CN116236449A - 一种聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及聚乙烯醇载木犀草素‑Fe微球及其制备方法，该方法具体包括以下步骤：(1)分散相制备：称取PVA粉末分散到重蒸水中，充分溶胀后将其置于水浴锅中，得到PVA溶液；在常温条件下，将可溶性三价铁盐与LUT溶溶解得到LUT‑Fe溶液，取PVA溶液和LUT‑Fe溶液混合均匀，制得分散相溶液；(2)连续相制备：在常温条件下，将Span‑80逐滴加入到石蜡中，制得澄清透明的连续相溶液；(3)LUT‑Fe@PVA微球制备：加热条件下取分散相逐滴加入到连续相中，搅拌均匀，加入交联剂戊二醛，待交联成球后，离心洗涤，冷冻干燥得到黑色微球。与现有技术相比，本发明制备方法简单，反应条件温和，制得微球具有生物相容性好、化学动力学/声动力学性能和T1成像效果等特点，具有广泛的医药应用价值。

Description

一种聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于介入栓塞药物微球制备技术领域，涉及一种聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是人们一直奋力攻克的难关，是最常见的高危、低治愈率的癌症之一。目前，肝癌的治疗方式包括手术、放疗、热疗、化疗、免疫治疗、基因治疗、靶向治疗等。经导管肝动脉栓塞术(TAE)是临床治疗中晚期肝癌的重要手段，借助导管将栓塞材料注入肿瘤供血动脉中，切断养分供给，从而有效地抑制肿瘤生长，具有微创、目的性强、风险低等优势，已成为非手术治疗肝癌的首选方法。经过人们在临床中的不断摸索和实践，经导管肝动脉栓塞技术已被公认为是可以有效改善癌症患者病情、能明显提高癌症患者的生存率的有效介入治疗方法，且栓塞材料是经导管肝动脉栓塞治疗的关键所在。
栓塞微球应用于生物体内，首先必须具有良好生物相容性。医药级聚乙烯醇(PVA)是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，其安全性可以从用于伤口皮肤修复，和眼部滴眼液产品可见一斑。此外，PVA成本低廉，使其获得了广泛的研究和应用。
由于微球材料具有形貌规则和比表面积大的特点，能够负载高浓度的药物，所以人们将化疗药物与血管栓塞进行结合，输送到肝癌患者的体内，这样不仅能够通过导管阻塞血管中断血液供应，阻断向肿瘤输送养分，而且可以精准定位肿瘤部位并原位释放化疗药物，避免对其他组织产生不良影响，治疗肿瘤以达双管齐下之效，可以极大地提高肿瘤的治疗效率。
目前，传统的栓塞微球自身不带有显影性，因此需要与造影剂进行结合成像，监测材料的分布和栓塞血管的效果，但是造影剂容易泄露到人体内，部分人会出现过敏状态，而且造影剂需要通过肾脏排出，增加了肾脏毒性风险。可视化栓塞微球具有自身显影功能，能够实时监控微球注射，在血管中具有可视化，能够提高经导管动脉栓塞的成功率，有效避免了误栓塞的发生，同时在复查中可以精准辨认微球在血管中的位置，有利于评估栓塞情况，减轻肝癌患者痛苦。探索简易高效的方法来制备诊疗一体化栓塞微球对于癌症的治疗具有重要的意义。
近年来，一些纳米/微米大小的材料成为研究的热点，多功能纳米材料有着较好的治疗效果，可以达到协同治疗肿瘤的目的，且对周围组织的损伤较小。组织穿透深度不够一直限制着治疗效果，声动力学治疗(SDT)能够借助外加能量场触发声敏剂，深部穿透组织集聚肿瘤部位，针对性的产生大量毒性的物质，进而高效杀死肿瘤细胞。由于肿瘤组织中有高表达的过氧化氢(H2O2)，内源性的H2O2可以通过与金属离子发生芬顿反应转化为具有毒性的羟基自由基(·OH)，因此引起DNA和蛋白质损伤，使肿瘤部位受到氧化损伤。所以开发一种可以达到诊断、成像和治疗的目的材料十分重要，在发展中晚期肿瘤的多功能协同治疗具有良好的应用价值。
发明内容
本发明的目的利用乳化-化学交联法通过油包水(W/O)乳液体系一步合成LUT-Fe@PVA栓塞微球，从而制备出具有生物相容性好、化学动力学/声动力学性能和T1成像效果的多功能PVA微球。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种LUT-Fe@PVA微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)分散相制备：称取PVA粉末分散到重蒸水中，充分溶胀后将其置于80～120℃水浴锅中，持续搅拌直至完全溶解，得到透明有一定粘度的PVA溶液；在常温条件下，将可溶性三价铁盐与木犀草素(缩写为LUT)溶于DMSO中，并持续搅拌得到均一透明棕黑溶液，即LUT-Fe溶液，取PVA溶液和LUT-Fe溶液混合均匀，制得分散相溶液；优选的，所述水浴锅的温度为90℃；
(2)连续相制备：在常温条件下，将Span-80逐滴加入到石蜡中，持续搅拌，制得澄清透明的连续相溶液；
(3)LUT-Fe@PVA微球制备：加热条件下取分散相逐滴加入到连续相中，搅拌均匀，加入交联剂戊二醛，待交联成球后，用重蒸水和乙醇多次离心洗涤，冷冻干燥得到黑色粉末，即制得所述的负载LUT-Fe的多功能PVA微球；
进一步的，步骤(1)中所述的PVA粉末占所述PVA溶液的质量分数为8～15wt％；进一步优选的，步骤(1)中所述的PVA粉末为80～120目；
进一步的，步骤(1)中所述的可溶性三价铁盐与木犀草素的质量比为1∶0.5～3；
进一步的，步骤(1)中所述的LUT-Fe溶液中的可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O；
进一步的，步骤(1)可溶性三价铁盐与木犀草素的质量比为1∶0.5～3；
进一步的，步骤(1)中，LUT-Fe溶液中LUT-Fe的浓度为10～30mg/mL；
进一步的，步骤(2)所述的连续相溶液中Span-80与石蜡的质量比为1∶40～80；
进一步的，步骤(3)中，所述的分散相与连续相的体积之比为0.2～0.6∶1。
进一步的，步骤(3)中，所述的交联剂戊二醛的体积占分散和连续相总体积的3～7％；
进一步的，步骤(3)中，所述反应温度为60～90℃；更进一步的，步骤(3)中，所述反应温度为70℃；
进一步的，步骤(1)～(3)中，所述搅拌转速为800～1200rpm；
进一步的，步骤(2)、(3)中所述搅拌时间为20～60min；更进一步的，步骤(2)、(3)中所述搅拌时间为30min；
本发明的第二方面提供了上述任一种方法制备的LUT-FePVA微球；
进一步的，所述LUT-FePVA微球的粒径为30～60μm；优选的，所述LUT-FePVA微球的粒径为40μm；
本发明的第三方面提供了上述任一种LUT-FePVA微球在制备核磁共振造影剂或抗肿瘤药物的应用；
进一步的，所述抗肿瘤药物为声动力学和/或化学动力学抗肿瘤治疗药物。
附图说明
图1为实施例1中，制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的SEM图谱；
图2为实施例1中，制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球微球的粒径分布图谱；
图3为实施例1中，制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的紫外吸收光谱图谱；
图4为实施例1中，制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球细胞毒性实验图谱；
图5为实施例2制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球在0.5T磁场下的弛豫率拟合图及其MRI造影效果图谱；
图6为实施例3制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的体外化学动力学表征图谱；
图7为实施例3制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的声动力性能表征图谱；
图8为实施例3制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的体外ROS水平表征图谱；
图9为实施例4制备得到的LUT-Fe@PVA多功能微球体外化学动力/声动力协同治疗效果图谱。
有益效果
PVA微球装载了LUT-Fe，制备了多功能LUT-Fe@PVA微球，用于中晚期肝癌的诊断和治疗。LUT-Fe@PVA微球呈均匀球形，体积较大(40μm)，能够通过动脉导管到达肿瘤部位阻断血管，该材料在超声的触发下在肿瘤深部产生ROS，而且Fe离子的存在能与肿瘤微环境中高表达的H2O2发生芬顿反应转化为大量具有毒性的·OH，联合治疗实现肿瘤治疗的疗效最大化。此外Fe3+能够赋予微球可视化性能，能够实时监测，对于评价微球的疗效具有重要意义。因此，LUT-Fe@PVA微球将实现声动力和化学动力学治疗为一体化的多模式治疗，并能在MRI成像引导下，协同杀伤肿瘤，并为癌症的诊断和治疗提供了新的思路。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种LUT-Fe@PVA栓塞微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取一定量的PVA粉末(80目)与重蒸水充分混合，将其置于90℃水浴锅中，在1000rpm转速下搅拌直至完全溶解，得到透明有一定粘度的PVA溶液(8wt％)。待PVA溶液冷却后，取3mL PVA溶液与0.6mL的LUT-Fe溶液(将50mg FeCl3·6H2O与25mg LUT溶于7.5mLDMSO中)混合均匀，即制得LUT-Fe@PVA分散相；(2)在室温下将0.16g Span-80加入到6.4g石蜡中，在1000rpm转速下持续搅拌30min，直至溶液无色透明，即制得连续相；(3)LUT-Fe@PVA微球制备：取2mL分散相逐滴加入到10mL连续相中，1000rpm搅拌30min，于70℃温度下加入0.36mL的戊二醛，待交联成球后，用重蒸水和乙醇多次离心洗涤后，冷冻干燥得到黑色粉末，即可得到LUT-Fe@PVA微球。
实施例2
一种LUT-Fe@PVA栓塞微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取一定量的PVA粉末(120目)与重蒸水充分混合，将其置于90℃水浴锅中，在800rpm转速下搅拌直至完全溶解，得到透明有一定粘度的PVA溶液(10wt％)；待PVA溶液冷却后，取3mL PVA溶液与1mL的(将50mg FeCl3·6H2O与75mg LUT溶于6.25mL DMSO中，形成LUT-Fe溶液)混合均匀，即制得LUT-Fe@PVA分散相；
(2)在室温下将160mg Span-80加入到9.6g石蜡中，在800rpm转速下持续搅拌60min，直至溶液无色透明，即制得连续相；
(3)LUT-Fe@PVA微球制备：取4mL分散相逐滴加入到10mL连续相中，800rpm搅拌60min，于60℃温度下加入0.7mL的戊二醛，待交联成球后，用重蒸水和乙醇多次离心洗涤后，冷冻干燥得到黑色粉末，即可得到LUT-Fe@PVA微球。
实施例3
(1)取一定量的PVA粉末(PVAAR1788型，80目)与重蒸水充分混合，将其置于90℃水浴锅中，在1200rpm转速下搅拌直至完全溶解，得到透明有一定粘度的PVA溶液(15wt％)。待PVA溶液冷却后，取3mL PVA溶液与1.5mL的LUT-Fe溶液(将50mg FeCl3·6H2O与150mg LUT溶于7mL DMSO中)混合均匀，即制得LUT-Fe@PVA分散相。
(2)在室温下将160mg Span-80加入到12.8g石蜡中，在1200rpm转速下持续搅拌20min，直至溶液无色透明，即制得连续相。
(3)LUT-Fe@PVA微球制备：取6mL分散相逐滴加入到10mL连续相中，1200rpm搅拌20min，于60℃温度下加入1.12mL的戊二醛，待交联成球后，用重蒸水和乙醇多次离心洗涤后，冷冻干燥得到黑色粉末，即可得到LUT-Fe@PVA微球。
实验例
将实施例1制备获得的微球进行以下实验。
1.微球形态观察
如图1、图2及图3所示，为实施例1制备得到的负载LUT-Fe的多功能PVA微球的SEM图、粒径分布图以及紫外吸收光谱图。通过扫描电子显微镜(SEM)可以看出LUT-Fe@PVA微球具有均匀的球形，外表较为光滑，从电镜标尺中可以看出微球粒径大约为38μm，通过粒径分析可以看出LUT-Fe@PVA微球的粒径与SEM相符，其中紫外吸收光谱图中现了具有LUT-Fe多酚金属配合物的吸收峰，说明已成功制备了LUT-Fe@PVA微球。
2.LUT-Fe@PVA微球的细胞毒性实验
图4为实施例1中，制备得到的LUT-Fe@PVA微球的细胞毒性实验图谱，分别用HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和HepG2(肝癌细胞)两种细胞对制得的LUT-Fe@PVA微球进行毒性检测，从图中数据可以看到制备的LUT-Fe@PVA微球对细胞没有明显的毒性。
3.用作核磁成像造影剂
配制一定Fe梯度浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mM)的LUT-Fe@PVA微球粉末分散在1wt％的黄原胶中，分别取2mL不同浓度材料在0.5T的核磁共振成像系统中测量横向弛豫率，纵向弛豫率和对应浓度下的造影效果图。如图5所示，为本实施例制备得到的LUT-Fe@PVA微球0.5T磁场下的MRI造影效果图(a)及其弛豫率拟合图(b、c)。LUT-Fe@PVA微球T1弛豫率r1为0.31mM-1s-1，T2弛豫率r2为0.36
mM-1s-1，r2/r1＝1.16＜2，且随着该纳米材料浓度的提升，MRI造影逐渐变亮，显示出越来越好的T1造影效果，表明了LUT-Fe@PVA微球能够作为磁共振成像中的T1造影剂使用。
4.微球的化学动力学性能
通过检测生成羟基自由基的能力来评估材料的化学动力学性能，反应溶液分为四组：(1)磷酸盐缓冲溶液(PBS)；(2)H2O2；(3)LUT-Fe@PVA；(4)LUT-Fe@PVA+H2O2。LUT-Fe@PVA和H2O2的浓度分别为1.0mg/mL和100μM，监测MB在663nm处的吸收值。
利用二苯基异苯并呋喃(DPBF)指示剂评估LUT-Fe@PVA微球的声动力学性能，反应溶液分为三组：(1)DPBF；(2)DPBF+LUT-Fe@PVA；(3)DPBF+LUT-Fe@PVA+NaN3(NaN3为饱和溶液)，用荧光分光光度计监测DPBF的荧光强度。
使用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)来检测细胞内活性氧(ROS)水平。材料分组为：(1)PBS，(2)LUT-Fe@PVA；(3)LUT-Fe@PVA+H2O2；(4)LUT-Fe@PVA+超声；(5)LUT-Fe@PVA+H2O2+超声，于高内涵和流式细胞术下进行观察。
如图6(a)和(b)可以看出，单纯的亚甲基蓝(MB)、H2O2以及LUT-Fe@PVA组其MB在664nm吸收值没有显著地下降。当H2O2与LUT-Fe@PVA微球同时存在时发生了芬顿反应，催化产生的·OH分解MB，从而使MB在664nm处的吸收值降低，从而可以证明LUT-Fe@PVA微球可作为良好的化学动力性试剂。
如图7所示，LUT-Fe@PVA微球在超声条件下，指示剂DPBF的荧光强度有60.2％下降，而在加入饱和的单线态氧抑制剂NaN3后，指示剂DPBF的荧光强度仅有31.2％下降，表明声动力效应主要与LUT-Fe@PVA微球本身有关，而且产生的ROS中有较高的单线态氧产率。可以证明LUT-Fe@PVA微球可作为良好的声动力性试剂。
如图8(a)所示，单纯的MB以及微球组(MPs)组都几乎没有绿色荧光，说明了材料自身的化学动力学效果比较差，但是在加入外源H2O2后，可以看到绿色荧光有所增强，而且在超声作用下，绿色荧光也有所增多，细胞内ROS水平增加，证明了化学动力学(CDT)和声动力学(SDT)在一定程度上能够增强ROS产生。从图8(b)可以看出，单纯的MB以及MPs组荧光峰值几乎相同，然而当加入外加条件后，峰值明显偏移，从图8(c)定量分析，当HepG2细胞与LUT-Fe@PVA微球孵育后给予H2O2和超声后，细胞内ROS产生量明显提高，说明CDT和SDT能在一定程度上能够促进产生更多的ROS。
5.体外化学动力/声动力协同作用
体外化学动力/声动力协同治疗，实验分为五组：(1)空白对照组：DMEM培养液；(2)材料组：LUT-Fe@PVA；(3)化学动力学组：LUT-Fe@PVA+H2O2；(4)声动力学组：LUT-Fe@PVA+超声；(5)化学动力学+声动力学组：LUT-Fe@PVA+H2O2+超声。使用高内涵显微镜和流式细胞术下进行观察细胞状态和荧光情况。
如图9(a)所示，CDT+SDT组出现呈现较为明显的红色荧光信号，说明LUT-Fe@PVA微球具有在化学动力学和声动力学协同作用下，产生过量ROS，对细胞以一定的杀伤作用，对肿瘤细胞造成更大的损伤。由图9(b)可以看出CDT+SDT协同治疗组，细胞凋亡率达到了47.35％，对细胞的杀伤效果有显著提升，证明LUT-Fe@PVA微球可以产生更多对肿瘤细胞有杀伤作用的物质，对肿瘤细胞造成更大的伤害。
熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分散相制备：称取PVA粉末分散到重蒸水中，充分溶胀后将其置于80～120℃水浴锅中，持续搅拌直至完全溶解，得到透明有一定粘度的PVA溶液；在常温条件下，将可溶性三价铁盐与木犀草素(缩写为LUT)溶于DMSO中，并持续搅拌得到均一透明棕黑溶液，即LUT-Fe溶液，取PVA溶液和LUT-Fe溶液混合均匀，制得分散相溶液；
(2)连续相制备：在常温条件下，将Span-80逐滴加入到石蜡中，持续搅拌，制得澄清透明的连续相溶液；
(3)LUT-Fe@PVA微球制备：加热条件下取分散相逐滴加入到连续相中，搅拌均匀，加入交联剂戊二醛，待交联成球后，用重蒸水和乙醇多次离心洗涤，冷冻干燥得到黑色粉末，即制得所述的负载LUT-Fe的多功能PVA微球。
2.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PVA粉末占所述PVA溶液的质量分数为8～15wt％。
3.根据权利要求1所聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的可溶性三价铁盐与木犀草素的质量比为1:0.5～3。
4.根据权利要求3所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的LUT-Fe溶液中的可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O。
5.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)可溶性三价铁盐与木犀草素的质量比为1:0.5～3。
6.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，LUT-Fe溶液中LUT-Fe的浓度为10～30mg/mL。
7.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的连续相溶液中Span-80与石蜡的质量比为1:40～80。
8.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的分散相与连续相的体积之比为0.2～0.6:1。
9.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的交联剂戊二醛的体积占分散和连续相总体积的3～7％。
10.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应温度为60～90℃。
11.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中，所述搅拌转速为800～1200rpm。
12.根据权利要求1所述聚乙烯醇载木犀草素-Fe微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)、(3)中所述搅拌时间为20～60min。
13.一种LUT-FePVA微球，其特征在于，由权利要求1～12任一项制备方法制备获得。
14.根据权利要求13所述的LUT-FePVA微球，其特征在于，所述LUT-FePVA微球的粒径为30～60μm；优选的，所述LUT-FePVA微球的粒径为40μm。
15.权利要求13～14任一项所述的LUT-FePVA微球在制备核磁共振造影剂或抗肿瘤药物的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为声动力学和/或化学动力学抗肿瘤治疗药物。
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