CN116234924A - 膀胱类器官及其制造方法 - Google Patents

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CN116234924A CN202180060272.9A CN202180060272A CN116234924A CN 116234924 A CN116234924 A CN 116234924A CN 202180060272 A CN202180060272 A CN 202180060272A CN 116234924 A CN116234924 A CN 116234924A
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RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
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Abstract

本发明的一个目的在于，提供用于制造具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的膀胱类器官的腹侧后肠类器官。本发明的一个方式提供一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，形成腹侧后肠类器官。

Description

膀胱类器官及其制造方法
技术领域
本公开涉及腹侧后肠类器官或膀胱类器官、或者它们的制造方法。本公开另外涉及在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物、或其制造方法。本公开还涉及评价腹侧后肠类器官、膀胱类器官或上述非人哺乳动物对受试物质的药物应答性的方法。本公开还涉及含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的再生医疗用组合物。
背景技术
已知膀胱为来源于胚胎内胚层(Definitive Endoderm)的器官，由位于原始消化管(Gut tube)最后方的后肠(Hindgut)经由腹侧泄殖腔(Ventral cloaca)发生。膀胱为暂时储存从肾脏经由输尿管输送来、经尿道排出的尿液的袋状器官。膀胱的蓄尿功能或排尿功能可因膀胱组织由于放射线治疗、膀胱破裂和糖尿病等受到损伤而下降或消失。
以使丧失功能的器官再生、治疗难治性疾病、或弥补器官移植中的长期供体不足为目标，正在进行再生医疗研究。再生医疗领域中，正在研究利用由ES细胞或iPS细胞等多能干细胞在试管内(体外)创造出的、被称为类器官的类似于器官的细胞集合体。
非专利文献1记载了通过在试管内培养小鼠ES细胞来分化诱导膀胱上皮。非专利文献2～4记载了通过在试管内培养人多能干细胞来分化诱导膀胱上皮。非专利文献5记载了：在试管内培养胶原蛋白基质中的小鼠ES细胞后，将其移植到小鼠肾被膜下，分化诱导膀胱上皮。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mauney JR,et.al.,:All-Trans Retinoic Acid DirectsUrothelial Specification of Murine Embryonic Stem Cells via GATA4/6SignalingMechanisms.PLoS One 2010,5:e11513.
非专利文献2：Osborn SL,et.al.,:Induction of human embryonic andinduced pluripotent stem cells into urothelium.Stem Cells Transl Med2014,3:610-9.
非专利文献3：Suzuki K,et.al.,:Directed differentiation of humaninduced pluripotent stem cells into mature stratified bladder urothelium.SciRep 2019,9:1-13.
非专利文献4：Kang M,et.al.,:Generation of Bladder Urothelium fromHuman Pluripotent Stem Cells under Chemically Defined Serum-and Feeder-FreeSystem.Int J Mol Sci 2014,15:7139-7157.
非专利文献5：Oottamasathien S,et.al.,:Directed differentiation ofembryonic stem cells into bladder tissue.Dev Biol 2007,304:556-566.
发明内容
发明所要解决的问题
非专利文献1～4记载的向膀胱上皮的分化诱导并不是模仿实际的膀胱发生过程，另外也不是通过三维培养系统进行分化诱导。非专利文献1～4中分化诱导出的膀胱上皮类器官不具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构。非专利文献5中分化诱导出的膀胱上皮类器官是否具有膀胱那样的三层结构这一点是不清楚的。
本发明人对由多能干细胞形成膀胱类器官的条件进行了各种研究。例如，本发明人研究了构建模仿了实际的膀胱发生过程的三维培养系统的条件。本公开的一个目的在于，提供用于制造具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的膀胱类器官的、新颖的腹侧后肠类器官或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供具有膀胱那样的膀胱上皮细胞类型的层结构的新颖的膀胱类器官或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的新颖的非人哺乳动物、或其制造方法。本公开的一个目的在于，提供含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的新颖的再生医疗用组合物。本公开的一个目的在于，提供评价腹侧后肠类器官、膀胱类器官、或上述非人哺乳动物对受试物质的药物应答性的新颖的方法。
用于解决问题的方法
本公开提供以下的方案。
[项A1]一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质凝胶中用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B进行培养而形成后肠类器官；以及将上述后肠类器官在胞外基质凝胶中用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基b2进行培养而形成腹侧后肠类器官。
[项A2]一种腹侧后肠类器官，其表达P63、CDX2、HOXA13和KRT8且不表达SOX2。
[项A2-1]一种腹侧后肠类器官，其表达P63、CDX2、HOXA13和KRT8且实质上不表达SOX2。
[项A3]根据项A2所述的腹侧后肠类器官，其中，腹侧后肠类器官中的CDX2的表达量比后肠类器官中的CDX2的表达量少，或在腹侧后肠类器官中不表达CDX2。
[项A3-1]根据项A2所述的腹侧后肠类器官，其中，腹侧后肠类器官中的CDX2的表达量比后肠类器官中的CDX2的表达量少，或在腹侧后肠类器官中实质上不表达CDX2。
[项A4]一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：将通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2或项A3所述的腹侧后肠类器官在胞外基质凝胶中用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养。
[项A5]一种膀胱类器官，其包含：沿着上述膀胱类器官的最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63和UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、含有不表达P63但表达UPK2的细胞的第三细胞层。
[项A5-1]一种膀胱类器官，其包含：沿着上述膀胱类器官的最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63和UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、含有实质上不表达P63但表达UPK2的细胞的第三细胞层。
[项A6]一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：将通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2或项A3所述的腹侧后肠类器官导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
[项A7]一种具有内腔的膀胱类器官，其包含：沿着上述膀胱类器官的最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63和UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、面向上述内腔的、含有不表达P63但表达UPK2的细胞的第三细胞层。
[项A7-1]一种具有内腔的膀胱类器官，其包含：沿着上述膀胱类器官的最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63和UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、面向上述内腔的、含有实质上不表达P63但表达UPK2的细胞的第三细胞层。
[项A8]一种制造在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有膀胱类器官的非人哺乳动物的方法，其包括下述步骤：将通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2、项A2-1、项A3或项A3-1所述的腹侧后肠类器官、或者通过项A4或项A6所述的方法制造的膀胱类器官、或者项A5、项A5-1、项A7或项A7-1所述的膀胱类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
[项A9]一种非人哺乳动物，在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2、项A2-1、项A3或项A3-1所述的腹侧后肠类器官、或者通过项A4或项A6所述的方法制造的膀胱类器官、或者项A5、项A5-1、项A7或项A7-1所述的膀胱类器官。
[项A10]一种用于处置膀胱的损伤或疾病的再生医疗用组合物，其含有通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2、项A2-1、项A3或项A3-1所述的腹侧后肠类器官、或者通过项A4或项A6所述的方法制造的膀胱类器官、或者项A5、项A5-1、项A7或项A7-1所述的膀胱类器官。
[项A11]一种评价对受试物质的药物应答性的方法，其包括下述步骤：使通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2、项A2-1、项A3或项A3-1所述的腹侧后肠类器官、或者通过项A4或项A6所述的方法制造的膀胱类器官、或者项A5、项A5-1、项A7或项A7-1所述的膀胱类器官、或者项A9所述的非人哺乳动物与受试物质接触；以及测定上述腹侧后肠类器官、上述膀胱类器官、或上述非人哺乳动物对上述受试物质的药物应答性。
[项A12]一种治疗膀胱的损伤或疾病的方法，其包括下述步骤：将通过项A1所述的方法制造的腹侧后肠类器官、或者项A2、项A2-1、项A3或项A3-1所述的腹侧后肠类器官、或者通过项A4或项A6所述的方法制造的膀胱类器官、或者项A5、项A5-1、项A7或项A7-1所述的膀胱类器官导入到有此需要的哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
[项B1]一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：
将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及
将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，从而形成腹侧后肠类器官。
[项B2]根据项B1所述的方法，其中，形成上述腹侧后肠类器官的步骤包括下述步骤：在用上述诱导培养基B培养上述胚胎内胚层细胞后，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B进行培养而形成后肠类器官；以及将上述后肠类器官在胞外基质存在下用上述诱导培养基B进行培养而形成腹侧后肠类器官，
用于形成后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。
[项B3]根据项B1所述的方法，其中，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。
[项B4]一种腹侧后肠类器官，其通过项B1～项B3中任一项所述的方法而制造。
[项B5]一种腹侧后肠类器官，其表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，并且
实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2。
[项B5-1]一种腹侧后肠类器官，其表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，并且
实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2和/或CDX2，或者，即使表达SOX2和/或CDX2，其表达量也比后肠类器官中的SOX2和/或CDX2的表达量少。
[项B6]一种具有内腔的腹侧后肠类器官，其表达选自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种腹侧后肠标志物，
表达选自由磷酸化Smad1/5/8(Phospho-Smad1/5/8)、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8和ECAD组成的组中的至少1种标志物，并且
实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种背侧后肠标志物。
[项B7]一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：
将通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官或项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官在胞外基质存在下用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养；
导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位；或者
在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。
[项B8]一种膀胱类器官，其通过项B7所述的方法而制造。
[项B9]一种膀胱类器官，其包含：
含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；以及
相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层，
可以还包含相对于上述第二细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第三细胞层。
[项B10]根据项B9所述的膀胱类器官，其中，包含被上述第一细胞层包围的内腔。
[项B11]根据项B9或项B10所述的膀胱类器官，其中，包含相对于上述第三细胞层在外侧方向局部存在的、含有间质样细胞的第四细胞层，可以还包含相对于上述第四细胞层在外侧方向局部存在的、含有平滑肌细胞的第五细胞层。
[项B12]一种制造在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物的方法，其包括下述步骤：将通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过项B7所述的方法制造的膀胱类器官、或者项B8～项B11中任一项所述的膀胱类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
[项B13]一种非人哺乳动物，在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过项B7所述的方法制造的膀胱类器官、或者项B8～项B11中任一项所述的膀胱类器官。
[项B14]一种用于处置膀胱的损伤或疾病的再生医疗用组合物，其含有通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过项B7所述的方法制造的膀胱类器官、或者项B8～项B11中任一项所述的膀胱类器官。
[项B15]一种评价对受试物质的药物应答性的方法，其包括下述步骤：
使通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过项B7所述的方法制造的膀胱类器官、项B8～项B11中任一项所述的膀胱类器官、通过项B12所述的方法制造的非人哺乳动物、或项B13所述的非人哺乳动物与受试物质接触；以及
测定上述腹侧后肠类器官、上述膀胱类器官、或上述非人哺乳动物对上述受试物质的药物应答性。
[项B16]一种治疗膀胱的损伤或疾病的方法，其包括下述步骤：将通过项B1～项B3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、项B4～项B6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过项B7所述的方法制造的膀胱类器官、或者项B8～项B11中任一项所述的膀胱类器官导入到有此需要的哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
附图说明
图1为示出一个实施方式的膀胱类器官制作的概要的流程图。
图2a为示出肠样类器官中的SATB2的分布的图像。图2b为示出肠样类器官中的CDX2的分布的图像。图2c为示出肠样类器官中的ECAD的分布的图像。图2d为肠样类器官的DAPI染色图像。
图3a为示出膀胱类器官中的UPK2的分布的图像。其中，在膀胱类器官的最外周观察到的白色信号为来自Matrigel(注册商标)的非特异性信号。图3b为示出膀胱类器官中的P63的分布的图像。图3c为示出膀胱类器官中的KRT5的分布的图像。图3d为示出膀胱类器官中的UPK2、P63和KRT5的分布的叠加图像。其中，在膀胱类器官的最外周观察到的白色信号为来自Matrigel的非特异性信号。图3e为示出膀胱类器官中的ECAD的分布的图像。图3f为膀胱类器官的DAPI染色图像。
图4a为示出使用从诱导培养基B和诱导培养基C中除去BMP4后的培养基诱导的细胞结构体中的UPK2的分布的图像。其中，在上述细胞结构体的最外周观察到的白色信号为来自Matrigel的非特异性信号。图4b为示出使用从诱导培养基B和诱导培养基C中除去BMP4后的培养基诱导的细胞结构体中的P63的分布的图像。图4c为示出使用从诱导培养基B和诱导培养基C中除去BMP4后的培养基诱导的细胞结构体中的ECAD的分布的图像。图4d为使用从诱导培养基C中除去BMP4后的培养基诱导的细胞结构体的DAPI染色图像。
图5a为示出被导入到非人哺乳动物中的膀胱类器官中的UPK2的分布的图像。图5b为示出被导入到非人哺乳动物中的膀胱类器官中的P63的分布的图像。图5c为示出被导入到非人哺乳动物中的膀胱类器官中的KRT5的分布的图像。图5d为膀胱类器官的DAPI染色图像。图5e为示出被导入到非人哺乳动物中的膀胱类器官中的P63、KRT5和DAPI染色的分布的叠加图像。图5f为示出被导入到非人哺乳动物中的膀胱类器官中的UPK2、P63和DAPI染色的分布的图像。图5g为示出生物体的膀胱中的细胞类型的层结构的示意图。
图6为示出一个实施方式的膀胱类器官制作的概要的流程图。
图7a1～a11为步骤b1的后肠分化诱导后的后肠类器官(分化诱导第11天)的荧光图像。图7b1～b11为步骤b3的腹侧后肠分化诱导中的腹侧后肠类器官(分化诱导第11天)的荧光图像。图7a1和图7b1为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的上皮标志物KRT8的分布的图像。图7a2和图7b2为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的腹侧标志物GATA3的分布的图像。图7a3和图7b3为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的背侧后肠标志物SOX2的分布的图像。图7a5和图7b5为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的背侧后肠标志物CDX2的分布的图像。图7a6和图7b6为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的背侧后肠标志物SOX2的分布的图像。图7a7和图7b7为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的背侧后肠标志物T的分布的图像。图7a9和图7b9为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的肠管标志物FOXA2的分布的图像。图7a10和图7b10为示出后肠类器官和腹侧后肠类器官各自中的上皮标志物ECAD的分布的荧光图像。图7a4、图7a8和图7a11为后肠类器官的DAPI染色图像。图7b4、图7b8和图7b11为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。
图8a1和图8a2分别为示出腹侧后肠分化诱导中的腹侧后肠类器官(分化诱导第14天)中的背侧后肠标志物CDX2和SOX2的分布的荧光图像。图8a3为示出腹侧后肠标志物GATA3的分布的荧光图像。图8a4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8a5为CDX2、SOX2、GATA3和DAPI染色的叠加图像。图8b1为示出原始肠管上皮标志物FOXA2的分布的荧光图像。图8b2和图8b3为分别示出腹侧后肠类器官中的腹侧后肠标志物ΔNP63和GATA3的分布的荧光图像。图8b4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8b5为FOXA2、ΔNP63、GATA3和DAPI染色的叠加图像。图8c1为示出肠管上皮标志物CK8的分布的荧光图像。图8c2为示出腹侧后肠标志物SATB2的分布的荧光图像。图8c3为示出顶端紧密连接(Apical tight junction)标志物ZO1的分布的荧光图像。图8c4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8c5为CK8、SATB2、ZO1和DAPI染色的叠加图像。图8d1为示出腹侧后肠标志物ISL1的分布的荧光图像。图8d2为示出腹侧后肠和泄殖腔(Cloaca)区域标志物磷酸化Smad1/5/8的分布的荧光图像。图8d3为示出上皮细胞标志物ECAD的分布的荧光图像。图8d4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8d5为ISL1、磷酸化Smad1/5/8、ECAD和DAPI染色的叠加图像。图8e1为示出腹侧后肠标志物GATA3的分布的荧光图像。图8e2为示出背侧后肠标志物的SOX2的分布的荧光图像。图8e3为示出膀胱上皮细胞标志物UPK2的分布的荧光图像。图8e4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8e5为GATA3、SOX2、UPK2和DAPI染色的叠加图像。图8f1为示出背侧后肠标志物CDX2的分布的荧光图像。图8f2为示出后方肠管标志物HOXA13的分布的荧光图像。图8f3为示出膀胱上皮细胞标志物KRT5的分布的荧光图像。图8f4为腹侧后肠类器官的DAPI染色图像。图8f5为CDX2、HOXA13、KRT5和DAPI染色的叠加图像。
图9a～d为通过腹侧后肠类器官与膀胱间充质细胞的共培养而得到的、膀胱上皮分化诱导中的膀胱类器官(分化诱导第20天)的明视场图像。
图10a1～a3为分别示出膀胱类器官分化诱导中的膀胱类器官(分化诱导第24天)中的膀胱上皮细胞标志物UPK2、ΔNP63和KRT5的分布的荧光图像。图10a4为上述膀胱类器官的DAPI染色图像。图10a5为UPK2、ΔNP63、KRT5和DAPI染色的叠加图像。图10b1为示出上述膀胱类器官中的上皮细胞标志物ECAD的分布的荧光图像。图10b2为示出上述膀胱类器官中的表示人源细胞的hLNB1的分布的荧光图像。图10b3为示出上述膀胱类器官中的间充质细胞标志物VIM的分布的荧光图像。图10b4为上述膀胱类器官的DAPI染色图像。图10b5为ECAD、hLNB1、VIM和DAPI染色的叠加图像。图10c1为示出上述膀胱类器官中的上皮细胞标志物ECAD的分布的荧光图像。图10c2为示出上述膀胱类器官中的平滑肌细胞标志物αSMA的分布的荧光图像。图10c3为上述膀胱类器官的DAPI染色图像。图10c4为ECAD、αSMA和DAPI染色的叠加图像。图10d1为示出上述膀胱类器官中的发生过程中的膀胱上皮细胞标志物FOXA2的分布的荧光图像。图10d2为示出上述膀胱类器官中的膀胱上皮细胞标志物GATA3的分布的荧光图像。图10d3为上述膀胱类器官的DAPI染色图像。图10d4为FOXA2、GATA3和DAPI染色的叠加图像。
图11a1和图11b1为分别示出膀胱类器官分化诱导中的膀胱类器官(分化诱导第42天)中的UPK1B和UPK2的分布的荧光图像。图11a2和图11b2为示出上述膀胱类器官中的ΔNP63的分布的荧光图像。图11a3和图11b3为示出上述膀胱类器官中的KRT5的分布的荧光图像。图11a4和图11b4为上述膀胱类器官的DAPI染色图像。图11a5为UPK1B、ΔNP63、KRT5和DAPI染色的叠加图像。图11b5为UPK2、ΔNP63、KRT5和DAPI染色的叠加图像。
具体实施方式
[腹侧后肠类器官或其制造方法]
本公开的一个方式提供腹侧后肠类器官的制造方法。本公开的另一方式提供腹侧后肠类器官。
本说明书中的术语“类器官”是指在试管内(体外)形成的三维的类似于生物体组织的细胞集合体、或在生物体内进一步培养上述细胞集合体而得到的细胞集合体。构成类器官的细胞例如是其大部分都具有分化能力和增殖能力的细胞。本说明书中，表达特定标志物的类器官是指以规定比例含有表达上述特定标志物的细胞的类器官。上述规定比例例如可以为构成类器官的细胞的3％以上、5％以上、10％以上、或15％以上。
本说明书中，“实质上不表达”特定标志物是指上述特定标志物的表达量少、无法利用该标志物进行表征。一个方式中，“实质上不表达”特定标志物的类器官可以为：上述类器官中的上述特定标志物的表达量与作为比较对象的类器官中的上述特定标志物的表达量相比降低到低于70％、低于80％、低于90％、或低于95％的类器官。标志物的表达量例如可以通过定量PCR或免疫染色法来测定。利用定量PCR的标志物的表达量例如可以为编码期望标志物的mRNA的表达量。利用免疫染色法的标志物的表达量例如可以为来自与和期望标志物结合的抗体直接结合或间接结合的可产生信号的物质(例如荧光物质)的信号的强度(例如荧光强度)。与和期望标志物结合的抗体(一抗)间接结合的可产生信号的物质例如可以为与能够和上述一抗结合的二抗直接结合的可产生信号的物质。
一个实施方式中，实质上不表达SOX2的腹侧后肠类器官中，上述腹侧后肠类器官中的SOX2的表达量与后肠类器官中的SOX2的表达量相比下降到低于70％。一个实施方式中，实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种，优选为3种)背侧后肠标志物的腹侧后肠类器官中，上述腹侧后肠类器官中的上述背侧后肠标志物的表达量与后肠类器官中的对应标志物的表达量相比下降到小于70％。上述实施方式中，上述后肠类器官为通过使用与构成腹侧后肠类器官的细胞同种的多能干细胞实施本公开的步骤A和步骤b1(例如实施例中记载的步骤A和步骤b1)而形成的后肠类器官。
本说明书中的术语“腹侧后肠类器官”是指：表达本公开的至少1种腹侧后肠标志物且实质上不表达本公开的至少1种背侧后肠标志物，或即使表达本公开的至少1种背侧后肠标志物，其表达量也比后肠类器官中的表达量少的类器官。腹侧后肠类器官例如可以通过本公开的腹侧后肠类器官的制造方法来制造。在上述腹侧后肠类器官的制造方法中，在形成后肠类器官、接着使上述后肠类器官腹侧化而形成腹侧后肠类器官的情况下，本说明书中有时将该腹侧后肠类器官称为“腹侧化后肠类器官”。腹侧后肠类器官的长径可以为80μm以上、100μm以上、或120μm以上。腹侧后肠类器官例如可以用于制造后述的膀胱类器官。腹侧后肠类器官例如可以用于评价对受试物质的药物应答性。腹侧后肠类器官例如可以作为本公开的再生医疗用组合物的有效成分使用。
一个实施方式的腹侧后肠类器官表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，并且实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2。一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征在于，表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2，并且实质上不表达作为背侧后肠标志物的CDX2，或者即使表达CDX2，其表达量也少于后肠类器官中的CDX2的表达量。一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征在于，表达作为腹侧后肠标志物的P63，表达HOXA13和CK8/KRT8，并且实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2和/或CDX2，或者即使表达SOX2和/或CDX2，其表达量也比后肠类器官中的SOX2和/或CDX2的表达量少。一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征还在于，P63的表达量比后肠类器官中的P63的表达量多。一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征还在于，CDX2的表达量相对于P63的表达量的比小于后肠类器官中的CDX2的表达量相对于P63的表达量的比。一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征还在于，转录HOXA13。
一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征在于，具有内腔，表达选自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种(例如1种、2种、3种、或4种以上)腹侧后肠标志物，表达选自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8和ECAD组成的组中的至少1种(例如1种、2种、3种、4种、或5种以上)标志物，并且实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种，优选为3种)。一个实施方式的腹侧后肠类器官还含有面向上述内腔的、共表达CK8/KRT8和ZO1的细胞的层。
一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征在于，具有内腔，表达作为腹侧后肠标志物的GATA3，表达选自由FOXA2、CK8/KRT8和ECAD组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种)标志物，并且实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种，优选为3种)。上述腹侧后肠类器官例如表达FOXA2、CK8/KRT8和ECAD。
一个实施方式的腹侧后肠类器官的特征在于，具有内腔，含有面向上述内腔的、共表达CK8/KRT8和ZO1的细胞的层，表达选自由ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种(例如1种、2种、或3种以上)腹侧后肠标志物，表达选自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、CK8/KRT8、FOXA2和ECAD组成的组中的至少1种(例如1种、2种、3种、或4种以上)标志物，并且实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种，优选为3种)。上述腹侧后肠类器官优选表达GATA3。上述腹侧后肠类器官例如还表达ΔN63、ISL1和SATB2。上述腹侧后肠类器官例如还表达磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、CK8/KRT8、FOXA2和ECAD。
本说明书中的术语“内腔”是指管状或袋状的细胞结构体的内侧空间。内腔例如可以由液体充满。一个实施方式中，膀胱类器官的内腔为袋状的细胞结构体的内侧空间。
关于腹侧后肠类器官的术语“P63”是抑癌基因P53的同源物，是指在上皮具有分化、增殖、维持等作用的蛋白质。P63可以作为膀胱上皮细胞标志物或腹侧后肠/泄殖腔标志物来利用。细胞或类器官中表达的P63例如可以通过免疫染色法使用抗P63抗体(例如抗P63兔单克隆抗体(EPR5701))进行检测或测定。
本说明书中的术语“ΔNP63”是指N末端的转录激活域(TN)缺失的p63的同种型。ΔNP63可以作为膀胱上皮细胞标志物或腹侧后肠标志物来利用。细胞或类器官中表达的ΔNP63例如可以通过免疫染色法使用抗ΔNP63抗体(例如兔抗ΔNP63(Cell signaling、#67825))进行检测或测定。
本说明书中的术语“GATA3”是指：与DNA中的“GATA”所构成的靶DNA序列结合而控制基因的开放/关闭的转录因子。GATA3可以作为腹侧后肠标志物或膀胱上皮细胞标志物来利用。细胞或类器官中表达的GATA3例如可以通过免疫染色法使用抗GATA3抗体(例如山羊抗GATA3(R&D Systems、#AF2605))进行检测或测定。
本说明书中的术语“UPK1B”是指：参与与尿溶蛋白(Uroplakin)Ia、II和III一起形成尿路系统上皮的移行上皮的被覆细胞的形成、具有提高被覆细胞的透过性、屏障功能的作用的膜糖蛋白。UPK1B可以作为膀胱上皮标志物或上皮组织标志物来利用。细胞或类器官中表达的UPK1B例如可以通过免疫染色法使用抗UPK1B抗体(小鼠抗UPK1B单克隆抗体(克隆1E1)(Sigma-aldrich、#WH0007348M2)进行检测或测定。
本说明书中的术语“ISL1”是具有LIM同源域的转录因子，是指作用于胰岛素基因的表达调节区域的因子。ISL1可以作为腹侧后肠标志物来利用。细胞或类器官中表达的ISL1例如可以通过免疫染色法使用抗ISL1抗体(小鼠抗ISL1&2(DSHB、#39.4D5))进行检测或测定。
本说明书中的术语“SATB2”是指与富含AT的序列结合的DNA结合蛋白。SATB2可以作为结肠或直肠标志物或腹侧后肠标志物来利用。细胞或类器官中表达的SATB2例如可以通过免疫染色法使用抗SATB2抗体(兔抗SATB2(CELL MARQUE、#384R-14))进行检测或测定。
本说明书中的术语“CDX2”是指由CDX2基因编码的同源框蛋白。CDX2可以作为中肠/后肠标志物来利用。细胞或类器官中表达的CDX2例如可以通过免疫染色法使用抗CDX2抗体(例如抗CDX2小鼠单克隆抗体(CX2-88))进行检测或测定。
本说明书中的术语“SOX2”也被称为SRY(Y染色体性别决定区)-框2)，是未分化状态的ES细胞维持自复制所必需的转录因子。SOX2可以作为背侧后肠标志物或肺/胃谱系标志物来利用。细胞或类器官中表达的SOX2例如可以通过免疫染色法使用抗SOX2抗体(例如抗SOX2山羊多克隆抗体(R&D Systems、#AF2018))进行检测或测定。
本说明书中的术语“T”也被称为TBXT(T-box转录因子T)，是指借助被称为T-box的N末端区域与被称为回文T位点的DNA序列结合、从而对中胚层的形成和分化中必需的基因的转录产生影响的转录因子。T可以作为背侧后肠标志物来利用。细胞或类器官中表达的T例如可以通过免疫染色法使用抗T抗体(例如山羊抗T/Brachyury抗体(R&D Systems、#AF2085))进行检测或测定。
本说明书中的术语“ZO1”是指：在上皮细胞与内皮细胞的紧密连接(Tightjunction)处表达的膜磷蛋白。ZO1可以作为紧密连接标志物来利用。细胞或类器官中表达的ZO1例如可以通过免疫染色法使用抗ZO1抗体(山羊抗ZO1(ThermoFisher、#PA5-19090))进行检测或测定。
本说明书中的术语“细胞角蛋白8(KRT8或CK8)”为角蛋白的1个亚型，是指在肌上皮细胞、膜基底细胞中表达的分子量约45kD的蛋白质。CK8/KRT8可以作为肠管上皮标志物来利用。细胞或类器官中表达的CK8/KRT8例如可以通过免疫染色法使用抗细胞角蛋白8大鼠单克隆抗体(TROMA-1))进行检测或测定。
本说明书中的术语“FOXA2”是叉头框蛋白A2的缩写，是在发生阶段中发挥重要作用的转录因子。FOXA2可以作为原始肠管上皮标志物或发生过程中的膀胱上皮细胞标志物来利用。FOXA2例如可以通过免疫染色法使用抗FOXA2抗体(小鼠抗FOXA2(Santa CruzBiotechnology、#sc-101060))进行检测或测定。
本说明书中的术语“ECAD”也被称为E-钙黏蛋白(epithelial cadherin)，是具有细胞粘附相关作用、存在于细胞表面的跨膜型糖蛋白。ECAD可以作为上皮组织标志物来利用。细胞或类器官中表达的ECAD例如可以通过免疫染色法使用抗ECAD抗体(例如山羊抗ECAD(R&D SYSTEMS、#AF648))进行检测或测定。
本说明书中的术语“HOXA13”在人类的情况下是指由HOXA13基因编码的同源框蛋白。细胞或类器官中表达的HOXA13例如可以通过定量RCR进行检测或测定。
本说明书中的术语“磷酸化Smad1/5/8”是指在细胞内在TGF-β信号转导系统中发挥重要作用的转录因子。磷酸化Smad1/5/8可以作为腹侧后肠和泄殖腔区域标志物来利用。细胞或类器官中表达的磷酸化Smad1/5/8例如可以通过免疫染色法使用抗Smad1/5/8抗体(例如兔抗pSmad1/5/8(Cell signaling、#13820))进行检测或测定。
本公开的一个实施方式的腹侧后肠类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及步骤B：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养而形成腹侧后肠类器官。
一个实施方式中，步骤B包括下述步骤：步骤b1：将胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官；以及步骤b2：将上述后肠类器官在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤B包括下述步骤：步骤b3：将胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
本公开的一个实施方式的腹侧后肠类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用上述诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b1：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官；以及步骤b2：将上述后肠类器官在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
本公开的一个实施方式的腹侧后肠类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及步骤b3：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
步骤A：胚胎内胚层细胞的分化诱导
步骤A包括：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞。
本说明书中的术语“多能干细胞”是指：可以在试管内(体外)进行培养且具有分化为来自三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的组织的能力、即多能性(pluripotency)的干细胞。多能干细胞例如可以由受精卵、克隆胚、生殖干细胞、或组织干细胞等建立。一个实施方式中，多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)、由体细胞诱导而成的人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、或胚胎生殖干细胞(EG细胞)。多能干细胞优选为ES细胞或iPS细胞。
本说明书中的术语“ES细胞”是具有自复制能力、具有多能性(pluripotency)的干细胞，是指来自早期胚的多能干细胞。一个实施方式中，ES细胞为人ES细胞。
本说明书中的术语“iPS细胞”是由体细胞诱导而成的多能干细胞，是指通过对体细胞进行初始化而人为地使其具有类似于胚胎干细胞的多能性的细胞。iPS细胞例如可以通过使成纤维细胞等分化后的细胞通过Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc等基因的表达进行初始化而建立。一个实施方式中，iPS细胞为通过使人成纤维细胞等分化后的细胞进行初始化而建立的人iPS细胞。
“诱导培养基A”含有基本培养基以及含有激活素A和GSK3β抑制剂的添加剂。诱导培养基A例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。添加到诱导培养基A中的上述添加剂的浓度可以考虑提供培养中使用的细胞的动物种由本领域技术人员适宜地设定。“基本培养基”可以为可按照公知方案制备的细胞培养用培养基，或者，可以为可商购的细胞培养用培养基。基本培养基例如可以为杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊戈尔基本培养基(BME)、公知的干细胞用培养基、或公知的用于使干细胞分化的培养基。基本培养基优选为用于使干细胞分化的培养基，例如可以为STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Tecnologies)。用于使干细胞分化的培养基例如可以按照Nature Protocols,vol.3,No.5,pp.768-776,2008来制备。诱导培养基A可以还含有无蛋白质培养基(例如PFHM-II)、抗生素(例如青霉素/链霉素、庆大霉素)、或抗生素-抗真菌剂混合液(例如抗生素-抗真菌素)、或这些的组合。
本说明书中的术语“激活素A”为属于TGFβ超家族的因子，为促进从脑垂体前叶分泌FSH(卵泡刺激激素)的蛋白质。激活素A在细胞分化、增殖、凋亡和癌变的调节中显示出各种功能。诱导培养基A可以含有例如10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的激活素A。
本说明书中的术语“GSK3β抑制剂”是指：抑制与包括wnt/β-连环蛋白通路在内的各种信号传导通路有关的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶3β的作用的化合物。GSK3β抑制剂例如可以为CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、星形孢菌素(Staurosporine)、K252A、WNT(优选为WNT3A)或TWS119、或这些的组合。GSK3β抑制剂优选为CHIR-99021或WNT(优选为WNT3A)。诱导培养基A可以以显示出与0.1～5μM、0.3～2.5μM、或0.5～1.5μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。“GSK3β抑制作用”例如可以在规定量的GSK3β抑制剂存在下通过由β连环蛋白的核转移带来的转录活性来测定。由β连环蛋白的核转移带来的转录活性可以按照公知方法(例如荧光素酶活性测定)来测定。由β连环蛋白的核转移带来的转录活性例如可以使用可商购的试剂盒(例如LEADING LIGHT(注册商标)Wnt Reporter Assay Starter kit)来测定。本说明书中，术语“同等程度的作用”是指与成为对照的作用相比在±30％以内、±20％以内、或±10％以内的作用。一个实施方式中，同等程度的作用为与成为对照的作用相比在±30％以内的作用。
诱导培养基A可以含有0.1～5μM、0.3～2.5μM、或0.5～1.5μM的GSK3β抑制剂(优选为CHIR-99021)。诱导培养基A可以以显示出与0.1～5μM、0.3～2.5μM、或0.5～1.5μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。诱导培养基A中，作为GSK3β抑制剂，可以含有0.2～200ng/ml、10～100ng/ml、或2～20ng/ml的WNT(优选为WNT3A)。诱导培养基A含有WNT(优选为WNT3A)作为GSK3β抑制剂时，诱导培养基A可以以显示出与0.1～5μM、0.3～2.5μM、或0.5～1.5μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有WNT(优选为WNT3A)。
后述的诱导培养基b2可以以显示出与1～50μM、3～25μM、或5～10μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。一个实施方式中，诱导培养基b2可以含有2～2000ng/ml、100～1000ng/ml、或20～200ng/ml的WNT(优选为WNT3A)。后述的诱导培养基b3可以以显示出与0.5～25μM、1～15μM、或2～8μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。一个实施方式中，诱导培养基b3可以含有1～1000ng/mL、50～500ng/mL、10～100ng/mL的WNT(优选为WNT3A)。
使用诱导培养基A的多能干细胞的培养可以在公知的细胞培养条件下实施。公知的细胞培养条件可以为在37℃、5％CO2下进行维持。进行培养的温度不限于37℃，可以适宜使用细胞培养领域中公知的温度。CO2浓度不限于5％，可以适宜使用细胞培养领域中公知的CO2浓度。多能干细胞的培养可以实施2天～5天、2天～4天、或3天。
“胚胎内胚层细胞”可以通过使用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A培养多能干细胞来进行分化诱导。
在诱导培养基A中培养的多能干细胞可以使用公知的干细胞用培养基进行了预培养。这样的多能干细胞例如可以在用iMatrix-511进行了包被的细胞培养容器中使用StemFit AK02N培养基(REPROCELL)进行预培养。经预培养的多能干细胞可以通过公知的方法或使用可商购的试剂(例如TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific))从细胞培养容器剥离。剥离而得的细胞可以悬浮于以终浓度为0.25μg/cm2的方式添加有培养基(例如iMatrix-511(nippi)的StemFit AK02N(10μMY-27632))。
一个实施方式中，使用诱导培养基A的多能干细胞的培养包括下述步骤：将经预培养的多能干细胞(例如人iPS或ES细胞)的细胞悬浮液以30000～90000个细胞/cm2的方式接种于6孔板，在37℃、CO2 5％下培养1天。然后，将培养基交换为作为诱导培养基A的STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Tecnologies)(添加了100ng/mL激活素A、1～1.25μMCHIR99021、2％ PFHM-II和抗生素-抗真菌素)，培养3～5天。通过上述培养，对胚胎内胚层进行分化诱导。关于培养基交换，例如在第2天后每天进行。优选对细胞表达胚胎内胚层标志物FOXA2、SOX17这一点进行确认。胚胎内胚层诱导期过长时，具有在此后的后肠诱导(后方化)的过程中前肠谱系细胞(ALB+、AFP+、PDX1+)混入的比例变高的倾向。因此，胚胎内胚层诱导期优选选择在表达FOXA2、SOX17的同时最能抑制在此后的后肠诱导过程中混入前肠谱系细胞的期间。所接种的细胞密度优选选择在分化诱导第2天集落状的细胞群向外扩展、在分化诱导第3天以片状达到100％汇合的条件。进而优选选择在后肠诱导时能得到最多的悬浮球状体的条件。细胞密度少或多的情况下，具有难以充分得到悬浮球状体的倾向。
步骤b1：后肠分化诱导
步骤b1包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官。
“诱导培养基B”含有基本培养基以及含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的添加剂。一个实施方式的诱导培养基B用于形成胚胎内胚层细胞的球状体，含有基本培养基以及含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的添加剂。用于形成上述球状体的诱导培养基B在本说明书中也称为“诱导培养基b”。一个实施方式的诱导培养基B用于形成后肠类器官，含有基本培养基以及含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的添加剂。用于由上述球状体形成后肠类器官的诱导培养基B在本说明书中也称为“诱导培养基b1”。用于由后述的后肠类器官形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B在本说明书中也称为“诱导培养基b2”。用于由后述的胚胎内胚层细胞形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B或用于由上述球状体形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B在本说明书中也称为“诱导培养基b3”。
诱导培养基B例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。与诱导培养基B相关的基本培养基可适宜地适用关于与诱导培养基A相关的基本培养基的说明。添加到诱导培养基B中的上述添加剂的浓度可以考虑提供培养中使用的细胞的动物种由本领域技术人员适宜地设定。诱导培养基B可以还含有肝素、无蛋白质培养基(例如PFHM-II)、抗生素(例如青霉素/链霉素、庆大霉素)、或抗生素-抗真菌剂混合液(例如抗生素-抗真菌素)、或这些的组合。
“诱导培养基b”或“诱导培养基b1”含有基本培养基以及含有FGF和GSK3β抑制剂的添加剂。诱导培养基b和b1例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。与诱导培养基b和b1相关的基本培养基可适宜地适用关于与诱导培养基A相关的基本培养基的说明。一个实施方式中，诱导培养基b和b1含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂，实质上不含骨形成蛋白。一个实施方式中，实质上不含骨形成蛋白的诱导培养基b和b1完全不含骨形成蛋白。一个实施方式中，实质上不含骨形成蛋白的诱导培养基b可以以不抑制胚胎内胚层细胞的球状体形成的浓度含有骨形成蛋白，例如可以含有低于1ng/ml、低于0.5ng/ml、或低于0.1ng/ml的骨形成蛋白。一个实施方式中，实质上不含骨形成蛋白的诱导培养基b1可以以不抑制由胚胎内胚层细胞的球状体形成后肠类器官的浓度含有骨形成蛋白，例如可以含有低于1ng/ml、低于0.5ng/ml、或低于0.1ng/ml的骨形成蛋白。
本说明书中的术语“成纤维细胞生长因子(FGF)”是指可促进成纤维细胞或内皮细胞的增殖的分子量16000～20000的蛋白质。FGF(例如FGF4)例如是为了抑制来自前方内胚层的细胞混入而在诱导培养基B中添加的。FGF(例如FGF4)例如是为了形成后肠球状体而在诱导培养基B中添加的。FGF例如可以为FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、或FGF23、或这些的组合。FGF优选为FGF4或FGF7、或者这些的组合。
诱导培养基b和b1可以含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF(优选为FGF4)。诱导培养基b和b1可以含有10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF7或者含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4。诱导培养基b或b1可以以显示出与用含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4的诱导培养基b或b1培养的细胞或类器官中的前方内胚层细胞标志物(例如肝脏谱系标志物ALB、胰腺谱系标志物PDX1、或肺/胃谱系标志物SOX2)的表达抑制同等程度的表达抑制的浓度含有FGF。该上下文中，使用诱导培养基b培养的细胞可以为在本公开的步骤A中由多能干细胞分化诱导的胚胎内胚层细胞。该上下文中，使用诱导培养基b1培养的细胞可以为在本公开的步骤b1中由上述胚胎内胚层细胞形成的球状体。前方内胚层细胞标志物的表达例如可以按照免疫染色法来测定。免疫染色法中，前方内胚层细胞标志物的表达例如可以使用可商购的抗体来测定。本说明书中，“同等程度的表达抑制”是指：与成为对照的表达量相比在±30％以内、±20％以内、或±10％以内的表达量。一个实施方式中，同等程度的作用为在±30％以内的表达量。
本说明书中，术语“ALB”是指：作为由约600个氨基酸构成的分子量约66000的蛋白质的白蛋白。ALB例如可以作为肝脏谱系标志物来利用。细胞或类器官中表达的ALB例如可以通过免疫染色法使用抗白蛋白抗体进行检测或测定。
本说明书中术语“胰腺十二指肠同源盒因子-1(Pancreatic and duodenalhomeobox factor-1，PDX1)”是指：与胰岛素基因启动子区域结合、参与胰岛素基因的胰腺β细胞特异性表达的同源域蛋白。PDX1例如可以作为胰腺谱系标志物来利用。细胞或类器官中表达的PDX1例如可以通过免疫染色法使用抗PDX1抗体进行检测或测定。
诱导培养基b或b1可以以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。“成纤维细胞增殖作用”例如可以基于在规定量的FGF存在下成纤维细胞将[3H]胸苷从细胞外摄取至细胞内的量来测定。成纤维细胞例如可以使用NR6R-3T3小鼠成纤维细胞。胸苷的从细胞外摄取至细胞内的量可以按照公知的方法(例如Eethods in Enzymology、Volume 109、1985、Pages749-773中记载的方法)来测定。
一个实施方式中，诱导培养基b或b1以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。
诱导培养基b和b1可以含有1～50μM、3～25μM、5～10μM、0.5～16μM、3～12μM、或6～10μM的GSK3β抑制剂(优选为CHIR-99021)。诱导培养基b和b1可以含有2～2000ng/ml、100～1000ng/ml、或20～200ng/ml的WNT(优选为WNT3A)。诱导培养基b和b1可以以显示出与1～50μM、3～25μM、5～10μM、0.5～16μM、3～12μM、或6～10μM或者0.1～5μM、0.3～2.5μM、或0.5～1.5μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。诱导培养基b或b1含有WNT(优选为WNT3A)作为GSK3β抑制剂时，诱导培养基b3可以以显示出与1～50μM、3～25μM、5～10μM、0.5～16μM、3～12μM、或6～10μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有WNT(优选为WNT3A)。
关于诱导培养基b和诱导培养基b1，它们的组成和/或用量可以相同也可以不同。一个实施方式中，关于诱导培养基b与诱导培养基b1，它们的组成和/或用量相同。
“后肠类器官”例如可以通过使用本公开的诱导培养基B培养胚胎内胚层细胞而形成。一个实施方式中，后肠类器官可以如下形成：将胚胎内胚层细胞用例如含有FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b进行培养，接着，在胞外基质凝胶中用含有FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b1进行三维培养，从而形成。胞外基质凝胶中的后肠类器官可以按照公知的方法或使用可商购的试剂来回收。胞外基质凝胶中的后肠类器官例如可以通过使用金属蛋白酶温和地破坏胞外基质凝胶而回收。
一个实施方式中，后肠类器官可以如下形成：将胚胎内胚层细胞用例如含有FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b进行培养，接着，在胞外基质凝胶上用含有FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b1进行培养，从而形成。一个实施方式中，后肠类器官可以如下形成：将胚胎内胚层细胞用例如含有FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b进行培养，接着，使用含有作为分散成分的胞外基质、FGF和GSK3β抑制剂的诱导培养基b1进行培养，从而形成。
本说明书中的术语“胞外基质(ECM)”没有限定，包括水、多糖、弹性蛋白、整联蛋白和糖蛋白。糖蛋白例如包括胶原蛋白、巢蛋白(nidogen)、纤连蛋白、和层粘连蛋白。ECM例如可以通过在试管内培养ECM产生细胞(例如上皮细胞、内皮细胞、脏壁内胚层样细胞、或成纤维细胞)后除去上述ECM细胞来制备。ECM产生细胞例如可以为：主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞；主要产生IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质胶原蛋白原、和纤连蛋白的成纤维细胞；以及主要产生胶原蛋白(I型、III型、和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白、和肌腱蛋白-C的结肠肌成纤维细胞。ECM可商购。可商购的胞外基质例如可以为胞外基质蛋白(Invitrogen)、来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物(例如Cultrex(注册商标)基底膜提取物(Trevigen，Inc.)、或Matrigel(注册商标)(corning公司))。ECM可以为合成胞外基质(例如ProNectin(Sigma Z378666))。胞外基质可以为1种，或者可以为2种以上的混合物。一个实施方式中，ECM为Matrigel。
与后肠类器官形成相关的胞外基质凝胶优选为显示出与由蛋白质浓度1～8mg/mL、1.5～6mg/mL、或2.5mg/mL或5mg/mL的Matrigel溶液形成的凝胶同等程度的弹力的凝胶。与后肠类器官形成相关的胞外基质凝胶优选由蛋白质浓度1～8mg/mL、1.5～6mg/mL、或1.5～3.5mg/mL或4～6mg/mL的Matrigel形成。实施后述的步骤c2而形成膀胱类器官时，胞外基质凝胶优选为显示出与由蛋白质浓度1～4mg/mL、2～3mg/mL、或2.5mg/mL的Matrigel溶液形成的凝胶同等程度的弹力的凝胶。本说明书中，术语“同等程度的弹力”是指：与成为对象的弹力相比在±30％以内、±20％以内、或±10％以内的弹力。一个实施方式中，同等程度的弹力为与成为对象的弹力相比在±30％以内的弹力。与膀胱类器官的形成相关的胞外基质凝胶优选由蛋白质浓度1～4mg/mL、2～3mg/mL、或2.5mg/mL的Matrigel形成。
作为“分散成分”的胞外基质例如在诱导培养基中以分散或溶解的状态存在。作为分散成分存在时，胞外基质例如在单位容积的诱导培养基中以10％v/v以下、7％v/v以下、5％v/v以下、例如2.5％v/v的分量存在。一个实施方式中，诱导培养基以0.1～10％v/v、0.1～7％v/v、0.1～5％v/v、1～10％v/v、1～7％v/v、1～5％v/v、1～2.5％v/v、2～10％v/v、2～7％v/v、2～5％v/v、或2～2.5％v/v的分量含有胞外基质。胞外基质含有来自生物体的生成物(例如来自小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物)时，从防止或减少所制造的类器官的污染的观点出发，诱导培养基中的胞外基质的含有浓度优选为低浓度。
使用诱导培养基b的胚胎内胚层细胞的培养例如包括下述步骤：在胚胎内胚层细胞粘附在培养容器的表面上的状态下进行培养。本说明书中，也将这种状态下的培养称为二维培养。一个实施方式中，通过使用诱导培养基b的胚胎内胚层细胞的二维培养而形成上述细胞的球状体，一部分球状体可悬浮于培养基中。一个实施方式中，通过使用诱导培养基b对低吸附性培养容器中的胚胎内胚层细胞进行静置培养而形成上述细胞的球状体，一部分球状体可悬浮于培养基中。悬浮于培养基中的球状体和附着于培养容器的球状体可以通过吹打等回收。使用诱导培养基b的胚胎内胚层细胞的培养例如可以在公知的细胞培养条件下实施3天～6天、3天～5天、或4天。
使用诱导培养基b1的胚胎内胚层细胞的培养包括在胞外基质存在下培养上述胚胎内胚层细胞的球状体的步骤。胞外基质存在下的上述球状体的培养例如包括使用含有胞外基质作为分散成分的诱导培养基b1培养上述球状体的步骤。上述培养例如可以通过使用低吸附性培养容器的静置培养或旋转悬浮培养来实施。通过作为分散成分的胞外基质存在下的上述球状体的培养，可形成后肠类器官。胞外基质存在下的上述球状体的培养例如包括将上述球状体接种在胞外基质凝胶上并进行培养的步骤。通过胞外基质凝胶上的上述球状体的培养，可形成后肠类器官。胞外基质存在下的上述球状体的培养例如包括在使上述球状体存在于胞外基质凝胶中的状态下进行培养的步骤。本说明书中，也将这种状态下的培养称为三维培养。通过胚胎内胚层细胞球状体的三维培养，可形成后肠类器官。胞外基质存在下的使用诱导培养基b1的胚胎内胚层细胞球状体的培养例如可以在公知的细胞培养条件下实施3天～6天、3天～5天、或4天。
一个实施方式中，步骤b1包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞使用诱导培养基b进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，形成含有上述胚胎内胚层细胞球状体的胞外基质凝胶，接着，在上述胞外基质凝胶中，将上述球状体使用诱导培养基b1进行培养而形成后肠类器官。一个实施方式中，步骤b1包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用诱导培养基b进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，接着，在胞外基质凝胶上，将上述球状体用诱导培养基b1进行培养而形成后肠类器官。一个实施方式中，步骤b1包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用诱导培养基b进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，接着，在作为分散成分的胞外基质存在下，将上述球状体用诱导培养基b1进行培养而形成后肠类器官。
一个实施方式中，为了形成胚胎内胚层细胞的球状体，步骤b1包括将胚胎内胚层细胞在作为诱导培养基b的STEMdiff APEL2培养基(200ng/mL FGF4、8μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II、抗生素-抗真菌素)中培养1～9天的步骤。在该球状体形成期间，在球状体悬浮最多的时期回收悬浮球状体并开始三维培养。从球状体悬浮最多的前一天起以100rpm开始振荡培养。次日，将悬浮的球状体回收到35mm培养皿中。接着，对于残留于回收悬浮球状体后的孔中的球状体通过吹打进行回收。回收的球状体置于冰上。将低生长因子基质胶(Matrigel Growth Factor Reduced)(Corning)用诱导培养基b1稀释(2.5～10mg/mL)，以50μL/孔加入到细胞培养插件24孔8.0μm孔径透明PET膜(Transparent PETMembrane 24well 8.0μm pore size)(corning)中，在37℃下孵育30分钟～60分钟而使其凝胶化。接着，向Matrigel溶液50μL中加入30～100个所回收的球状体并混合，全部添加到凝胶化的Matrigel上。在37℃、CO2 5％下孵育30分钟～60分钟而使其凝胶化，在细胞培养插件上加入200μL诱导培养基b1、在其下加入300μL诱导培养基b1，在37℃、CO2 5％下进行培养。关于培养基交换，在二维培养时优选每天进行、在三维培养时优选每两天进行。在后肠分化诱导时，优选对细胞共表达中肠/后肠标志物FOXA2、CDX2这一点进行确认。可以持续用诱导培养基b1培养，直至可以确认在后肠/泄殖腔区域中表达的P63表达为止。
步骤b2：后肠腹侧化
步骤b2包括下述步骤：将后肠类器官在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
“诱导培养基b2”含有基本培养基以及含有FGF、GSK3β抑制剂和骨形态发生蛋白的添加剂。诱导培养基b2例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。与诱导培养基b2相关的基本培养基可适宜地适用关于与诱导培养基A相关的基本培养基的说明。
诱导培养基b2可以含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF(优选为FGF4)。诱导培养基b2可以含有10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF7或者20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4。诱导培养基b2可以以显示出与用含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4的诱导培养基b2培养的类器官中的前方内胚层细胞标志物(例如肝脏谱系标志物ALB、胰腺谱系标志物PDX1、或肺/胃谱系标志物SOX2)的表达抑制同等程度的表达抑制的浓度含有FGF。该上下文中，使用诱导培养基b2培养的类器官可以为在本公开的步骤b1中由胚胎内胚层细胞分化诱导而成的后肠类器官。诱导培养基b2可以以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。一个实施方式中，诱导培养基b2可以以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。
诱导培养基b2可以含有1～50μM、3～25μM、5～10μM、0.5～16μM、3～12μM、或6～10μM的GSK3β抑制剂(优选为CHIR-99021)。诱导培养基b2可以含有2～2000ng/ml、100～1000ng/ml、或20～200ng/ml的WNT(优选为WNT3A)作为GSK3β抑制剂。诱导培养基b2可以以显示出与1～50μM、3～25μM、或5～10μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。诱导培养基b2含有WNT(优选为WNT3A)作为GSK3β抑制剂时，诱导培养基b2可以以显示出与1～50μM、3～25μM、或5～10μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有WNT(优选为WNT3A)。
本说明书中的术语“骨形成蛋白(BMP)”是属于转化生长因子β超家族的蛋白质，是指诱导异位骨形成的蛋白质。BMP是为了诱导腹侧后肠类器官而在诱导培养基B(例如诱导培养基b2和b3)中添加的。BMP例如可以为BMP2、BMP4、或BMP7、或这些的组合。BMP优选为BMP4。诱导培养基b2可以含有3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP(例如BMP4)。
诱导培养基b2可以以显示出与3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。“碱性磷酸酶产生诱导作用”例如可以基于规定量的BMP存在下的、软骨形成细胞中的碱性磷酸酶的产生量来测定。软骨形成细胞例如可以使用小鼠软骨形成细胞。碱性磷酸酶的产生量可以按照公知方法(例如Biochemical and Biophysical Research Communications、Volume315、Issue2、Pages272-280中记载的方法)来测定。
诱导培养基b2可以以显示出与用含有3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4的诱导培养基b2培养的细胞或类器官中的腹侧后肠标志物(例如GATA3、P63、或HOXA13)的表达同等程度的表达的浓度含有BMP。该上下文中，使用诱导培养基b2培养的细胞可以为本公开的步骤b1中由胚胎内胚层细胞分化诱导而成的后肠类器官。上述腹侧后肠标志物的表达例如可以按照免疫染色法来测定。免疫染色法中，腹侧后肠标志物的表达可以使用本公开中关于各标志物而示出的抗体进行测定。本说明书中，术语“同等程度的表达”是指：与成为对照的表达量相比在±30％以内、±20％以内、或±10％以内的表达。一个实施方式中，同等程度的表达为与成为对照的表达量相比在±30％以内的表达。
一个实施方式中，诱导培养基b2以显示出与3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。
关于从诱导培养基b、诱导培养基b1和诱导培养基b2除去BMP后的培养基，它们的组成和/或用量可以相同也可以不同。一个实施方式中，关于从诱导培养基b、诱导培养基b1和诱导培养基b2除去BMP后的培养基，它们的组成和/或用量相同。
胞外基质存在下的使用诱导培养基b2的后肠类器官的培养可以适宜地适用上述的针对胞外基质存在下的使用诱导培养基b1的胚胎内胚层细胞球状体的培养的说明。胞外基质存在下的使用诱导培养基b2的后肠类器官的培养例如可以在公知的细胞培养条件下实施。公知的细胞培养条件可以为在37℃、5％CO2下进行维持。进行培养的温度不限于37℃，可以适宜使用细胞培养领域中公知的温度。CO2浓度不限于5％，可以适宜使用细胞培养领域中公知的CO2浓度。后肠类器官的培养可以实施3天～6天、3天～5天、或4天。
步骤b1与步骤b2的胞外基质的状态(凝胶状态或分散成分的状态)可以相同也可以不同。一个实施方式中，步骤b1与步骤b2的胞外基质的状态相同。一个实施方式中，含有后肠类器官的胞外基质凝胶可以为步骤b1中形成的胞外基质凝胶，或者可以为在步骤b1之后从胞外基质凝胶回收后肠类器官、以含有回收的上述后肠类器官的方式新形成的胞外基质凝胶。从操作简洁的观点出发，步骤b2中的含有后肠类器官的胞外基质凝胶为步骤b1中形成的胞外基质凝胶。
一个实施方式中，步骤b2包括下述步骤：将胞外基质凝胶中的后肠类器官用诱导培养基b2进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤b2包括下述步骤：在胞外基质凝胶上，将后肠类器官用诱导培养基b2进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤b2包括下述步骤：在作为分散成分的胞外基质存在下，将后肠类器官用诱导培养基b2进行培养而形成腹侧后肠类器官。
一个实施方式中，为了对后肠进行腹侧化，使用诱导培养基b2的后肠类器官的培养包括将胞外基质凝胶中的后肠类器官用作为诱导培养基b2的STEMdiff APEL2培养基(30ng/mL BMP4、200ng/mL FGF4、8μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％PFHM-II、抗生素-抗真菌素)或STEMdiff APEL2培养基(30ng/mL BMP4、100ng/mL FGF7、200ng/mL FGF4、8μMCHIR99021、1μg/mL肝素、2％PFHM-II、抗生素-抗真菌素)培养3～6天的步骤。向细胞培养插件凝胶上加入200μL诱导培养基b2，向其下加入300μL诱导培养基b2，每2天进行培养基交换。优选持续进行腹侧化，直至细胞中背侧后肠标志物SOX2、CDX2的表达减少且强烈表达腹侧后肠/泄殖腔标志物P63。在后方化和腹侧化不充分的情况下，会混入中肠和背侧肠管谱系的细胞。这种情况下，可延长后肠诱导期间或后肠腹侧化期间。
步骤b3：腹侧后肠类器官形成
步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子、CSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用上述诱导培养基B进行培养而形成胚胎内胚层细胞的球状体，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基b3进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，用于形成胚胎内胚层细胞球状体的诱导培养基B的组成和/或用量可以与上述诱导培养基b3相同。该上下文中，步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
本公开的一个实施方式的腹侧后肠类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及步骤b3：将上述胚胎内胚层细胞用可含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官。
“诱导培养基b3”含有基本培养基以及含有FGF、GSK3β抑制剂和骨形态发生蛋白的添加剂。诱导培养基b3例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。与诱导培养基b3相关的基本培养基可适宜地适用关于与诱导培养基A相关的基本培养基的说明。
诱导培养基b3可以含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF(优选为FGF4)。诱导培养基b3可以含有10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF7或者20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4。诱导培养基b3可以含有0.5～25μM、1～15μM、2～8μM、0.1～10μM、0.5～9μM、1～8μM、2～6μM、或3～5μM的GSK3β抑制剂(优选为CHIR-99021)。诱导培养基b3可以含有0.1～100ng/mL、0.5～80ng/mL、1～60ng/mL、2～40ng/mL、或5～20ng/mL的骨形态发生蛋白(优选为BMP4)。
诱导培养基b3可以以显示出与用含有20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4的诱导培养基b3培养的细胞或类器官中的前方内胚层细胞标志物(例如肝脏谱系标志物ALB、胰腺谱系标志物PDX1、或肺/胃谱系标志物SOX2)的表达抑制同等程度的表达抑制的浓度含有FGF。该上下文中，使用诱导培养基b3培养的细胞可以为本公开的步骤A中由多能干细胞分化诱导而成的胚胎内胚层细胞。该上下文中，使用诱导培养基b3培养的类器官可以为本公开的步骤b1中由上述胚胎内胚层细胞分化诱导而成的后肠类器官。诱导培养基b3可以以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。一个实施方式中，诱导培养基b3以显示出与20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF。
诱导培养基b3中，作为GSK3β抑制剂，可以含有1～1000ng/mL、50～500ng/mL、10～100ng/mL的WNT(优选为WNT3A)。诱导培养基b3可以以显示出与0.5～25μM、1～15μM、或2～8μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有GSK3β抑制剂。诱导培养基b3含有WNT(优选为WNT3A)作为GSK3β抑制剂时，诱导培养基b3可以以显示出与0.5～25μM、1～15μM、或2～8μM的CHIR-99021所显示的GSK3β抑制作用同等程度的作用的浓度含有WNT(优选为WNT3A)。
诱导培养基b3可以以显示出与0.1～100ng/mL、0.5～80ng/mL、1～60ng/mL、2～40ng/mL、或5～20ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。诱导培养基b3可以以显示出与用含有0.1～100ng/mL、0.5～80ng/mL、1～60ng/mL、2～40ng/mL、或5～20ng/mL的BMP4的诱导培养基b3培养的细胞或类器官中的腹侧后肠标志物(例如GATA3、P63、或HOXA13)的表达同等程度的表达的浓度含有BMP。一个实施方式中，诱导培养基b3以显示出与0.1～100ng/mL、0.5～80ng/mL、1～60ng/mL、2～40ng/mL、或5～20ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。
一个实施方式中，步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用诱导培养基B(优选为诱导培养基b3)进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，形成含有上述胚胎内胚层细胞球状体的胞外基质凝胶，接着，在上述胞外基质凝胶中，将上述球状体用诱导培养基b3进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用诱导培养基B(优选为诱导培养基b3)进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，接着，在胞外基质凝胶上，将上述球状体用诱导培养基b3进行培养而形成腹侧后肠类器官。一个实施方式中，步骤b3包括下述步骤：将胚胎内胚层细胞用诱导培养基B(优选为诱导培养基b3)进行培养而形成胚胎内胚层细胞球状体，接着，在作为分散成分的胞外基质存在下，将上述球状体用诱导培养基b3进行培养而形成腹侧后肠类器官。
一个实施方式中，为了形成胚胎内胚层细胞的球状体，步骤b3包括将胚胎内胚层细胞用作为诱导培养基b3的STEMdiff APEL2培养基(10～30ng/mL BMP4、200ng/mL FGF4、4μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II、抗生素-抗真菌素)培养8～11天的步骤。在该球状体形成期间，在球状体悬浮最多的时期回收悬浮球状体并开始三维培养。从球状体悬浮最多的前一天起以100rpm开始振荡培养。次日，将悬浮的球状体回收到35mm培养皿中。接着，通过吹打向残留于回收悬浮球状体后的孔中的球状体喷吹培养基而使球状体悬浮，并将其回收。回收的球状体置于冰上。将低生长因子基质胶(Corning)用诱导培养基b3稀释(25～100％浓度)，以50μL/孔加入到细胞培养插件24孔8.0μm孔径透明PET膜(corning)中，在37℃下孵育30分钟～60分钟而使其凝胶化。接着，向Matrigel溶液50μL中加入30～100个所回收的球状体并混合，全部添加到凝胶化的Matrigel上。在37℃、CO2 5％下孵育30分钟～60分钟而使其凝胶化，在细胞培养插件上加入200μL诱导培养基b3、在其下加入300μL诱导培养基b3，在37℃、CO2 5％下进行培养。关于培养基交换，在二维培养时优选每天进行、在三维培养时优选每两天进行。在腹侧后肠分化诱导时，对细胞持续进行诱导培养基b3中的培养，直至背侧中肠/后肠标志物CDX2、SOX2和T中的任意一者的表达均减少或不表达、且表达腹侧后肠/泄殖腔标志物GATA3和P63为止。所得到的腹侧后肠类器官带有圆形，具有管腔结构。在后方化和腹侧化不充分的类器官中，可观察到中肠和背侧肠管谱系的细胞。这种情况下，可延长诱导培养基b3中的培养或提高诱导培养基b3中的BMP4的浓度。
胚胎内胚层细胞的分化诱导(步骤A)和腹侧后肠类器官的形成(步骤B)各步骤中的各术语的说明和包括培养条件的实施方式的说明可适宜地适用于这些步骤中记载的对应的各术语和实施方式。
[膀胱类器官或其制造方法]
本公开的一个方式提供膀胱类器官的制造方法。本公开的另一个方式提供膀胱类器官。
本说明书中的术语“膀胱类器官”是指具有至少2个细胞层的类器官。上述至少2个细胞层包括：含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；以及相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层。一个实施方式的膀胱类器官包含：含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；以及相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第三细胞层。在表述上，上述膀胱类器官例如可以确定为包含：沿着其最外周局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在内侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在内侧方向局部存在的、含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第三细胞层。对于如此确定的各细胞层，本说明书中也将上述第一细胞层称为基底细胞层(basal-cell layer)、将上述第二细胞层称为中间细胞层(intermediate-cell layer)、并且将上述第三细胞层称为表面细胞层(superficial-cell layer)。
膀胱类器官例如可以通过本公开的膀胱类器官的制造方法来制造。上述膀胱类器官的制造方法中，在形成腹侧后肠类器官、接着通过体外培养由上述腹侧后肠类器官形成膀胱类器官时，本说明书中有时将该膀胱类器官称为“膀胱样类器官”。膀胱类器官的长径可以为80μm以上、100μm以上、120μm以上、150μm以上、或200μm以上。膀胱类器官例如可以用于评价对受试物质的药物应答性。膀胱类器官例如可以作为本公开的再生医疗用组合物的有效成分使用。
一个实施方式的膀胱类器官不具有内腔结构，且包含：含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第三细胞层。一个实施方式中，上述膀胱类器官包含相对于上述第三细胞层在外侧方向局部存在的、含有间质样细胞的第四细胞层。一个实施方式中，上述膀胱类器官还包含相对于上述第四细胞层在外侧方向局部存在的、含有平滑肌细胞的第五细胞层。
一个实施方式的膀胱类器官具有内腔，且包含：面向上述内腔的、含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；以及相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层。上述第一细胞层包围上述内腔、或面向上述内腔而存在。一个实施方式的膀胱类器官具有内腔，且包含：面向上述内腔的、含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；相对于上述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层；以及相对于上述第二细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第三细胞层。上述第一细胞层包围上述内腔、或面向上述内腔而存在。一个实施方式中，上述膀胱类器官包含相对于上述第三细胞层在外侧方向局部存在的、含有间质样细胞的第四细胞层。一个实施方式中，上述膀胱类器官还包含相对于上述第四细胞层在外侧方向局部存在的、含有平滑肌细胞的第五细胞层。
膀胱类器官例如还具有如下特征：表达选自由ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种(例如1种、2种、或3种以上)腹侧后肠标志物；表达选自由Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8、ECAD和UPK1B组成的组中的至少1种(例如1种、2种、3种、4种、5种或6种以上)标志物；并且实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种(例如1种、2种或3种，优选为3种)。一个实施方式的膀胱类器官还表达ΔNP63和GATA3中的任意一者或两者。上述膀胱类器官表达选自由Smad1/5/8、FOXA2、ECAD和UPK1B组成的组中的至少1种(例如1种、2种、或3种以上)标志物。上述膀胱类器官实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2和CDX2中的任意一者。
本说明书中的术语“尿溶蛋白2(UPK2)”是指：参与与尿溶蛋白Ia、Ib、III一起形成尿路系统上皮的移行上皮的被覆细胞的形成、具有提高被覆细胞的透过性、屏障功能的作用的分子量约15kDa的膜糖蛋白。UPK2可以作为膀胱上皮标志物来利用。细胞或类器官中表达的UPK2例如可以通过免疫染色法使用抗UPK2抗体(例如小鼠抗尿溶蛋白II(BIOCAREMEDICAL、#ACR3051C)进行检测或测定。
与膀胱类器官相关的术语“P63”可以作为膀胱上皮标志物来利用。细胞或类器官中表达的P63例如可以通过免疫染色法使用抗P63抗体(例如兔抗P63(abcam、#ab124762)进行检测或测定。
本说明书中的术语“角蛋白5(KRT5)”是指：与角蛋白14二聚体化而形成构成基底上皮细胞的细胞骨架的中间丝的、由KRT5基因编码的蛋白质。KRT5可以作为膀胱上皮标志物来利用。细胞或类器官中表达的KRT5例如可以通过免疫染色法使用抗KRT5抗体(例如鸡抗角蛋白5(BioLegend、#905903)进行检测或测定。
本说明书中的术语“细胞层”是指：主要存在特定细胞类型的细胞群的重叠物。细胞层例如可以为：特定1种细胞类型存在70％以上、75％、80％、85％、或90％以上的细胞群的重叠物。一个例子中，第一、第二、或第三细胞层可以为：能够与其它细胞群区分开的、主要存在特定1种细胞类型的1个细胞群的区域。
一个例子中，细胞层含有70％以上、75％以上、80％以上、优选85％以上、更优选90％以上的实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞。一个例子中，细胞层本质上由实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成。一个例子中，含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层具有袋状结构，具有内腔。上述例子中，上述内腔被上述细胞层包围。上述例子中，上述细胞层面向上述内腔。一个例子中，含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层面向内腔，相对于后述的含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层在内侧方向重叠。
一个例子中，细胞层含有70％以上、75％以上、80％以上、优选85％以上、更优选90％以上的共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞。一个例子中，细胞层本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成。一个例子中，含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层具有袋状结构。一个例子中，上述细胞层相对于含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层在外侧方向重叠。上述例子中，共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞相对于含有表达UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层在外侧方向局部存在。一个例子中，含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层存在于含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层、与后述的含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层之间。
一个例子中，细胞层含有70％以上、75％以上、80％以上、优选85％以上、更优选90％以上的共表达P63和KRT5的细胞。一个例子中，细胞层本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成。一个例子中，含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层具有袋状结构。一个例子中，上述细胞层相对于含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层在外侧方向重叠。上述例子中，共表达P63和KRT5的细胞相对于含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层在外侧方向局部存在。一个例子中，含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层存在于含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的细胞层或本质上由共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞构成的细胞层、与后述的含有间质样细胞的细胞层或本质上由间质样细胞构成的细胞层之间。
一个例子中，细胞层含有70％以上、75％以上、80％以上、优选85％以上、更优选90％以上的间质样细胞。一个例子中，细胞层本质上由间质样细胞构成。一个例子中，含有间质样细胞的细胞层或本质上由间质样细胞构成的细胞层具有袋状结构。一个例子中，上述细胞层相对于含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层在外侧方向重叠。上述例子中，间质样细胞相对于含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层在外侧方向局部存在。一个例子中，含有间质样细胞的细胞层或本质上由间质样细胞构成的细胞层存在于含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层或本质上由共表达P63和KRT5的细胞构成的细胞层、与后述的含有平滑肌细胞的细胞层或本质上由平滑肌细胞构成的细胞层之间。
一个例子中，细胞层含有70％以上、75％以上、80％以上、优选85％以上、更优选90％以上的平滑肌细胞。一个例子中，细胞层本质上由平滑肌细胞构成。一个例子中，含有平滑肌细胞的细胞层或本质上由平滑肌细胞构成的细胞层具有袋状结构。一个例子中，上述细胞层相对于含有间质样细胞的细胞层或本质上由间质样细胞构成的细胞层在外侧方向重叠。上述例子中，平滑肌细胞相对于含有间质样细胞的细胞层或本质上由间质样细胞构成的细胞层在外侧方向局部存在。
本说明书中，术语“间质样细胞”是指构成上皮细胞的支撑组织的细胞。间质样细胞例如包括成纤维细胞。一个实施方式中，含有间质样细胞的细胞层含有表达波形蛋白(VIM)的细胞作为主要细胞。一个实施方式中，含有间质样细胞的细胞层为在膀胱类器官中局部存在于含有共表达P63和KRT5的细胞的细胞层与含有表达αSMA的平滑肌细胞的细胞层之间的细胞层，上述细胞层中主要含有的细胞表达VIM。
本说明书中，术语“VIM”是指间充质细胞所特有的中间丝。VIM可以作为间充质干细胞标志物来利用。细胞或类器官中表达的VIM例如可以通过免疫染色法使用抗VIM抗体(例如鸡抗波形蛋白(NOVUS、#NB300-223))进行检测或测定。
本说明书中，术语“平滑肌细胞”是细长的纺锤形的单核细胞，是指在细胞内存在大量肌动蛋白纤丝和少量肌球蛋白纤丝的细胞。一个实施方式中，含有平滑肌细胞的细胞层含有表达αSMA的细胞作为主要细胞。一个实施方式中，含有平滑肌细胞的细胞层含有共表达αSMA和VIM的细胞作为主要细胞。
本说明书中，术语“α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)”也被称为ACTA2，是指属于肌动蛋白家族的蛋白质。αSMA可以作为平滑肌细胞标志物来利用。细胞或类器官中表达的αSMA例如可以通过免疫染色法使用抗αSMA抗体(兔抗αSMA(Cellsignaling、#19245T))进行检测或测定。
膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导胚胎内胚层细胞；步骤B：将上述胚胎内胚层细胞用诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用上述诱导培养基B进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c1：在胞外基质存在下用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养；步骤c2：导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位；或者步骤c3：在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。
步骤c1：膀胱上皮的分化诱导(体外培养)
步骤c1包括下述步骤：在胞外基质存在下，将腹侧后肠类器官用诱导培养基C进行培养。
“诱导培养基C”含有基本培养基以及含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的添加剂。诱导培养基C例如可以通过向基本培养基(液体)中添加上述添加剂(固体或液体)而制备。添加到诱导培养基C中的上述添加剂的浓度可以考虑提供培养中使用的细胞的动物种由本领域技术人员适宜地设定。与诱导培养基C相关的基本培养基可适宜地适用关于与诱导培养基A相关的基本培养基的说明。诱导培养基C可以还含有肝素、无蛋白质培养基(例如PFHM-II)、抗生素(例如青霉素/链霉素、庆大霉素)、或抗生素-抗真菌剂混合液(例如抗生素-抗真菌素)、或这些的组合。
诱导培养基C可以含有10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF(优选为FGF7)。诱导培养基C可以含有10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF7或者20～1000ng/mL、60～500ng/mL、或100～300ng/mL的FGF4。诱导培养基C可以以显示出与10～500ng/mL、30～250ng/mL、或50～150ng/mL的FGF7所显示的成纤维细胞增殖作用同等程度的作用的浓度含有FGF，
诱导培养基C可以含有3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的骨形成蛋白(优选为BMP4)。诱导培养基C可以以显示出与3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。诱导培养基C可以以显示出与用含有3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4的诱导培养基C培养的类器官中的腹侧后肠标志物(例如GATA3、P63、或HOXA13)的表达同等程度的表达的浓度含有BMP。该上下文中，用诱导培养基C进行培养的类器官可以为本公开的步骤b2或b3中形成的膀胱类器官。上述腹侧后肠标志物的表达例如可以按照免疫染色法来测定。免疫染色法中，腹侧后肠标志物的表达可以使用本公开中关于各标志物而示出的抗体来测定。一个实施方式中，诱导培养基C以显示出与3～150ng/mL、9～75ng/mL、或15～45ng/mL的BMP4所显示的碱性磷酸酶产生诱导作用同等程度的作用的浓度含有BMP。
诱导培养基C可以含有0～1μM、10nM～500nM、30nM～300nM、或50nM～150nM的视黄酸(优选为全反式视黄酸)。
胞外基质存在下的使用诱导培养基C的腹侧后肠类器官的培养可以适宜地适用上述的针对胞外基质存在下的使用诱导培养基b1的胚胎内胚层细胞球状体的培养的说明。胞外基质存在下的使用诱导培养基C的腹侧后肠类器官的培养例如可以在公知的细胞培养条件下实施。公知的细胞培养条件可以为在37℃、5％CO2下进行维持。进行培养的温度不限于37℃，可以适宜使用细胞培养领域中公知的温度。CO2浓度不限于5％，可以适宜使用细胞培养领域中公知的CO2浓度。腹侧后肠类器官的培养可以实施5天～30天、5天～25天、5～20天、5～15天、或5～10天。
步骤c1的胞外基质的状态(凝胶状态或分散成分的状态)与步骤b1和步骤b2各自可以相同也可以不同。一个实施方式中，步骤c1的细胞基质的状态与步骤b1和步骤b2各自中的胞外基质的状态相同。一个实施方式中，含有腹侧后肠类器官的胞外基质凝胶可以为步骤b1和步骤b2中形成的胞外基质凝胶，或者可以为在步骤b2之后从胞外基质凝胶中回收腹侧后肠类器官、以含有回收的上述腹侧后肠类器官的方式新形成的胞外基质凝胶。从操作简洁的观点出发，步骤c1中的含有腹侧后肠类器官的胞外基质凝胶为步骤b1和步骤b2中形成的胞外基质凝胶。
一个实施方式中，步骤c1包括下述步骤：将胞外基质凝胶中的腹侧后肠类器官用诱导培养基C进行培养而形成膀胱类器官。一个实施方式中，步骤c1包括下述步骤：在胞外基质凝胶上，将腹侧后肠类器官用诱导培养基C进行培养而形成膀胱类器官。一个实施方式中，步骤c1包括下述步骤：在作为分散成分的胞外基质存在下，将腹侧后肠类器官用诱导培养基C进行培养而形成膀胱类器官。
一个实施方式中，为了分化诱导膀胱上皮，使用诱导培养基C的腹侧后肠类器官的培养包括将腹侧后肠类器官用作为诱导培养基C的STEMdiff APEL2培养基(10或30ng/mLBMP4、0.1～1μM全反式视黄酸、100ng/mL FGF7或FGF9、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II、抗生素-抗真菌素)培养6天以上的步骤。向细胞培养插件凝胶上加入200～400μL诱导培养基C、向其下加入300～600μL诱导培养基C，每2天进行培养基交换。优选持续进行培养，直至可以确认膀胱上皮标志物UPK2、P63和KRT5的表达为止。接着，为了使膀胱上皮细胞成熟，向诱导培养基C中添加PPARγ激动剂(0.1～10μM罗格列酮)并进行培养。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b1：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)用上述诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官；以及步骤b2：在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)，将上述后肠类器官用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c1：在胞外基质存在下，将上述腹侧后肠类器官用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b3：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质(优选作为分散成分的胞外基质)存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c1：在胞外基质存在下，将上述腹侧后肠类器官用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养。
步骤c2：向哺乳动物的肾脏或膀胱或者其周边部位的导入
步骤c2包括下述步骤：将腹侧后肠类器官导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位而形成膀胱类器官。一个实施方式中，步骤c2包括下述步骤：将腹侧后肠类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位而形成膀胱类器官。在腹侧后肠类器官存在于胞外基质凝胶中的情况下，步骤c2可以还包括下述步骤：在导入到人或非人哺乳动物之前，从上述胞外基质凝胶中取出上述腹侧后肠类器官。
本说明书中的术语“非人哺乳动物”例如为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类；黑猩猩等非人灵长类；牛、山羊、绵羊等偶蹄目；马等奇蹄目；兔、狗、猫等观赏动物。一个实施方式中，非人哺乳动物为啮齿类或非人灵长类。
本说明书中的术语“肾脏”是指进行来自血液的废物或多余的水分的过滤和排出、生成尿液的泌尿系统的器官。本说明书中，肾脏可以为观察不到特定损伤或疾病的正常肾脏，也可以为已受到损伤的肾脏、或已罹患肾脏疾病的肾脏。一个实施方式中，肾脏为正常肾脏。一个实施方式中，肾脏已受到损伤的肾脏或已罹患肾脏疾病的肾脏。
本说明书中的术语“膀胱”是指暂时蓄积从肾脏输送来的尿液的袋状器官。本说明书中，膀胱可以为观察不到特定损伤或疾病的正常膀胱，也可以为已受到损伤的膀胱、或已罹患膀胱疾病的膀胱。一个实施方式中，膀胱为正常膀胱。一个实施方式中，膀胱为已受到损伤的膀胱或已罹患膀胱疾病的膀胱。
肾脏或膀胱的“周边部位”是指与泌尿系统相接触的或附近的组织或区域。泌尿系统包括肾脏、输尿管、膀胱和尿道。肾脏或膀胱的周边部位例如可以为腹腔内或肠系膜。
腹侧后肠类器官向肾脏或膀胱或者它们的周边部位的“导入”是指：用于将腹侧后肠类器官配置到肾脏内或膀胱内或它们的周边部位的操作。腹侧后肠类器官向肾脏或膀胱或者它们的周边部位的导入例如包括：将胞外基质凝胶中的腹侧后肠类器官通过外科手术移植到肾脏或膀胱或者它们的周边部位。腹侧后肠类器官向肾脏或膀胱或者它们的周边部位的导入例如包括：将溶液中的腹侧后肠类器官用注射器等器具注入到肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
腹侧后肠类器官例如既可以由来自与要在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位进行导入的人或非人哺乳动物不同的动物种的多能干细胞制造，也可以由来自同一动物种或同一个体的多能干细胞制造。一个实施方式中，制造膀胱类器官的方法包括下述步骤：将由人ES细胞或人iPS细胞制造的腹侧后肠类器官导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
一个实施方式中，腹侧后肠类器官向肾脏的导入包括下述步骤：将腹侧后肠球状体移植到NOD SCID小鼠的肾被膜下。通过将移植后的上述小鼠饲养4周而将移植的腹侧后肠类器官进行4周体内培养。通过上述体内培养，可形成具有袋状结构的膀胱类器官。一个实施方式中，体内培养可以实施1周～6周、2周～5周、或3周～5周。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b1：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)用上述诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官；以及步骤b2：在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)，将上述后肠类器官用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c2：导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b3：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质(优选作为分散成分的胞外基质)存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c2：导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
步骤c3：间充质干细胞或间充质细胞存在下的共培养
步骤c3包括下述步骤：将腹侧后肠类器官在间充质干细胞或间充质细胞存在下培养而形成膀胱类器官。在腹侧后肠类器官存在于胞外基质凝胶中的情况下，步骤c3可以还包括在共培养前从上述胞外基质凝胶中取出上述腹侧后肠类器官的步骤。
本说明书中，术语“间充质细胞”是指来自多细胞动物的胎儿期的间充质的细胞。间充质细胞例如具有分化为支撑组织、结缔组织、骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。一个实施方式中，间充质细胞为膀胱间充质细胞。膀胱间充质细胞例如可以由非人哺乳动物按照公知的方法或本说明书的实施例中记载的方法来制备。由非人哺乳动物制备的间充质细胞例如含有胚胎成纤维细胞。一个实施方式中，胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。间充质细胞例如可以通过由ES细胞或iPS细胞按照公知的方法进行分化诱导来制备。间充质细胞例如可商购。
本说明书中，术语“间充质干细胞”是指具有自复制能力、并且具有能够分化为构成结缔组织、骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等非上皮系间充质的细胞的能力的细胞。间充质干细胞例如可以通过由ES细胞或iPS细胞按照公知的方法进行分化诱导而制备。间充质干细胞例如可商购。间充质干细胞例如可以从生物体中按照公知的方法回收。已知间充质干细胞在生物体中存在于例如牙髓或骨髓液中。
一个实施方式中，步骤c3包括下述步骤：将腹侧后肠类器官在间充质干细胞或间充质细胞存在下用培养基进行培养而形成膀胱类器官。步骤c3中使用的上述培养基例如可以为基本培养基，也可以含有本公开中记载的添加剂。一个实施方式中，上述培养基的特征在于，未添加胞外基质。一个实施方式中，上述培养基为STEMdiff APEL2培养基(STEMCELLTecnologies)(添加了2％ PFHM-II和抗生素-抗真菌素)或STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Tecnologies)(添加了2％PFHM-II、2％FBS和抗生素-抗真菌素)。
一个实施方式中，步骤c3包括下述步骤：将腹侧后肠类器官在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行静置培养，接着，对上述腹侧后肠类器官和间充质干细胞或间充质细胞进行旋转悬浮培养而形成膀胱类器官。旋转悬浮培养例如可以通过三维旋转悬浮培养装置CellPet3D-iP(ジェイテックコーポレーション)来实施。旋转悬浮培养中的旋转速度可以由本领域技术人员以细胞块不会因重力而下降、与培养容器接触的方式适宜设定。上述旋转速度例如可以为1～50rpm、1～30rpm、1～15rpm、1～10、2～50rpm、2～30rpm、2～15rpm、2～10、3～50rpm、3～30rpm、3～15rpm或3～10rpm。
一个实施方式中，步骤c3中，将腹侧后肠类器官或膀胱类器官与E12.5小鼠膀胱间充质细胞一起旋转悬浮培养2周以上，形成呈袋状结构的含有膀胱上皮细胞、间质样细胞和平滑肌细胞的膀胱类器官。步骤c3中的培养例如可以实施1周～6周、2周～5周、或3周～5周。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b1：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)用上述诱导培养基B(诱导培养基b1)进行培养而形成后肠类器官；以及步骤b2：将上述后肠类器官在胞外基质存在下(优选胞外基质凝胶中)用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b2)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c3：在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。
一个实施方式中，膀胱类器官可以通过包括下述步骤的方法来制造：步骤A：将多能干细胞用诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；步骤b3：将上述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且可以还含有骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b)进行培养，接着，在胞外基质(优选作为分散成分的胞外基质)存在下用含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白的诱导培养基B(诱导培养基b3)进行培养而形成腹侧后肠类器官；以及步骤c3：在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。
胚胎内胚层细胞的分化诱导(步骤A)、腹侧后肠类器官的形成(步骤B)和膀胱类器官的形成(步骤C)各步骤中的各术语的说明和包括培养条件的实施方式的说明可适宜地适用于这些步骤中记载的对应的各术语和实施方式。
[具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物或其制造方法]
本公开的一个方式提供在肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物的制造方法。本公开的另一个方式提供在肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物。
在肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官的非人哺乳动物可以通过包括将本公开的腹侧后肠类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位的步骤的方法来制造。在肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有膀胱类器官的非人哺乳动物可以通过包括具有下述步骤的方法来制造：将本公开的腹侧后肠类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位；以及饲养导入了本公开的腹侧后肠类器官的上述非人哺乳动物。非人哺乳动物的饲养例如包括向非人哺乳动物提供公知的饲料的步骤。
一例中，通过将肿瘤细胞或肿瘤片导入到本公开的腹侧后肠类器官后、将含有肿瘤细胞或肿瘤片的腹侧后肠类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位，可以制造作为肾癌模型或膀胱癌模型的在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有膀胱类器官的非人哺乳动物。作为肾癌模型或膀胱癌模型的在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有膀胱类器官的非人哺乳动物可以用于包括下述步骤的、评价肾癌或膀胱癌的治疗药候选物质的效果的方法：使上述非人哺乳动物与肾癌治疗药候选物质接触；以及评价上述治疗药候选物质的效果。
[评价对受试物质的药物应答性的方法]
评价对受试物质的药物应答性的方法包括下述步骤：使本公开的腹侧后肠类器官、膀胱类器官、或具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物与受试物质接触；以及测定上述腹侧后肠类器官、膀胱类器官、或上述非人哺乳动物对上述受试物质的药物应答性。
本说明书中的术语“受试物质”例如可以为低分子化合物、蛋白质(例如抗体)、DNA、RNA、低分子干扰RNA、或反义寡核苷酸。受试物质例如可以为：用于治疗肾脏或膀胱的障碍或疾病或者肾癌或膀胱癌的药物、或它们的候选物质。受试物质例如可以为1种，或者可以2种以上的混合物。受试物质优选为1种物质。
使腹侧后肠类器官、膀胱类器官或非人哺乳动物与受试物质“接触”是指：腹侧后肠类器官、膀胱类器官或非人哺乳动物与受试物质处于能够相接触的状况下。使腹侧后肠类器官或膀胱类器官与受试物质接触例如可以为向含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的培养液中混合受试物质。使在肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的非人哺乳动物与受试物质接触例如可以为向上述非人哺乳动物经口给予或非经口给予受试物质。
药物应答性例如包括受试物质所引起的腹侧后肠类器官的结构上或功能上的变化。药物应答性例如包括由腹侧后肠类器官引起的受试物质的浓度变化。
[再生医疗用组合物或其制造方法]
本公开的一个方式提供用于处置膀胱损伤或膀胱疾病的再生医疗用组合物。
本说明书中的术语“再生医疗用组合物”含有本公开的腹侧后肠类器官或膀胱类器官。本公开的再生医疗用组合物可以用于处置哺乳动物的膀胱损伤或膀胱疾病。再生医疗用组合物例如可以适宜地含有医药上可接受的载体。本说明书中的术语“医药上可接受的载体”是指在哺乳动物中安全性高、变应性小的本公开的腹侧后肠类器官或膀胱类器官以外的任意成分。医药上可接受的载体例如包括适合于给药的水性或非水性溶剂、溶液(例如生理盐水、基本培养基或细胞悬浮保存液)、冷冻防止剂(例如甘油)、水溶性高分子(例如葡聚糖)、或缓冲剂(例如磷酸缓冲液)。再生医疗用组合物可以按照公知的方法适宜地制造。一例中，本公开的再生医疗用组合物可以通过将本公开的腹侧后肠类器官或膀胱类器官与医药上可接受的载体(例如基本培养基)配合而制造。
再生医疗用组合物例如可通过利用外科方法移植到膀胱的规定部位或使用注射器等器具注入到膀胱的规定部位而给药于有此需要的哺乳动物。从减轻移植片排斥反应的观点出发，优选要被给予再生医疗用组合物的哺乳动物与用于制造腹侧后肠类器官或膀胱类器官的多能干细胞的动物种相同，进一步优选为同一个体。
与再生医疗用组合物相关的术语“哺乳动物”例如为人、人以外的哺乳动物。人以外的哺乳动物例如可以为：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类；黑猩猩等非人灵长类；牛、山羊、绵羊等偶蹄目；马等奇蹄目；兔、狗、猫等观赏动物。一个实施方式中，哺乳动物为人。
本说明书中的术语“膀胱损伤”或“膀胱疾病”例如可以为因外伤而受到损伤的膀胱、放射线性膀胱炎、因糖尿病或缺血等而受到损伤的膀胱、因对膀胱组织有害的药物而受到损伤的膀胱、膀胱炎、或膀胱癌。
本公开的再生医疗用组合物可以用于处置哺乳动物的膀胱的损伤或疾病的方法中。一个实施方式提供处置膀胱的损伤或疾病的方法，其包括下述步骤：将本公开的含有腹侧后肠类器官或膀胱类器官的再生医疗用组合物给药于有此需要的哺乳动物。
[治疗膀胱的损伤或疾病的方法]
本公开的一个方式提供治疗哺乳动物的膀胱的损伤或疾病的方法。治疗哺乳动物的膀胱的损伤或疾病的方法包括下述步骤：将本公开的腹侧后肠类器官、膀胱类器官、或再生医疗用组合物导入到有此需要的哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。一个实施方式中，治疗哺乳动物的膀胱的损伤或疾病的方法包括下述步骤：将本公开的再生医疗用组合物导入到有此需要的哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
本说明书中的术语“有此需要的哺乳动物”是指具有或疑似具有膀胱的损伤或疾病的哺乳动物。具有膀胱的损伤或疾病的哺乳动物是指：已被医疗从业者(例如医生)按照规定的诊断基准诊断为具有膀胱的损伤或疾病的哺乳动物。疑似具有膀胱的损伤或疾病的哺乳动物例如可以为：基于上述哺乳动物的行为历史(例如外伤、放射线治疗和接受过或正在接受对膀胱组织有害的药物)或病历(例如患有或曾经患有糖尿病、缺血、膀胱炎、或膀胱癌)而怀疑具有膀胱的损伤或疾病的哺乳动物。本方式的哺乳动物优选为人或非人灵长类，更优选为人。
膀胱的损伤或疾病的“治疗”包括其症状或病情得以维持、减轻、或消失。膀胱的损伤或疾病的治疗包括治愈膀胱的损伤或疾病。
从减轻移植片排斥反应的观点出发，优选用于制造要导入到有此需要的哺乳动物中的腹侧后肠类器官、膀胱类器官或再生医疗用组合物的多能干细胞的动物种与有此需要的哺乳动物为同一种或同一个体。
本说明书中的术语“包含”是指存在所列举的要素和/或步骤、并且可追加其它要素和/或步骤。本说明书中的术语“由……构成”是指存在所列举的要素和/或步骤、并且排除其它要素和/或步骤。本说明书中的术语“本质上由……构成”是指存在所列举的要素和/或步骤、并且可在不影响细胞层、类器官、组合物和方法的新颖的技术特征的范围内追加其它要素和/或步骤。本说明书中的术语“实质上不含”不排除“完全不含”。
只要没有特别提及，则本公开所提供的术语和实施方式的说明可在本公开所提供的方式和实施方式之间适宜地适用。
以下记载具体的实施例，但是它们为示出本发明的优选实施方式的例子，对所附的权利要求书中记载的发明没有任何限定。
实施例
材料和方法
准备以下的生长因子、化合物：
重组人/小鼠/大鼠激活素A(R&D SYSTEMS、#338-AC)、重组人FGF4(R&D SYSTEMS、#7460-F4)、重组人BMP4(R&D SYSTEMS、#314-BP)、重组人KGF/FGF7(R&D SYSTEMS、#251-KG)、CHIR99021(TOCRIS、#4423)、全反式视黄酸(SIGMA、R2625)。
免疫荧光染色法
为了制作冷冻切片，将膀胱类器官或移植片一边在4％ PFA中在4℃下振荡一边孵育一晚。接着，用PBS(-)洗涤3次，用蔗糖溶液进行置换。将蔗糖用PBS(-)制备10％、20％、30％溶液，在各步骤中在4℃下孵育至样品沉淀为止。然后，对于膀胱类器官，在用镊子除去周边的Matrigel后包埋于OCT Compound，制作冷冻块。制作10μm的切片，在添加有10％驴血清、0.3％Triton-X的PBS(-)(以下记作“封闭缓冲液”)中在室温下孵育1小时而进行封闭。接着，与用封闭缓冲液稀释后的一抗在4℃下孵育一晚。然后，用PBS(-)洗涤3次，与用PBS(-)稀释后的二抗在4℃下孵育一晚。将核用DAPI染色。接着，用PBS(-)洗涤3次，用FluorSave试剂(Millipore、#345789)封入后，用共聚焦显微镜(ZEISS、LSM800)观察。
[实施例1]腹侧后肠类器官的制造
图1为示出一个实施方式的膀胱类器官制作的概要的流程图。图1示出由人iPS细胞向胚胎内胚层细胞分化诱导的步骤A、由胚胎内胚层细胞向后肠类器官分化诱导的步骤b1、由后肠类器官向腹侧后肠类器官分化诱导的步骤b2和由腹侧后肠类器官向膀胱样类器官分化诱导的步骤c1。包括步骤b1和步骤b2的步骤B中分化诱导出腹侧后肠。实施例1中实施步骤A、步骤b1和步骤b2，制造腹侧后肠类器官。
人iPS细胞的预培养
将人iPS细胞(1502.3株、由Dr.Melissa Little、Murdoch Children’sReseachInstitute惠赠)在用iMatrix-511(nippi)进行了包被的培养板表面上在StemFit AK02N培养基(REPROCELL)中进行维持培养。将上述细胞用TrypLE Select(Thermo FisherScientific)剥离，得到细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液以200rcf在室温下离心5分钟，除去上清，然后将沉淀物重悬浮于StemFit AK02N(10μM Y-27632)中。向上述悬浮液中以达到0.25μg/cm2的方式添加iMatrix-511(nippi)，以达到60000个细胞/cm2的方式接种于6孔板(Corning)，在37℃、CO25％下培养1天。
步骤A：胚胎内胚层细胞的分化诱导
将该培养用培养基交换为作为诱导培养基A的STEMdiff APEL2培养基(STEMCELLTecnologies)(添加了100ng/mL激活素A、1μM CHIR99021、2％ PFHM-II和抗生素-抗真菌素)，培养3天，由此向胚胎内胚层细胞分化诱导。在第2天以后每天进行培养基交换。人iPS细胞在分化诱导第1天时细胞集合成集落状，但在分化诱导第2天细胞开始扩展到集落的外侧。在分化诱导第3天，细胞以片状增殖，达到100％汇合。在胚胎内胚层诱导出典型的铺路石状的细胞。
步骤b1：后肠的分化诱导
在胚胎内胚层诱导后(分化诱导第3天)，将诱导培养基A交换成作为诱导培养基b1的STEMdiff APEL2培养基(添加了200ng/mL FGF4、8μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II、抗生素-抗真菌素)，将分化诱导后的胚胎内胚层细胞培养4天。
在分化诱导第7天，将悬浮的球状体回收到35mm培养皿中。接着，向残留于回收悬浮球状体后的孔中的球状体中，通过吹打来喷吹培养基，使球状体悬浮，回收到同一35mm培养皿中。回收的球状体在冰上静置。
将低生长因子基质胶(Corning)(蛋白质浓度10mg/mL)用诱导培养基b1稀释成50％浓度，以50μL/孔加入到细胞培养插件24孔8.0μm孔径透明PET膜(corning)中，在37℃下孵育30分钟而使其凝胶化。接着，向50％Matrigel溶液50μL中加入40～50个回收的球状体并混合。将上述混合物全部加入到凝胶化后的50％Matrigel上，在37℃、CO2 5％下孵育30分钟，使其凝胶化，得到细胞培养插件凝胶。向上述细胞培养插件凝胶上加入200μL诱导培养基b1、向其下加入300μL诱导培养基b1，在37℃、CO2 5％下培养4天。关于培养基交换，在二维培养时每天进行、在三维培养时每2天进行。50％Matrigel中的球状体通过在诱导培养基b1中培养而生长，形成稍带圆形的管状的细胞结构体(后肠类器官)。
步骤b2：后肠腹侧化
在后肠诱导后(分化诱导第11天)，将诱导培养基b1交换成作为诱导培养基b2的STEMdiff APEL2培养基(添加了30ng/mL BMP4、200ng/mL FGF4、8μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％PFHM-II和抗生素-抗真菌素)，在上述细胞培养插件凝胶中将诱导后的后肠培养3天，使后肠腹侧化。向上述细胞培养插件凝胶上加入200μL的诱导培养基b2、向其下加入300μL的诱导培养基b2，每2天进行培养基交换。在后肠腹侧培养基中培养时，后肠类器官的生长变慢，变为球状的细胞结构体(腹侧后肠类器官)。
对于上述腹侧后肠类器官(分化诱导第14天)，使用下表中记载的抗体进行免疫荧光染色。
[表1]
Figure BDA0004113747840000611
腹侧后肠类器官表达作为腹侧后肠标志物的P63，分别弱表达和不表达作为背侧后肠标志物的CDX2和SOX2，并且表达作为肠管上皮标志物的KRT8。另外，通过RT-PCR确认作为后方肠管和泄殖腔区域的标志物的HOXA13的转录有所增加。将这些结果汇总于下表。
[表2]
早期后肠类器官 后肠类器官 腹侧后肠类器官
分化诱导后的天数 9天 11天 14天
P63 + ++ +++
CDX2 +++ +++ +
SOX2 ++ + -
KRT8 ++ +++ ++
HOXA13 - - ++
+++：强表达
++：表达或在一部分细胞中强表达
+：弱表达或在一部分细胞中表达
-：表达未上调或不表达
[比较例1]
肠样类器官(SATB2阳性)的分化诱导
在实施例1的步骤b2中，将步骤b1中得到的细胞培养插件凝胶中的后肠类器官用培养基STEMdiff APEL2培养基(添加了100ng/mL BMP2、100ng/mL EGF、500ng/mL RSPO1和0.1μM视黄酸)培养21天，分化诱导出肠样类器官(SATB2阳性)。
肠样类器官表达结肠或直肠标志物SATB2(图2a)。肠的类器官在一部分中表达Mid/后肠标志物CDX2，还表达上皮组织标志物ECAD(图2b和图2c)。SATB2、CDX2、ECAD和核标志物DAPI(图2d)的荧光图像未显示出规则地局部存在有特定细胞类型的细胞层结构。
比较例1中得到的肠样类器官还表达腹侧后肠/泄殖腔标志物P63、膀胱上皮标志物UPK2和膀胱上皮标志物KRT5。另外，P63、UPK2和KRT5的结果也未显示出比较例1中得到的肠样类器官具有规则地局部存在有特定细胞类型的细胞层结构。
比较例1中，使用了与实施例1的步骤b2中使用的添加剂的组合(BMP4、FGF4和CHIR99021)不同的添加剂的组合(BMP2、EGF、RSPO1和视黄酸)。比较例1中得到的细胞结构体不具有如实施例1中得到的腹侧后肠类器官那样的、规则地局部存在有特定细胞类型的细胞层结构。
使用与实施例1的步骤b2中使用的添加剂的组合(BMP4、FGF4和CHIR99021)不同的其它添加剂的组合(EGF、RSPO1和视黄酸的组合；EGF、RSPO1、视黄酸和Noggin的组合；EGF、RSPO1、视黄酸、Noggin和FGF7的组合；以及EGF、RSPO1、视黄酸、BMP2和FGF7的组合)而得到的细胞结构体也不具有如实施例1中得到的腹侧后肠类器官那样的、规则地局部存在有特定细胞类型的细胞层结构。
[实施例2]膀胱样类器官的制造
步骤c1：膀胱上皮的分化诱导
在后肠腹侧化后(分化诱导第14天)，将诱导培养基b2交换成作为诱导培养基C的STEMdiff APEL2培养基(添加了30ng/mL BMP4、100nM全反式视黄酸、100ng/mL FGF7、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II和抗生素-抗真菌素)，将球状的细胞结构体培养6天而诱导膀胱上皮细胞。向上述细胞培养插件凝胶上加入200μL的诱导培养基C、向其下加入300μL的诱导培养基C，每2天进行培养基交换。诱导出的膀胱样类器官为球状。
对于上述膀胱样类器官进行免疫荧光染色。在实施例2和下述实施例3中的免疫荧光染色中使用以下抗体。
免疫荧光染色法中使用的一抗为小鼠抗尿溶蛋白II(1：100、BIOCARE MEDICAL、#ACR3051C)、兔抗P63(1：100、abcam、#ab124762)、鸡抗角蛋白5(1：300、BioLegend、#905903)、山羊抗ECAD(1：300、R&D SYSTEMS、#AF648)。免疫荧光染色法中使用的二抗为Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(1：400、Life Technologies、#A21202)、Alexa Fluor 568驴抗兔IgG(1：400、Life Technologies、#A10042)、Alexa Fluor 647驴抗山羊IgG(1：400、Life Technologies、#A21447)、Alexa Fluor 647驴抗鸡IgY(1：400、JacksonImmunoResearch、#703-606-155)。
膀胱样类器官表达上皮组织标志物ECAD(图3e)。膀胱样类器官表达膀胱上皮标志物UPK2(图3a)、P63(图3b)和KRT5(图3c)。图3a和图3d中，在膀胱样类器官的最外周观察到的信号为来自Matrigel的非特异性信号。将UPK2、P63和KRT5的荧光图像叠加后的图3d显示出：在膀胱样类器官中，沿着其最外周局部存在共表达P63和KRT5的基底细胞样的细胞，在局部存在上述KRT5-基底细胞样细胞的区域的内侧方向局部存在共表达P63和UPK2的中间细胞样的细胞，在局部存在上述中间细胞样细胞的区域的内侧方向局部存在不表达P63但表达UPK2的表面细胞样的细胞。膀胱样类器官中的这些细胞类型的层结构与生物体中的发生过程中的膀胱上皮的结构类似(图5的g)。该膀胱样类器官中，表达KRT5的细胞少，但由于表达KRT5的Krt5-基底细胞是在膀胱发生后期出现的细胞类型，因此暗示了诱导后的膀胱样类器官处于未成熟阶段。
[比较例2]
对于后肠类器官，使用从诱导培养基b2和上述诱导培养基C中除去了BMP4的培养基，除此以外与实施例2同样地进行膀胱上皮的分化诱导。对于比较例2中形成的细胞结构体，与实施例2同样地进行免疫荧光染色。比较例2中形成的细胞结构体与实施例2中形成的膀胱样类器官同样地表达膀胱上皮标志物P63(图4b)和上皮组织标志物ECAD(图4c)。但是，比较例2中形成的细胞结构体并未如在实施例2中形成的膀胱样类器官中观察到的那样表达膀胱上皮标志物UPK2(图3a和图4a)。图4a中，在膀胱样类器官的最外周观察到的信号为来自Matrigel的非特异性信号。这样，比较例2中形成的细胞结构体不具有如在实施例2中形成的膀胱样类器官中所观察到的细胞层结构。
[实施例3]生物体内(体内)的膀胱类器官的制造
人iPS细胞的预培养
在6孔板中以达到90000个细胞/cm2的方式接种细胞，除此以外与实施例1同样地进行人iPS细胞的预培养。
步骤A：向胚胎内胚层细胞的分化诱导
与实施例1同样地进行从人iPS细胞向胚胎内胚层细胞的分化诱导。
步骤b1：后肠分化诱导
对于细胞培养插件凝胶，将低生长因子基质胶(Corning)(蛋白质浓度10mg/mL)用诱导培养基b1稀释成2.5mg/mL浓度后使其凝胶化，使其内部含有通过二维培养胚胎内胚层细胞而形成的球状体90～100个，除此以外实质上与实施例1同样地进行后肠分化诱导。
步骤b2：后肠腹侧化
在后肠诱导后(分化诱导第11天)，将诱导培养基b1交换成作为诱导培养基b2的STEMdiff APEL2培养基(添加了30ng/mL BMP4、100ng/mL FGF7、200ng/mL FGF4、8μMCHIR99021、1μg/mL肝素、2％PFHM-II和抗生素-抗真菌素)，将上述细胞培养插件凝胶培养3天而使后肠腹侧化。向上述细胞培养插件凝胶下加入500μL的诱导培养基b2，每2天进行培养基交换。
步骤c2：向免疫缺陷小鼠肾被膜下的移植
后肠腹侧化后(分化诱导第14天)，将上述细胞培养插件凝胶从细胞培养插件透明PET膜的膜切下，置于35mm培养皿上。接着，使用镊子在实体显微镜下从2.5mg/mL Matrigel中取出腹侧后肠类器官。
在异氟烷吸入麻醉下(异氟烷1.3～1.4％、190～200mL/分钟)用剃刀将4周龄雄性NOD SCID JAX小鼠(オリエンタル酵母工业株式会社)的肾被膜切开，将上述腹侧后肠类器官移植到肾被膜与肾实质之间。移植4周后，采集含有移植片的区域后，在4％PFA、4℃下进行一晩的组织固定。将固定化的移植片冷冻，制作冷冻切片。对于冷冻切片，进行荧光免疫染色和H&E染色。
所移植的腹侧后肠类器官在移植4周后成为如生物体的膀胱那样具有内腔的袋状的细胞结构体(膀胱类器官)。在膀胱类器官内存在表达膀胱上皮标志物UPK2(图5a)、P63(图5b)和KRT5(图5c)的细胞，这些细胞与生物体内的成熟的膀胱的层结构类似(图5g)。具体而言，膀胱类器官中，在袋状的细胞结构体的最外周局部存在共表达P63和KRT5的Krt5-基底细胞样的细胞(图5e)。另外，在局部存在上述KRT5-基底细胞样的细胞的区域的内侧方向，少量存在共表达UPK2和P63的中间细胞样的细胞(图5f)。进而，在局部存在中间细胞样的细胞的区域的内侧方向，在面向膀胱类器官的内腔的区域局部存在表达UPK2且不表达P63和KRT5的表面细胞样细胞(图5e和f)。
实施例2和3表明，能够诱导多种膀胱上皮细胞，由该多种膀胱上皮细胞构成的细胞结构体具有层结构。实施例2和3表明，形成了由多种膀胱上皮细胞构成的膀胱样的三维结构体。对腹侧后肠类器官比较了实施例2的试管内(体外)的分化诱导系统和实施例3的生物体内(体内)的分化诱导系统，表明：对于由腹侧后肠类器官形成膀胱样的袋状结构和成熟化而言，优选组合能够长期培养或存在间充质的生物体内(体内)分化诱导系统。
[实施例4]腹侧后肠类器官的制造
图6为示出膀胱类器官制作的培养的流程图。图6示出：由人iPS细胞向胚胎内胚层细胞分化诱导的步骤A、由胚胎内胚层细胞向腹侧后肠类器官分化诱导的步骤b3、和通过与间充质细胞或间充质干细胞的共培养而由腹侧后肠类器官向膀胱类器官分化诱导的步骤c3。图6的上部记载的天数为一个实施方式的例示性的分化诱导所需的天数。实施例4中实施步骤A和步骤b3，制造腹侧后肠类器官。
人iPS细胞的预培养
向6孔板中，以达到45000个细胞/cm2的方式接种细胞，除此以外与实施例1同样地进行人iPS细胞的预培养。
步骤A：向胚胎内胚层细胞的分化诱导
将作为诱导培养基A的STEMdiff APEL2培养基中所含的添加剂CHIR99021的浓度从1μM变更为1.25μM，除此以外与实施例1同样地进行由人iPS细胞向胚胎内胚层细胞的分化诱导。
步骤b3：腹侧后肠的分化诱导
胚胎内胚层诱导后(分化诱导第3天)，将诱导培养基A交换成作为诱导培养基b3的STEMdiff APEL2培养基(添加了10ng/mL BMP4、200ng/mL FGF4、4μM CHIR99021、1μg/mL肝素、2％ PFHM-II、抗生素-抗真菌素)，将分化诱导后的胚胎内胚层细胞培养3天。
在分化诱导第5天，开始以100rpm进行振荡培养。然后，在分化诱导第6天，将悬浮的球状体回收到35mm培养皿中。接着，向残留于回收悬浮球状体后的孔中的球状体中，通过吹打而喷吹培养基，使球状体悬浮，回收到同一35mm培养皿中。将回收的球状体在冰上静置。
将低生长因子基质胶(Corning)(蛋白质浓度10mg/mL)用诱导培养基b3稀释成50％浓度，以50μL/孔加入到细胞培养插件24孔8.0μm孔径透明PET膜(corning)中，在37℃下孵育30分钟而使其凝胶化。接着，向50％Matrigel溶液50μL中加入60～70个回收的球状体并混合。将上述混合物全部加入到凝胶化后的50％Matrigel上，在37℃、CO2 5％下孵育30分钟，使其凝胶化，得到细胞培养插件凝胶。向上述细胞培养插件凝胶上加入200μL诱导培养基b3、向其下加入300μL诱导培养基b3，在37℃、CO2 5％下进一步培养8天(至分化诱导第14天)。关于培养基交换，在二维培养时每天进行、在三维培养时每2天进行。50％Matrigel中的球状体通过在诱导培养基b3中培养而生长，形成具有管腔结构的带有圆形的细胞结构体(腹侧后肠类器官)。
对于分化诱导第11天和第14天的腹侧后肠类器官，进行免疫荧光染色。实施例4和实施例5的免疫荧光染色中使用以下抗体。
免疫荧光染色法中使用的一抗为小鼠抗CDX2(1：100、BioGenex、#MU392-UC)、小鼠抗FOXA2(1：100、Santa Cruz Biotechnology、#sc-101060)、兔抗GATA3(1：100、CellSignaling、#5852S)、山羊抗GATA3(1：100、R&D Systems、#AF2605)、小鼠抗ISL1&2(1：100、DSHB、#39.4D5)、山羊抗SOX2(1：100、R&D Systems、#AF2018)、兔抗SATB2(1：100、CELLMARQUE、#384R-14)、兔抗HOXA13(1：200、abcam、#ab106503)、山羊抗ZO1(1：100、ThermoFisher、#PA5-19090)、兔抗pSmad1/5/8(1：100、Cell signaling、#13820)、大鼠抗CK8(1：200、DSHB、#TROMA-1)、小鼠抗尿溶蛋白II(1：100、BIOCARE MEDICAL、#ACR3051C)、兔抗ΔNP63(1：100、Cell signaling、#67825)、兔抗P63(1：100、abcam、#ab124762)、鸡抗角蛋白5(1：300、BioLegend、#905903)、小鼠抗ECAD(1：200、BD Transduction Laboratries、#610181)、山羊抗ECAD(1：300、R&D SYSTEMS、#AF648)、鸡抗波形蛋白(1：300、NOVUS、#NB300-223)、兔抗αSMA(1：100、Cell signaling、#19245T)。
免疫荧光染色法中使用的二抗为Alexa Fluor488驴抗小鼠IgG(1：400、LifeTechnologies、#A21202)、Alexa Fluor568驴抗兔IgG(1：400、Life Technologies、#A10042)、Alexa Fluor647驴抗山羊IgG(1：400、Life Technologies、#A21447)、AlexaFluor647驴抗鸡IgY(1：400、Jackson ImmunoResearch、#703-606-155)。
实施例1中的步骤b1的后肠分化诱导后的后肠类器官(分化诱导第11天)不具有管腔结构(图7a)。实施例4中的步骤b3的腹侧后肠分化诱导第5天的腹侧后肠类器官(分化诱导第11天)具有管腔结构(图7b)。后肠类器官和腹侧后肠类器官均表达上皮标志物KRT8和ECAD(图7a1、a10、b1和b10)。后肠类器官弱表达作为腹侧后肠标志物的GATA3(图7a2)，但腹侧后肠类器官强表达(图7b2)。后肠类器官表达作为背侧后肠标志物的SOX2、CDX2和T(图7a3和a5～a7)，但在腹侧后肠类器官中不表达(图7b3和b5～b7)。后肠类器官不表达肠管标志物FOXA2(图7a9)，但在腹侧后肠类器官中表达(图7b9)。如此地，实施例1中进行步骤b2的后肠腹侧化之前的后肠类器官不具有管腔结构且表达背侧后肠标志物(SOX2、CDX2和T)，但另一方面，仅弱表达腹侧后肠标志物(GATA3)和肠管标志物(FOXA2)或不表达(图7a)。与此相对地，实施例4中的步骤b3的腹侧后肠分化诱导中的腹侧后肠类器官具有管腔结构，不表达上述背侧后肠标志物，但是表达上述腹侧后肠标志物和肠管标志物(图7b)。
对于实施例4中的步骤b3的腹侧后肠分化诱导第8天的腹侧后肠类器官(分化诱导第14天)，使用免疫荧光染色法利用显微镜进行观察(图8)。上述腹侧后肠类器官表达上皮组织标志物ECAD(图8d3)，表达紧密连接(Tight junction)标志物ZO1(图8c3)。另外，上述腹侧后肠类器官表达原始肠管上皮标志物FOXA2(图8b1)和CK8(图8c1)，并且表达作为腹侧后肠标志物的GATA3(图8a3、b3和e1)、ISL1(图8d1)、SATB2(图8c2)和ΔNP63(图8b2)。另外，上述腹侧后肠类器官表达腹侧泄殖腔区域标志物磷酸化Smad1/5/8(图8d2)，并且表达后方肠管和泄殖腔区域的标志物HOXA13(图8f2)。另一方面，上述腹侧后肠类器官几乎不表达作为背侧后肠标志物的CDX2(图8a1和f1)以及SOX2(图8a2和e2)。另外，上述腹侧后肠类器官不表达膀胱上皮祖细胞和膀胱上皮细胞标志物UPK2(图8e3)以及KRT5(图8f3)。这些结果暗示了，通过在诱导培养基b3中培养8天(分化诱导14天)，形成具有管腔结构的腹侧后肠类器官。另外暗示了，形成了成为膀胱上皮祖细胞之前的腹侧后肠/泄殖腔样细胞。
[实施例5]试管内(体外)的膀胱类器官的制造
在实施例5中实施图6所示的步骤A、步骤b3和步骤c3，在试管内制造膀胱类器官。实施例5的步骤C中，将步骤b3中形成的腹侧后肠类器官与来自E12.5小鼠的膀胱间充质细胞一起在试管内培养(步骤c3)。
人iPS细胞的预培养
与实施例4同样地进行了人iPS细胞的预培养。
步骤A：向胚胎内胚层细胞的分化诱导
与实施例4同样地进行由人iPS细胞向胚胎内胚层细胞的分化诱导。
步骤b3：后肠分化诱导
与实施例4同样地地进行由胚胎内胚层细胞向腹侧后肠类器官的分化诱导。
步骤c3：基于共培养的膀胱上皮分化诱导
E12.5小鼠膀胱间充质细胞的制备
通过脊椎脱臼使妊娠第12天的ICR小鼠安乐死。从上述ICR小鼠中将包裹胎仔的孕囊取出到冰冷10％FBS/PBS(-)中。用镊子从上述孕囊中取出胎仔，从胎仔切下胎盘。然后，用镊子将胎仔的上半身去除而使膀胱部露出，采集从膀胱至尿道的区域。将采集的膀胱、尿道区域放入解离缓冲液(Dispase：Corning#354235、1mg/mL DNaseI：Sigma-Aldrich#11284932001)200μL中，在37℃下孵育1分钟。然后，用冰冷M2培养基3mL稀释2次，在冰上静置10分钟。然后，使用镊子和玻璃针从输尿管插入部仅采集上部的膀胱间充质细胞，集中到1.5mL管中。然后，将在37℃保温的TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)200μL加入上述管中，在37℃下孵育3分钟后，对组织进行吹打直至成为单细胞。将DMEM(添加了10％FBS、GultaMAX-I、抗生素-抗真菌素)1mL加入到上述管中使酶反应停止。将上述管以300rcf离心3分钟，除去其上清。向其沉淀物中加入STEM-CELLBAMKER GMP级(ZENOQ#CB045)250μL而重悬浮。将得到的细胞悬浮液转移到冷冻保存管中，在-80℃下保存。
与E12.5小鼠膀胱间充质细胞的共培养
通过吹打使步骤b3中得到的胞外基质(50％Matrigel)凝胶中的腹侧后肠类器官从上述凝胶脱离，将其静置在冰上。
将冷冻保存的上述E12.5小鼠膀胱间充质细胞在37℃水浴中融解后，加入STEMdiff APEL2培养基1mL而进行悬浮。将得到的细胞悬浮液以300rcf离心3分钟，除去其上清。向该沉淀物中加入STEMdiff APEL2培养基200μL而重悬浮。对于得到的细胞悬浮液进行细胞计数，以达到25000个细胞/孔的方式将细胞悬浮液加入到PrimeSurface(注册商标)板96V(住友电木#MS-9096V)中。将上述板以200rcf离心5分钟。
将从Matrigel脱离后的上述腹侧后肠类器官以1个/孔的方式加入到上述板中，静置至沉淀为止。然后，以追加25000个细胞/孔的方式向各孔中加入上述细胞悬浮液，将上述板以200rcf离心5分钟后，将上述腹侧后肠类器官和膀胱间充质细胞在37℃、CO2 5％下培养1天。然后，将组合后的细胞块从上述板的孔转移到容器中，将上述容器设置于三维旋转悬浮培养装置CellPet 3D-iP(ジェイテックコーポレーション)。将上述组合后的细胞块用STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Tecnologies)(添加了2％ PFHM-II和抗生素-抗真菌素)或STEMdiff APEL2培养基(STEMCELL Tecnologies)(添加了2％ PFHM-II、2％FBS和抗生素-抗真菌素)CellPet 3D-iP在37℃、CO2 5％下培养11天，诱导膀胱类器官(分化诱导第24天)。
在明视场下对步骤c3中的腹侧后肠类器官与膀胱间充质细胞的共培养第7天的膀胱类器官(分化诱导第20天)进行显微镜观察(图9)。在上述膀胱类器官中观察到上皮结构和管腔结构的二层结构(图9a～c)。即使在明视场下难以观察到二层结构的情况下(图9d)，使用荧光染色法观察时也可观察到二层结构。
步骤c3中的共培养第11天的膀胱类器官(分化诱导第24天)为球状，具有管腔结构。使用免疫荧光染色法利用显微镜观察上述膀胱类器官(图10)。上述膀胱类器官具有管腔，具有表达上皮细胞标志物ECAD的细胞的层，上述ECAD表达细胞层面向上述管腔(图10b1)，在上述ECAD表达细胞层的外侧具有表达间充质细胞标志物VIM的细胞的层(图10b3和b5)。上述膀胱类器官在ECAD表达细胞层(图10c1)的外侧含有被DAPI染色的细胞层(图10c4)，在该被DAPI染色的细胞层的外侧具有表达平滑肌细胞标志物αSMA的细胞的层(图10c2和c4)。这些结果表明，上述膀胱类器官具有管腔、面向上述管腔的表达ECAD的上皮细胞层、上述上皮细胞层外侧的表达VIM的间质样细胞层、以及上述间质样细胞层外侧的表达αSMA的平滑肌细胞层。
上述膀胱类器官的ECAD细胞层的细胞共表达人核纤层蛋白B1(hLNB)(图10b2和b)。该结果表明上述膀胱类器官的上皮细胞来自人iPS细胞。因此，上述膀胱类器官具有管腔、面向上述管腔的来自人iPS细胞的上皮细胞层、上述上皮细胞层的外侧的来自小鼠膀胱间充质细胞的间质样细胞层、以及上述间质样细胞层的外侧的来自小鼠间充质细胞的平滑肌细胞层。
上述膀胱类器官中观察到收缩运动。这暗示了，上述膀胱类器官所具有的平滑肌细胞层具有功能。
上述膀胱类器官的上述上皮细胞层在其最内侧具有表达UPK2的细胞的层(图10a1)，在上述UPK2表达细胞层的外侧具有表达ΔNP63的细胞的层(图10a2和a5)。该结果表明上述膀胱类器官类似于处于膀胱的发生过程中的膀胱上皮结构。上述膀胱类器官的上述上皮细胞层未观察到表达膀胱上皮标志物KRT5的细胞(图10a3)。已知表达KRT5的基底细胞在膀胱发生后期出现。这些结果暗示了，实施例5中的分化诱导第24天的膀胱类器官处于膀胱发生过程中的阶段。上述膀胱类器官的上述上皮细胞层表达膀胱上皮细胞标志物GATA3(图10d2)，但表达发生过程中的膀胱上皮细胞标志物FOXA2(图10d1)。这些结果也暗示了，实施例5中的分化诱导第24天的膀胱类器官处于膀胱发生过程中的阶段。
使用免疫荧光染色法利用显微镜观察步骤c3中的共培养第29天的膀胱类器官(分化诱导第42天)(图11)。上述膀胱类器官具有管腔结构。上述膀胱类器官的上皮细胞层具有面向管腔且表达UPK1B(图11a1)和UPK2(图11b1)的细胞的层、上述细胞层外侧的表达ΔNP63的细胞的层(图11a2和b2)、以及上述细胞层外侧的表达KRT5的细胞的层(图11a3和b3)(图11a5和b5)。已知表达KRT5的基底细胞在膀胱发生后期出现，因此，这些结果暗示了，实施例5中的分化诱导第42天的膀胱类器官处于膀胱发生后期的阶段。

Claims (15)

1.一种制造腹侧后肠类器官的方法，其包括下述步骤：
将多能干细胞用含有激活素A和GSK3β抑制剂的诱导培养基A进行培养而分化诱导为胚胎内胚层细胞；以及
将所述胚胎内胚层细胞用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且还任选含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，接着，在胞外基质存在下用含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂且还任选含有骨形成蛋白的诱导培养基B进行培养，形成腹侧后肠类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，形成所述腹侧后肠类器官的步骤包括下述步骤：在用所述诱导培养基B培养所述胚胎内胚层细胞后，在胞外基质存在下用所述诱导培养基B进行培养而形成后肠类器官；以及将所述后肠类器官在胞外基质存在下用所述诱导培养基B进行培养而形成腹侧后肠类器官，
用于形成后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子和GSK3β抑制剂，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，用于形成腹侧后肠类器官的诱导培养基B含有成纤维细胞生长因子、GSK3β抑制剂和骨形成蛋白。
4.一种腹侧后肠类器官，其通过权利要求1～3中任一项所述的方法而制造。
5.一种腹侧后肠类器官，其表达作为腹侧后肠标志物的P63，
表达HOXA13和CK8/KRT8，并且
实质上不表达作为背侧后肠标志物的SOX2。
6.一种腹侧后肠类器官，其是具有内腔的腹侧后肠类器官，其表达选自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1和SATB2组成的组中的至少1种腹侧后肠标志物，
表达选自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8和ECAD组成的组中的至少1种标志物，并且
实质上不表达选自由SOX2、T和CDX2组成的组中的至少1种背侧后肠标志物。
7.一种制造膀胱类器官的方法，其包括下述步骤：
将通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官或权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官在胞外基质存在下用含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白的诱导培养基C进行培养；
导入到人或非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位；或者
在间充质干细胞或间充质细胞存在下进行培养。
8.一种膀胱类器官，其通过权利要求7所述的方法而制造。
9.一种膀胱类器官，其包含：
含有实质上不表达P63但表达UPK1B和/或UPK2的细胞的第一细胞层；以及
相对于所述第一细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63以及UPK1B和/或UPK2的细胞的第二细胞层，
还任选包含相对于所述第二细胞层在外侧方向局部存在的、含有共表达P63和KRT5的细胞的第三细胞层。
10.根据权利要求9所述的膀胱类器官，其中，包含被所述第一细胞层包围的内腔。
11.根据权利要求9或10所述的膀胱类器官，其中，包含相对于所述第三细胞层在外侧方向局部存在的、含有间质样细胞的第四细胞层，还任选包含相对于所述第四细胞层在外侧方向局部存在的、含有平滑肌细胞的第五细胞层。
12.一种制造非人哺乳动物的方法，所述非人哺乳动物在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有腹侧后肠类器官或膀胱类器官，所述方法包括下述步骤：
将通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过权利要求7所述的方法制造的膀胱类器官、或者权利要求8～11中任一项所述的膀胱类器官导入到非人哺乳动物的肾脏或膀胱或者它们的周边部位。
13.一种非人哺乳动物，在其肾脏或膀胱或者它们的周边部位具有通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过权利要求7所述的方法制造的膀胱类器官、或者权利要求8～11中任一项所述的膀胱类器官。
14.一种用于处置膀胱的损伤或疾病的再生医疗用组合物，其含有通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过权利要求7所述的方法制造的膀胱类器官、或者权利要求8～11中任一项所述的膀胱类器官。
15.一种评价对受试物质的药物应答性的方法，其包括下述步骤：
使通过权利要求1～3中任一项所述的方法制造的腹侧后肠类器官、权利要求4～6中任一项所述的腹侧后肠类器官、通过权利要求7所述的方法制造的膀胱类器官、权利要求8～11中任一项所述的膀胱类器官、通过权利要求12所述的方法制造的非人哺乳动物、或权利要求13所述的非人哺乳动物与受试物质接触；以及
测定所述腹侧后肠类器官、所述膀胱类器官、或所述非人哺乳动物对所述受试物质的药物应答性。
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