CN116200424A - 叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 - Google Patents
叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116200424A CN116200424A CN202210950505.9A CN202210950505A CN116200424A CN 116200424 A CN116200424 A CN 116200424A CN 202210950505 A CN202210950505 A CN 202210950505A CN 116200424 A CN116200424 A CN 116200424A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- orchid
- ccmyb24
- banyi
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 title claims abstract description 37
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 64
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 12
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims abstract description 11
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 claims abstract description 6
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 101150094083 24 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 12
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 abstract description 10
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 abstract description 4
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000732800 Cymbidium Species 0.000 description 1
- 241000026010 Dendrobium candidum Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150098141 MYB24 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000358848 Orchidantha maxillarioides Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000519406 Paphiopedilum Species 0.000 description 1
- 241001505935 Phalaenopsis Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用，所述叶斑艺兰花CcMYB24基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，所述性状为：转基因植株的表现为更健壮；转基因植株的莲座叶数增加；转基因植株的侧枝数增加；转基因植株的叶绿素a增加；转基因植株的叶绿素b增加，本发明是利用简并引物设计扩增全长的方法从叶斑艺兰花中克隆出CcMYB24基因，在拟南芥中进行过量表达，并通过农杆菌介导花序浸润法遗传转化拟南芥，实验结果表明在过表达转基因拟南芥中CcMYB244基因能够正常表达，转入过表达CcMYB24基因的生长情况比对照植株表现为更健壮，过量表达CcMYB24基因能够很大程度的提高增加转基因植株的莲座叶数、侧枝数、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用。
背景技术
兰科（Orchidaceae）植物是单子叶植物第一大科，有5个亚科801属28237种,其中兰属（Cymbidium）、兜兰属（Paphiopedilum）、石斛属（Dendrobium）等是世界级的花卉名品。兰科兰属小花型地生种，俗称国兰，在我国有悠久的栽培历史，其花形、叶形、株型优美，花色变化丰富，具有重要的观赏价值。兰花经过长期的选育栽培，出现了很多的变异品种，根据观赏部位的不同，分为花艺、叶艺两大类型，其中的叶斑艺兰花起源于中国，在近些年中逐渐被人们认识。“叶艺”在园艺学上称为叶部彩斑（variegation），是观赏植物叶部变异的重要组成部分。其中，兰花叶斑艺品种观赏价值很高，是“精品兰花”的重要特征。叶艺兰（线艺兰）指兰科兰属植物（Cymbidium）的叶片上镶嵌着金黄色、银白色、浓绿色、朱红色、或墨黑的嘴、边、点、线、斑的中国兰统称。明朝咏兰诗中就有看叶胜看花的佳句，人们在追求兰花花艺的同时也在追求兰花植株外形美，叶艺兰凭借其古朴、厚重、矮小的株型以及多样奇异的叶片形态，自古受到人们追捧，其独特的叶斑性状受人们重视并被选为培育的重点。目前，叶艺兰多来自野生兰科植物的天然杂交后代，或在长期培育过程中的自然变异植株，因此，叶艺兰育种存在数量极为稀少，选育时间较长等瓶颈问题，并且艺象也通常不稳定，导致了叶艺兰定向培育极为困难。近年来随着叶艺兰新品种的培育以及公众对叶艺兰深入的鉴赏，出现了不同颜色和形状变异的新类型。
针对叶斑艺兰花中CcMYB24基因的功能探究以及应用，目前尚未见相关报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一个可显著影响拟南芥的基因片段叶斑艺兰花CcMYB24基因CDS序列如SEQ ID NO:1所示，该基因在拟南芥中正常表达，且促进拟南芥莲座叶数、叶侧枝数、植株叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素合成。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，所述叶斑艺兰花基因的名称为CcMYB24 CDS序列如SEQ ID NO:1所示，所述性状为以下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）性状中的至少一种：
（1）转基因植株的表现为更健壮；
（2）转基因植株的莲座叶数增加；
（3）转基因植株的侧枝数增加；
（4）转基因植株的叶绿素a增加；
（5）转基因植株的叶绿素b增加。
进一步的，所述转基因植株的获得方法为：
（1）叶斑艺兰花CcMYB24基因的扩增；
（2）构建重组载体；
（3）农杆菌介导的遗传转化；
（4）转基因植物培养、检测。
优选的，步骤（1）中，叶斑艺兰花CcMYB24基因的扩增所用的引物核苷酸序列如SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
优选的，步骤（2）中，用于构建所述重组载体的起始载体为pCAMBIA1301，含有35S启动子，其后紧接CcMYB24基因。
本发明是利用简并引物设计扩增全长的方法从叶斑艺兰花中克隆出CcMYB24基因，在拟南芥中进行过量表达，并通过农杆菌介导花序浸润法遗传转化拟南芥，实验结果表明在过表达转基因拟南芥中CcMYB244基因能够正常表达，转入过表达CcMYB24基因的生长情况比对照植株表现为更健壮，过量表达CcMYB24基因能够很大程度的提高增加转基因植株的莲座叶数、侧枝数、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。
附图说明：
图1: CcMYB24基因扩增前后凝胶电泳显示图（M:maker2000bp; 1：MYB24基因全长）；
图2：过表达载体PCR验证凝胶电泳显示图；
图3：过表达转化铁皮石斛原球茎显示图（A：农杆菌介导花序浸润，B：T0代植株，C：T0种子收集及消毒，D：T0种子播种于筛选培养，E：筛选培养基中的小苗，F：移栽到基质土中的小苗）；
图4: PCR检测转基因阳性植株情况显示图（M：DL2000，PC：阳性对照，NC：阴性对照）；
图5 转基因和野生型植株形态显示图（A、B：转基因植株，C、D：野生型植株）；
图6：野生型和转基因拟南芥植株莲座叶侧枝数与莲座叶数比较对比图；
图7：野生型和转基因拟南芥植株光合色素含量对比图；
图8：CcMYB24在野生型和转基因拟南芥植株中茎、叶、花的表达水平效果图；
图9重组载体pCAMBIA1300-35S -CcMYB24结构显示图。
具体实施方式
为了能够更加清楚地理解本发明的技术实质和有益效果，申请人在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本发明方案的限制，任何依据本发明构思所做出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。
为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知技术将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
叶斑艺兰花CcMYB24基因， ORF Finder分析表明CcMYB24基因具有序列较长且完整的开放阅读框，共1390bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，起始密码子为ATG,终止密码子为TAG，CDS序列906 bp，如SEQ ID NO:1所示，共编码301个氨基酸。经ExPASy分析蛋白质的总平均亲水系数为-0.483，表明该蛋白质是亲水性蛋白。
一、重组载体pCAMBIA1300-35S -CcMYB24（图9）由下述方法构建而成：
（1）叶斑艺兰花CcMYB24基因的扩增
设计引物，并以叶斑艺兰花突变体基因组DNA作为扩增模板，获得叶斑艺兰花CcMYB24基因全长序列，图1为CcMYB24基因全长序列电泳图。
① PCR引物
设计引物：
CcMYB24-BamHI F：GCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGGGAGGGCTCCTTGC
CcMYB24-SacI R：GGAATTCGAGCTGGTCAGAGCTCTCAAAAAGTGCTCATACTCTTCCA
②用上述反转录产物进行PCR，体系如下：10xPCR buffer 5.0 ul、dNTP mixture(10 mM) 1.0ul、Primer F (10μM) 1.0 ul、Primer R (10μM) 1.0ul、DNA 1.0ul、KOD (1U/μL) 1.0 ul和ddH2O 40.0 ul，总容量为50ul；
③ PCR反应程序如下：94℃预变性5min；98℃变性30 sec，56℃退火30 sec，68℃延伸2min，32个循环；68℃延伸5min，4℃终止反应。
（2）CcMYB24基因植物过表达载体pCAMBIA1300-35S-CcMYB24构建
用SacI与BamHI双酶切pCAMBIA1300-35S载体并回收纯化，37℃反应30 min。酶切后载体与CcMYB24的PCR扩增产物混合，使用无缝克隆方法构建pCAMBIA1300-35S-CcMYB24载体，37℃反应30 min。
① 载体酶切体系如下：pCAMBIA1300-35S 16 ul、10×FastDigest buffer 2 ul、FastDigest BamHI 1 ul、FastDigest SalI 1ul，总容量为20 ul；
② 用上述PCR产物和酶切载体进行无缝连接，反应体系如下：PCR产物 4 ul、酶切载体 4 ul、Assembly Enzyme 1 ul、10×Assembly Buffer 1 ul，总容量为10 ul；
将植物过表达载体转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达的重组载体pCAMBIA1300- 35S - CcMYB24，之后获得重组质粒。目的基因片段清晰，大小与预期结果一致（1390bp），无非特异性扩增带，过表达载体成功构建；图2为过表达载体图。
三、农杆菌的遗传转化和转化子的检测
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pCAMBIA1300-35S-CcMYB24转入农杆菌（EHA105）中，在加有潮霉素的平板上筛选转化子菌落。以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用CcMYB24基因的特异引物CcMYB24-BamHIF和CcMYB24-SalI R做PCR检测，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
二、用含有CcMYB24基因的植物过表达的农杆菌转化植物
采用农杆菌介导拟南芥花序浸润法
挑取携带有质粒pCAMBIA1300-35S -CcMYB24的农杆菌单菌落接种于液体培养基中培养，离心收集菌体，选择主花序开始结荚，次生花序开始开花的拟南芥侵染，侵染前一天拟南芥浇透水并剪去植株上已结实的所有果荚，向重悬液中加入200-600 μL/L的Silwet-77搅匀，将拟南芥种植盆倒置于装有重悬液的倒三角玻璃杯中使花序完全浸泡于重悬液，浸泡2-6 min，注意避免重悬液滴入拟南芥的莲座。侵染后套上黑色塑料袋气候箱中黑暗湿润培养24 h，后去除黑色塑料袋调整至正常培养条件培养20 d后减少浇水，按前述方法收集种子并保存。过表达遗传转化流程见图3，获得了阳性植株。
五、CcMYB24基因在转基因植物中的插入情况及表达量的检测
为了确认用抗生素（卡那霉素）筛选获得的转基因植物确实含有CcMYB24基因，用利用2XT5 Direct PCR Kit (Plant)试剂盒对筛选到的转基因植物做进一步的鉴定。首先提取转基因植物的基因组DNA，然后以植物基因组DNA为模板，用CcMYB24特异性引物做PCR检测，鉴定是否为阳性植株，鉴定结果如图4所示。
此外，CcMYB24基因在T1代转基因拟南芥中茎、叶、花的表达分别显著高于对照植株（未转基因的野生型），并且在转基因拟南芥中茎、叶、花表达水平有差异，其中叶片表达量最高，其次是花和茎段，检测结果如图5所示。
六、转基因植株形态和生理指标变化的实验
将转基因以及对照野生型在光照培养箱中培养成苗，对过表达CcMYB24基因的植物拟南芥进行各项生理指标的测定，得到了图6、图7、图8的测定结果，实验结果表明在转基因过表达拟南芥中CcMYB24基因能够正常表达，转入拟南芥基因的生长情况相比对照植株（未转基因的野生型），转基因植株表现为莲座叶数，莲座叶侧枝数、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量增加；而类胡萝卜素、总黄酮、可溶性糖和可溶性蛋白含量降低，以上结果表明叶斑艺兰花的CcMYB24转录因子与调控光合色素合成以及叶片、叶芽的生长发育有关。
Claims (5)
1.叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，其特征在于，所述叶斑艺兰花CcMYB24基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，所述性状为以下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）性状中的至少一种：
（1）转基因植株的表现为更健壮；
（2）转基因植株的莲座叶数增加；
（3）转基因植株的侧枝数增加；
（4）转基因植株的叶绿素a增加；
（5）转基因植株的叶绿素b增加。
2.如权利要求1所述的叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，其特征在于，所述转基因植株的获得方法为：
（1）叶斑艺兰花CcMYB24基因的扩增；
（2）构建重组载体；
（3）农杆菌介导的遗传转化；
（4）转基因植物培养、检测。
3.根据权利要求2所述的叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，其特征在于，步骤（1）中，叶斑艺兰花CcMYB24基因的扩增所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示。
4.根据权利要求2所述的叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，其特征在于，步骤（2）中，用于构建所述重组载体的起始载体为pCAMBIA1301，含有35S启动子，其后紧接CcMYB24基因。
5.根据权利要求2所述的叶斑艺兰花CcMYB24基因在植物性状改良中的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述农杆菌为EHA105。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210950505.9A CN116200424B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210950505.9A CN116200424B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116200424A true CN116200424A (zh) | 2023-06-02 |
| CN116200424B CN116200424B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=86517989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210950505.9A Active CN116200424B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | 叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116200424B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116987168A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-11-03 | 云南农业大学 | 一种能稳定改变兰花叶色的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070266459A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | Sudip Chattopadhyay | Novel stress responsive transcription factor involved in plant growth and development and methods thereof |
| CA2771927A1 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Institute Of Subtropical Agriculture, Chinese Academy Of Sciences | Proteins relating to grain shape and leaf shape of rice, coding genes and uses thereof |
| CN111593067A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-28 | 云南农业大学 | 叶斑艺兰花f3′5′h基因的植物表达载体构建及其应用 |
| CN113943744A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-01-18 | 云南农业大学 | 叶斑艺兰花rca基因的应用及其载体构建方法 |
-
2022
- 2022-08-09 CN CN202210950505.9A patent/CN116200424B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070266459A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | Sudip Chattopadhyay | Novel stress responsive transcription factor involved in plant growth and development and methods thereof |
| CA2771927A1 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Institute Of Subtropical Agriculture, Chinese Academy Of Sciences | Proteins relating to grain shape and leaf shape of rice, coding genes and uses thereof |
| CN111593067A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-28 | 云南农业大学 | 叶斑艺兰花f3′5′h基因的植物表达载体构建及其应用 |
| CN113943744A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-01-18 | 云南农业大学 | 叶斑艺兰花rca基因的应用及其载体构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| YU-JIE KE等: "Genome-Wide Identification of the MYB Gene Family in Cymbidium ensifolium and Its Expression Analysis in Different Flower Colors", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 22, no. 24, pages 1 - 15 * |
| 姚红旭等: "叶艺兰CcMYB8基因克隆及生物信息学分析", 北方园艺, no. 18, pages 75 - 80 * |
| 牛义岭等: "植物转录因子MYB基因家族的研究进展", 分子植物育种, vol. 14, no. 8, pages 2050 - 2059 * |
| 王雪霁等: "小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析", 林业科学研究, vol. 31, no. 3, pages 104 - 113 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116987168A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-11-03 | 云南农业大学 | 一种能稳定改变兰花叶色的方法 |
| CN116987168B (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-12 | 云南农业大学 | 一种能稳定改变兰花叶色的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116200424B (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116003556B (zh) | 一种燕子花bHLH3蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN108949786B (zh) | 拟南芥e3泛素连接酶编码基因atl27在调控植物耐盐性能中的应用 | |
| CN116200424B (zh) | 叶斑艺兰花CcMYB24基因的应用 | |
| CN116655758B (zh) | 一种IlMYB5蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN110257401B (zh) | 毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用 | |
| CN113088526A (zh) | 热激相关基因ZmHsf11及其在调控植物耐热性中的应用 | |
| CN113024648A (zh) | 一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用 | |
| CN115960189B (zh) | 一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用 | |
| CN116064572B (zh) | 一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用 | |
| CN114214333A (zh) | 一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用 | |
| CN115927390B (zh) | 一种墨兰花器官发育基因CsPI1及其编码蛋白与应用 | |
| CN116535478B (zh) | 一种燕子花myb4蛋白及其在花色调控中的应用 | |
| CN116987168B (zh) | 一种能稳定改变兰花叶色的方法 | |
| CN116375835B (zh) | 一种燕子花MYB4b蛋白在调控植物叶片形态中的应用 | |
| CN114875044B (zh) | 野葡萄VyVTE1基因及其编码的蛋白和应用 | |
| CN110194791B (zh) | Spl3蛋白在调控植物花序或果柄发育中的用途 | |
| CN108588094B (zh) | 海洋微生物冷激蛋白基因csp、其编码蛋白及其应用 | |
| CN116606359A (zh) | 负向调控植物抗旱性的蛋白质及其编码基因与应用 | |
| CN117802153A (zh) | SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用 | |
| CN117126859A (zh) | 一种调控拟南芥器官大小的基因及其应用 | |
| CN117737080A (zh) | 油菜抗寒基因BnaHSFB1及其应用 | |
| CN117448318A (zh) | 葡萄VviHKT1;1启动子及应用 | |
| CN115976053A (zh) | 一种干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用 | |
| CN117721121A (zh) | MtSPG9基因、蛋白及应用 | |
| CN117604003A (zh) | 一个大豆天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶家族基因GmAK-HSDH的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |