CN116240271A - 利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性tcr序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法。所述方法包括步骤：获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；制备单细胞悬液，进行测序，从测序结果中选取第一备选TCR序列集合、第二备选TCR序列集合和第三备选TCR序列集合；同时满足第一备选TCR序列集合、第二备选TCR序列集合和第三备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。所述方法针对每例患者，在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤抗原特异性TCR序列。

Description

利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法。
背景技术
近年来，阻断针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、程序性死亡-1(PD-1)和程序性死亡配体-1(PD-L1)的单克隆抗体可以恢复预先存在的抗癌免疫，并在各种类型的实体肿瘤中获得持久的临床反应。这些免疫检查点抑制剂的成功证明了恶性肿瘤患者存在抗癌免疫。另一方面肿瘤浸润T细胞（TIL）与预后相关性研究指出，CD8毒性TIL与CD4辅助TIL都显著提高了癌症的总生存率。这些研究指出了肿瘤的免疫治疗具有巨大的潜在价值。
然而，并非所有的肿瘤对检查点阻断治疗都能有好的响应效果，例如乳腺癌。与高免疫原性的癌症（如黑色素瘤和非小细胞肺癌）相比，乳腺癌的肿瘤突变负荷较低及其免疫原性较差。单纯的免疫检查点阻断治疗，并不能获得广泛的疗效。三阴性乳腺癌（TNBC），作为免疫源性最高的乳腺癌亚型，常作为免疫检查点阻断治疗的对象。多个临床研究表明，免疫检查点阻断转移性TNBC的客观缓解率（ORR,objective response rate）均介于4.7%-24%，其ORR高低取决于PD-L1的表达量、一线或者二线治疗以及淋巴细胞浸润程度。总体而言，其响应率都较低。对于一线治疗及PD-L1阳性的TNBC患者，免疫检查点阻断治疗才显得有效。故乳腺癌患者接受免疫检查点阻断治疗的受众非常局限。
免疫检查点阻断治疗从细胞学机制上讲，可扭转毒性CD8+ T淋巴细胞耗竭，增强其效应功能，从而达到杀伤肿瘤的作用。但是同时也有研究指出，T细胞的耗竭可通过多个机制达成，单一阻断PD-1仍会激活其他机制，同样导致T细胞的耗竭。从另一方面讲，CD4+调节性T细胞（Treg）的功能也有可能被上调。已有研究指出PD-1的阻断可增强Treg的功能，从而限制CD8+ T细胞的功能，导致肿瘤进展。临床研究中，还有观察到阻断PD-1可导致肿瘤超进展（tumor hyper-progression）的情况，尤其在年龄大于65岁的患者中出现的频率较高。故单纯的免疫检查点阻断，很多情况下可能无法达到很好的治疗效果。
近年来，T细胞受体基因修饰T细胞（TCR-T）的治疗方法被广泛关注。而TCR-T在实体瘤中展现了一些特有的优势，其中包括：1）通过MHC的提呈，TCR-T细胞可以识别胞内和细胞表面蛋白，尤其是突变后被MHC提呈的蛋白片段，而CAR-T细胞只能识别细胞表面蛋白，这使得TCR-T识别肿瘤细胞具有更高的特异性与灵敏度；2）因为它保留了所有TCR信号转导通路的辅助分子，当有少量抗原存在时，TCR-T细胞可完全激活，产生杀伤作用；3）TCR可以识别肿瘤细胞内部分子，而对TCR进行基因编辑可提高对肿瘤细胞的亲和力；4）结合近年来高速发展的高通量单细胞技术，可以实现多靶点识别，降低由于靶点单一而导致的肿瘤复发率；5）若利用患者自体TCR序列，如参与外周循环及淋巴循环的TCR，实施个性化TCR-T治疗，则可以避免对正常细胞的杀伤副作用。
目前，人们对肿瘤特异TCR的认识还非常不足。大多数临床TCR-T试验是人类白细胞抗原（HLA-）A1和A2限制的，直接针对分化、癌胚或癌种系抗原。总的来说，这些试验已经证明转移性黑色素瘤、结直肠癌和滑膜肉瘤患者有显著的临床反应。这种TCR-T治疗一般先确定肿瘤抗原，或依靠癌细胞种系，或预测肿瘤新抗原，通过亲和力计算及体外试验确定TCR序列，以应对具有相似情况的多个患者。但实际上，患者多样化，肿瘤异质性高，而这种TCR-T并不具有以不变应万变的能力，所以适合该方法治疗的患者并不多。
近年来，随着对肿瘤微环境的不断探索，及单细胞多组学的发展，使得个性化定制肿瘤患者的TCR-T治疗成为了可能。其原理是从患者自身寻找肿瘤特异T细胞，人工合成其TCR序列，并插入该患者外周血杀伤性T细胞中，使得外周血T细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。通过批量合成多条序列，还可以达到多靶点杀伤肿瘤的效果。
但是，个性化TCR-T的治疗方法还存在一些问题，例如需首先获取肿瘤抗原，再获取肿瘤特异T细胞，技术步骤繁琐易出错，且无法获得表达该TCR的细胞属于何种状态、何种亚群以及表达何种效应因子，其肿瘤反应性也无法得知，故不利于对TCR序列应用于TCR-T的有效性的评估。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明的一方面在于提供了一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法。所述方法包括以下步骤：
（1）获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；
（2）从步骤（1）获得的肿瘤组织中取样制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8+T细胞的TCR序列作为第一备选TCR序列集合；
（3）从步骤（1）获得的肿瘤组织中取样制备单细胞悬液，以单细胞转录组测序技术进行测序，选取同时表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的细胞的TCR序列作为第二备选TCR序列集合；
（4）使用转移淋巴结组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8+T细胞的TCR序列作为第三备选TCR序列集合；
（5）同时满足第一备选TCR序列集合、第二备选TCR序列集合和第三备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。
步骤（2）、（3）、（4）可以同时实施，也可以交换实施顺序。
基于单细胞测序获得肿瘤特异TCR的方法，由于肿瘤组织中存在非特异扩增的效应CD8+T细胞，很难从细胞转录组特征上区分肿瘤特异与旁观者（bystander）效应T细胞。单单利用肿瘤组织难以筛选出准确的靶向肿瘤的TCR序列，因此本方法同时还以转移淋巴结组织进行测序。同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织位点都出现了相同的抗原，才能导致具有相同的T细胞克隆增殖。那么靶向这种抗原的TCR序列，是可以同时靶向转移灶与原发灶的肿瘤细胞，可降低由于肿瘤异质性，尤其是易转移肿瘤细胞与原发灶肿瘤细胞异质性而导致的脱靶效应。将肿瘤细胞与的CD8+T细胞双胞体作为限制条件，能更进一步确证其肿瘤特异性，降低了假阳性的出现概率。
在一些实施方式中，T细胞标签基因选自CD8A、CD3E和EPCAM中的至少一种。
在一些实施方式中，所述转移淋巴结组织或肿瘤组织的获取步骤包括：
a)组织破碎成组织块；优选地，所述组织经过反复冲洗后剪碎成组织块；优选地，所述组织块的体积为1~2mm3；
b)使用组织消化液消化所述组织块；优选地，向组织块加入组织消化液，混匀，摇床消化；优选地，所述摇床消化是35~40℃摇床中消化1~2小时；
c)终止消化，将消化处理后的组织液以70μm的筛网过滤至新的离心管中，离心，弃去上清液；
d)用平衡盐溶液洗涤，弃上清，加入培养液重悬细胞；优选地，所述洗涤次数至少两次。
在一些实施方式中，步骤b)所述组织消化液包括I型胶原酶、DNA酶和RPMI1640培养基；优选地，所述组织消化液包括10~50 mg I型胶原酶、10~50 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10~50 mL RPMI1640培养基；优选地，所述组织消化液包括20 mg I型胶原酶、10 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10 mL含L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基。
在一些实施方式中，步骤c)所述离心的条件为1500~2300 rpm，持续5~10 min；优选地，所述离心的条件为1800rpm，持续8min，离心机离心上升速率设置为7，下降速率设置为4，常温。
在一些实施方式中，步骤d)所述培养液为添加了抗生素的完全RPMI1640培养基，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素。
在一些实施方式中，制得的所述单细胞悬液先经过细胞分选磁珠去除死亡细胞。
在一些实施方式中，获取第一备选TCR序列集合或第三备选TCR序列集合的步骤包括：
A)测序后获得fastq文件，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的TCR序列；
B)利用Seurat软件的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据；
C)利用Seurat软件的细胞聚类方法进行细胞分群；
D)筛选克隆频率>0.5%的CD8+T细胞，获得其α链与β链的TCR序列。
所述克隆频率的计算公式为：克隆频率=单一T细胞克隆数量/总T细胞克隆数量。
在一些实施方式中，获取第二备选TCR序列集合的步骤包括：
A’)测序后获得fastq文件，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的TCR序列；
B’)利用Seurat软件的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据；
C’)利用Seurat软件的细胞聚类方法进行细胞分群；
D’)筛选表达CD8A、CD3E和EPCAM基因频率>0.5%的细胞数据，获得其α链与β链的TCR序列。
上述肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法可应用于肿瘤抗原筛选、疫苗制备等场合。
本公开的有益效果是：提供了一种利用双胞体筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，所述方法针对每例患者，在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤抗原特异性TCR序列，通过人工合成该肿瘤抗原特异性TCR的片段并插入患者外周血杀伤性T细胞中，使得外周血T细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。
附图说明
图1是肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法的步骤流程图；
图2是UMAP可视化细胞分群；
图3是图2中各细胞在不同的组织间的分布；
图4是CD8+T细胞在不同组织间的分布；
图5是肿瘤高频CD8+T细胞的分布；
图6是转移淋巴结高频CD8+T细胞的分布；
图7是肿瘤细胞与T细胞的双胞体分布；
图8是与肿瘤共培养后 CD107a阳性（左）及IFNG阳性（右）的TCR-T细胞占比。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.样本：一个乳腺癌病人组织样本，包括肿瘤组织及转移淋巴结样本。
2.制备单细胞悬液：
2-1.将离体的新鲜的手术切除组织置于无菌平皿内，用无菌PBS或Hank’s反复冲洗，并减去四周结缔组织和脂肪组织，在平皿中用眼科镊将组织剪碎，尽量剪成1~2mm3大小的小块。
2-2.倒入新鲜配置的组织消化液（由20 mg I型胶原酶、10 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10 mLRPMI1640配制而成，所述RPMI1640培养基是由赛默飞世尔科技公司生产的含有L-谷氨酰胺的不完全RPMI1640培养基，产品货号C11875500BT），混匀，于37℃摇床中消化1~2小时。
2-3.加10 mL HBSS终止消化，用无菌巴氏移液管将消化好的组织液转移至70 μm的筛网中，过滤至新的50 mL离心管中，离心（离心条件1800rpm，持续8min，离心机离心上升速率设置为7，下降速率设置为4，常温）。
2-4.弃去上清液，用Hank’s洗涤2次，如果肉眼可见细胞团块有红色血细胞，弃去上清液，加入5mL红细胞裂解液，轻轻吹散细胞团块，RT静置5~10 min，随时观察液体的颜色，如果变成清亮透明的状态即可以终止，加20~30 mLHank’s液终止，离心洗涤两次；末次离心后，弃上清，加入全完RPMI1640培养液（由500 mL不完全RPMI1640溶液、50 mL灭活的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素配制而成）重悬细胞，计数细胞。
2-5.流式分选的细胞离心后用无菌1×PBS洗涤2次，适量无菌1×PBS重悬细胞，取10 μL细胞悬液，与10 μL台盼蓝混合，用Life Count细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率＜80%时，做去死细胞处理。
2-6.使用美天旎磁珠去死细胞磁珠去除死细胞。
2-7.利用10×Genomics磁珠标签技术标记单细胞，使同一个细胞的每条RNA都标记上相同的标签，逆转录和酶切后，转录组和VDJ分别扩增，最后使用读长大于100方法双端测序。
3.单细胞测序数据处理：
3-1.测序后获得fastq文件，利用单细胞测序对应的数据处理方法，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的TCR。
3-2.利用Seurat中提供的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据。
3-3.利用Seurat中提供的细胞聚类方法进行细胞分群，UMAP可视化细胞分群及在组织中的分布如图2所示，其中测到的细胞包括T细胞、NK细胞、内皮细胞、单核细胞、B细胞、浆细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和肿瘤及上皮细胞；提取其中CD8+T细胞的分布如图3所示。
3-4.筛选肿瘤中克隆频率>0.5%的CD8+T细胞（此范例对应频数>=16），获得其α链和β链的TCR序列，其CD8+T细胞的分布如图4所示。具体的CD8+T细胞TRA和TRB CDR3序列如表1所示：
Figure 864126DEST_PATH_IMAGE001
3-5.筛选转移淋巴结组织中克隆频率>0.5%的CD8+T细胞（此范例对应频数>=14），获得其α链和β链的TCR序列，其CD8+T细胞的分布如图5所示。具体的CD8+T细胞TRA和TRBCDR3序列如表2所示：
Figure 321652DEST_PATH_IMAGE002
3-6.筛选同时表达CD8A、CD3E和EPCAM的细胞数据，获得其α链和β链的TCR序列，其CD8+T细胞的分布如图6所示，图中圈出的区域为双胞体的分布。具体的双胞体TRA和TRBCDR3序列如表3所示：
Figure 136024DEST_PATH_IMAGE003
3-7.取表1至表3的交集，如表4所示：
Figure 35452DEST_PATH_IMAGE004
3-8.表4中的TCR序列为该病人的肿瘤抗原特异性TCR序列，其α链、β链对应的V JC区及全长核酸序列如下：
（1）TCR编号Ⅰ中：
TRA（SEQ ID NO.1）对应TRAV14DV4 TRAJ49 TRAC。
TRA CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
TRA全长核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
TRB（SEQ ID NO.2）对应 TRBV27 TRBJ1-1 TRBC1。
TRB CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。
TRB全长核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
（2）TCR编号Ⅱ中：
TRA（SEQ ID NO.5）对应 TRAV17 TRAJ44 TRAC。
TRA CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.11所示。
TRA全长核酸序列如SEQ ID NO12所示。
TRB（SEQ ID NO.6）对应 TRBV2 TRBJ2-1 TRBC2。
TRB CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。
TRB全长核酸序列如SEQ ID NO.14所示。
（3）TCR编号Ⅲ中：
TRA（SEQ ID NO.7）对应 TRAV39 TRAJ40 TRAC。
TRA CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.15所示。
TRA全长核酸序列如SEQ ID NO.16所示。
TRB（SEQ ID NO.8）对应 TRBV5-4 TRBJ2-7 TRBC2。
TRB CDR3的核酸序列如SEQ ID NO.17所示。
TRB全长核酸序列如SEQ ID NO.18所示。
3-9.验证3对TCR序列的肿瘤特异性：
以患者PBMC T细胞作为载体，CRISPR/CAS9敲入3-8中所得的TCR的α链、β链序列，构建TCR-T细胞。构建出4群TCR-T细胞后，与肿瘤共培养两周，检测IFNG和CD107a表达的细胞占比。构建出的3群TCR-T细胞的培养结果如图7所示，CD107a表达的细胞占比均在25%以上，IFNG表达的细胞占比也普遍在25%以上，证明均具有显著的肿瘤特异性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，其特征在于，包括步骤：
获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；
从获得的肿瘤组织中取样制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8+T细胞的TCR序列作为第一备选TCR序列集合；
从获得的肿瘤组织中取样制备单细胞悬液，以单细胞转录组测序技术进行测序，选取同时表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的细胞的TCR序列作为第二备选TCR序列集合；
使用转移淋巴结组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8+T细胞的TCR序列作为第三备选TCR序列集合；
同时满足第一备选TCR序列集合、第二备选TCR序列集合和第三备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转移淋巴结组织或肿瘤组织的获取步骤包括：
a)组织破碎成组织块；优选地，所述组织经过反复冲洗后剪碎成组织块；优选地，所述组织块的体积为1~2mm3；
b)使用组织消化液消化所述组织块；优选地，向组织块加入组织消化液，混匀，摇床消化；优选地，所述摇床消化是35~40℃摇床中消化1~2小时；
c)终止消化，将消化处理后的组织液以70μm的筛网过滤至新的离心管中，离心，弃去上清液；
d)用平衡盐溶液洗涤，弃上清，加入培养液重悬细胞；优选地，所述洗涤次数至少两次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)所述组织消化液包括I型胶原酶、DNA酶和RPMI1640培养基；优选地，所述组织消化液包括10~50 mg I型胶原酶、10~50 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10~50 mL RPMI1640培养基；优选地，所述组织消化液包括20 mg I型胶原酶、10 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10 mL RPMI1640培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c)所述离心的条件为1500~2300 rpm，持续5~10 min；优选地，所述离心的条件为1800 rpm，持续8 min，离心机离心上升速率设置为7，下降速率设置为4，常温。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤d)所述培养液为添加了抗生素的完全RPMI1640培养基，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制得的所述单细胞悬液先经过细胞分选磁珠去除死亡细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获取第一备选TCR序列集合或第三备选TCR序列集合的步骤包括：
A)测序后获得fastq文件，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的TCR序列；
B)利用Seurat软件的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据；
C)利用Seurat软件的细胞聚类方法进行细胞分群；
D)筛选克隆频率>0.5%的CD8+T细胞，获得其α链和β链的TCR序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述克隆频率的计算公式为：
克隆频率=单一T细胞克隆数量/总T细胞克隆数量。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获取第二备选TCR序列集合的步骤包括：
A’)测序后获得fastq文件，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的TCR序列；
B’)利用Seurat软件的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据；
C’)利用Seurat软件的细胞聚类方法进行细胞分群；
D’)筛选表达CD8A、CD3E和EPCAM基因频率>0.5%的细胞数据，获得其α链和β链的TCR序列。
10.权利要求1至9任一项所述的方法在肿瘤抗原筛选、疫苗制备的应用。
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