TW202221112A - 膀胱類器官及其製造方法 - Google Patents

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TW202221112A
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高里実
尾藤和浩
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國立研究開發法人理化學研究所
日商大塚製藥股份有限公司
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Abstract

本發明之一個目的在於提供一種用以製造具有如膀胱之膀胱上皮細胞種之層結構之膀胱類器官的腹側後腸類器官。 本發明之一個態樣提供一種製造腹側後腸類器官之方法，其包括：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；及對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，繼而，於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官。

Description

膀胱類器官及其製造方法
本發明係關於一種腹側後腸類器官、或者膀胱類器官、或其等之製造方法。又，本發明係關於一種非人哺乳動物、或者其製造方法，上述非人哺乳動物於其腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或者膀胱類器官。本發明進而係關於一種評估腹側後腸類器官、膀胱類器官、或上述非人哺乳動物對受驗物質之藥物應答性之方法。本發明進而係關於一種包含腹側後腸類器官或膀胱類器官之再生醫學用組合物。
膀胱係源自胚體內胚葉(Definitive Endoderm)之器官，且已知係自位於早期消化道(Gut tube)之最後方之後腸(Hindgut)經由腹側總排泄腔(Ventral cloaca)發育而來。膀胱係暫時容納自腎臟經由尿管送來並會經由尿道排出之尿液的袋狀器官。膀胱之蓄尿功能或排尿功能可能因膀胱組織由於放射線治療、膀胱破裂、及糖尿病等受到傷害而降低或消失。
以喪失功能之器官之再生、難治性疾病之治療、或彌補器官移植過程中之慢性供體不足為目的，正在進行再生醫學研究。於再生醫學領域中，正在研究利用稱為類器官之類似於器官之細胞集合體，上述類器官係由ES細胞或iPS細胞等多能幹細胞於試管內(in vitro)被創造出。
據非專利文獻1中記載，藉由於試管內對小鼠ES細胞進行培養，而誘導分化成膀胱上皮。據非專利文獻2～4中記載，藉由於試管內對人多能幹細胞進行培養，而誘導分化成膀胱上皮。據非專利文獻5中記載，於試管內對膠原蛋白基質中之小鼠ES細胞培養後，移植至小鼠腎被膜下，而誘導分化成膀胱上皮。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Mauney JR, et. al.,: All-Trans Retinoic Acid Directs Urothelial Specification of Murine Embryonic Stem Cells via GATA4/6 Signaling Mechanisms. PLoS One 2010, 5: e11513. [非專利文獻2]Osborn SL, et. al.,: Induction of human embryonic and induced pluripotent stem cells into urothelium. Stem Cells Transl Med 2014, 3: 610 - 9. [非專利文獻3]Suzuki K, et. al.,: Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature stratified bladder urothelium. Sci Rep 2019, 9:1 - 13. [非專利文獻4]Kang M, et. al.,: Generation of Bladder Urothelium from Human Pluripotent Stem Cells under Chemically Defined Serum- and Feeder-Free System. Int J Mol Sci 2014, 15: 7139 - 7157. [非專利文獻5]Oottamasathien S, et. al.,: Directed differentiation of embryonic stem cells into bladder tissue. Dev Biol 2007, 304: 556 - 566.
[發明所欲解決之問題]
關於非專利文獻1～4中記載之向膀胱上皮之誘導分化，並非是模仿實際之膀胱發育過程，且亦非以三維培養系統來進行誘導分化。非專利文獻1～4中誘導分化成之膀胱上皮類器官不具有如膀胱之膀胱上皮細胞種之層結構。非專利文獻5中誘導分化成之膀胱上皮類器官是否具有如膀胱之3層結構，尚不明確。
本發明人等對由多能幹細胞形成膀胱類器官之條件進行了各種研究。例如，本發明人等對構建模仿了實際膀胱發育過程之三維培養系統之條件進行了研究。本發明之一個目的在於提供一種新穎腹側後腸類器官、或其製造方法，上述新穎腹側後腸類器官係用以製造具有如膀胱之膀胱上皮細胞種之層結構之膀胱類器官。本發明之一個目的在於提供一種新穎膀胱類器官、或其製造方法，上述新穎膀胱類器官具有如膀胱之膀胱上皮細胞種之層結構。本發明之一個目的在於提供一種新穎非人哺乳動物、或其製造方法，上述新穎非人哺乳動物係於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官。本發明之一個目的在於提供一種包含腹側後腸類器官或膀胱類器官之新穎再生醫學用組合物。本發明之一個目的在於提供一種評估於腹側後腸類器官、膀胱類器官、或上述非人哺乳動物中之受驗物質之藥物應答性的新穎方法。 [解決問題之技術手段]
本發明提供以下之態樣。 [項A1]一種製造腹側後腸類器官之方法，其包括：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B進行培養，繼而於細胞外基質凝膠中，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B進行培養，而形成後腸類器官；及於細胞外基質凝膠中，對上述後腸類器官使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基b2進行培養，而形成腹側後腸類器官。 [項A2]一種腹側後腸類器官，其表現P63、CDX2、HOXA13、及KRT8，且不表現SOX2。 [項A2-1]一種腹側後腸類器官，其表現P63、CDX2、HOXA13、及KRT8，且實質上不表現SOX2。 [項A3]如項A2記載之腹側後腸類器官，其中腹側後腸類器官中之CDX2之表現量少於後腸類器官中之CDX2之表現量，或者於腹側後腸類器官中不表現CDX2。 [項A3-1]如項A2記載之腹側後腸類器官，其中腹側後腸類器官中之CDX2之表現量少於後腸類器官中之CDX2之表現量，或者於腹側後腸類器官中實質上不表現CDX2。 [項A4]一種製造膀胱類器官之方法，其包括：於細胞外基質凝膠中，使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C，對藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2或項A3記載之腹側後腸類器官進行培養。
[項A5]一種膀胱類器官，其包括：第一細胞層，其沿上述膀胱類器官之最外周存在且包含共表現P63及KRT5之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層存在於內側方向上且包含共表現P63及UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層存在於內側方向上且包含不表現P63但表現UPK2之細胞。 [項A5-1]一種膀胱類器官，其包括：第一細胞層，其沿上述膀胱類器官之最外周存在且包含共表現P63及KRT5之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層存在於內側方向上且包含共表現P63及UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層存在於內側方向上且包含實質上不表現P63但表現UPK2之細胞。 [項A6]一種製造膀胱類器官之方法，其包括：將藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2或項A3記載之腹側後腸類器官導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。 [項A7]一種膀胱類器官，其係具有內腔者，且包括：第一細胞層，其沿上述膀胱類器官之最外周存在且包含共表現P63及KRT5之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層存在於內側方向上且包含共表現P63及UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層存在於內側方向上並面對上述內腔且包含不表現P63但表現UPK2之細胞。 [項A7-1]一種膀胱類器官，其係具有內腔者，且包括：第一細胞層，其沿上述膀胱類器官之最外周存在且包含共表現P63及KRT5之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層存在於內側方向上且包含共表現P63及UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層存在於內側方向上並面對上述內腔且包含實質上不表現P63但表現UPK2之細胞。
[項A8]一種製造於非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有膀胱類器官之非人哺乳動物之方法，其包括：將藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2、項A2-1、項A3或項A3-1記載之腹側後腸類器官、或者藉由如項A4或項A6記載之方法所製造之膀胱類器官、或者如項A5、項A5-1、項A7或項A7-1記載之膀胱類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。 [項A9]一種非人哺乳動物，其腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2、項A2-1、項A3或項A3-1記載之腹側後腸類器官、或者藉由如項A4或項A6記載之方法所製造之膀胱類器官、或者如項A5、項A5-1、項A7或項A7-1記載之膀胱類器官。 [項A10]一種用以治療膀胱之損傷或疾病之再生醫學用組合物，其包含：藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2、項A2-1、項A3或項A3-1記載之腹側後腸類器官、或者藉由如項A4或項A6記載之方法所製造之膀胱類器官、或者如項A5、項A5-1、項A7或項A7-1記載之膀胱類器官。 [項A11]一種評估受驗物質之藥物應答性之方法，其包括：使藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2、項A2-1、項A3或項A3-1記載之腹側後腸類器官、或者藉由如項A4或項A6記載之方法所製造之膀胱類器官、或者如項A5、項A5-1、項A7或項A7-1記載之膀胱類器官、或者如項A9記載之非人哺乳動物與受驗物質進行接觸；及測定上述受驗物質於上述腹側後腸類器官、上述膀胱類器官、或上述非人哺乳動物中之藥物應答性。 [項A12]一種治療膀胱之損傷或疾病之方法，其包括：將藉由如項A1記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或者如項A2、項A2-1、項A3或項A3-1記載之腹側後腸類器官、或者藉由如項A4或項A6記載之方法所製造之膀胱類器官、或者如項A5、項A5-1、項A7或項A7-1記載之膀胱類器官導入至需要治療之哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
[項B1] 一種製造腹側後腸類器官之方法，其包括： 對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；及 對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官。 [項B2] 如項B1記載之方法，其中形成上述腹側後腸類器官係包括：對上述胚體內胚葉細胞利用上述誘導培養基B進行培養後，於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B進行培養，而形成後腸類器官；及對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用上述誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官， 用以形成後腸類器官之誘導培養基B含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑，且用以形成腹側後腸類器官之誘導培養基B含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質。 [項B3] 如項B1記載之方法，其中用以形成腹側後腸類器官之誘導培養基B含有：纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質。 [項B4] 一種腹側後腸類器官，其係藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造。
[項B5] 一種腹側後腸類器官，其 表現作為腹側後腸標記物之P63， 表現HOXA13及CK8/KRT8，且 實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2。 [項B5-1] 一種腹側後腸類器官，其 表現作為腹側後腸標記物之P63， 表現HOXA13及CK8/KRT8，且 實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2及/或CDX2，或者即便表現SOX2及/或CDX2，其表現量亦少於後腸類器官中之SOX2及/或CDX2之表現量。 [項B6] 一種腹側後腸類器官，其係具有內腔者，且 表現選自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1及SATB2所組成之群中之至少1種腹側後腸標記物， 表現選自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8、及ECAD所組成之群中之至少1種標記物，且 實質上不表現選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種背側後腸標記物。 [項B7] 一種製造膀胱類器官之方法，其包括：將藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、或如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官， 於細胞外基質之存在下，使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C進行培養； 導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位；或者 於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下進行培養。 [項B8] 一種膀胱類器官，其藉由如項B7記載之方法所製造。
[項B9] 一種膀胱類器官，其包括： 第一細胞層，其包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；及 第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63及UPK1B及/或UPK2之細胞， 上述膀胱類器官可進而包括第三細胞層，其相對於上述第二細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63及KRT5之細胞。 [項B10] 如項B9記載之膀胱類器官，其包含被上述第一細胞層包圍之內腔。 [項B11] 如項B9或項B10記載之膀胱類器官，其包括第四細胞層，可進而包括第五細胞層，上述第四細胞層相對於上述第三細胞層局部化於外側方向上且包含間質樣細胞，上述第五細胞層相對於上述第四細胞層局部化於外側方向上且包含平滑肌細胞。 [項B12] 一種製造於非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官之非人哺乳動物的方法，其包括：將藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官、藉由如項B7中記載之方法所製造之膀胱類器官、或如項B8至項B11中任一項記載之膀胱類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
[項B13] 一種非人哺乳動物，其腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官、藉由如項B7中記載之方法所製造之膀胱類器官、或如項B8至項B11中任一項記載之膀胱類器官。 [項B14] 一種用以治療膀胱之損傷或疾病之再生醫學用組合物，其包含：藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官、藉由如項B7中記載之方法所製造之膀胱類器官、或如項B8至項B11中任一項記載之膀胱類器官。 [項B15] 一種評估受驗物質之藥物應答性之方法，其包括： 使藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官、藉由如項B7中記載之方法所製造之膀胱類器官、如項B8至項B11中任一項記載之膀胱類器官、藉由如項B12記載之方法所製造之非人哺乳動物、或如項B13記載之非人哺乳動物與受驗物質進行接觸；及 測定上述受驗物質於上述腹側後腸類器官、上述膀胱類器官、或上述非人哺乳動物中之藥物應答性。 [項B16]一種治療膀胱之損傷或疾病之方法，其包括：將藉由如項B1至項B3中任一項記載之方法所製造之腹側後腸類器官、如項B4至項B6中任一項記載之腹側後腸類器官、藉由如項B7中記載之方法所製造之膀胱類器官、或如項B8至項B11中任一項記載之膀胱類器官導入至需要治療之哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
[腹側後腸類器官或其製造方法] 本發明之一個態樣提供一種腹側後腸類器官之製造方法。本發明之另一態樣提供一種腹側後腸類器官。
本說明書中之用語「類器官」意指試管內(in vitro)形成之三維之類似生物組織之細胞集合體、或將上述細胞集合體於生物體內進一步培養後所得之細胞集合體。構成類器官之細胞例如大部分為具有分化能力及增生能力之細胞。本說明書中，表現特定標記物之類器官意指以規定之比率包含表現上述特定標記物之細胞之類器官。上述規定之比例例如可為構成類器官之細胞之3%以上、5%以上、10%以上、或15%以上。
本說明書中，所謂「實質上不表現」特定標記物意味著上述特定標記物之表現量較少而無法由該標記物表徵。於一態樣中，「實質上不表現」特定標記物之類器官亦可為如下類器官，即與作為比較對象之類器官中之上述特定標記物之表現量相比，上述類器官中之上述特定標記物之表現量降低至未達70%、未達80%、未達90%、或未達95%。標記物之表現量例如可藉由定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)或免疫染色法進行測定。藉由定量PCR所獲得之標記物之表現量例如可為編碼所需標記物之mRNA之表現量。藉由免疫染色法所獲得之標記物之表現量例如可為與結合於所需標記物之抗體直接結合或間接結合之可產生訊號之物質(例如螢光物質)所發出的訊號之強度(例如螢光強度)。與結合於所需標記物之抗體(一級抗體)間接結合之可產生訊號之物質例如可為與可結合於上述一級抗體之二級抗體直接結合之可產生訊號之物質。
於一個實施方式中，關於實質上不表現SOX2之腹側後腸類器官，與後腸類器官中之SOX2之表現量相比，上述腹側後腸類器官中之SOX2之表現量降低至未達70%。於一個實施方式中，關於選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種或3種、較佳為3種)背側後腸標記物全部實質上不表現之腹側後腸類器官，與後腸類器官中之相對應之標記物之表現量相比，上述腹側後腸類器官中之上述背側後腸標記物之表現量降低至未達70%。於上述實施方式中，上述後腸類器官係藉由如下方式形成：使用與構成腹側後腸類器官之細胞相同種類之多能幹細胞，實施本發明之步驟A及步驟b1(例如實施例中記載之步驟A及步驟b1)。
本說明書中之用語「腹側後腸類器官」係指如下類器官：表現本發明之至少1種腹側後腸標記物，且實質上不表現本發明之至少1種背側後腸標記物、或者即便表現本發明之至少1種背側後腸標記物，其表現量亦少於在後腸類器官中之表現量。腹側後腸類器官例如可藉由本發明之腹側後腸類器官之製造方法進行製造。於上述腹側後腸類器官之製造方法中，在形成後腸類器官後，使上述後腸類器官腹側化而形成腹側後腸類器官之情形時，有時於本說明書中將該腹側後腸類器官稱為「腹側化後腸類器官」。腹側後腸類器官之長徑可以為80 μm以上、100 μm以上、或120 μm以上。腹側後腸類器官例如可用於製造下述膀胱類器官。腹側後腸類器官例如可用於評估受驗物質之藥物應答性。腹側後腸類器官例如可用作本發明之再生醫學用組合物之有效成分。
一個實施方式之腹側後腸類器官表現作為腹側後腸標記物之P63；表現HOXA13及CK8/KRT8；且實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2。一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：表現作為腹側後腸標記物之P63；表現HOXA13及CK8/KRT8；實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2；實質上不表現作為背側後腸標記物之CDX2，或者即便表現CDX2，其表現量亦少於後腸類器官中之CDX2之表現量。一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：表現作為腹側後腸標記物之P63，表現HOXA13及CK8/KRT8，且實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2及/或CDX2，或者即便表現SOX2及/或CDX2，其表現量亦少於後腸類器官中之SOX2及/或CDX2之表現量。一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：進而P63之表現量多於後腸類器官中之P63之表現量。一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：進而CDX2之表現量相對於P63之表現量之比小於後腸類器官中CDX2之表現量相對於P63之表現量之比。一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：進而HOXA13被轉錄。
一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：具有內腔；表現選自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1及SATB2所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種、3種、或4種以上)腹側後腸標記物；表現選自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8、及ECAD所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、3種、4種、或5種以上)標記；且實質上不表現選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種(例如1種、2種或3種，較佳為3種)。一個實施方式之腹側後腸類器官進而包含面對上述內腔且共表現CK8/KRT8及ZO1之細胞之層。
一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：具有內腔；表現作為腹側後腸標記物之GATA3；表現選自由FOXA2、CK8/KRT8及ECAD所組成之群中之至少1種(例如1種、2種或3種)標記；且實質上不表現選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種(例如1種、2種或3種，較佳為3種)。上述腹側後腸類器官例如表現FOXA2、CK8/KRT8及ECAD。
一個實施方式之腹側後腸類器官之特徵在於：具有內腔；包含面對上述內腔且共表現CK8/KRT8及ZO1之細胞之層；表現選自由ΔN63、GATA3、ISL1及SATB2所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、或3種以上)腹側後腸標記物；表現選自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、CK8/KRT8、FOXA2、及ECAD所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、3種、或4種以上)之標記；且實質上不表現SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種(例如1種、2種或3種，較佳為3種)。上述腹側後腸類器官較佳為表現GATA3。上述腹側後腸類器官例如進而表現ΔN63、ISL1及SATB2。上述腹側後腸類器官例如進而表現磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、CK8/KRT8、FOXA2、及ECAD。
本說明書中之用語「內腔」意指管狀或袋狀之細胞結構體之內側空間。內腔例如可由液體填滿。於一個實施方式中，膀胱類器官之內腔係袋狀之細胞結構體之內側空間。
關於腹側後腸類器官之用語「P63」係癌抑制基因P53之同系物，意指於上皮中具有分化、生長、維持等作用之蛋白質。P63可用作膀胱上皮細胞標記物或腹側後腸/排泄腔標記。於細胞或類器官中表現之P63例如可藉由免疫染色法，使用抗P63抗體(例如，抗P63兔單株抗體(EPR5701))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「ΔNP63」意指欠缺N末端之反式激活域(TN)之p63之同功型。ΔNP63可用作膀胱上皮細胞標記物或腹側後腸標記物。於細胞或類器官中表現之ΔNP63例如可藉由免疫染色法，使用抗ΔNP63抗體(例如，兔抗ΔNP63(細胞訊號(Cell signaling)，#67825))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「GATA3」意指與DNA之由「GATA」組成之靶DNA序列結合而控制基因之開/關的轉錄因子。GATA3可用作腹側後腸標記物或膀胱上皮細胞標記物。於細胞或類器官中表現之GATA3例如可藉由免疫染色法，使用抗GATA3抗體(例如，山羊抗GATA3(R&D Systems，#AF2605))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「UPK1B」意指參與形成與尿溶蛋白Ia、II及III一同形成泌尿系統上皮之移行上皮之被覆細胞，且具有提高被覆細胞之透過性、障壁功能之作用的膜糖蛋白。UPK1B可用作膀胱上皮標記物或上皮組織標記。於細胞或類器官中表現之UPK1B例如可藉由免疫染色法，使用抗UPK1B抗體(小鼠抗UPK1B單株抗體(clone 1E1)(Sigma-aldrich，#WH0007348M2)進行檢測或測定。
本說明書中之用語「ISL1」意指具有LIM同源域之轉錄因子，該轉錄因子會作用於胰島素基因之表現調節區域。ISL1可用作腹側後腸標記物。於細胞或類器官中表現之ISL1例如可藉由免疫染色法，使用抗ISL1抗體(小鼠抗ISL1&2(DSHB，#39.4D5))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「SATB2」意指與富含AT之序列結合之DNA結合蛋白質。SATB2可用作結腸或直腸標記物或腹側後腸標記物。於細胞或類器官中表現之SATB2例如可藉由免疫染色法，使用抗SATB2抗體(兔抗SATB2(CELL MARQUE，#384R-14))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「CDX2」意指由CDX2基因編碼之同源盒蛋白。CDX2可用作中腸/後腸標記物。於細胞或類器官中表現之CDX2例如可藉由免疫染色法，使用抗CDX2抗體(例如抗CDX2抗體小鼠單株(CX2-88))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「SOX2」亦被稱為SRY(性別決定區Y)-box 2)，且意指未分化狀態ES細胞之自我複製維持所需之轉錄因子。SOX2可用作背側後腸標記物或肺/胃譜系標記。於細胞或類器官中表現之SOX2例如可藉由免疫染色法，使用抗SOX2抗體(例如，抗SOX2山羊多株抗體(R&D Systems，#AF2018))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「T」亦被稱為TBXT(T-box transcription factor T，T盒轉錄因子T)，意指經由稱為T盒之N末端區域而與稱為迴折T部位之DNA序列結合，會對中胚葉之形成及分化所需之基因之轉錄造成影響的轉錄因子。T可用作背側後腸標記物。於細胞或類器官中表現之T例如可藉由免疫染色法，使用抗T抗體(例如，山羊抗T/Brachyury抗體(R&D Systems，#AF2085))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「ZO1」意指因上皮細胞及內皮細胞之緊密結合(Tight junction)表現之膜磷蛋白質。ZO1可用作緊密結合標記。於細胞或類器官中表現之ZO1例如可藉由免疫染色法，使用抗ZO1抗體(山羊抗ZO1(ThermoFisher，#PA5-19090))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「細胞角蛋白8(KRT8或CK8)」係角蛋白之一個亞型，意指於肌上皮細胞、膜基底細胞中表現之分子量約45 kD之蛋白質。CK8/KRT8可用作腸管上皮標記物。於細胞或類器官中表現之CK8/KRT8例如可藉由免疫染色法，使用抗細胞角蛋白8大鼠單株抗體(TROMA-1))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「FOXA2」係Forkhead box protein A2(叉頭盒蛋白A2)之縮寫，意指於發育階段發揮重要作用之轉錄因子。FOXA2可用作早期腸管上皮標記物或發育中途之膀胱上皮細胞標記物。FOXA2例如可藉由免疫染色法，使用抗FOXA2抗體(小鼠抗FOXA2(Santa Cruz Biotechnology，#sc-101060))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「ECAD」亦被稱為E-鈣黏附蛋白(epithelial cadherin)，意指具有與細胞黏著相關之作用，且存在於細胞表面之跨膜型糖蛋白。ECAD可用作上皮組織標記。於細胞或類器官中表現之ECAD例如可藉由免疫染色法，使用抗ECAD抗體(例如，山羊抗ECAD(R&D SYSTEMS，#AF648))進行檢測或測定。
本說明書中之用語「HOXA13」意指人中由HOXA13基因編碼之同源盒蛋白。於細胞或類器官中表現之HOXA13例如可藉由定量RCR進行檢測或測定。
本說明書中之用語「磷酸化Smad1/5/8」意指於細胞內TGF-β訊號傳遞系統中發揮重要作用之轉錄因子。磷酸化Smad1/5/8可用作腹側後腸及排泄腔區域標記。於細胞或類器官中表現之磷酸化Smad1/5/8例如可藉由免疫染色法，使用抗Smad1/5/8抗體(例如，兔抗pSmad1/5/8(細胞訊號，#13820))進行檢測或測定。
本發明之一個實施方式之腹側後腸類器官可藉由包括步驟A及步驟B之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟B：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官。
於一個實施方式中，步驟B包括如下步驟b1及步驟b2，步驟b1：對胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官；步驟b2：對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟B包括步驟b3：對胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
本發明之一個實施方式之腹側後腸類器官可藉由包括步驟A、步驟b1及步驟b2之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用上述誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b1：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用上述誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官；步驟b2：對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
本發明之一個實施方式之腹側後腸類器官可藉由包括步驟A及步驟b3之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
步驟 A ：胚體內胚葉細胞之誘導分化步驟A包括：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞。
本說明書中之用語「多能幹細胞」意指可於試管內(in vitro)進行培養，具有會分化成源自三胚葉(外胚葉、中胚葉及內胚葉)之組織之能力、即多能性(pluripotency)之幹細胞。多能幹細胞例如可由受精卵、複製胚、生殖幹細胞、或組織內幹細胞等建立。於一個實施方式中，多能幹細胞係胚胎幹細胞(ES細胞)、由體細胞誘導之人工多能幹細胞(iPS細胞)、胚胎腫瘤細胞(EC細胞)、或胚胎生殖幹細胞(EG細胞)。多能幹細胞較佳為ES細胞或iPS細胞。
本說明書中之用語「ES細胞」係具有自我複製功能，且具有多能性(pluripotency)之幹細胞，且意指源自早期胚胎之多能幹細胞。於一個實施方式中，ES細胞係人類ES細胞。
本說明書中之用語「iPS細胞」係自體細胞誘導出之多能幹細胞，且意指藉由將體細胞初始化而人為地具有類似於胚性幹細胞之多能性的細胞。iPS細胞例如可藉由利用Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc等基因之表現將纖維母細胞等分化之細胞初始化而建立。於一個實施方式中，iPS細胞係藉由將人纖維母細胞等分化之細胞初始化而建立之人iPS細胞。
「誘導培養基A」包含：基本培養基、及含有活化素A及GSK3β抑制劑之添加劑。誘導培養基A例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)而製備。添加於誘導培養基A之上述添加劑之濃度係業者考慮提供可用於培養之細胞之動物種類而適當設定。「基本培養基」可以為可依據公知之操作說明進行製備之細胞培養用培養基，或者可以為可以商業方式獲取之細胞培養用培養基。基本培養基例如可為達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、最小必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、公知之幹細胞用培養基、或者公知之用以使幹細胞分化之培養基。基本培養基較佳為用以使幹細胞分化之培養基，例如可以為STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)。用以使幹細胞分化之培養基例如可依據Nature Protocols, vol.3, No.5, pp.768 - 776, 2008進行製備。誘導培養基A可進而包含無蛋白質培養基(例如，PFHM-II)、抗生素(例如青黴素/鏈黴素、慶大黴素)、或者抗生素-抗真菌劑混合液(例如抗生素-抗黴菌劑(Antibiotic-Antimycotic))、或其等之組合。
本說明書中之用語「活化素A」係屬於TGFβ超家族之因子，且係促進自腦下垂體前葉分泌FSH(促濾泡素)之蛋白質。活化素A係於細胞分化、生長、細胞凋亡、及致癌之調節中示出各種功能。誘導培養基A可含有例如10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之活化素A。
本說明書中之用語「GSK3β抑制劑」意指抑制與包含wnt/β-連環蛋白路徑之各種訊號傳遞路徑相關之絲胺酸-蘇胺酸蛋白激酶3β之作用的化合物。GSK3β抑制劑例如可為CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、星形孢菌素、K252A、WNT(較佳為WNT3A)或TWS119、或者其等之組合。GSK3β抑制劑較佳為CHIR-99021或WNT(較佳為WNT3A)。誘導培養基A可以顯示與0.1～5 μM、0.3～2.5 μM、或0.5～1.5之μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度之作用的濃度含有GSK3β抑制劑。「GSK3β抑制作用」例如可於規定量之GSK3β抑制劑之存在下，基於由β連環蛋白之核轉位產生之轉錄活性進行測定。由β連環蛋白之核轉位產生之轉錄活性可依據公知方法(例如螢光素酶活性測定)進行測定。由β連環蛋白之核轉位產生之轉錄活性例如可使用以商業方式獲取之套組(例如LEADING LIGHT(註冊商標)Wnt Reporter Assay Starter kit)進行測定。本說明書中用語「相同程度之作用」意指與作為對照之作用相比±30%以內、±20%以內、或±10%以內之作用。於一個實施方式中，相同程度之作用係與對照之作用相比±30%以內之作用。
誘導培養基A可含有0.1～5 μM、0.3～2.5 μM、或0.5～1.5 μM之GSK3β抑制劑(較佳為CHIR-99021)。誘導培養基A可以顯示與0.1～5 μM、0.3～2.5 μM、或0.5～1.5 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度之作用的濃度含有GSK3β抑制劑。誘導培養基A亦可含有0.2～200 ng/ml、10～100 ng/ml、或2～20 ng/ml之作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)。於誘導培養基A包含作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)之情形時，誘導培養基A可以顯示與0.1～5 μM、0.3～2.5 μM、或0.5～1.5 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度之作用的濃度含有WNT(較佳為WNT3A)。
下述之誘導培養基b2可以顯示與1～50 μM、3～25 μM、或5～10 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度之作用的濃度含有GSK3β抑制劑。於一個實施方式中，誘導培養基b2可含有2～2000 ng/ml、100～1000 ng/ml、或20～200 ng/ml之WNT(較佳為WNT3A)。下述之誘導培養基b3可以顯示與0.5～25 μM、1～15 μM、或2～8 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度之作用的濃度含有GSK3β抑制劑。於一個實施方式中，誘導培養基b3可含有1～1000 ng/mL、50～500 ng/mL、10～100 ng/mL之WNT(較佳為WNT3A)。
使用誘導培養基A之多能幹細胞之培養可於公知之細胞培養條件下實施。公知之細胞培養條件可維持在37℃且5%CO 2下。培養之溫度並不限定於37℃，可適當使用細胞培養領域中公知之溫度。CO 2濃度並不限定於5%，可適當使用細胞培養領域中公知之CO 2濃度。多能幹細胞之培養可實施2天～5天、2天～4天、或者3天。
「胚體內胚葉細胞」可藉由對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養而進行誘導分化。
誘導培養基A中所培養之多能幹細胞可使用公知之幹細胞用培養基進行預培養。此種多能幹細胞例如可藉由塗覆有iMatrix-511之細胞培養容器，使用StemFit AK02N培養基(REPROCELL)進行預培養。經預培養之多能幹細胞可使用公知之方法或能夠以商業方式獲取之試劑(例如，TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific))而自細胞培養容器中剝離。剝離出之細胞可於將培養基(例如，iMatrix-511(nippi)以最終濃度成為0.25 μg/cm 2之方式添加後所得之StemFit AK02N(10μM Y-27632))中進行懸浮。
於一個實施方式中，使用誘導培養基A之多能幹細胞之培養包括：將經預培養之多能幹細胞(例如人iPS或ES細胞)之細胞懸浮液以成為30,000～90,000 cells/cm 2之方式接種至6孔板中，並於37℃、CO 25%下培養1天。繼而，將培養基更換為作為誘導培養基A之STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加100 ng/mL 活化素A、1～1.25 μM CHIR99021、2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)，並培養3～5天。藉由上述培養而誘導分化成胚體內胚葉。培養基更換例如於第2天以後每天進行。較佳為確認細胞表現作為胚體內胚葉標記之FOXA2、SOX17。於胚體內胚葉誘導期間過長之情形時，有於其後之後腸誘導(後方化)之過程中前腸譜系細胞(ALB＋、AFP＋、PDX1＋)混入之比例提昇之傾向。因此，胚體內胚葉誘導期間較佳為選擇在表現FOXA2、SOX17之同時，在其後之後腸誘導過程中前腸譜系細胞之混入最為得到抑制之期間。關於接種之細胞密度，較佳為選擇如下條件，即於誘導分化第2天群落狀之細胞群向外擴展，於誘導分化第3天以片狀達成100%融合。進而較佳為選擇於後腸誘導時可獲得最多懸浮球狀細胞團塊之條件。於細胞密度較少之情形、或細胞密度較大之情形時，有難以獲得足夠之懸浮球狀細胞團塊之傾向。
步驟 b1 ：後腸誘導分化步驟b1包括：對胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官。
「誘導培養基B」包含：基本培養基；及含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之添加劑。一個實施方式之誘導培養基B係用以形成胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊，且包含基本培養基、及含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之添加劑。上述用以形成球狀細胞團塊之誘導培養基B於本說明書中亦稱為「誘導培養基b」。一個實施方式之誘導培養基B係用以形成後腸類器官，且包含基本培養基、及含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之添加劑。上述用以由球狀細胞團塊形成後腸類器官之誘導培養基B於本說明書中亦被稱為「誘導培養基b1」。下述用以由後腸類器官形成腹側後腸類器官之誘導培養基B於本說明書中亦被稱為「誘導培養基b2」。下述用以由胚體內胚葉細胞形成腹側後腸類器官之誘導培養基B或上述用以由球狀細胞團塊形成腹側後腸類器官之誘導培養基B於本說明書中亦稱為「誘導培養基b3」。
誘導培養基B例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)而進行製備。關於誘導培養基B之基本培養基適用關於誘導培養基A之基本培養基之說明。添加於誘導培養基B之上述添加劑之濃度係業者考慮提供可用於培養之細胞之動物種類而適當設定。誘導培養基B可進而含有肝素、無蛋白質培養基(例如PFHM-II)、抗生素(例如青黴素/鏈黴素、慶大黴素)、或者抗生素-抗真菌劑混合液(例如抗生素-抗黴菌劑)、或其等之組合。
「誘導培養基b」或「誘導培養基b1」包含基本培養基、及含有FGF及GSK3β抑制劑之添加劑。誘導培養基b及b1例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)而進行製備。與誘導培養基b及b1相關之基本培養基適用與誘導培養基A相關之基本培養基之說明。於一個實施方式中，誘導培養基b及b1包含纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑，且實質上不包含骨成形性蛋白質。於一個實施方式中，實質上不包含骨成形性蛋白質之誘導培養基b及b1完全不包含骨成形性蛋白質。於一個實施方式中，實質上不包含骨成形性蛋白質之誘導培養基b可以不會抑制胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊形成之濃度包含骨成形性蛋白質，例如可包含未達1 ng/ml、未達0.5 ng/ml、或未達0.1 ng/ml之骨成形性蛋白質。於一個實施方式中，實質上不包含骨成形性蛋白質之誘導培養基b1可以不會抑制由胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊形成後腸類器官之濃度包含骨成形性蛋白質，例如可包含未達1 ng/ml、未達0.5 ng/ml、或未達0.1 ng/ml之骨成形性蛋白質。
本說明書中之用語「纖維母細胞生長因子(FGF)」意指促進纖維母細胞或內皮細胞之生長之分子量16,000～20,000之蛋白質。FGF(例如FGF4)例如添加於誘導培養基B中以抑制源自前方內胚葉之細胞之混入為目的。FGF(例如FGF4)例如添加於誘導培養基B中以形成後腸球狀細胞團塊為目的。FGF例如可為FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、或者FGF23、或其等之組合。FGF較佳為FGF4或者FGF7、或其等之組合。
誘導培養基b及b1可含有20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或者100～300 ng/mL之FGF(較佳為FGF4)。誘導培養基b及b1可含有10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF7；或者20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4。誘導培養基b或b1可以顯示與在包含20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4之誘導培養基b或b1中培養所得之細胞或類器官中之前方內胚葉細胞標記物(例如，作為肝臟譜系標記之ALB、作為胰腺譜系標記之PDX1、或者作為肺/胃譜系標記之SOX2)之表現抑制相同程度的表現抑制之濃度包含FGF。在此背景下，使用誘導培養基b所培養之細胞可為於本發明之步驟A中誘導多能幹細胞分化成之胚體內胚葉細胞。在此背景下，使用誘導培養基b1所培養之細胞可為於本發明之步驟b1中由上述胚體內胚葉細胞形成之球狀細胞團塊。前方內胚葉細胞標記物之表現例如可依據免疫染色法進行測定。免疫染色法中，前方內胚葉細胞標記物之表現例如可使用能夠以商業方式獲取之抗體進行測定。本說明書中「相同程度之表現抑制」意指與作為對照之表現量相比±30%以內、±20%以內、或±10%以內之表現量。於一個實施方式中，相同程度之作用係±30%以內之表現量。
本說明書中用語「ALB」意指包含約600個胺基酸之分子量約66,000之作為蛋白質之白蛋白。ALB例如可用作肝臟譜系標記。於細胞或類器官中表現之ALB例如可藉由免疫染色法，使用抗白蛋白抗體進行檢測或測定。
本說明書中用語「胰腺十二指腸同源盒因子-1(PDX1，Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)」意指與胰島素基因啟動子區域結合，與胰島素基因之胰島β細胞特異性表現相關之同源域蛋白質。PDX1例如可用作胰腺譜系標記。於細胞或類器官中表現之PDX1例如可藉由免疫染色法，使用抗PDX1抗體進行檢測或測定。
誘導培養基b或b1可以顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度之作用的濃度包含FGF。「纖維母細胞生長作用」例如可於規定量之FGF之存在下，基於纖維母細胞之[ 3H]胸苷自細胞外摻入細胞內之量來進行測定。纖維母細胞例如可使用NR6R-3T3小鼠纖維母細胞。胸苷自細胞外摻入細胞內之量可依據公知之方法(例如，Eethods in Enzymology, Volume 109, 1985, Pages749 - 773中記載之方法)進行測定。
於一個實施方式中，誘導培養基b或b1係以顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度之作用的濃度包含FGF。
誘導培養基b及b1可含有1～50 μM、3～25 μM、5～10 μM、0.5～16 μM、3～12 μM、或6～10 μM之GSK3β抑制劑(較佳為CHIR-99021)。誘導培養基b及b1可含有2～2000 ng/ml、100～1000 ng/ml、或20～200 ng/ml之WNT(較佳為WNT3A)。誘導培養基b及b1可包含如下濃度之GSK3β抑制劑，即此濃度時顯示與1～50 μM、3～25 μM、5～10 μM、0.5～16 μM、3～12 μM、或6～10 μM、或者0.1～5 μM、0.3～2.5 μM、或0.5～1.5 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。於誘導培養基b或b1包含作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)之情形時，誘導培養基b3可包含如下濃度之WNT(較佳為WNT3A)，即此濃度時顯示與1～50 μM、3～25 μM、5～10 μM、0.5～16 μM、3～12 μM、或6～10 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。
誘導培養基b與誘導培養基b1其等之組成及/或用量可相同亦可不同。於一個實施方式中，誘導培養基b與誘導培養基b1其等之組成及/或用量係相同。
「後腸類器官」例如可藉由對胚體內胚葉細胞使用本發明之誘導培養基B進行培養而形成。於一個實施方式中，後腸類器官可藉由如下方式形成：例如對胚體內胚葉細胞使用含有FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b進行培養，繼而於細胞外基質凝膠中，使用含有FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b1進行三維培養。細胞外基質凝膠中之後腸類器官可依據公知之方法或使用可以商業方式獲取之試劑進行回收。細胞外基質凝膠中之後腸類器官例如可藉由使用金屬蛋白酶，溫和地破壞細胞外基質凝膠而回收。
於一個實施方式中，後腸類器官可藉由如下方式形成：例如對胚體內胚葉細胞使用含有FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b進行培養，繼而於細胞外基質凝膠上，使用含有FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b1進行培養。於一個實施方式中，後腸類器官可藉由如下方式形成：例如對胚體內胚葉細胞使用含有FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b進行培養，繼而使用含有作為分散成分之細胞外基質、FGF及GSK3β抑制劑之誘導培養基b1進行培養。
本說明書中之用語「細胞外基質(ECM)」並無限定，包含水、多糖、彈力蛋白、整合素、及糖蛋白。糖蛋白例如包含膠原蛋白、內功素(巢蛋白)、纖維黏連蛋白、及層黏連蛋白。ECM例如可藉由如下方式製造：於試管內對ECM產生細胞(例如上皮細胞、內皮細胞、壁內胚葉樣細胞、或纖維母細胞)培養後，將上述ECM細胞去除。ECM產生細胞例如可為主要產生膠原蛋白及蛋白多糖之軟骨細胞；主要產生IV型膠原蛋白、層黏連蛋白、間質原膠原、及纖維黏連蛋白之纖維母細胞；以及主要產生膠原蛋白(I型、III型、及V型)、軟骨素硫酸蛋白多糖、玻尿酸、纖維黏連蛋白、及肌腱蛋白-C之結腸肌纖維母細胞。ECM能夠以商業方式獲取。可以商業方式獲取之細胞外基質例如可為細胞外基質蛋白質(Invitrogen)、源自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤細胞之基底膜製備物(例如Cultrex(註冊商標)Basement Membrane Extract(Trevigen, Inc.)、或者Matrigel(註冊商標)(康寧公司))。ECM可為合成細胞外基質(例如，ProNectin(Sigma Z378666))。細胞外基質可為1種、或2種以上之混合物。於一個實施方式中，ECM為Matrigel。
與後腸類器官形成相關之細胞外基質凝膠較佳為製成彈力與由蛋白質濃度1～8 mg/mL、1.5～6 mg/mL、或2.5 mg/mL或者5 mg/mL之Matrigel溶液形成之凝膠相同程度的凝膠。與後腸類器官形成相關之細胞外基質凝膠較佳為由蛋白質濃度1～8 mg/mL、1.5～6 mg/mL、或1.5～3.5 mg/mL或者4～6 mg/mL之Matrigel形成。於實施下述步驟c2而形成膀胱類器官之情形時，細胞外基質凝膠較佳為製成彈力與由蛋白質濃度1～4 mg/mL、2～3 mg/mL、或2.5 mg/mL之Matrigel溶液形成之凝膠相同程度之凝膠。本說明書中用語「相同程度之彈力」意指與作為對象之彈力相比±30%以內、±20%以內、或±10%以內之彈力。於一個實施方式中，相同程度之彈力係與作為對象之彈力相比±30%以內之彈力。與膀胱類器官形成相關之細胞外基質凝膠較佳為由蛋白質濃度1～4 mg/mL、2～3 mg/mL、或2.5 mg/mL之Matrigel形成。
作為「分散成分」之細胞外基質例如以分散或溶解於誘導培養基中之狀態存在。於以分散成分之形式存在之情形時，細胞外基質例如以誘導培養基之每單位容積為10%v/v以下、7%v/v以下、5%v/v以下、例如2.5%v/v之分量存在。於一個實施方式中，誘導培養基包含0.1～10%v/v、0.1～7%v/v、0.1～5%v/v、1～10%v/v、1～7%v/v、1～5%v/v、1～2.5%v/v、2～10%v/v、2～7%v/v、2～5%v/v、或2～2.5%v/v之分量之細胞外基質。於細胞外基質包含源自生物體之產物(例如源自小鼠肉瘤細胞之基底膜製備物)之情形時，就防止或減少所製造之類器官之污染的觀點而言，誘導培養基中之細胞外基質之含有濃度較佳為低濃度。
使用誘導培養基b之胚體內胚葉細胞之培養例如包括：於胚體內胚葉細胞黏著在培養容器之表面上之狀態下進行培養。將此種狀態下之培養於本說明書中亦稱為二維培養。於一個實施方式中，藉由使用誘導培養基b之胚體內胚葉細胞之二維培養，而形成上述細胞之球狀細胞團塊，一部分球狀細胞團塊可於培養基中懸浮。於一個實施方式中，使用誘導培養基b，將低吸附性之培養容器中之胚體內胚葉細胞進行靜置培養，藉此形成上述細胞之球狀細胞團塊，一部分球狀細胞團塊可於培養基中懸浮。可將於培養基中懸浮之球狀細胞團塊及附著於培養容器之球狀細胞團塊藉由移液等進行回收。使用誘導培養基b之胚體內胚葉細胞之培養例如可於公知之細胞培養條件下實施3天～6天、3天～5天、或者4天。
使用誘導培養基b1之胚體內胚葉細胞之培養包括：將上述胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊於細胞外基質之存在下進行培養。於細胞外基質之存在下之上述球狀細胞團塊之培養例如包括：對上述球狀細胞團塊使用包含細胞外基質作為分散成分之誘導培養基b1進行培養。上述培養例如可藉由使用低吸附性之培養容器之靜置培養或旋轉懸浮培養來實施。藉由於作為分散成分之細胞外基質之存在下培養上述球狀細胞團塊，可形成後腸類器官。於細胞外基質之存在下之上述球狀細胞團塊之培養例如包括：將上述球狀細胞團塊接種至細胞外基質凝膠上來進行培養。藉由於細胞外基質凝膠上培養上述球狀細胞團塊，可形成後腸類器官。於細胞外基質之存在下之上述球狀細胞團塊之培養例如包括：於使上述球狀細胞團塊存在於細胞外基質凝膠中之狀態下進行培養。於本說明書中亦將此種狀態下之培養稱為三維培養。藉由胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之三維培養，可形成後腸類器官。於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基b1之胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之培養例如可於公知之細胞培養條件下實施3天～6天、3天～5天、或4天。
於一個實施方式中，步驟b1包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基b進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，形成包含上述胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之細胞外基質凝膠，繼而於上述細胞外基質凝膠中，對上述球狀細胞團塊使用誘導培養基b1進行培養而形成後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b1包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基b進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，繼而，於細胞外基質凝膠上，對上述球狀細胞團塊使用誘導培養基b1進行培養而形成後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b1包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基b進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，繼而於作為分散成分之細胞外基質之存在下，對上述球狀細胞團塊使用誘導培養基b1進行培養而形成後腸類器官。
於一個實施方式中，步驟b1包括：將胚體內胚葉細胞於作為誘導培養基b之STEMdiff APEL2培養基(200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)中培養1～9天，以形成胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊。於該球狀細胞團塊形成之期間，在球狀細胞團塊最多懸浮之時期回收懸浮球狀細胞團塊，並開始三維培養。自球狀細胞團塊最多懸浮之前一天起以100 rpm開始振盪培養。第二天，將懸浮之球狀細胞團塊回收至35 mm培養皿中。繼而，藉由移液回收殘留在已回收了懸浮球狀細胞團塊之孔中之球狀細胞團塊。所回收之球狀細胞團塊係事先置於冰上。將生長因子減量型Matrigel(康寧)利用誘導培養基b1進行稀釋(2.5～10 mg/mL)，以50μL/孔添加至細胞培養小室透明PET薄膜(24孔、孔隙尺寸8.0 μm)(康寧)中，於37℃下保溫30 min～60 min以進行凝膠化。繼而，於50 μL之Matrigel溶液中加入所回收之球狀細胞團塊30～100個並加以混合，將全部混合物添加到已凝膠化之Matrigel之上。於37℃、CO 25%下保溫30 min～60 min以進行凝膠化，於細胞培養小室(Cell Culture Insert)之上加入300 μL之誘導培養基b1，於細胞培養小室(Cell Culture Insert)之下加入200 μL之誘導培養基b，於37℃、CO 25%下進行培養。關於培養基更換，較佳為於二維培養時每天進行，於三維培養時每2天進行。後腸誘導分化時，較佳為確認細胞共表現作為中腸/後腸標記物之FOXA2、CDX2。可利用誘導培養基b1持續培養直至可確認會於後腸/排泄腔區域表現之P63之表現。
步驟 b2 ：後腸腹側化步驟b2包括：對後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
「誘導培養基b2」包含基本培養基、及含有FGF、GSK3β抑制劑、及成骨因子之添加劑。誘導培養基b2例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)來製備。與誘導培養基b2相關之基本培養基適用與誘導培養基A相關之基本培養基之說明。
誘導培養基b2可含有20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF(較佳為FGF4)。誘導培養基b2可含有10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF7；或者20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4。誘導培養基b2可包含如下濃度之FGF，即此濃度時顯示與利用包含20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4之誘導培養基b2培養所得之類器官中之前方內胚葉細胞標記物(例如作為肝臟譜系標記之ALB、作為胰腺譜系標記之PDX1、或作為肺/胃譜系標記之SOX2)之表現抑制相同程度的表現抑制。在此背景下，使用誘導培養基b2所培養之類器官可為於本發明之步驟b1中誘導胚體內胚葉細胞分化成之後腸類器官。誘導培養基b2可包含如下濃度之FGF，即此濃度時顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度的作用。於一個實施方式中，誘導培養基b2包含如下濃度之FGF，即此濃度時顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度的作用。
誘導培養基b2可含有1～50 μM、3～25 μM、5～10 μM、0.5～16 μM、3～12 μM、或6～10 μM之GSK3β抑制劑(較佳為CHIR-99021)。誘導培養基b2可含有2～2000 ng/ml、100～1000 ng/ml、或20～200 ng/ml之作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)。誘導培養基b2可含有如下濃度之GSK3β抑制劑，即此濃度時顯示與1～50 μM、3～25 μM、或5～10 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。於誘導培養基b2包含作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)之情形時，誘導培養基b2可含有如下濃度之WNT(較佳為WNT3A)，即此濃度時顯示與1～50 μM、3～25 μM、或5～10 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。
本說明書中之用語「骨成形性蛋白質(BMP)」係屬於轉化生長因子β超家族之蛋白質，且意指誘導異位性骨形成之蛋白質。BMP添加於誘導培養基B(例如誘導培養基b2及b3)中以誘導腹側後腸類器官。BMP例如可為BMP2、BMP4、或BMP7、或者其等之組合。BMP較佳為BMP4。誘導培養基b2可含有3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP(例如BMP4)。
誘導培養基b2可包含如下濃度之BMP，即此濃度時顯示與3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4所示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度之作用。「鹼性磷酸酶產生誘導作用」例如於特定量之BMP之存在下基於軟骨形成細胞中之鹼性磷酸酶之產生量進行測定。軟骨形成細胞例如可使用小鼠軟骨形成細胞。鹼性磷酸酶之產生量可依據公知方法(例如，Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume315, Issue2, Pages272-280中記載之方法)進行測定。
誘導培養基b2可包含如下濃度之BMP，即此濃度時顯示與利用包含3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4之誘導培養基b2培養所得之細胞或類器官中之腹側後腸標記物(例如GATA3、P63、或HOXA13)之表現相同程度的表現。在此背景下，使用誘導培養基b2所培養之細胞可為於本發明之步驟b1中誘導胚體內胚葉細胞分化成之後腸類器官。上述腹側後腸標記物之表現例如可依據免疫染色法進行測定。免疫染色法中，腹側後腸標記物之表現可使用本發明中關於各標記所示之抗體進行測定。本說明書中用語「相同程度之表現」意指與作為對照之表現量相比±30%以內、±20%以內、或±10%以內之表現。於一個實施方式中，相同程度之表現係與作為對照之表現量相比±30%以內之表現。
於一個實施方式中，誘導培養基b2包含如下濃度之BMP，即此濃度時顯示與3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4所示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度之作用。
關於誘導培養基b、誘導培養基b1、及自誘導培養基b2中去除BMP後所得之培養基，其等之組成及/或用量可相同亦可不同。於一個實施方式中，誘導培養基b、、誘導培養基b1、及自誘導培養基b2中去除BMP後所得之培養基其等之組成及/或用量相同。
於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基b2之後腸類器官的培養適用上述於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基b1之胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之培養的說明。於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基b2之後腸類器官的培養例如可於公知之細胞培養條件下實施。公知之細胞培養條件可維持在37℃且5%CO 2下。培養之溫度並不限定於37℃，可適當使用細胞培養領域中公知之溫度。CO 2濃度並不限定於5%，可適當使用細胞培養領域中公知之CO 2濃度。後腸類器官之培養可實施3天～6天、3天～5天、或4天。
步驟b1與步驟b2之細胞外基質之狀態(凝膠狀態或分散成分之狀態)可相同亦可不同。於一個實施方式中，步驟b1與步驟b2之細胞外基質之狀態係相同。於一個實施方式中，包含後腸類器官之細胞外基質凝膠可為步驟b1中所形成之細胞外基質凝膠，或者還可以為以如下方式新形成之細胞外基質凝膠，即於步驟b1之後，自細胞外基質凝膠回收後腸類器官，形成包含所回收之上述後腸類器官之細胞外基質凝膠。就操作之簡潔度之觀點而言，步驟b2中之包含後腸類器官之細胞外基質凝膠係步驟b1中所形成之細胞外基質凝膠。
於一個實施方式中，步驟b2包括：使用誘導培養基b2對細胞外基質凝膠中之後腸類器官進行培養而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b2包括：於細胞外基質凝膠上使用誘導培養基b2對後腸類器官進行培養而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b2包括：於作為分散成分之細胞外基質之存在下使用誘導培養基b2對後腸類器官進行培養而形成腹側後腸類器官。
於一個實施方式中，使用誘導培養基b2之後腸類器官之培養包括：使用作為誘導培養基b2之STEMdiff APEL2培養基(30 ng/mL BMP4、200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2%PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)或STEMdiff APEL2培養基(30 ng/mL BMP4、100 ng/mL FGF7、200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2%PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)，對細胞外基質凝膠中之後腸類器官培養3～6天，以使後腸腹側化。誘導培養基b2係於細胞培養小室凝膠之上添加200 μL，於細胞培養小室凝膠之下添加300 μL，且每2天進行培養基更換。較佳為繼續腹側化直至於細胞中作為背側後腸標記物之SOX2、CDX2之表現減少，且作為腹側後腸/排泄腔標記之P63強表現。於後方化及腹側化不充分之情形時，會混入中腸及背側腸管譜系細胞。於該情形時，後腸誘導期間或後腸腹側化期間延長。
步驟 b3 ：腹側後腸類器官形成步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，繼而於細胞外基質之存在下使用含有纖維母細胞生長因子、CSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用上述誘導培養基B進行培養而形成胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊，繼而於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基b3進行培養，而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，用以形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之誘導培養基B之組成及/或用量可與上述誘導培養基b3相同。於此背景下，步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
本發明之一個實施方式之腹側後腸類器官可藉由包括步驟A及步驟b3之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官。
「誘導培養基b3」包含基本培養基、及含有FGF、GSK3β抑制劑、及成骨因子之添加劑。誘導培養基b3例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)而製備。與誘導培養基b3相關之基本培養基適用與誘導培養基A相關之基本培養基之說明。
誘導培養基b3可含有20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF(較佳為FGF4)。誘導培養基b3可含有10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF7；或者20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4。誘導培養基b3可含有0.5～25 μM、1～15 μM、2～8 μM、0.1～10 μM、0.5～9 μM、1～8 μM、2～6 μM、或3～5 μM之GSK3β抑制劑(較佳為CHIR-99021)。誘導培養基b3可含有0.1～100 ng/mL、0.5～80 ng/mL、1～60 ng/mL、2～40 ng/mL、或5～20 ng/mL之成骨因子(較佳為BMP4)。
誘導培養基b3可含有如下濃度之FGF，即於此濃度時顯示與利用包含20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4之誘導培養基b3培養所得之細胞或類器官中之前方內胚葉細胞標記物(例如，作為肝臟譜系標記之ALB、作為胰腺譜系標記之PDX1、或者作為肺/胃譜系標記之SOX2)之表現抑制相同程度的表現抑制。於此背景下，使用誘導培養基b3所培養之細胞可為本發明之步驟A中誘導多能幹細胞分化成之胚體內胚葉細胞。於此背景下，使用誘導培養基b3所培養之類器官可為於本發明之步驟b1中誘導上述胚體內胚葉細胞分化成之後腸類器官。誘導培養基b3可含有如下濃度之FGF，即於此濃度時顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度的作用。於一個實施方式中，誘導培養基b3包含如下濃度之FGF，即於此濃度時顯示與20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度的作用。
誘導培養基b3可含有1～1000 ng/mL、50～500 ng/mL、10～100 ng/mL之作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)。誘導培養基b3可含有如下濃度之GSK3β抑制劑，即於此濃度時顯示與0.5～25 μM、1～15 μM、或2～8 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。於誘導培養基b3包含作為GSK3β抑制劑之WNT(較佳為WNT3A)之情形時，誘導培養基b3可含有如下濃度之WNT(較佳為WNT3A)，即於此濃度時顯示與0.5～25 μM、1～15 μM、或2～8 μM之CHIR-99021所顯示之GSK3β抑制作用相同程度的作用。
誘導培養基b3可含有如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與0.1～100 ng/mL、0.5～80 ng/mL、1～60 ng/mL、2～40 ng/mL、或5～20 ng/mL之BMP4所顯示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度的作用。誘導培養基b3可含有如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與利用包含0.1～100 ng/mL、0.5～80 ng/mL、1～60 ng/mL、2～40 ng/mL、或5～20 ng/mL之BMP4之誘導培養基b3培養所得之細胞或類器官中之腹側後腸標記物(例如GATA3、P63、或HOXA13)之表現相同程度的表現。於一個實施方式中，誘導培養基b3包含如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與0.1～100 ng/mL、0.5～80 ng/mL、1～60 ng/mL、2～40 ng/mL、或5～20 ng/mL之BMP4所顯示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度的作用。
於一個實施方式中，步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基B(較佳為誘導培養基b3)進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，形成包含上述胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊之細胞外基質凝膠，繼而於上述細胞外基質凝膠中對上述球狀細胞團塊使用誘導培養基b3進行培養而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基B(較佳為誘導培養基b3)進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，繼而於細胞外基質凝膠上對上述球狀細胞團塊使用誘導培養基b3進行培養而形成腹側後腸類器官。於一個實施方式中，步驟b3包括：對胚體內胚葉細胞使用誘導培養基B(較佳為誘導培養基b3)進行培養而形成胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊，繼而對上述球狀細胞團塊於作為分散成分之細胞外基質之存在下使用誘導培養基b3進行培養而形成腹側後腸類器官。
於一個實施方式中，步驟b3包括：將胚體內胚葉細胞於作為誘導培養基b3之STEMdiff APEL2培養基(10～30 ng/mL BMP4、200 ng/mL FGF4、4 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)中培養8～11天，以形成胚體內胚葉細胞之球狀細胞團塊。於該球狀細胞團塊形成之期間，在球狀細胞團塊最多懸浮之時期回收懸浮球狀細胞團塊，開始三維培養。自球狀細胞團塊最多懸浮之前一天起以100 rpm開始振盪培養。第二天，將懸浮之球狀細胞團塊回收至35 mm培養皿中。繼而，藉由移液，將培養基吹送至殘留在已回收了懸浮球狀細胞團塊之孔中之球狀細胞團塊，使球狀細胞團塊懸浮以進行回收。所回收之球狀細胞團塊係預先置於冰上。將生長因子減量型Matrigel(康寧)利用誘導培養基b3進行稀釋(25～100%濃度)，並以50 μL/孔加入至細胞培養小室透明PET薄膜(24孔、孔隙尺寸8.0 μm)(康寧)中，於37℃下保溫30 min～60 min以進行凝膠化。繼而，於50 μL之Matrigel溶液中加入所回收之球狀細胞團塊30～100個並加以混合，將全部混合物添加到已凝膠化之Matrigel之上。於37℃、CO 25%下保溫30 min～60 min以進行凝膠化，於細胞培養小室之上添加200 μL之誘導培養基b3，於細胞培養小室之下添加300 μL之誘導培養基b3，於37℃、CO 25%下進行培養。關於培養基更換，於二維培養時每天進行，於三維培養時每2天進行。於腹側後腸誘導分化時，利用誘導培養基b3持續培養，直至細胞中作為背側中腸/後腸標記物之CDX2、SOX2、及T均表現減少或不表現其等，且作為腹側後腸/排泄腔標記之GATA3、及P63表現。所獲得之腹側後腸類器官具有帶弧度之管腔結構。於後方化及腹側化不充分之類器官中，觀察到中腸及背側腸管譜系細胞。於該情形時，延長利用誘導培養基b3進行培養、或者提高誘導培養基b3中之BMP4之濃度。
胚體內胚葉細胞之誘導分化(步驟A)、及腹側後腸類器官之形成(步驟B)之各步驟中之各用語的說明及包括培養條件之實施方式的說明係適用於其等步驟中記載之相對應的各用語及實施方式。
[膀胱類器官或其製造方法] 本發明之一個態樣提供一種膀胱類器官之製造方法。本發明之另一態樣提供一種膀胱類器官。
本說明書中之用語「膀胱類器官」意指具有至少2個細胞層之類器官。上述至少2個細胞層包括：第一細胞層，其包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；及第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞。一個實施方式之膀胱類器官包括：第一細胞層，其包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63及KRT5之細胞。亦可自表現方面上，特定出上述膀胱類器官例如包括：第一細胞層，其沿上述膀胱類器官之最外周存在且包含共表現P63及KRT5之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層存在於內側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層存在於內側方向上且包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞。關於如此特定出之各細胞層，於本說明書中，將上述第一細胞層稱為基底細胞層(basal-cell layer)，將上述第二細胞層稱為中間細胞層(intermediate-cell layer)，將上述第三細胞層稱為表面細胞層(superficial-cell layer)。
膀胱類器官例如可藉由本發明之膀胱類器官之製造方法進行製造。於上述膀胱類器官之製造方法中，在形成腹側後腸類器官後，由上述腹側後腸類器官藉由試管內培養而形成膀胱類器官之情形時，有時於本說明書中將該膀胱類器官稱為「膀胱樣類器官」。膀胱類器官其長徑可為80 μm以上、100 μm以上、120 μm以上、150 μm以上、或200 μm以上。膀胱類器官例如可用於評估受驗物質之藥物應答性。膀胱類器官例如可用作本發明之再生醫學用組合物之有效成分。
一個實施方式之膀胱類器官不具有內腔結構；且包括：第一細胞層，其包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63及KRT5之細胞。於一個實施方式中，上述膀胱類器官包含第四細胞層，其相對於上述第三細胞層局部化於外側方向上且包含間質樣細胞。於一個實施方式中，上述膀胱類器官還包含第五細胞層，其相對於上述第四細胞層局部化於外側方向上且包含平滑肌細胞。
一個實施方式之膀胱類器官具有內腔；且包括：第一細胞層，其面對上述內腔且包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；及第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞。上述第一細胞層包圍上述內腔、或者面對上述內腔地存在。一個實施方式之膀胱類器官具有內腔；且包括：第一細胞層，其面對上述內腔且包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞；及第三細胞層，其相對於上述第二細胞層局部化於外側方向上且包含共表現P63及KRT5之細胞。上述第一細胞層包圍上述內腔、或面對上述內腔地存在。於一個實施方式中，上述膀胱類器官包括第四細胞層，其相對於上述第三細胞層局部化於外側方向上且包含間質樣細胞。於一個實施方式中，上述膀胱類器官進而包括第五細胞層，其相對於上述第四細胞層局部化於外側方向上且包含平滑肌細胞。
膀胱類器官之進一步特徵在於：例如表現選自由ΔN63、GATA3、ISL1及SATB2所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、或3種以上)腹側後腸標記物；表現選自由Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8、ECAD、及UPK1B所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種、3種、4種、5種或6種以上)標記；且實質上不表現選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種或3種，較佳為3種)。一個實施方式之膀胱類器官還表現ΔNP63及GATA3之任一者或兩者。上述膀胱類器官表現選自由Smad1/5/8、FOXA2、ECAD、及UPK1B所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種、或3種以上)之標記。上述膀胱類器官實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2及CDX2之任一者。
本說明書中之用語「尿溶蛋白2(UPK2)」意指參與形成與尿溶蛋白Ia、Ib、III一同形成泌尿系統上皮之移行上皮之被覆細胞，具有提高被覆細胞之透過性、障壁功能之作用的分子量約15 kDa之膜糖蛋白。UPK2可用作膀胱上皮標記物。於細胞或類器官中表現之UPK2例如可藉由免疫染色法，使用抗UPK2抗體(例如，小鼠抗尿溶蛋白II(BIOCARE MEDICAL，#ACR3051C)進行檢測或測定。
與膀胱類器官相關之用語「P63」可用作膀胱上皮標記物。於細胞或類器官中表現之P63例如可藉由免疫染色法，使用抗P63抗體(例如，兔抗P63(abcam，#ab124762)進行檢測或測定。
本說明書中之用語「角蛋白5(KRT5)」意指與角蛋白14二聚物化，形成構成基底上皮細胞之細胞骨架之中間絲的由KRT5基因編碼之蛋白質。KRT5可用作膀胱上皮標記物。於細胞或類器官中表現之KRT5例如可藉由免疫染色法，使用抗KRT5抗體(例如，雞抗角蛋白5(BioLegend，#905903)進行檢測或測定。
本說明書中之用語「細胞層」意指主要存在特定細胞種之細胞集群之堆積。細胞層例如可為特定之1種細胞種存在70%以上、75%、80%、85%、或90%以上之細胞集群的重疊。於一個例中，第一、第二、或第三細胞層可以為能夠與其他細胞集群區分之主要存在特定之1種細胞種之一個細胞集群的區域。
於一個例中，細胞層包含70%以上、75%以上、80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上之實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞。於一個例中，細胞層本質上由實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞組成。於一個例中，包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層具有袋狀結構，且具有內腔。於上述例中，上述內腔被上述細胞層包圍。於上述例中，上述細胞層係面對上述內腔。於一個例中，包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層相對於面對內腔且包含下述共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或者本質上由該等細胞組成之細胞層，在內側方向上重疊。
於一個例中，細胞層包含70%以上、75%以上、80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上之共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞。於一個例中，細胞層本質上由共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞組成。於一個例中，包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層具有袋狀結構。於一個例中，上述細胞層相對於包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層於外側方向上重疊。於上述例中，共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞相對於包含表現UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層局部化於外側方向上。於一個例中，包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層存在於包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層、與下述包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層之間。
於一個例中，細胞層包含70%以上、75%以上、80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上之共表現P63及KRT5之細胞。於一個例中，細胞層本質上由共表現P63及KRT5之細胞組成。於一個例中，包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層具有袋狀結構。於一個例中、上述細胞層相對於包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層於外側方向上重疊。於上述例中，共表現P63及KRT5之細胞相對於包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層局部化於外側方向上。於一個例中，包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層存在於包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層、與下述包含間質樣細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層之間。
於一個例中，細胞層包含70%以上、75%以上、80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上之間質樣細胞。於一個例中，細胞層本質上由間質樣細胞組成。於一個例中，包含間質樣細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層具有袋狀結構。於一個例中，上述細胞層相對於包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層於外側方向上重疊。於上述例中，間質樣細胞相對於包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層局部化於外側方向上。於一個例中，包含間質樣細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層存在於包含共表現P63及KRT5之細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層、與下述包含平滑肌細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層之間。
於一個例中，細胞層包括70%以上、75%以上、80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上之平滑肌細胞。於一個例中，細胞層本質上由平滑肌細胞組成。於一個例中，包含平滑肌細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層具有袋狀結構。於一個例中，上述細胞層相對於包含間質樣細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層於外側方向上重疊。於上述例中，平滑肌細胞相對於包含間質樣細胞或本質上由該等細胞組成之細胞層局部化於外側方向上。
本說明書中用語「間質樣細胞」意指構成上皮細胞之支持組織之細胞。間質樣細胞例如包含纖維母細胞。於一個實施方式中，包含間質樣細胞之細胞層包含以表現波形蛋白(VIM)之細胞為主之細胞。於一個實施方式中，包含間質樣細胞之細胞層係於膀胱類器官中存在於包含共表現P63及KRT5之細胞之細胞層、與包含表現αSMA之平滑肌細胞之細胞層之間的細胞層，上述細胞層所主要包含之細胞表現VIM。
本說明書中用語「VIM」意指間葉細胞所特有之中間絲。VIM可用作間葉系幹細胞標記物。於細胞或類器官中表現之VIM例如可藉由免疫染色法，使用抗VIM抗體(例如，Chicken Anti-Vimentin(NOVUS，#NB300-223))進行檢測或測定。
本說明書中用語「平滑肌細胞」係細長之紡錘形單核細胞，且意指於細胞內存在大量肌動蛋白絲及少量肌凝蛋白絲之細胞。於一個實施方式中，包含平滑肌細胞之細胞層包含以表現αSMA之細胞為主之細胞。於一個實施方式中，包含平滑肌細胞之細胞層包含以共表現αSMA及VIM之細胞為主之細胞。
本說明書中用語「α-平滑肌肌動蛋白(αSMA，α-smooth muscle actin)」亦稱為ACTA2，意指屬於肌動蛋白家族之蛋白質。αSMA可用作平滑肌細胞標記物。於細胞或類器官中表現之αSMA例如可藉由免疫染色法，使用抗αSMA抗體(兔抗αSMA(細胞訊號，#19245T))進行檢測或測定。
膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟B、步驟c1及步驟c2或步驟c3之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟B：對上述胚體內胚葉細胞使用誘導培養基B進行培養，繼而於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c1：於細胞外基質之存在下使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C進行培養；步驟c2：導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位；步驟c3：於存在間葉系幹細胞或間葉細胞之情況進行培養。
步驟 c1 ：膀胱上皮之誘導分化 ( 試管內 培養 )步驟c1包括：對腹側後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用誘導培養基C進行培養。
「誘導培養基C」包含：基本培養基、及含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之添加劑。誘導培養基C例如可藉由於基本培養基(液體)中添加上述添加劑(固體或液體)而進行製備。供添加於誘導培養基C之上述添加劑之濃度係業者考慮提供可用於培養之細胞之動物種類而適當設定。與誘導培養基C相關之基本培養基適用與誘導培養基A相關之基本培養基之說明。誘導培養基C可進而含有：肝素、無蛋白質培養基(例如PFHM-II)、抗生素(例如青黴素/鏈黴素、慶大黴素)、或抗生素-抗真菌劑混合液(例如抗生素-抗黴菌劑)、或者其等之組合。
誘導培養基C可含有10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF(較佳為FGF7)。誘導培養基C可含有10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF7，或者20～1000 ng/mL、60～500 ng/mL、或100～300 ng/mL之FGF4。誘導培養基C可含有如下濃度之FGF，即於此濃度時顯示與10～500 ng/mL、30～250 ng/mL、或50～150 ng/mL之FGF7所顯示之纖維母細胞生長作用相同程度的作用。
誘導培養基C可含有3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之骨成形性蛋白質(較佳為BMP4)。誘導培養基C可含有如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4所顯示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度的作用。誘導培養基C可含有如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與利用包含3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4之誘導培養基C培養所得之類器官中之腹側後腸標記物(例如GATA3、P63、或HOXA13)之表現相同程度的表現。於此背景下，使用誘導培養基C所培養之類器官可為於本發明之步驟b2或b3中所形成之膀胱類器官。上述腹側後腸標記物之表現例如可依據免疫染色法進行測定。於免疫染色法中，腹側後腸標記物之表現可使用本發明中關於各標記所示之抗體進行測定。於一個實施方式中，誘導培養基C包含如下濃度之BMP，即於此濃度時顯示與3～150 ng/mL、9～75 ng/mL、或15～45 ng/mL之BMP4所顯示之鹼性磷酸酶產生誘導作用相同程度的作用。
誘導培養基C可進而含有0～1 μM、10 nM～500 nM、30 nM～300 nM、或50 nM～150 nM之視黃酸(較佳為全反式視黃酸)。
於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基C之腹側後腸類器官的培養適用上述於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基b1之胚體內胚葉細胞球狀細胞團塊的培養之說明。於細胞外基質之存在下之使用誘導培養基C之腹側後腸類器官的培養例如可於公知之細胞培養條件下實施。公知之細胞培養條件可維持在37℃且5%CO 2下。培養之溫度並不限定於37℃，可適當使用細胞培養領域中公知之溫度。CO 2濃度並不限定於5%，可適當使用細胞培養領域中公知之CO 2濃度。腹側後腸類器官之培養可實施5天～30天、5天～25天、5～20天、5～15天、或5～10天。
步驟c1之細胞外基質之狀態(凝膠狀態或分散成分之狀態)可與步驟b1及步驟b2各自相同，亦可不同。於一個實施方式中，步驟c1之細胞基質之狀態係與步驟b1及步驟b2各自之細胞外基質之狀態相同。於一個實施方式中，包含腹側後腸類器官之細胞外基質凝膠可為步驟b1及步驟b2中所形成之細胞外基質凝膠，或者亦可為新形成之細胞外基質凝膠，即於步驟b2之後，自細胞外基質凝膠回收腹側後腸類器官，新形成包含所回收之上述腹側後腸類器官之細胞外基質凝膠。就操作之簡潔性之觀點而言，步驟c1中之包含腹側後腸類器官之細胞外基質凝膠係步驟b1及步驟b2中所形成之細胞外基質凝膠。
於一個實施方式中，步驟c1包括：對細胞外基質凝膠中之腹側後腸類器官使用誘導培養基C進行培養而形成膀胱類器官。於一個實施方式中，步驟c1包括：於細胞外基質凝膠上對腹側後腸類器官使用誘導培養基C進行培養而形成膀胱類器官。於一個實施方式中，步驟c1包括：於作為分散成分之細胞外基質之存在下，對腹側後腸類器官使用誘導培養基C進行培養而形成膀胱類器官。
於一個實施方式中，使用誘導培養基C之腹側後腸類器官之培養包括：使用作為誘導培養基C之STEMdiff APEL2培養基(10或30 ng/mL BMP4、0.1～1 μM 全反式視黃酸、100 ng/mL FGF7或FGF9、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)，將腹側後腸類器官培養6天以上，以誘導分化成膀胱上皮。誘導培養基C係於細胞培養小室凝膠之上加入200～400 μL，於細胞培養小室凝膠之下加入300～600 μL，且每2天進行培養基更換。較佳為持續培養直至可確認作為膀胱上皮標記物之UPK2、P63、及KRT5之表現。繼而，於誘導培養基C中添加PPARγ促效劑(0.1～10 μM 羅格列酮)來進行培養，以使膀胱上皮細胞成熟化。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b1、步驟b2、及步驟c1之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b1：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)使用上述誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官；步驟b2：對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c1：對上述腹側後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C進行培養。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b3、及步驟c1之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質(較佳為作為分散成分之細胞外基質)之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c1：對上述腹側後腸類器官於細胞外基質之存在下，使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C進行培養。
步驟 c2 ：導入至哺乳動物之腎臟或者膀胱或其周邊部位步驟c2包括：將腹側後腸類器官導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位，而形成膀胱類器官。於一個實施方式中，步驟c2包括：將腹側後腸類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位，而形成膀胱類器官。於腹側後腸類器官存在於細胞外基質凝膠中之情形時，步驟c2可進而包括：於導入至人或非人哺乳動物之前，自上述細胞外基質凝膠中取出上述腹側後腸類器官。
本說明書中之用語「非人哺乳動物」例如可為小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠等嚙齒類；黑猩猩等非人靈長類；牛、山羊、綿羊等偶蹄目；馬等奇蹄目；兔、狗、貓等寵物。於一個實施方式中，非人哺乳動物為嚙齒類或非人靈長類。
本說明書中之用語「腎臟」意指進行來自血液之廢物或多餘之水分之過濾及排出而生成尿液之泌尿系統的器官。本說明書中，腎臟可為未觀察到特定損傷或疾病之正常腎臟，亦可為已受損之腎臟、或者罹患腎臟疾病之腎臟。於一個實施方式中，腎臟係正常之腎臟。於一個實施方式中，腎臟係已受損之腎臟或患腎臟疾病之腎臟。
本說明書中之用語「膀胱」意指暫時容納自腎臟送來之尿液之袋狀器官。於本說明書中，膀胱可為未觀察到特定損傷或疾病之正常膀胱，亦可為已受損之膀胱、或者罹患膀胱疾病之膀胱。於一個實施方式中，膀胱係正常之膀胱。於一個實施方式中，膀胱係已受損之膀胱、或者罹患膀胱疾病之膀胱。
腎臟或膀胱之「周邊部位」意指與泌尿系統相接或附近之組織或區域。泌尿系統包括腎臟、尿管、膀胱及尿道。腎臟或膀胱之周邊部位例如可為腹腔內、或腸繫膜。
向腹側後腸類器官之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位之「導入」意指用以將腹側後腸類器官配置於腎臟內或者膀胱內或其等之周邊部位的操作。向腹側後腸類器官之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位之導入例如包括：藉由外科手術，將細胞外基質凝膠中之腹側後腸類器官移植至腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。向腹側後腸類器官之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位之導入例如包括：使用注射器等器具，將溶液中之腹側後腸類器官注入至腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
腹側後腸類器官例如可為由來自與要導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位之人或非人哺乳動物不同之動物種類的多能幹細胞所製造者，或者可為由來自同一動物種類或者同一個體之多能幹細胞所製造者。於一個實施方式中，製造膀胱類器官之方法包括：將由人ES細胞或人iPS細胞製造之腹側後腸類器官導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
於一個實施方式中，向腹側後腸類器官之腎臟之導入包括：將腹側後腸球狀細胞團塊移植至NOD SCID(non-obese diabetic severe combined immunodeficiency，非肥胖型糖尿病重症聯合免疫缺陷)小鼠之腎被膜下。將受到移植之上述小鼠飼養4週，藉此將受到移植之腹側後腸類器官於活體內培養4週。藉由上述活體內培養，可形成具有袋狀結構之膀胱類器官。於一個實施方式中，活體內培養可實施1週～6週、2週～5週、或者3週～5週。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b1、步驟b2及步驟c2之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b1：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)使用上述誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官；步驟b2：對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c2：導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b3、及步驟c2之方法進行製造：步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質(較佳為作為分散成分之細胞外基質)之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c2：導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
步驟 c3 ：於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下之共培養步驟c3包括：對腹側後腸類器官於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下進行培養，而形成膀胱類器官。於腹側後腸類器官存在於細胞外基質凝膠中之情形時，步驟c3可進而包括：在共培養之前，自上述細胞外基質凝膠取出上述腹側後腸類器官。
本說明書中用語「間葉細胞」意指來自多細胞動物之胚胎期之間葉的細胞。間葉細胞例如具有分化成支持組織、結締組織、骨細胞、軟骨細胞、及脂肪細胞的能力。於一個實施方式中，間葉細胞係膀胱間葉細胞。膀胱間葉細胞例如可依據公知之方法或者本說明書之實施例中記載之方法自非人哺乳動物製備。自非人哺乳動物製備出之間葉細胞例如包含胚胎纖維母細胞。於一個實施方式中，胚胎纖維母細胞係小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)。間葉細胞例如可藉由依據公知之方法自ES細胞、或iPS細胞進行誘導分化而製備。間葉細胞例如可以商業方式獲取。
本說明書中用語「間葉系幹細胞」意指具有自我複製能力，且具有分化成結締組織、骨細胞、軟骨細胞、及脂肪細胞等構成非上皮系間葉之細胞的能力之細胞。間葉系幹細胞例如可藉由依據公知之方法，自ES細胞或iPS細胞進行誘導分化而製備。間葉系幹細胞例如可以商業方式獲取。間葉系幹細胞例如可依據公知之方法自生物體進行回收。已知間葉系幹細胞於生物體內存在於例如牙髓或骨髓液中。
於一個實施方式中，步驟c3包括：對腹側後腸類器官於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下，使用培養基進行培養，而形成膀胱類器官。步驟c3中所使用之上述培養基例如可為基本培養基，亦可包含本發明中記載之添加劑。於一個實施方式中，上述培養基之特徵在於不添加細胞外基質。於一個實施方式中，上述培養基係STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)或STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加2% PFHM-II、2% FBS及抗生素-抗黴菌劑)。
於一個實施方式中，步驟c3包括：於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下將腹側後腸類器官進行靜置培養，繼而將上述腹側後腸類器官及間葉系幹細胞或間葉細胞進行旋轉懸浮培養，而形成膀胱類器官。旋轉懸浮培養例如可藉由三維旋轉懸浮培養裝置CellPet 3D-iP(JTEC Corporation)來實施。旋轉懸浮培養時之旋轉速度係以細胞塊不會因重力而下降並與培養容器接觸之方式，由業者適當設定。上述旋轉速度例如可為1～50 rpm、1～30 rpm、1～15 rpm、1～10、2～50 rpm、2～30 rpm、2～15 rpm、2～10、3～50 rpm、3～30 rpm、3～15 rpm或3～10 rpm。
於一個實施方式中，步驟c3中，將腹側後腸類器官或膀胱類器官與E12.5小鼠膀胱間葉細胞一起進行旋轉懸浮培養2週以上，而形成呈袋狀結構之含有膀胱上皮細胞、間質樣細胞及平滑肌細胞之膀胱類器官。步驟c3中之培養例如可實施1週～6週、2週～5週、或者3週～5週。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b1、步驟b2、及步驟c3之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b1：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)使用上述誘導培養基B(誘導培養基b1)進行培養，而形成後腸類器官；步驟b2：對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下(較佳為細胞外基質凝膠中)，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b2)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c3：於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下進行培養。
於一個實施方式中，膀胱類器官可藉由包括步驟A、步驟b3、及步驟c3之方法進行製造，步驟A：對多能幹細胞使用誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3：對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b)進行培養，繼而於細胞外基質(較佳為作為分散成分之細胞外基質)之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質之誘導培養基B(誘導培養基b3)進行培養，而形成腹側後腸類器官；步驟c3：於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下進行培養。
胚體內胚葉細胞之誘導分化(步驟A)、腹側後腸類器官之形成(步驟B)、及膀胱類器官之形成(步驟C)之各步驟中的各用語之說明及包括培養條件之實施方式的說明適用於該等步驟中記載之相對應之各用語及實施方式。
[具有腹側後腸類器官或膀胱類器官之非人哺乳動物或其製造方法] 本發明之一個態樣提供一種非人哺乳動物之製造方法，該非人哺乳動物於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官。本發明之其他態樣提供一種非人哺乳動物，其於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官。
於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官之非人哺乳動物可藉由如下方法進行製造，該方法包括將本發明之腹側後腸類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有膀胱類器官之非人哺乳動物可藉由如下方法進行製造，該方法包括：將本發明之腹側後腸類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位；及將導入有本發明之腹側後腸類器官之上述非人哺乳動物進行飼養。非人哺乳動物之飼養例如包括：對非人哺乳動物提供公知之餌料。
於一例中，將腫瘤細胞或腫瘤片導入至本發明之腹側後腸類器官後，將包含腫瘤細胞或腫瘤片之腹側後腸類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位，藉此可製造作為腎臟癌模型或膀胱癌模型之於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有膀胱類器官之非人哺乳動物。作為腎臟癌模型或膀胱癌模型之於腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有膀胱類器官之非人哺乳動物可用於評估腎臟癌或膀胱癌之治療用藥候補物質之效果的方法，該方法包括：使上述非人哺乳動物與腎臟癌之治療用藥候補物質接觸；及對上述治療用藥候補物質之效果進行評估。
[評估受驗物質之藥物應答性之方法] 評估受驗物質之藥物應答性之方法包括：使本發明之腹側後腸類器官、膀胱類器官、或者具有腹側後腸類器官或膀胱類器官之非人哺乳動物、與受驗物質接觸；及測定上述受驗物質於上述腹側後腸類器官、膀胱類器官、或者上述非人哺乳動物中之藥物應答性。
本說明書中之用語「受驗物質」例如可為低分子化合物、蛋白質(例如抗體)、DNA、RNA、低分子幹渉RNA、或者反義寡核苷酸。受驗物質例如可為用以治療腎臟或膀胱之障礙或疾病、或者腎癌或膀胱癌之藥物、或者其等之候補物質。受驗物質例如可為1種，或者亦可為2種以上之混合物。受驗物質較佳為1種物質。
使腹側後腸類器官、膀胱類器官或非人哺乳動物與受驗物質「接觸」意指腹側後腸類器官、膀胱類器官或非人哺乳動物、與受驗物質處在能夠接觸之狀況下。使腹側後腸類器官或膀胱類器官、與受驗物質接觸時，例如可於包含腹側後腸類器官或膀胱類器官之培養液中混合受驗物質。使腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官之非人哺乳動物與受驗物質接觸時，例如可對上述非人哺乳動物經口投予或非經口投予受驗物質。
藥物應答性例如包括由受驗物質引起之腹側後腸類器官之結構性變化或功能性變化。藥物應答性例如包括由腹側後腸類器官引起之受驗物質之濃度變化。
[再生醫學用組合物或其製造方法] 本發明之一個態樣提供一種用以治療膀胱之損傷或膀胱之疾病的再生醫學用組合物。
本說明書中之用語「再生醫學用組合物」包含本發明之腹側後腸類器官或膀胱類器官。本發明之再生醫學用組合物可用以治療哺乳動物之膀胱之損傷或膀胱之疾病。再生醫學用組合物例如可適宜包含醫藥上所容許之載體。本說明書中之用語「醫藥上所容許之載體」意指哺乳動物中安全性較高且過敏反應性較小之除本發明之腹側後腸類器官或膀胱類器官以外之任意成分。醫藥上所容許之載體例如包括：適於醫藥投予之水性或非水性溶劑、溶液(例如生理鹽水、基本培養基或細胞懸浮保存液)、抗冷凍劑(例如甘油)、水溶性高分子(例如葡聚糖)、或者緩衝劑(例如磷酸緩衝液)。再生醫學用組合物可依據公知方法適宜製造。於一例中，本發明之再生醫學用組合物可藉由調配本發明之腹側後腸類器官或膀胱類器官、與醫藥上所容許之載體(例如基本培養基)來製造。
再生醫學用組合物例如藉由利用外科手法移植至膀胱之規定部位、或者使用注射器等器具注入至膀胱之規定部位，而投予至需要再生醫學用組合物之哺乳動物。就減輕移植物排斥反應之觀點而言，供投予再生醫學用組合物之哺乳動物、與用於製造腹側後腸類器官或膀胱類器官之多能幹細胞之動物種類較佳為同一種類，進而較佳為同一個體。
與再生醫學用組合物相關之用語「哺乳動物」例如為人、人以外之哺乳動物。人以外之哺乳動物例如可為小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠等嚙齒類；黑猩猩等非人靈長類；牛、山羊、綿羊等偶蹄目；馬等奇蹄目；兔、狗、貓等寵物。於一個實施方式，哺乳動物係人類。
本說明書中之用語「膀胱之損傷」或「膀胱之疾病」例如可為因外傷而受損之膀胱、放射性膀胱炎、因糖尿病或缺血等而受損之膀胱、因對膀胱組織有害之藥物而受損之膀胱、膀胱炎、或膀胱癌。
本發明之再生醫學用組合物可用於治療哺乳動物之膀胱之損傷或疾病之方法。一個實施方式提供一種治療膀胱之損傷或疾病之方法，其包括：將包含本發明之腹側後腸類器官或膀胱類器官之再生醫學用組合物投予至有需要之哺乳動物。
[治療膀胱之損傷或疾病之方法] 本發明之一個態樣提供一種治療哺乳動物之膀胱之損傷或疾病之方法。治療哺乳動物之膀胱之損傷或疾病之方法包括：將本發明之腹側後腸類器官、膀胱類器官、或再生醫學用組合物導入至有需要之哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。於一個實施方式中，治療哺乳動物之膀胱之損傷或疾病之方法包括：將本發明之再生醫學用組合物導入至有需要之哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
本說明書中之用語「有需要之哺乳動物」意指具有或疑似具有膀胱之損傷或疾病之哺乳動物。具有膀胱之損傷或疾病之哺乳動物意指依據醫療從業者(例如醫師)所規定之診斷基準而被診斷為具有膀胱之損傷或疾病之哺乳動物。疑似具有膀胱之損傷或疾病之哺乳動物例如可為基於上述哺乳動物之行動履歷(例如，已遭受或正在遭受外傷、放射線治療、及對膀胱組織有害之藥物)或者病歷(例如患有或患過糖尿病、虛血、膀胱炎、或膀胱癌)，疑似具有膀胱之損傷或疾病之哺乳動物。本態樣之哺乳動物較佳為人或非人靈長類，更佳為人。
膀胱之損傷或疾病之「治療」包括：膀胱之損傷或疾病之症狀或病情得到維持、減輕、或者消失。膀胱之損傷或疾病之治療包括治癒膀胱之損傷或疾病。
就減輕移植物排斥反應之觀點而言，用以製造導入至有需要之哺乳動物之腹側後腸類器官、膀胱類器官或再生醫學用組合物之多能幹細胞的動物種類、與有需要之哺乳動物較佳為同一種類或同一個體。
本說明書中之用語「包含」意指存在所例舉之要素及/或步驟，且還可追加其他要素及/或步驟。本說明書中之用語「由…組成」意指存在所例舉之要素及/或步驟，且將其他要素及/或步驟排除。本說明書中之用語「本質上由…組成」意指存在所例舉之要素及/或步驟，還可在不會對細胞層、類器官、組合物、及方法之新穎技術特徵造成影響之範圍內追加其他要素及/或步驟。本說明書中之用語「實質上不包含」不排除「完全不包含」。
關於本發明所提供之用語及實施方式之說明，除非另有說明，則於藉由本發明進行提供之態樣及實施方式之間適用。
以下，記載具體之實施例，但其等表示本發明之較佳實施方式，並不以任何方式限定所附申請專利範圍中記載之發明。 [實施例]
材料及方法準備以下之生長因子、化合物： 重組人/小鼠/大鼠活化素A(R&D SYSTEMS，#338-AC)、重組人FGF4(R&D SYSTEMS，#7460-F4)、重組人BMP4(R&D SYSTEMS，#314-BP)、重組人KGF/FGF7(R&D SYSTEMS，#251-KG)、CHIR99021(TOCRIS，#4423)、全反式視黃酸(SIGMA，R2625)。
免疫螢光染色法為了製作冷凍切片，將膀胱類器官或移植物於4% PFA(Paraformaldehyde，多聚甲醛)中在4℃下振盪並且保溫一晚。繼而，利用PBS(-)洗淨3次，並用蔗糖溶液進行置換。蔗糖係利用PBS(-)製備10%、20%、30%溶液，於各步驟中以4℃進行保溫直至樣本沈沒。繼而，對於膀胱類器官，利用鑷子去除周邊之Matrigel後，用OCT化合物進行包埋而製作冷凍塊。以10 μm製作切片，利用添加有10%驢血清、0.3%Triton-X之PBS(-)(以下稱為「封閉緩衝液」)於室溫下保溫1小時以進行封閉。繼而，與經封閉緩衝液稀釋之一級抗體一同在4℃下保溫一晚。繼而，利用PBS(-)洗淨3次，與經PBS(-)稀釋之二級抗體一同在4℃下保溫一晚。將核用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色。繼而，利用PBS(-)洗淨3次，利用FluorSave試劑(Millipore，#345789)封入後，利用共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM800)進行觀察。
[實施例1]腹側後腸類器官之製造 圖1係表示一個實施方式之膀胱類器官製作之概要的流程圖。圖1中示出如下步驟：步驟A，其自人iPS細胞誘導分化成胚體內胚葉細胞；步驟b1，其自胚體內胚葉細胞誘導分化成後腸類器官；步驟b2，其自後腸類器官誘導分化成腹側後腸類器官；及步驟c1，其自腹側後腸類器官誘導分化成膀胱樣類器官。於包括步驟b1及步驟b2之步驟B中，誘導分化成腹側後腸。於實施例1中，實施步驟A、步驟b1及步驟b2，而製造腹側後腸類器官。
人iPS細胞之預培養 於塗佈有iMatrix-511(nippi)之培養板表面上，利用StemFit AK02N培養基(REPROCELL)將人iPS細胞(1502.3株，Dr.Melissa Little，由默多克兒童研究所(Murdoch Children's Reseach Institute)領取)維持培養。使用TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)將上述細胞進行剝離，而獲得細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液以200 rcf、室溫進行5分鐘離心，將上清液去除後，使沈澱物再次懸浮於StemFit AK02N(10 μM Y-27632)中。於上述懸浮液中以成為0.25 μg/cm 2之方式添加iMatrix-511(nippi)，以成為60,000 cells/cm 2之方式接種至6孔板(康寧)中，於37℃、CO 25%下培養1天。
步驟 A ：胚體內胚葉細胞之誘導分化將該培養用培養基更換為作為誘導培養基A之STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加100 ng/mL 活化素A、1 μM CHIR99021、2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)，並培養3天，藉此誘導分化成胚體內胚葉細胞。培養基更換係於第2天以後每天進行。人iPS細胞於誘導分化第1天，細胞集合成群落狀，但於誘導分化第2天，細胞開始向群落之外側擴展。於誘導分化第3天，細胞片狀地增生，達到100%融合。誘導出胚體內胚葉典型之石塊狀細胞。
步驟 b1 ：後腸之誘導分化胚體內胚葉誘導後(誘導分化第3天)，將誘導培養基A更換為作為誘導培養基b1之STEMdiff APEL2培養基(添加200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)，將誘導分化出之胚體內胚葉細胞培養4天。
於誘導分化第7天，將懸浮之球狀細胞團塊回收至35 mm皿中。繼而，藉由移液將培養基吹送至殘留在已回收了懸浮球狀細胞團塊之孔中的球狀細胞團塊中，使球狀細胞團塊懸浮，回收至相同之35 mm皿中。所回收之球狀細胞團塊係靜置於冰上。
將生長因子減量型Matrigel(康寧)(蛋白質濃度10 mg/mL)利用誘導培養基b1稀釋至50%濃度，以50 μL/well添加至細胞培養小室透明PET薄膜(24孔、孔隙尺寸8.0 μm)(康寧)，於37℃下保溫30 min以進行凝膠化。繼而，於50%Matrigel溶液50 μL中加入所回收之球狀細胞團塊40～50個並加以混合。將上述混合物全部添加到已凝膠化之50%Matrigel之上，於37℃、CO 25%下保溫30 min以進行凝膠化，而獲得細胞培養小室凝膠。於上述細胞培養小室凝膠之上添加200 μL之誘導培養基b1，於上述細胞培養小室凝膠之下添加300 μL之誘導培養基b1，並於37℃、CO 25%下保溫4天。關於培養基更換，於二維培養時每天進行，於三維培養時時每2天進行。50%Matrigel中之球狀細胞團塊藉由利用誘導培養基b1進行培養而生長，形成略帶弧度之管狀細胞結構體(後腸類器官)。
步驟 b2 ：後腸腹側化誘導後腸後(誘導分化第11天)，將誘導培養基b1更換為作為誘導培養基b2之STEMdiff APEL2培養基(添加30 ng/mL BMP4、200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)，將於上述細胞培養小室凝膠中誘導出之後腸培養3天，而使後腸腹側化。於上述細胞培養小室凝膠之上添加200 μL之誘導培養基b2，於上述細胞培養小室凝膠之下添加300μL之誘導培養基b2，每2天進行培養基更換。若利用後腸腹側培養基進行培養，則後腸類器官之生長會變慢，而變化為球狀細胞結構體(腹側後腸類器官)。
關於上述腹側後腸類器官(誘導分化第14天)，使用以下表中記載之抗體進行免疫螢光染色。 [表1]
抗體 目錄編號 供應商
抗P63兔單株抗體 (EPR5701) ab124762 Abcam
抗CDX2小鼠單株抗體 (CX2-88) MU392A-UC BioGeneX
抗SOX2山羊多株抗體 AF2018 R&D systems
抗細胞角蛋白8大鼠單株抗體 (TROMA-1) TOROMA-1 Developmental Studies Hybridoma Bank
Alexa Fluor 488驢抗小鼠IgG A21202 Life Technologies
Alexa Fluor 568驢抗兔IgG A10042 Life Technologies
Alexa Fluor 647驢抗山羊IgG A21447 Life Technologies
Alexa Fluor 488驢抗大鼠IgG A21208 Life Technologies
腹側後腸類器官表現作為腹側後腸標記物之P63，且作為背側後腸標記物之CDX2及SOX2分別較弱地表現及未表現，表現作為腸管上皮標記物之KRT8。又，藉由RT-PCR，確認到作為後方腸管及排泄腔區域之標記之HOXA13之轉錄得到增加。將該等結果彙總於以下表中。 [表2]
   早期後腸類器官 後腸類器官 腹側後腸類器官
誘導分化後之天數 9天 11天 14天
P63 ＋ ＋＋ ＋＋＋
CDX2 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋
SOX2 ＋＋ ＋ －
KRT8 ＋＋ ＋＋＋ ＋＋
HOXA13 － － ＋＋
＋＋＋：較強地表現 ＋＋：表現或於一部分細胞中較強地表現 ＋：較弱地表現或於一部分細胞中表現 －：表現未上升或未表現
[比較例1] 腸樣類器官 (SATB2 陽性 ) 之誘導分化於實施例1之步驟b2中，使用培養基STEMdiff APEL2培養基(添加100 ng/mL BMP2、100 ng/mL EGF、500 ng/mL RSPO1、及0.1 μM 視黃酸)，將步驟b1中所獲得之細胞培養小室凝膠中之後腸類器官培養21天，誘導分化成腸樣類器官(SATB2陽性)。
腸樣類器官表現作為結腸或直腸標記物之SATB2(圖2a)。腸之類器官一部分表現作為Mid/後腸標記物之CDX2，還表現作為上皮組織標記之ECAD(圖2b及圖2c)。SATB2、CDX2、ECAD及作為核標記之DAPI(圖2d)之螢光圖像中未顯示如特定細胞種有規律地存在之細胞層結構。
比較例1中所獲得之腸樣類器官亦表現作為腹側後腸/排泄腔標記之P63、作為膀胱上皮標記物之UPK2、及作為膀胱上皮標記物之KRT5。又，P63、UPK2、及KRT5之結果亦未顯示比較例1中所獲得之腸樣類器官具有如特定細胞種有規律地存在之細胞層結構。
比較例1中，使用與實施例1之步驟b2中所使用之添加劑之組合(BMP4、FGF4、及CHIR99021)不同的添加劑之組合(BMP2、EGF、RSPO1、及視黃酸)。比較例1中所獲得之細胞結構體不具有諸如實施例1中所獲得之腹側後腸類器官之特定細胞種有規律地存在之細胞層結構。
使用與實施例1之步驟b2中所使用之添加劑之組合(BMP4、FGF4、及CHIR99021)不同的其他添加劑之組合(EGF、RSPO1、及視黃酸之組合；EGF、RSPO1、視黃酸、及頭蛋白(Noggin)之組合；EGF、RSPO1、視黃酸、頭蛋白(Noggin)、及FGF7之組合；以及EGF、RSPO1、視黃酸、BMP2、及FGF7之組合)所獲得之細胞結構體亦不具有諸如實施例1中所獲得之腹側後腸類器官之特定細胞種有規律地存在之細胞層結構。
[實施例2]膀胱樣類器官之製造 步驟 c1 ：膀胱上皮之誘導分化後腸腹側化後(誘導分化第14天)，將誘導培養基b2更換為作為誘導培養基C之STEMdiff APEL2培養基(添加30 ng/mL BMP4、100 nM 全反式視黃酸、100 ng/mL FGF7、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)，將球狀細胞結構體培養6天，而誘導出膀胱上皮細胞。於上述細胞培養小室凝膠之上添加200 μL之誘導培養基C，於上述細胞培養小室凝膠之下添加300 μL之誘導培養基C，且每2天進行培養基更換。誘導出之膀胱樣類器官為球狀。
針對上述膀胱樣類器官進行免疫螢光染色。於實施例2及下述實施例3中之免疫螢光染色中，使用以下之抗體。 用於免疫螢光染色法之一級抗體為小鼠抗尿溶蛋白II(1：100、BIOCARE MEDICAL、#ACR3051C)、兔抗P63(1：100、abcam、#ab124762)、雞抗角蛋白5(1：300、BioLegend、#905903)、山羊抗ECAD(1：300、R&D SYSTEMS、#AF648)。用於免疫螢光染色法之二級抗體為Alexa Fluor 488驢抗小鼠IgG(1：400、Life Technologies、#A21202)、Alexa Fluor 568驢抗兔IgG(1：400、Life Technologies、#A10042)、Alexa Fluor 647驢抗山羊IgG(1：400、Life Technologies、#A21447)、Alexa Fluor 647驢抗雞IgY(1：400、Jackson ImmunoResearch、#703-606-155)。
膀胱樣類器官表現作為上皮組織標記之ECAD(圖3e)。膀胱樣類器官表現作為膀胱上皮標記物之UPK2(圖3a)、P63(圖3b)、及KRT5(圖3c)。圖3a及圖3d中，膀胱樣類器官之最外周所觀察到之訊號係源自Matrigel之非特異性訊號。將UPK2、P63、及KRT5之螢光圖像重疊所得之圖3d中顯示，於膀胱樣類器官中，沿其最外周存在共表現P63及KRT5之基底細胞樣之細胞，於存在上述KRT5-基底細胞樣細胞之區域之內側方向上，存在共表現P63及UPK2之中間細胞樣之細胞，於存在上述中間細胞樣細胞之區域之內側方向上，存在不表現P63但表現UPK2之表層細胞樣之細胞。膀胱樣類器官中之該等細胞種之層結構係與生物體內之發育中途之膀胱上皮之結構類似(圖5g)。於該膀胱樣類器官中，表現KRT5之細胞較少，但表現KRT5之Krt5-基底細胞係於膀胱發育後期出現之細胞種，由此提示所誘導出之膀胱樣類器官處於未成熟階段。
[比較例2] 針對後腸類器官，使用自誘導培養基b2與上述誘導培養基C中去除BMP4後所得之培養基，除此以外，以與實施例2相同之方式進行膀胱上皮之誘導分化。針對比較例2中所形成之細胞結構體，以與實施例2相同之方式進行免疫螢光染色。比較例2中所形成之細胞結構體與實施例2中所形成之膀胱樣類器官同樣地，表現作為膀胱上皮標記物之P63(圖4b)、及作為上皮組織標記之ECAD(圖4c)。然而，比較例2中所形成之細胞結構體不表現如在實施例2中所形成之膀胱樣類器官中所見之作為膀胱上皮標記物之UPK2(圖3a及圖4a)。圖4a中，膀胱樣類器官之最外周所觀察到之訊號係源自Matrigel之非特異性訊號。如上所述，比較例2中所形成之細胞結構體不具有如在實施例2中所形成之膀胱樣類器官中所見之細胞層結構。
[實施例3]活體內(in vivo)之膀胱類器官之製造 人 iPS 細胞之預培養除將細胞以成為90,000 cells/cm 2之方式接種至6孔板以外，以與實施例1相同之方式進行人iPS細胞之預培養。 步驟 A ：向胚體內胚葉細胞之誘導分化與實施例1同樣地，誘導人iPS細胞分化成胚體內胚葉細胞。 步驟 b1 ：後腸誘導分化針對細胞培養小室凝膠，利用誘導培養基b1將生長因子減量型Matrigel(康寧)(蛋白質濃度10 mg/mL)稀釋成2.5 mg/mL濃度後，進行凝膠化，而使其內部含有藉由胚體內胚葉細胞之二維培養所形成之球狀細胞團塊90～100個，除此以外，實質上與實施例1同樣地進行後腸誘導分化。
步驟 b2 ：後腸腹側化後腸誘導後(誘導分化第11天)，將誘導培養基b1更換為作為誘導培養基b2之STEMdiff APEL2培養基(添加30 ng/mL BMP4、100 ng/mL FGF7、200 ng/mL FGF4、8 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)，將上述細胞培養小室凝膠培養3天，而使後腸腹側化。誘導培養基b2係於上述細胞培養小室凝膠之下添加500 μL，且每2天進行培養基更換。
步驟 c2 ：向免疫不全小鼠腎被膜下之移植後腸腹側化後(誘導分化第14天)，自細胞培養小室透明PET薄膜之膜片切出上述細胞培養小室凝膠，並置於35 mm培養皿上。繼而，使用鑷子，於立體顯微鏡下自2.5 mg/mL Matrigel中取出腹側後腸類器官。
於異氟醚吸入麻醉下(異氟醚1.3～1.4%、190～200 mL/mim)，利用剃刀將4週齡之雄性NOD SCID JAX小鼠(Oriental Yeast股份有限公司)之腎被膜切開，將上述腹側後腸類器官移植至腎被膜與腎實質之間。於移植4週後，採取包含移植物之區域後，於4%PFA、4℃下將組織固定一晚。將經固定化之移植物冷凍，而製作冷凍切片。針對冷凍切片，進行螢光免疫染色及H&E染色。
移植之腹側後腸類器官於移植4週後，成為如生物體之膀胱般具有內腔之袋狀細胞結構體(膀胱類器官)。於膀胱類器官內，存在表現作為膀胱上皮標記物之UPK2(圖5a)、P63(圖5b)、及KRT5(圖5c)之細胞，該等細胞與生物體內之成熟之膀胱之層結構類似(圖5g)。具體而言，於膀胱類器官中，於袋狀細胞結構體之最外周存在共表現P63及KRT5之Krt5-基底細胞樣之細胞(圖5e)。又，於存在上述KRT5-基底細胞樣之細胞之區域之內側方向上，存在少量之共表現UPK2及P63之中間細胞樣之細胞(圖5f)。進而，於存在中間細胞樣之細胞之區域之內側方向且膀胱類器官之面對內腔之區域存在表現UPK2且不表現P63及KRT5的表層細胞樣細胞(圖5e及f)。
實施例2及3顯示，誘導出複數種膀胱上皮細胞且由該等複數種之膀胱上皮細胞構成之細胞結構體具有層結構。實施例2及3顯示，形成由複數種膀胱上皮細胞構成之膀胱樣之三維結構體。據顯示，關於腹側後腸類器官，將實施例2之試管內(in vitro)之誘導分化系統、與實施例3之活體內(in vivo)之誘導分化系統進行比較，為了由腹側後腸類器官形成膀胱樣之袋狀結構及成熟化，較佳為將能夠長期培養或存在間葉組織之活體內(in vivo)之誘導分化系統加以組合。
[實施例4]腹側後腸類器官之製造 圖6係表示膀胱類器官製作之培養之流程圖。圖6中示出如下步驟：步驟A，其誘導人iPS細胞分化成胚體內胚葉細胞；步驟b3，其誘導胚體內胚葉細胞分化成腹側後腸類器官；及步驟c3，其藉由間葉細胞或間葉系幹細胞之共培養而誘導腹側後腸類器官分化成膀胱類器官。圖6之上部記載之天數係一個實施方式之例示性之誘導分化所需的天數。實施例4中，實施步驟A及步驟b3而製造腹側後腸類器官。
人 iPS 細胞之預培養除將細胞以成為45,000 cells/cm 2之方式接種至6孔板以外，以與實施例1相同之方式進行人iPS細胞之預培養。 步驟 A ：向胚體內胚葉細胞之誘導分化除將作為誘導培養基A之STEMdiff APEL2培養基中所含之添加劑CHIR99021之濃度自1 μM變更為1.25 μM以外，以與實施例1相同之方式，誘導人iPS細胞分化成胚體內胚葉細胞。
步驟 b3 ：腹側後腸之誘導分化胚體內胚葉誘導後(誘導分化第3天)，將誘導培養基A更換為作為誘導培養基b3之STEMdiff APEL2培養基(添加10 ng/mL BMP4、200 ng/mL FGF4、4 μM CHIR99021、1 μg/mL肝素、2% PFHM-II、抗生素-抗黴菌劑)，將誘導分化成之胚體內胚葉細胞培養3天。
於誘導分化第5天，以100 rpm開始振盪培養。其後，於誘導分化第6天，將懸浮之球狀細胞團塊回收至35 mm培養皿。繼而，藉由移液，將培養基吹送至殘留在已回收了懸浮球狀細胞團塊之孔中的球狀細胞團塊中，使球狀細胞團塊懸浮，回收至相同之35 mm培養皿。所回收之球狀細胞團塊係靜置於冰上。
將生長因子減量型Matrigel(康寧)(蛋白質濃度10 mg/mL)利用誘導培養基b3稀釋至50%濃度，並以50 μL/well添加至細胞培養小室透明PET薄膜(24孔、孔隙尺寸8.0 μm)(康寧)，於37℃下保溫30 min以進行凝膠化。繼而，於50%Matrigel溶液50 μL中添加所回收之球狀細胞團塊60～70個並加以混合。將上述混合物全部添加到已凝膠化之50%Matrigel之上，於37℃、CO 25%下保溫30 min以進行凝膠化，而獲得細胞培養小室凝膠。於上述細胞培養小室凝膠之上添加200 μL之誘導培養基b3，於上述細胞培養小室凝膠之下添加300 μL之誘導培養基b3，於37℃、CO 25%下進而培養8天(誘導分化第14天為止)。關於培養基更換，於二維培養時每天進行，於三維培養時每2天進行。50%Matrigel中之球狀細胞團塊係藉由利用誘導培養基b3進行培養而生長，形成具有管腔結構之帶弧度之細胞結構體(腹側後腸類器官)。
針對誘導分化第11天及第14天之腹側後腸類器官進行免疫螢光染色。於實施例4及實施例5中之免疫螢光染色中，使用以下之抗體。 免疫螢光染色法所使用之一級抗體係小鼠抗CDX2(1：100、BioGenex、#MU392-UC)、小鼠抗FOXA2(1：100、Santa Cruz Biotechnology、#sc-101060)、兔抗GATA3(1：100、Cell Signaling、#5852S)、山羊抗GATA3(1：100、R&D Systems、#AF2605)、小鼠抗ISL1&2(1：100、DSHB、#39.4D5)、山羊抗SOX2(1：100、R&D Systems、#AF2018)、兔抗SATB2(1：100、CELL MARQUE、#384R-14)、兔抗HOXA13(1：200、abcam、#ab106503)、山羊抗ZO1(1：100、ThermoFisher、#PA5-19090)、兔抗pSmad1/5/8(1：100、細胞訊號、#13820)、Rat Anti-CK8(1：200、DSHB、#TROMA-1)、小鼠抗尿溶蛋白 II(1：100、BIOCARE MEDICAL、#ACR3051C)、兔抗ΔNP63(1：100、細胞訊號、#67825)、兔抗P63(1：100、abcam、#ab124762)、雞抗角蛋白5(1：300、BioLegend、#905903)、小鼠抗ECAD(1：200、BD Transduction Laboratries、#610181)、山羊抗ECAD(1：300、R&D SYSTEMS、#AF648)、雞抗波形蛋白(1：300、NOVUS、#NB300-223)、兔抗αSMA(1：100、細胞訊號、#19245T)。
免疫螢光染色法所使用之二級抗體係Alexa Fluor488驢抗小鼠IgG(1：400、Life Technologies、#A21202)、Alexa Fluor568驢抗兔IgG(1：400、Life Technologies、#A10042)、Alexa Fluor647驢抗山羊IgG(1：400、Life Technologies、#A21447)、Alexa Fluor647驢抗雞IgY(1：400、Jackson ImmunoResearch、#703-606-155)。
實施例1中之步驟b1之後腸誘導分化後之後腸類器官(誘導分化第11天)不具有管腔結構(圖7a)。實施例4中之步驟b3之腹側後腸誘導分化第5天之腹側後腸類器官(誘導分化第11天)具有管腔結構(圖7b)。後腸類器官及腹側後腸類器官均表現作為上皮標記物之KRT8及ECAD(圖7a1、a10、b1及b10)。後腸類器官較弱地表現作為腹側後腸標記物之GATA3(圖7a2)，但腹側後腸類器官較強地表現作為腹側後腸標記物之GATA3(圖7b2)。後腸類器官表現作為背側後腸標記物之SOX2、CDX2及T(圖7a3及a5～a7)，腹側後腸類器官不表現作為背側後腸標記物之SOX2、CDX2及T(圖7b3及b5～b7)。後腸類器官不表現作為腸管標記物之FOXA2(圖7a9)，但腹側後腸類器官表現作為腸管標記物之FOXA2(圖7b9)。如上所述，於實施例1中進行步驟b2之後腸腹側化之前的後腸類器官不具有管腔結構，表現背側後腸標記物(SOX2、CDX2及T)，另一方面，僅較弱地表現或不表現腹側後腸標記物(GATA3)及腸管標記物(FOXA2)(圖7a)。相對於此，實施例4中步驟b3之腹側後腸誘導分化中之腹側後腸類器官具有管腔結構，不表現上述背側後腸標記物，但表現上述腹側後腸標記物及腸管標記物(圖7b)。
使用免疫螢光染色法，利用顯微鏡對實施例4中之步驟b3之腹側後腸誘導分化第8天之腹側後腸類器官(誘導分化第14天)進行觀察(圖8)。上述腹側後腸類器官表現作為上皮組織標記之ECAD(圖8d3)，且表現作為緊密結合(Tight junction)標記之ZO1(圖8c3)。又，上述腹側後腸類器官表現作為初期腸管上皮標記物之FOXA2(圖8b1)及CK8(圖8c1)，且表現作為腹側後腸標記物之GATA3(圖8a3、b3及e1)、ISL1(圖8d1)、SATB2(圖8c2)及ΔNP63(圖8b2)。又，上述腹側後腸類器官表現作為腹側排泄腔區域標記之磷酸化Smad1/5/8(圖8d2)，且表現作為後方腸管及排泄腔區域之標記之HOXA13(圖8f2)。另一方面，上述腹側後腸類器官幾乎不表現作為背側後腸標記物之CDX2(圖8a1及f1)及SOX2(圖8a2及e2)。又，上述腹側後腸類器官不表現作為膀胱上皮前驅細胞及膀胱上皮細胞標記物之UPK2(圖8e3)及KRT5(圖8f3)。該等結果提示，藉由利用誘導培養基b3培養8天(14天之誘導分化)，而形成具有管腔結構之腹側後腸類器官。又，提示形成了成為膀胱上皮前驅細胞之前之腹側後腸/排泄腔樣細胞。
[實施例5]試管內(in vitro)之膀胱類器官之製造 實施例5中，實施圖6中所示之步驟A、步驟b3及步驟c3，而於試管內製造膀胱類器官。於實施例5之步驟C中，將步驟b3中所形成之腹側後腸類器官與源自E12.5小鼠之膀胱間葉細胞一起於試管內進行培養(步驟c3)。
人 iPS 細胞之預培養與實施例4同樣地進行人iPS細胞之預培養。 步驟 A ：向胚體內胚葉細胞之誘導分化與實施例4同樣地，誘導人iPS細胞分化成胚體內胚葉細胞。 步驟 b3 ：後腸誘導分化與實施例4同樣地，誘導胚體內胚葉細胞分化成腹側後腸類器官。
步驟 c3 ：藉由共培養進行之膀胱上皮誘導分化 E12.5 小鼠膀胱間葉細胞之製備藉由脊椎脫臼使妊娠第12天之ICR小鼠安樂死。自上述ICR小鼠中，將內包胎仔之胎嚢取出至冰冷10%FBS/PBS(-)中。使用鑷子，自上述胎嚢中取出胎仔，自胎仔將胎盤切下。繼而，利用鑷子去除胎仔之上半身，使膀胱部露出，採取自膀胱直至尿道之區域。將採取到之膀胱・尿道區域放入到解離緩衝液(Dispase：康寧 #354235、1 mg/mL DNaseI：Sigma-Aldrich #11284932001)200 μL中，於37℃下保溫1分鐘。繼而，利用冰冷M2培養基3 mL稀釋2次，於冰上靜置10分鐘。其後，使用鑷子及玻璃針，自尿管插入部僅採取上部之膀胱間葉細胞，並收集到1.5 mL管中。繼而，將於37℃下加溫過之TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)200 μL添加到上述管中，於37℃下保溫3分鐘後，進行移液直至組織成為單細胞。將DMEM(添加10%FBS、GultaMAX-I、抗生素-抗黴菌劑)1 mL添加至上述管中，而使酵素反應終止。對上述管以300 rcf實施3分鐘離心，將其上清液去除。於其沈澱物中添加STEM-CELLBAMKER GMP grade(ZENOQ #CB045)250 μL以進行再懸浮。將所獲得之細胞懸浮液移至冷凍保存管中，以-80℃進行保存。
與 E12.5 小鼠膀胱間葉細胞之共培養藉由移液，使步驟b3中所獲得之細胞外基質(50%Matrigel)凝膠中之腹側後腸類器官自上述凝膠中脫離，並靜置於冰上。
使冷凍保存之上述E12.5小鼠膀胱間葉細胞於37℃水浴中融解後，添加STEMdiff APEL2培養基1 mL並進行懸浮。對所獲得之細胞懸浮液以300 rcf實施3分鐘離心，將其上清液去除。於其沈澱物中添加STEMdiff APEL2培養基200 μL以進行再懸浮。針對所獲得之細胞懸浮液，進行細胞計數，並將細胞懸浮液以成為25,000 cells/well之方式添加至PrimeSurface(註冊商標)培養板96V(住友電木 #MS-9096V)。對上述培養板以200 rcf實施5分鐘離心。
使自Matrigel脫離之上述腹側後腸類器官以1個/孔之方式加入至上述培養板中，進行靜置直至沈澱。其後，將上述細胞懸浮液以追加25,000 cells/孔之方式添加至各孔中，對上述培養板以200 rcf實施5分鐘離心後，將上述腹側後腸類器官與膀胱間葉細胞於37℃、CO 25%下培養1天。繼而，將組合之細胞塊自上述培養板之孔中移至容器中，將上述容器設置於三維旋轉懸浮培養裝置CellPet 3D-iP(Oriental Yeast)中。使用STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加2% PFHM-II、及抗生素-抗黴菌劑)或者STEMdiff APEL2培養基(STEMCELL Tecnologies)(添加2% PFHM-II、2% FBS及抗生素-抗黴菌劑)CellPet 3D-iP，將上述組合之細胞塊於37℃、CO 25%下培養11天，而誘導出膀胱類器官(誘導分化第24天)。
將步驟c3中之腹側後腸類器官與膀胱間葉細胞之共培養第7天之膀胱類器官(誘導分化第20天)於明視野下進行顯微鏡觀察(圖9)。上述膀胱類器官中，觀察到上皮結構及管腔結構之二重結構(圖9a～c)。即便於在明視野下不易觀察到二重結構之情形時(圖9d)，若使用螢光染色法進行觀察，則亦觀察到二重結構。
步驟c3中之共培養第11天之膀胱類器官(誘導分化第24天)為球狀，具有管腔結構。使用免疫螢光染色法，利用顯微鏡對上述膀胱類器官進行觀察(圖10)。上述膀胱類器官具有管腔，具有表現作為上皮細胞標記物之ECAD之細胞之層，上述ECAD表現細胞層具有面對上述管腔(圖10b1)且處在上述ECAD表現細胞層之外側的表現作為間葉細胞標記物之VIM之細胞之層(圖10b3及b5)。上述膀胱類器官於ECAD表現細胞層(圖10c1)之外側包含經DAPI染色之細胞層(圖10c4)，於該經DAPI染色之細胞層之外側具有表現作為平滑肌細胞標記物之αSMA之細胞之層(圖10c2及c4)。該等結果顯示，上述膀胱類器官具有：管腔；面對上述管腔之表現ECAD之上皮細胞層；處在上述上皮細胞層之外側之表現VIM之間質樣細胞層；及處在上述間質樣細胞層之外側之表現αSMA之平滑肌細胞層。
上述膀胱類器官之ECAD細胞層之細胞共表現人核纖層蛋白B1(hLNB)(圖10b2及b)。該結果顯示，上述膀胱類器官之上皮細胞源自人iPS細胞。因此，上述膀胱類器官具有：管腔；面對上述管腔之源自人iPS細胞之上皮細胞層；處在上述上皮細胞層之外側之源自小鼠膀胱間葉細胞之間質樣細胞層；及處在上述間質樣細胞層之外側之源自小鼠間葉細胞之平滑肌細胞層。
於上述膀胱類器官中觀察到收縮運動。其提示上述膀胱類器官所具有之平滑肌細胞層發揮功能。
上述膀胱類器官之上述上皮細胞層其最內側具有表現UPK2之細胞之層(圖10a1)，於上述UPK2表現細胞層之外側具有表現ΔNP63之細胞之層(圖10a2及a5)。該結果顯示，上述膀胱類器官類似於處在膀胱之發育中途之膀胱上皮的結構。上述膀胱類器官之上述上皮細胞層中，未觀察到表現作為膀胱上皮標記物之KRT5之細胞(圖10a3)。已知表現KRT5之基底(Basal)細胞於膀胱發育後期出現。該等結果提示，實施例5中之誘導分化第24天之膀胱類器官處在膀胱發育中途之階段。上述膀胱類器官之上述上皮細胞層表現作為膀胱上皮細胞標記物之GATA3(圖10d2)，表現作為發育中途之膀胱上皮細胞標記物之FOXA2(圖10d1)。該等結果亦提示，實施例5中之誘導分化第24天之膀胱類器官處在膀胱發育中途之階段。
使用免疫螢光染色法，利用顯微鏡對步驟c3中之共培養第29天之膀胱類器官(誘導分化第42天)進行觀察(圖11)。上述膀胱類器官具有管腔結構。上述膀胱類器官之上皮細胞層具有：面對管腔且表現UPK1B(圖11a1)及UPK2(圖11b1)之細胞之層；處在上述細胞層之外側之表現ΔNP63之細胞之層(圖11a2及b2)；及處在上述細胞層之外側之表現KRT5之細胞之層(圖11a3及b3)(圖11a5及b5)。由於已知表現KRT5之基底細胞於膀胱發育後期出現，故該等結果提示，實施例5中之誘導分化第42天之膀胱類器官處在膀胱發育後期之階段。
圖1係表示一個實施方式之膀胱類器官製作之概要的流程圖。 圖2a係表示腸樣類器官中之SATB2之分佈之圖像。圖2b係表示腸樣類器官中之CDX2之分佈之圖像。圖2c係表示腸樣類器官中之ECAD之分佈之圖像。圖2d係腸樣類器官中之DAPI染色之圖像。 圖3a係表示膀胱類器官中之UPK2之分佈之圖像。其中，膀胱類器官之最外周所觀察到之白色訊號係源自Matrigel(註冊商標)之非特異性訊號。圖3b係表示膀胱類器官中之P63之分佈之圖像。圖3c係表示膀胱類器官中之KRT5之分佈之圖像。圖3d係表示膀胱類器官中之UPK2、P63及KRT5之分佈之合併圖像。其中，膀胱類器官之最外周所觀察到之白色訊號係源自Matrigel之非特異性訊號。圖3e係表示膀胱類器官中之ECAD之分佈之圖像。圖3f係膀胱類器官中之DAPI染色之圖像。 圖4a係表示使用自誘導培養基B及誘導培養基C中去除BMP4後所得之培養基而誘導出之細胞結構體中之UPK2之分佈的圖像。其中，上述細胞結構體之最外周所觀察到之白色訊號係源自Matrigel之非特異性訊號。圖4b係表示使用自誘導培養基B及誘導培養基C中去除BMP4後所得之培養基而誘導出之細胞結構體中之P63之分佈的圖像。圖4c係表示使用自誘導培養基B及誘導培養基C中去除BMP4後所得之培養基而誘導出之細胞結構體中之ECAD之分佈的圖像。圖4d係使用自誘導培養基C中去除BMP4後所得之培養基而誘導出之細胞結構體中之DAPI染色的圖像。 圖5a係表示導入至非人哺乳動物中後之膀胱類器官中之UPK2之分佈的圖像。圖5b係表示導入至非人哺乳動物中後之膀胱類器官中之P63之分佈的圖像。圖5c係表示導入至非人哺乳動物中後之膀胱類器官中之KRT5之分佈的圖像。圖5d係膀胱類器官中之DAPI染色之圖像。圖5e係表示導入至非人哺乳動物中後之膀胱類器官中之P63、KRT5及DAPI染色之分佈的合併圖像。圖5f係表示導入至非人哺乳動物中後之膀胱類器官中之UPK2、P63及DAPI染色之分佈的圖像。圖5g係表示生物體之膀胱中之細胞種之層結構之模式圖。 圖6係表示一個實施方式之膀胱類器官製作之概要之流程圖。 圖7a1～a11係步驟b1之後腸誘導分化後之後腸類器官(誘導分化第11天)之螢光圖像。圖7b1～b11係步驟b3之腹側後腸誘導分化中之腹側後腸類器官(誘導分化第11天)之螢光圖像。圖7a1及圖7b1係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為上皮標記物之KRT8之分佈的圖像。圖7a2及圖7b2係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為腹側標記物之GATA3之分佈的圖像。圖7a3及圖7b3係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為背側後腸標記物之SOX2之分佈的圖像。圖7a5及圖7b5係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為背側後腸標記物之CDX2之分佈的圖像。圖7a6及圖7b6係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為背側後腸標記物之SOX2之分佈的圖像。圖7a7及圖7b7係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為背側後腸標記物之T之分佈的圖像。圖7a9及圖7b9係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為腸管標記物之FOXA2之分佈的圖像。圖7a10及圖7b10係表示後腸類器官及腹側後腸類器官各自中之作為上皮標記物之ECAD之分佈的螢光圖像。圖7a4、圖7a8及圖7a11係後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖7b4、圖7b8及圖7b11係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。 圖8a1及圖8a2係分別表示腹側後腸誘導分化中之腹側後腸類器官(誘導分化第14天)中之作為背側後腸標記物之CDX2及SOX2之分佈的螢光圖像。圖8a3係表示作為腹側後腸標記物之GATA3之分佈之螢光圖像。圖8a4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8a5係CDX2、SOX2、GATA3及DAPI染色之合併圖像。圖8b1係表示作為初期腸管上皮標記物之FOXA2之分佈的螢光圖像。圖8b2及圖8b3係分別表示腹側後腸類器官中之作為腹側後腸標記物之ΔNP63及GATA3之分佈的螢光圖像。圖8b4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8b5係FOXA2、ΔNP63、GATA3及DAPI染色之合併圖像。圖8c1係表示作為腸管上皮標記物之CK8之分佈之螢光圖像。圖8c2係表示作為腹側後腸標記物之SATB2之分佈之螢光圖像。圖8c3係表示作為頂部緊密結合標記之ZO1之分佈之螢光圖像。圖8c4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8c5係CK8、SATB2、ZO1及DAPI染色之合併圖像。圖8d1係表示作為腹側後腸標記物之ISL1之分佈之螢光圖像。圖8d2係表示作為腹側後腸及排泄腔區域標記之磷酸化Smad1/5/8之分佈之螢光圖像。圖8d3係表示作為上皮細胞標記物之ECAD之分佈之螢光圖像。圖8d4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8d5係ISL1、磷酸化Smad1/5/8、ECAD及DAPI染色之合併圖像。圖8e1係表示作為腹側後腸標記物之GATA3之分佈之螢光圖像。圖8e2係表示作為背側後腸標記物之SOX2之分佈之螢光圖像。圖8e3係表示作為膀胱上皮細胞標記物之UPK2之分佈之螢光圖像。圖8e4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8e5係GATA3、SOX2、UPK2及DAPI染色之合併圖像。圖8f1係表示作為背側後腸標記物之CDX2之分佈之螢光圖像。圖8f2係表示作為後方腸管標記物之HOXA13之分佈之螢光圖像。圖8f3係表示作為膀胱上皮細胞標記物之KRT5之分佈之螢光圖像。圖8f4係腹側後腸類器官中之DAPI染色圖像。圖8f5係CDX2、HOXA13、KRT5及DAPI染色之合併圖像。 圖9a～d係藉由腹側後腸類器官與膀胱間葉細胞之共培養進行之膀胱上皮誘導分化中的膀胱類器官(誘導分化第20天)之明視野圖像。 圖10a1～a3係分別表示膀胱類器官誘導分化中之膀胱類器官(誘導分化第24天)中之作為膀胱上皮細胞標記物之UPK2、ΔNP63及KRT5之分佈的螢光圖像。圖10a4係上述膀胱類器官中之DAPI染色圖像。圖10a5係UPK2、ΔNP63、KRT5及DAPI染色之合併圖像。圖10b1係表示上述膀胱類器官中之作為上皮細胞標記物之ECAD之分佈的螢光圖像。圖10b2係表示上述膀胱類器官中之表示源自人之細胞之hLNB1之分佈的螢光圖像。圖10b3係表示上述膀胱類器官中之作為間葉細胞標記物之VIM之分佈的螢光圖像。圖10b4係上述膀胱類器官中之DAPI染色圖像。圖10b5係ECAD、hLNB1、VIM及DAPI染色之合併圖像。圖10c1係表示上述膀胱類器官中之作為上皮細胞標記物之ECAD之分佈的螢光圖像。圖10c2係表示上述膀胱類器官中之作為平滑肌細胞標記物之αSMA之分佈的螢光圖像。圖10c3係上述膀胱類器官中之DAPI染色圖像。圖10c4係ECAD、αSMA及DAPI染色之合併圖像。圖10d1係表示上述膀胱類器官中之作為發育中途之膀胱上皮細胞標記物之FOXA2之分佈的螢光圖像。圖10d2係表示上述膀胱類器官中之作為膀胱上皮細胞標記物之GATA3之分佈的螢光圖像。圖10d3係上述膀胱類器官中之DAPI染色圖像。圖10d4係FOXA2、GATA3及DAPI染色之合併圖像。 圖11a1及圖11b1係分別表示膀胱類器官誘導分化中之膀胱類器官(誘導分化第42天)中之UPK1B及UPK2之分佈的螢光圖像。圖11a2及圖11b2係表示上述膀胱類器官中之ΔNP63之分佈的螢光圖像。圖11a3及圖11b3係表示上述膀胱類器官中之KRT5之分佈的螢光圖像。圖11a4及圖11b4係上述膀胱類器官中之DAPI染色圖像。圖11a5係UPK1B、ΔNP63、KRT5及DAPI染色之合併圖像。圖11b5係UPK2、ΔNP63、KRT5及DAPI染色之合併圖像。

Claims (15)

  1. 一種製造腹側後腸類器官之方法，其包括： 對多能幹細胞使用含有活化素A及GSK3β抑制劑之誘導培養基A進行培養，而誘導分化成胚體內胚葉細胞；及 對上述胚體內胚葉細胞使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，繼而，於細胞外基質之存在下，使用含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑且可進而含有骨成形性蛋白質之誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官。
  2. 如請求項1之方法，其中形成上述腹側後腸類器官包括：對上述胚體內胚葉細胞利用上述誘導培養基B進行培養後，於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B進行培養，而形成後腸類器官；及對上述後腸類器官於細胞外基質之存在下使用上述誘導培養基B進行培養，而形成腹側後腸類器官； 用以形成後腸類器官之誘導培養基B含有纖維母細胞生長因子及GSK3β抑制劑，且用以形成腹側後腸類器官之誘導培養基B含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質。
  3. 如請求項1之方法，其中用以形成腹側後腸類器官之誘導培養基B含有纖維母細胞生長因子、GSK3β抑制劑、及骨成形性蛋白質。
  4. 一種腹側後腸類器官，其係藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造。
  5. 一種腹側後腸類器官，其表現作為腹側後腸標記物之P63， 表現HOXA13及CK8/KRT8，並且 實質上不表現作為背側後腸標記物之SOX2。
  6. 一種腹側後腸類器官，其係具有內腔者，且 表現選自由P63、ΔN63、GATA3、ISL1及SATB2所組成之群中之至少1種腹側後腸標記物， 表現選自由磷酸化Smad1/5/8、HOXA13、FOXA2、CK8/KRT8、及ECAD所組成之群中之至少1種標記物，並且 實質上不表現選自由SOX2、T及CDX2所組成之群中之至少1種背側後腸標記物。
  7. 一種製造膀胱類器官之方法，其包括：將藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造之腹側後腸類器官、或如請求項4至6中任一項之腹側後腸類器官， 於細胞外基質之存在下，使用含有視黃酸、纖維母細胞生長因子及骨成形性蛋白質之誘導培養基C進行培養； 導入至人或非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位；或 於間葉系幹細胞或間葉細胞之存在下進行培養。
  8. 一種膀胱類器官，其係藉由如請求項7之方法所製造。
  9. 一種膀胱類器官，其包括： 第一細胞層，其包含實質上不表現P63但表現UPK1B及/或UPK2之細胞；及 第二細胞層，其相對於上述第一細胞層局部化於外側方向上，且包含共表現P63以及UPK1B及/或UPK2之細胞；且 上述膀胱類器官可進而包括第三細胞層，其相對於上述第二細胞層局部化於外側方向上，且包含共表現P63及KRT5之細胞。
  10. 如請求項9之膀胱類器官，其包含被上述第一細胞層包圍之內腔。
  11. 如請求項9或10之膀胱類器官，其包含第四細胞層，且可進而包含第五細胞層，上述第四細胞層相對於上述第三細胞層局部化於外側方向上，且包含間質樣細胞；上述第五細胞層相對於上述第四細胞層局部化於外側方向上，且包含平滑肌細胞。
  12. 一種製造非人哺乳動物之方法，上述非人哺乳動物於其腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有腹側後腸類器官或膀胱類器官，上述方法包括：將藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造之腹側後腸類器官、如請求項4至6中任一項之腹側後腸類器官、藉由如請求項7之方法所製造之膀胱類器官、或者如請求項8至11中任一項之膀胱類器官導入至非人哺乳動物之腎臟或膀胱或者其等之周邊部位。
  13. 一種非人哺乳動物，於其腎臟或膀胱或者其等之周邊部位具有藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造之腹側後腸類器官、如請求項4至6中任一項之腹側後腸類器官、藉由如請求項7之方法所製造之膀胱類器官、或者如請求項8至11中任一項之膀胱類器官。
  14. 一種用以治療膀胱之損傷或疾病之再生醫學用組合物，其包含：藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造之腹側後腸類器官、如請求項4至6中任一項之腹側後腸類器官、藉由如請求項7之方法所製造之膀胱類器官、或者如請求項8至11中任一項之膀胱類器官。
  15. 一種評估對受驗物質之藥物應答性之方法，其包括： 使藉由如請求項1至3中任一項之方法所製造之腹側後腸類器官、如請求項4至6中任一項之腹側後腸類器官、藉由如請求項7之方法所製造之膀胱類器官、如請求項8至11中任一項之膀胱類器官、藉由如請求項12之方法所製造之非人哺乳動物、或如請求項13之非人哺乳動物與受驗物質進行接觸；及 測定上述腹側後腸類器官、上述膀胱類器官、或上述非人哺乳動物對上述受驗物質之藥物應答性。
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Family Cites Families (5)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6494515B2 (ja) * 2012-10-19 2019-04-03 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞を１又は２以上の細胞系列に分化させる方法
WO2015156929A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for culture of human bladder cell lines and organoids and uses thereof
AU2017214468B2 (en) * 2016-02-01 2020-09-17 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
MA45479A (fr) * 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
SG10202105768WA (en) * 2016-12-05 2021-06-29 Childrens Hospital Med Ct Colonic organoids and methods of making and using same

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