMA1基因表达的物质、提高或增强OMA1蛋白活性的物质或提高或增强OMA1蛋白含量的物质为与OMA1蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述(c1)至(c4)中的任一种：
(c1)编码OMA1的核酸分子；
(c2)含有(c1)所述核酸分子的表达盒；
(c3)含有(c1)所述核酸分子的重组载体、或含有(c2)所述表达盒的重组载体；
(c4)含有(c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(c2)所述表达盒的重组微生物、或含有(c3)所述重组载体的重组微生物；
优选地，所述重组载体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
8.一种产品，包含(b1)～(b3)中的至少一种：
(b1)提高或增强OMA1基因表达的物质；
(b2)提高或增强OMA1蛋白活性的物质；
(b3)提高或增强OMA1蛋白含量的物质；
所述产品的功能为(a1)～(a6)中的至少一种；
(a1)逆转急性淋巴细胞白血病耐药性；
(a2)提高急性淋巴细胞白血病耐药细胞对药物的敏感性；
(a3)抑制急性淋巴细胞白血病耐药细胞增殖；
(a4)促进急性淋巴细胞白血病耐药细胞凋亡
(a5)改善急性淋巴细胞白血病预后；
(a6)预防和/或治疗急性淋巴细胞白血病复发。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述提高或增强OMA1基因表达的物质、提高或增强OMA1蛋白活性的物质或提高或增强OMA1蛋白含量的物质为与OMA1蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述(c1)至(c4)中的任一种：
(c1)编码OMA1的核酸分子；
(c2)含有(c1)所述核酸分子的表达盒；
(c3)含有(c1)所述核酸分子的重组载体、或含有(c2)所述表达盒的重组载体；
(c4)含有(c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(c2)所述表达盒的重组微生物、或含有(c3)所述重组载体的重组微生物；
优选地，所述重组载体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
10.一种逆转急性淋巴细胞白血病细胞耐药的方法，通过提高或增强OMA1基因表达和/或提高或增强OMA1蛋白活性和/或提高或增强OMA1蛋白含量。
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