CN116200475A - 一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对及其方法，该简并引物是基于tet(X)基因及其同源基因的多序列比对设计的，具有较好的特异性和敏感性；通过PCR参数的优化，建立了快速检测tet(X)基因及其同源基因的PCR方法，多次重复证明，该方法快速，灵敏，并可实现一对引物检测多种tet(X)同源基因，检测成本低、耗时短、普适性好。为耐药基因的流行性调查提供高效、可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对及其方法。
背景技术
替加环素是第三代四环素类抗生素，被认为是临床对抗多重耐药菌的“最后一道防线”。近年来，在畜禽养殖业、畜禽产品、人以及环境等多种来源的细菌中广泛存在替加环素耐药基因tet(X)基因及其同源基因，该基因可赋予细菌对四环素类抗生素产生高程度的耐药，严重威胁了人类健康。监测tet(X)基因及其同源基因的流行情况，有助于指导临床合理用药，及时控制耐药菌和耐药基因的传播。
tet(X)最初是在专性厌氧脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的R质粒上发现的，编码一种黄素依赖性单加氧酶。随后又在拟杆菌中发现了同源基因tet(X1)和tet(X2)，与tet(X)分别具有61.7％和99.5％的氨基酸序列同一性，但并未发现大规模的流行。直到2019年，研究发现新型tet(X)同系物tet(X3)和tet(X4)基因在动物源大肠杆菌和不动杆菌中广泛存在，引起了全球学者的高度关注。随即在黄杆菌属、鞘氨醇杆菌属、香味菌属以及多重耐药病原菌(肺炎克雷伯菌、肠杆菌、假单胞菌等)中发现了多种变体，尤其是黄杆菌科的鸭疫里默氏杆菌，现已发现44种tet(X)同源基因，同源性在60％～99％不等。
目前，检测tet(X)基因及其同源基因的方法主要是通过PCR扩增和Sanger测序，但针对不同tet(X)同源基因需要选择不同的引物，需要经过多次扩增才能完成检测。也有使用多重PCR进行检测的方法，但检测效果不稳定，并且很多不常见的同源基因也无法检测到，造成漏检。仅适用于常见的tet(X3)和tet(X4)基因，具有较大的局限性，且较为繁琐，不利于对耐药基因的流行性调查。
如中国专利申请号201911069274.5公开了用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR引物组合物及其应用，针对替加环素耐药基因tet(X)的5种变体tet(X)、tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)建立了设计了多组引物进行相应荧光定量PCR方法，该检测方法适用于可培养菌和不可培养菌，并且PCR反应条件相同，从而保证了在同一PCR条件下可以对样品中的替加环素耐药基因tet(X)的5种变体进行同时检测。但是其针对不同tet(X)同源基因需要选择不同的引物，需要经过多次扩增才能完成检测。
中国专利申请号202010862590.4公开了一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，基于tet(X)基因表达的酶能降解替加环素的功能，开发了一种使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的方法，只能检测菌株是否携带tet(X)基因，但是不能检测tet(X)同源基因。
因此，亟需开发一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对及其方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对及其方法，可实现一对引物检测多种tet(X)同源基因。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对，所述简并引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列为:5’-GGHGTAAAYWTTGYTGATGA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为:5’-GGTTSADGAATRTCRSCYTG-3’；
其中：W＝A or T；Y＝C or T；S＝C or G；R＝A or G；D＝A,G or T。
本发明的第二个目的是要提供一种检测tet(X)基因及其同源基因的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的DNA；
S2、以提取的DNA为模板，利用上述检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对构建PCR反应体系和/或qPCR反应体系，进行PCR反应或qPCR反应；
S3、对PCR产物进行凝胶电泳分离，染色，结果判断：如出现332bp的条带，说明待测菌株携带tet(X)基因或其同源基因；否则，说明待测菌株无tet(X)基因或其同源基因；对qPCR产物分析其Ct值，如Ct值小于30，说明待测菌株携带tet(X)基因或其同源基因，否则，说明待测菌株无tet(X)基因或其同源基因；
S4、对待测菌株的DNA进行PCR反应，并对PCR产物进行一代测序，将序列与Genbank数据库中的tet(X)基因或其同源基因进行比对，判定具体tet(X)变体。
具体地，所述步骤S2中，所述PCR反应体系为：以20μL计，2×Taq Master Mix(杭州擎科生物科技有限公司)10μL，10mmol/L上游引物0.5μL，10mmol/L下游引物0.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 8μL；
PCR反应条件为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，42～52℃退火45s；72℃延伸20～60s，共30～40个循环；3)72℃延伸5min。
具体地，所述步骤S2中，所述qPCR反应体系为：以20μL计，2×TB Green Fast qPCRMix 10μL，10mmol/L上游引物0.5μL，10mmol/L下游引物0.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 8μL；
qPCR反应条件为：1)95℃预变性2min；2)95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环；3)72℃延伸5min。
优选地，所述PCR反应条件为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；3)72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明的引物对是基于tet(X)基因及其同源基因的多序列比对设计的，具有较好的特异性和敏感性；通过PCR参数的优化，建立了快速检测tet(X)基因及其同源基因的PCR方法，多次重复证明，该方法快速，灵敏，并可实现一对引物检测多种tet(X)同源基因，检测成本低、耗时短、普适性好。为耐药基因的流行性调查提供高效、可靠的方法。
附图说明
图1tet(X)基因及其同源基因的多序列比对。
图2为筛选PCR扩增的最适温度。
图3为利用引物检测待测菌株qPCR扩增曲线图。图4为利用引物检测待测菌株PCR扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。下述实施例所用的菌株如表1所示，菌株均为实验室保藏。
实施例1
为了设计能够检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对，收集Genebank数据库中的tet(X)基因及其同源基因进行序列比对(如图1所示)，发现几个相对保守的区域，长度可达到20bp以上，仅存在个别碱基的突变。基于这一发现，本发明通过设计简并引物的方式覆盖所有的突变碱基，将这些突变位点替换成简并碱基，如图1所示；合成能够扩增tet(X)基因和所有已知tet(X)同源基因的引物对，根据是否能扩增出目标产物即可判断待测菌株是否携带tet(X)基因及其同源基因。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成了检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对(参见SEQ ID No.15、SEQ ID No.16)，所述简并引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列为:5’-GGHGTAAAYWTTGYTGATGA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为:5’-GGTTSADGAATRTCRSCYTG-3’；
其中：W＝A or T；Y＝C or T；S＝C or G；R＝A or G；D＝A,G or T。
实施例2
利用实施例1的检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对进行PCR扩增即可检测tet(X)基因及其同源基因，具体操作如下：
以不携带tet(X)同源基因的大肠杆菌DNA作为空白对照，以已知携带tet(X)同源基因的大肠杆菌的DNA作为阳性对照。分离培养携带不同tet(X)同源基因的菌株，挑单菌落在肉汤培养基中扩增培养后，用细菌DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取表1中的细菌基因组DNA。
以提取的DNA为模板，利用实施例1的引物，使用PCR的方法进行扩增；所述PCR反应体系为：以20μL计，2×Taq Master Mix(杭州擎科生物科技有限公司)10μL，10mmol/L上游引物0.5μL，10mmol/L下游引物0.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 8μL；PCR反应条件为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，42～52℃退火45s；72℃延伸20～60s，共30～40个循环；3)72℃延伸5min。通过梯度PCR的方法对PCR的退火温度进行优化，所得最优退火温度为48℃，具体胶图如图2所示，因此，后续PCR反应条件优选为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；3)72℃延伸5min。
在上述基础上，以携带tet(X3)基因的Acinetobacter seohaensis、携带tet(X4)基因的Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Enterobacter cloacae、携带tet(X6)基因的Proteus cibarius以及携带不同tet(X)同源基因的Riemerella anatipestifer为检测对象，阳性对照为携带tet(X4)的Escherichia coli，阴性对照为不携带tet(X4)的Escherichia coli。
挑单菌落在肉汤培养基中扩增培养后，用细菌DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取基因组DNA。
利用实施例1的检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对构建PCR反应体系：以20μL计，2×Taq Master Mix(杭州擎科生物科技有限公司)10μL，10mmol/L上游引物0.5μL，10mmol/L下游引物0.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 8μL；PCR反应条件优选为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；3)72℃延伸5min；
对PCR产物进行凝胶电泳分离(120V,30min)，染色，观察产物条带，结果如图4所示，携带tet(X)同源基因的A.seohaensis、E.coli、K.pneumoniae、E.cloacae、P.cibarius、R.anatipestifer均能扩增出322bp的条带，而不携带tet(X)同源基因的E.coli均无法扩增出322bp的条带。
然后，对PCR产物进行一代测序，将序列与Genbank数据库中的tet(X3)基因、tet(X4)基因、tet(X6)基因进行比对，当序列相同时即可确定具体是那种同源基因。
实施例3
以携带tet(X3)基因的Acinetobacter seohaensis、携带tet(X4)基因的Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、携带tet(X6)基因的Proteus cibarius以及携带不同tet(X)同源基因的Riemerella anatipestifer为检测对象。
挑单菌落在肉汤培养基中扩增培养后，用细菌DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取基因组DNA。
利用实施例1的检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对构建qPCR反应体系(20μL)：10μL 2×TB Green Fast qPCR Mix，1.5μL 10mmol/L上游引物，1.5μL 10mmol/L下游引物，1μL 200μg/μL模板DNA，6μL ddH2O；qPCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸20s，共50个循环；最后72℃延伸2min。荧光定量PCR所用仪器为Bio-Rad(CFX96)，对所培养菌落的DNA进行荧光定量PCR，所得荧光定量扩增曲线如图3所示，具体Ct值见表2。
已知tet(X4)基因阳性对照Ct值在35以下，检测菌株的Ct值均在35以下。说明这些携带tet(X)同源基因属。而无tet(X)同源基因的阴性对照的Ct值在35以上。
表2
对待测菌株的DNA进行PCR反应(与实施例2相同)，并对PCR产物进行一代测序，将序列与Genbank数据库中的tet(X3)基因、tet(X4)基因、tet(X6)基因进行比对，当序列相同时即可确定具体是哪种同源基因。
上述实施例只是示例性的检测tet(X3)基因、tet(X4)基因、tet(X6)基因，采用上述方法同样可以检测tet(X)基因以及同源基因tet(X1)-tet(X14)，本实施例不再赘述。
综上所述，本发明建立了快速检测tet(X)同源基因的PCR方法，多次重复证明，该方法快速，灵敏，并可实现一对引物检测tet(X)基因以及同源基因tet(X1)-tet(X14)，检测成本低、耗时短、普适性好。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对，其特征在于：所述简并引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列为:5’-GGHGTAAAYWTTGYTGATGA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为:5’-GGTTSADGAATRTCRSCYTG-3’；
其中：W＝A or T；Y＝C or T；S＝C or G；R＝A or G；D＝A,G or T。
2.一种检测tet(X)基因及其同源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的DNA；
S2、以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的检测tet(X)基因及其同源基因的简并引物对构建PCR反应体系和/或qPCR反应体系，进行PCR反应或qPCR反应；
S3、对PCR产物进行凝胶电泳分离，染色，结果判断：如出现332bp的条带，说明待测菌株携带tet(X)基因或其同源基因；否则，说明待测菌株无tet(X)基因或其同源基因；对qPCR产物分析其Ct值，如Ct值小于35，说明待测菌株携带tet(X)基因或其同源基因，否则，说明待测菌株无tet(X)基因或其同源基因。
S4、对待测菌株的DNA进行PCR反应，并对PCR产物进行一代测序，将序列与Genbank数据库中的tet(X)基因或其同源基因进行比对，判定具体tet(X)变体。
3.根据权利要求2所述的检测tet(X)基因及其同源基因的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述PCR反应体系为：以20μL计，2×Taq Master Mix(杭州擎科生物科技有限公司)10μL，10mmol/L上游引物0.5μL，10mmol/L下游引物0.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 8μL；
PCR反应条件为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，42～52℃退火45s；72℃延伸20～60s，共30～40个循环；3)72℃延伸5min。
4.根据权利要求2所述的检测tet(X)基因及其同源基因的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述qPCR反应体系为：以20μL计，2×TB Green Fast qPCR Mix 10μL，10mmol/L上游引物1.5μL，10mmol/L下游引物1.5μL，200μg/μL模板DNA 1μL，ddH2O 6μL；
qPCR反应条件为：1)95℃预变性3min；2)95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环；3)72℃延伸2min。
5.根据权利要求3所述的检测tet(X)基因及其同源基因的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；3)72℃延伸5min。
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