CN116196438A - 一种氧化响应性纳米制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种氧化响应性纳米制剂的制备方法,纳米制剂包括Fe/Cu基MOFs,负载声敏剂后在其孔隙和表明原位形成MnO2。本申请采用的原料毒性小、安全性高、操作简单;同时,本申请方法在37℃±0.2℃的温度条件下搅拌合成了纳米制剂,反应条件温和可控,成本低。本发明利用MOFs高负载量、结构多样性等优势制备了一种ROS氧化响应性纳米制剂药物控制系统,该控释体系集成高药物装载量、易表面修饰、尺寸小以及ROS响应性等优点,易于制备与保存,并在药物递送及肿瘤治疗方面有潜在的应用。此外本发明具有自增强MOFs裂解和药物释放性能;而且该药控体系可以肿瘤微环境提供充足的O2,以保证充分发挥CDTSDT的协同治疗效果,实现内部深部肿瘤的无创治疗。
Description
技术领域
本发明涉及纳米载体技术领域,具体涉及一种氧化响应性纳米制剂的制备方法。
背景技术
活性氧(ROS),包括超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)和羟基自由基(·OH),具有通过破坏脂质、蛋白质和DNA等生物分子来杀死癌细胞的能力。近年来,人们致力于开发更高效、安全的癌症治疗方法,比如,光热治疗(photothermal therapy,PTT)、光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)、化学动力治疗(themodynamic therapy,CDT),声动力治疗(Sonodynamic therapy,SDT)等。新型癌症治疗思路为癌症的诊断和治疗带来新的希望。特别是CDT,它是一种独特的肿瘤治疗技术,其原理是芬顿(Fenton)反应。该疗法通常利用铁(Fe)基化合物介导内源性化学环境中的Fenton反应,并促进H2O2、激素代谢物、谷胱甘肽等的形成,当产生一定量的有毒ROS时,可导致体内肿瘤细胞的死亡。除Fe外,其他金属也能表现出Fenton活性,从而引起类Fenton反应。在还原金属离子的催化下,H2O2生成高氧化性·OH,即Fenton反应或类Fenton反应。此外,H2O2在肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)中转化为毒性·OH,改变了肿瘤细胞的氧化还原状态,进而破坏DNA、蛋白质和脂质,最终导致肿瘤细胞坏死。由于CDT的治疗原理和TME紧密结合,所以具有高选择性,即在正常组织中不会产生·OH,不依赖外部刺激(如光、超声或x射线),只有在肿瘤区域才被激活并释放治疗因子,这也是其他治疗方式不具备的一个优势。值得注意的是,肿瘤局部空间的限制和滞后的血管生成极易引起血液灌流不足,这会导致肿瘤局部形成缺氧微环境。缺氧是大多数实体瘤固有的微环境特征,一直是癌症治疗的瓶颈。缺氧不仅会导致细胞毒性的减弱,甚至会促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。随着越来越多的人认识到TME在肿瘤进展中的关键作用,许多研究致力于通过调控TME(氧气、谷胱甘肽、H2O2等)来抑制肿瘤增殖或提高治疗效果。其中,基于高分子胶束、介孔二氧化硅、脂质体、金属纳米颗粒和金属有机骨架(metal-organic framework,MOFs)的药物给药系统显示出巨大的发展潜力和价值。
MOFs通常以金属离子或金属离子簇为节点,有机分子为连接键,通过配位键和桥接键组装而成。这种结构具有独特的结构和性能,如高孔隙率、低密度、高比表面积、气孔规则、孔径可调、拓扑多样、可改性等。MOFs可以作为载体,通过负载方式输送大量药物,解决游离药物稳定性和溶解性差、代谢和清除快、吸收快等问题;其次,利用TME的特征,如酸性、过量的H2O2和谷胱甘肽,使得MOFs可以和微环境发生反应(如CDT)并克服单一治疗方面的劣势和不足,并协同其他治疗手段,发挥CDT/SDT、CDT/PDT、CDT/PTT、CDT/化疗等治疗效应,从而提高肿瘤诊疗疗效。此外,有机配体的功能化还提供了另一个优势,在合成过程中或合成后可以接枝各种极性或非极性有机官能团,从而改变材料的物理化学性质。如Zhou等人使用基于锆(IV)的卟啉MOF纳米颗粒靶向肿瘤细胞。卟啉衍生物是广泛应用于PDT中的光敏剂,而MOF中的Zr6簇通过后续的修饰获得了主动靶向能力,使PDT效果更加增强。
金属纳米颗粒包括铜(Cu)、锰(Mn)、锌(Zn)、Fe和钛(Ti)基纳米材料,其中Mn基纳米材料因其独特的特性,引起了人们的广泛研究兴趣,并占有很大的比例。二氧化锰(MnO2)纳米颗粒作为一种类过氧化氢酶,可以催化H2O2生成氧气(O2)。生成的O2可以解决肿瘤内部O2不足的问题以缓解耐药性,增强细胞毒性,增强CDT和SDT治疗效果。由于这些优良的特性,MnO2纳米粒子被广泛用于缓解肿瘤缺氧。
本申请先合成有机配体5,5-二甲基-4,6二硫壬二酸(5,5-dimethyl-4,6-dithia-nonanedioic acid,简称HOOC-TK-COOH)。它对ROS高度敏感且降解迅速。与传统的单金属MOF材料不同的是,我们创新性的将ROS氧化响应的TK键与Fe、Cu离子配位合成双金属MOFs。对MOFs进行功能化修饰,克服传统MOFs结构和功能单一的缺点,得到的MOFs具有肿瘤渗透、可控释放的特性,从而实现高效的肿瘤杀伤。
本发明构建的具有增强肿瘤渗透和自放大药物释放特性的ROS氧化响应的纳米制剂,共负载声敏剂焦脱镁叶绿素a(ppa)及原位生成MnO2,解决肿瘤内部供氧不足问题,联合CDT/SDT治疗策略,有效杀伤肿瘤并抑制肿瘤生长及转移,为MOF控释系统的构建及CDT/SDT协同治疗提供科学依据及实践参考。
发明内容
针对以上现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种氧化响应性纳米制剂的制备方法,该方法制备的纳米制剂亲水性好、尺寸小、有利于体内循环,具有肿瘤渗透、可控释放的特性,从而实现高效的肿瘤杀伤;最重要的是还可以解决肿瘤微环境缺氧对CDT和SDT效果的影响;同时,该方法操作简单、安全性高,制备成本低廉、制备过程中试剂毒性小。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种氧化响应性纳米制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:在37℃±0.2℃的温度条件下,将3-巯基丙酸、丙酮和三氟乙酸混合并搅拌;反应5h后,将混合物冷却以促进结晶;然后,用正己烷和水洗涤产品并干燥,得到白色固体HOOC-TK-COOH;其中3-巯基丙酸和丙酮的物质的量的比为5:3;
步骤二:将FeCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、TK和三乙胺的混合物分散在一个容量瓶中,加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇溶液(VDMF/V乙醇=5/3),直到混合物的体积达到13mL;分散均匀后,将混合物转移到50mL的特氟隆内衬不锈钢高压釜中,在150℃下反应12h;在离心并清洗混合物后,得到固体B;其中FeCl2·4H2O和CuCl2·2H2O的物质的量的比为1:0.1~1;
步骤三:在37℃±0.2℃的温度条件下,将步骤二中得到的固体B与焦脱镁叶绿酸a(ppa)按照质量比1:0.1~10的比例进行混合,混合后搅拌24h,然后,通过离心得到固体C;
步骤四:在37℃±0.2℃的温度条件下,将预先溶解在去离子水中的MnCl2·4H2O加入到固体C分散液中(0.4wt%),并搅拌2h;然后,用氨水(25wt%)将分散液的pH值调整到11后,剧烈搅拌4h,随后进行洗涤和离心,得到新型氧化响应性纳米制剂;其中MnCl2·4H2O和固体C的质量的比为2:5。
优选的,所述步骤一中3-巯基丙酸和丙酮的物质的量的比为5:3。
优选的,所述步骤二FeCl2·4H2O和CuCl2·2H2O的物质的量的比为1:0.1~1。
优选的,所述步骤二中使用高压反应釜使用的温度是150℃。
优选的,所诉步骤二中溶剂DMF和乙醇的体积比是5:3。
优选的,所述步骤三中固体B与ppa按照质量比1:0.1~10
优选的,所述步骤四中用氨水调溶液的pH最终的pH值为11。
优选的,所述步骤四中MnCl2·4H2O和固体C的质量的比为2:5。
优选的,所述步骤四中固体C的质量百分比为0.4wt%。
优选的,所述纳米制剂能够用于制备药物,特别是抗肿瘤药物。
优选的,所述的纳米制剂能够氧化响应降解,实现药物的可控释放。
优选的,所述化学动力学剂能够用于制备具有CDT/SDT协同治疗功能的药物;
优选的,所述化学动力学剂具有三种金属元素,提高CDT治疗效率;
优选的,所述纳米制剂能够用于缓解肿瘤缺氧,增强CDT/SDT治疗效果。
本申请的原理在于:
本发明利用水热合成法,将DMF,乙醇等还原性溶剂、有机配体HOOC-TK-COOH混合加入聚四氟乙烯的反应釜中,合成双金属配位的MOFs纳米颗粒内核FCT MOFs。随后,在FCTMOFs内核颗粒表面以及孔洞中负载ppa并原位形成MnO2,制备氧化响应性纳米制剂控释系统FCTpM纳米制剂。本申请采用的原料毒性小、安全性高、操作简单;同时,本申请方法在37℃±0.2℃的温度条件下搅拌合成了纳米制剂,反应条件温和可控,成本低;本发明制备得到的FCTpM纳米制剂控释体系集成高药物装载量、易表面修饰、尺寸小以及ROS响应性等优点,易于制备与保存,并在药物递送及肿瘤治疗方面有潜在的应用。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明通过ROS敏感键、ppa和原位形成MnO2合成了一类氧化响应性MOFs纳米制剂,它可以响应肿瘤细胞内过表达的ROS,快速裂解并原位释放Mn/Fe/Cu离子以及ppa,具有良好的生物安全性;(2)本发明制备的纳米制剂表面电势为负、尺寸在165nm左右、尺寸分布较为均一且分散均匀,利于纳米载体的分散以及能克服肿瘤渗透和细胞摄取屏障,提高递送效率;此外,该体系还具有ROS响应性可裂解性能,能响应肿瘤胞内高浓度的ROS,原位裂解并释放多种金属离子,进一步提高药物生物利用度;(3)本发明制备的FCTpM纳米制剂,利用MnO2为肿瘤微环境提供充足的O2,以保证充分发挥CDT的治疗效果,实现内部深部肿瘤的无创治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施实例中有机配体HOOC-TK-COOH的表征图;
图2为本发明实施实例中制备的FCT MOFs的透射电子显微镜及动态光散射图;
图3为本发明实施实例中制备的产物动态光散射、X射线光电子能谱和紫外吸收谱图;
图4为本发明实施例中制备的产物的细胞外检测的荧光图谱;
图5为本发明实施例中制备的FCTpM纳米制剂细胞外ROS水平检测荧光图谱;
图6为本发明实施例中制备的FCTpM纳米制剂细胞毒性实验和活/死染色实验结果图;
图7为本发明实施例中制备的FCTpM纳米制剂细胞内ROS水平检测结果图;
图8为4T1荷瘤小鼠模型评估本发明实施例中制备的FCTpM纳米制剂体内治疗效果;
图9为本发明实施例中制备的FCTpM纳米制剂体内治疗结束后肿瘤组织用于组织学检查的细胞核增殖抗原(Ki67)、苏木精伊红(H&E)免疫组化染色和ROS免疫荧光染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。若未特别指明,实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例:
一种氧化响应性纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
如图1所示,图1中A的合成路径图;B是核磁共振氢谱图;
有机配体HOOC-TK-COOH的合成方法如下:
在37℃±0.2℃的温度条件下,3-巯基丙酸、丙酮和三氟乙酸在室温下混合并搅拌。反应5h后,将混合物冷却以促进结晶。然后,用正己烷和水洗涤产品并干燥,得到白色固体HOOC-TK-COOH;其中3-巯基丙酸和丙酮的物质的量的比为5:3;
FCT MOFs的合成方法如下:
将FeCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、TK和三乙胺的混合物分散在一个容量瓶中,加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇溶液(VDMF/V乙醇=5/3),直到混合物的体积达到13mL。分散均匀后,将混合物转移到50mL的特氟隆内衬不锈钢高压釜中,在150℃下反应12h。在离心并清洗混合物后,得到固体B;其中FeCl2·4H2O和CuCl2·2H2O的物质的量的比为1:0.1~1;
氧化响应性纳米制剂的制备方法如下:
在37℃±0.2℃的温度条件下,将步骤二中得到的固体B与ppa按照质量比1:0.1~10的比例进行混合,混合后搅拌24h,然后,通过离心得到固体C;
在37℃±0.2℃的温度条件下,将预先溶解在去离子水中的MnCl2·4H2O加入到固体C分散液中(0.4wt%),并搅拌2h;然后,用氨水(25wt%)将分散液的pH值调整到11后,在室温下剧烈搅拌4h,随后进行洗涤和离心,得到新型氧化响应性纳米制剂;其中MnCl2·4H2O和固体C的质量的比为2:5。
纳米制剂及结构实验:
本发明通过核磁共振氢谱对实施例中得到有机配体TK进行化学结构分析。如图1所示,化学位移2.7和化学位移2.47为-CH2-的特征峰,化学位移1.49为-CH3的特征峰,这证明了HOOC-TK-COOH的合成。
本发明通过透射电镜及动态光散射对实施例中得到的FCT MOFs进行表征。如图2所示,图2中A透射电子显微镜图;B是动态光散射图;MOFs是呈纳米花结构,且尺寸均一、大小在155nm左右,Zeta电位为10.73mV。
为直接观察本申请制得的氧化响应性纳米制剂的形貌和大小,以实施例得到的纳米制剂FCTM作为实验对象:首先,将制得的FCTpM溶于超纯水中、得混合液;然后,将混合液添加到玻璃比色皿中用纳米粒度及Zeta电位分析仪(90Plus PALS)测试;得到的动态光散射图及Zeta电位图如图3A所示。从图3A能够得出:本申请实施例制备的纳米制剂尺寸均一、大小在100~250nm范围内,Zeta电位为-45.50mV。图3中A是FCTpM纳米制剂的动态光散射图;B是FCTpM纳米制剂的X射线光电子能谱图;C是FCT MOFs、ppa以及FCTpM纳米制剂的紫外吸收谱图。
本发明通过X射线光电子能谱分析了实施例得到的FCTpM的元素组成,结果如图3B所示,样品有Cu 2p、Cu 3p、Mn 2p、Fe 2p、S 2p、S 2s、C 1s和O1s轨道的特征峰,表明FCTpM含Fe、Cu、Mn三种金属元素,其Fe、Cu、Mn的含量比为18:13:10。
发明通过紫外吸收光谱分析了实施例得到的FCTpM纳米制剂中ppa的封装情况,如图3C所示,发现FCTpM纳米制剂在660nm处出现了ppa的特征峰,表明FCTMPB纳米制剂成功装载了ppa。相比之下,FCT纳米制剂在660nm处没有显示特征峰。
纳米制剂光学性质试验:
(1)首先,将实施例得到的未负载ppa的氧化响应性纳米制剂FCTM,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制成FCTM浓度为100μg/mL(2.75μM的Mn离子)的溶液;加入到1mL的PBS(pH5.6)中,其中含有10mM的H2O2;对照组为单独的PBS(含有10mM的H2O2)。
实验组与对照组均加入100μL的:三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)(10μg/mL),然后将样品溶液进行荧光光谱扫描(RF-6000),设置激发波长为455nm、波长范围为500~800nm;实验组与对照组的细胞外氧气检测荧光谱图如图4A所示。:图4中,A是FCTM纳米制剂细胞外O2水平检测荧光图;B是化FCTM纳米制剂细胞外·OH水平检测荧光图谱。由于动态淬灭的作用,分子氧会引起三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)的荧光显著降低。从图4A能够看出:实验组光照后在625nm左右的荧光强度明显更强,证明纳米制剂能够在酸性条件下产生O2。由此可知,FCTM可以解决肿瘤内部O2不足的问题以缓解耐药性,增强CDT治疗效果。
(2)实验组:将实施例得到的纳米制剂FCTM用水配制成浓度为100μg/mL的溶液加入0.1mM的H2O2;对照组为单独的水(含有0.1mM的H2O2);
实验组与对照组均加入50μL的罗丹明B(20μg/mL),然后立即将样品溶液进行荧光光谱扫描(RF-6000),设置激发波长为554nm、波长范围为530~700nm;实验组与对照组的细胞外·OH水平检测荧光谱图如图4B所示。由于纳米制剂以H2O2为氧化剂,以金属离子为催化体系的氧化法,所产生的·OH与罗丹明B作用后使体系荧光强度降低,利用荧光强度的变化间接测定所产生的羟自由基。从图4B能够看出:相比于对照组,实验组在580nm左右的荧光强度明显更弱,证明FCTM能够产生·OH。
(3)实验组:将实施例得到的FCTpM纳米制剂用PBS配制成ppa浓度为5μg/mL的溶液;对照组为单独的PBS;
实验组与对照组均加入500μL的二氯荧光素(20μmol/mL),然后采用1.15W/cm2的超声照射1.5min,照射后立即将样品溶液进行荧光光谱扫描(RF-6000),设置激发波长为488nm、波长范围为500~650nm;实验组与对照组的细胞外活性氧水平检测荧光谱图如图5所示。图5中,A是FCTpM纳米制剂细胞毒性实验结果图;B是FCTpM纳米制剂用钙黄绿素/PI染色的倒置荧光显微镜图。从图5能够看出:在1.15W/cm2的超声照射条件下,相比于对照组,实验组在520nm左右的荧光强度明显更强、证明纳米制剂光照后能够产生ROS。
肿瘤细胞应用试验:
(1)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测纳米制剂对肿瘤细胞的毒性:
首先,将4T1细胞置于含有10%胎牛血清(FBS)的培养基中,在37℃和5%的二氧化碳气氛中培养24h;然后除去旧培养基,将含ppa浓度为0-20μg/mL的实施例中制备的FCTpM的培养基加入96孔板的每个孔中。对于需要超声处理的4T1细胞,将含有ppa浓度为0-20μg/mL的FCTpM的培养基在生理温度(即37℃)下与4T1细胞一起温育4h,除去旧培养基、更换新培养基;用超声照射(0.87W/cm2,30s),然后将4T1细胞置于37℃温度下的黑暗环境中孵育20h。然后将MTT溶液(20μL,5mg/mL)加入96孔板的各孔中,并在37℃条件下孵育4h;之后向96孔板的每个孔中加入200μL二甲基亚砜;最后使用酶标仪(Labserv K3型酶标仪,赛默飞)在492nm条件下测量溶液的吸光度;得到的4T1细胞的细胞毒性图如下图6A所示,其中图6A中数据显示为平均值±SD,从图6A能够看出:依在FCTpM纳米制剂不同浓度下且经过超声照射处理的4T1细胞存活率分别为101.5%、97.0%、90.44%、73.3%、69.64605%、50.84%、37.9%、30.0%,并且细胞的存活率都低于未经超声照射的处理组,证明本申请得到的纳米制剂在进行SDT治疗后,对细胞的杀伤效果更大,证明了FCTpM纳米制剂可以协同CDT/SDT,达到更好的治疗效果
(2)采用钙黄绿素实验检测纳米制剂对肿瘤细胞的毒性:
首先,将增殖好的4T1细胞以5×104个/mL的浓度接种于六孔板中;再将含ppa浓度为5μg/mL的FCTpM纳米制剂的培养基加入六孔板中的每个孔;然后在温度为37℃的黑暗条件下将FCTpM纳米制剂与4T1细胞孵育24h。对需要超声照射处理的4T1细胞,将FCTpM纳米制剂在生理温度(37℃)下与4T1细胞一起温育24h,用超声(0.87W/cm2)照射30s。以上处理后,按照钙黄绿素/PI细胞试剂盒说明书的要求加入钙黄绿素/PI,染色30min,用PBS清洗三次;再使用倒置荧光显微镜观察4T1细胞的活/死情况,活细胞显示为绿色、死细胞显示为红色,得到的倒置荧光显微镜图如图6B所示:从图6B能够看出:在超声照射的条件下,FCTpM纳米制剂处理的4T1细胞视野可见细胞均为红色,表面几乎没有4T1细胞存活;而无超声处理的的FCTpM处理的细胞只有部分有红色细胞。即本申请实施例中制备的FCTpMPB对4T1细胞具有明显毒性,并且CDT/SDT联合的细胞毒性明显大于CDT单独治疗毒性。
(3)采用二氯荧光素实验检测纳米制剂肿瘤细胞ROS的生成:
首先,将增殖好的4T1细胞以5×104个/mL的浓度接种于共聚焦培养皿中;再将含ppa浓度为5μg/mL的FCTpM纳米制剂的培养基加入六共聚焦培养皿中;然后在温度为37℃的黑暗条件下将FCTpM纳米制剂与4T1细胞孵育4h。以上处理后,按照2',7'-二氯荧光素二乙酸盐试剂盒说明书的要求加入2',7'-二氯荧光素二乙酸盐,染色15min,用PBS清洗三次;对需要超声照射处理的4T1细胞,染色15min后,用超声(0.87W/cm2)照射30s。再使用共聚焦扫描显微镜观察4T1细胞的ROS产生情况,细胞核显示为蓝色、ROS显示为绿色,得到的共聚焦扫描显微镜图如图7所示,图7中A是用共聚焦扫描显微镜评价细胞内ROS水平;B在超声照射30s后用共聚焦扫描显微镜评价细胞内ROS水平。
图7A显示细胞的未经超声照射,图7B显示的细胞经超声照射处理:从图7能够看出:由于纳米制剂中金属离子的CDT抗肿瘤功效,在没有超声处理的情况下,FCTpM组也出现了绿色荧光;与未经照射的PBS、FCTpM组相比,FCTpM组在超声辐照下显示更强绿色荧光,这主要是由于超声辐照激活了ppa激发的SDT。这些结果表明,FCTpM纳米制剂可以产生足够ROS,使得纳米制剂在进入肿瘤细胞后能够快速的裂解释放金属离子以及ppa,通过综合的SDT和CDT级联反应杀死4T1细胞。
体内抗肿瘤实验:
将含有1×107个4T1细胞的200μL细胞悬液皮下注射到BALB/c小鼠的背部,建立皮下肿瘤模型。当肿瘤生长到100mm3左右后,将小鼠分为2组(每组4只)。(1)FCTpM和(2)PBS,并按照5mg/kg ppa静脉注射PBS或纳米制剂。注射24h后,对肿瘤区域进行超声辐照(1.15W/cm2,1min)。在第14天处死小鼠,以获肿瘤组织并测量其体积与体重。根据以下的公式计算肿瘤体积(V):V=L×S2/2(L,肿瘤的长径;S,肿瘤的短径)。
处死小鼠后,收集肿瘤组织如图8A所示,图8中,A是荷瘤小鼠治疗14天后的肿瘤大小;B是治疗后的肿瘤体积以及抑制率;C疗后的肿瘤体重以及抑制率。PBS组的肿瘤在给药期间呈现出快速的生长趋势,FCTpM组诱导了明显的肿瘤生长抑制作用,表明FCTpM介导的肿瘤CDT/SDT协同治疗能高效杀伤肿瘤。图8B的肿瘤体积统计结果与图8C的肿瘤体重统计结果均证实了相同的肿瘤生长抑制趋势。在进行14天的治疗后FCTpM组基于PBS组的肿瘤体积抑制率为58.5%,肿瘤体重抑制率为49.3%。这些结果表明FCTpM纳米制剂具有优异的抗肿瘤效果。
组织病理学分析:
组织病理学分析的结果如图9所示,与PBS组相比,FCTpM组均诱导了一定程度的肿瘤组织凋亡,表现为肿瘤切片H&E图中明显的细胞塌陷、变形和染色质浓缩。此外,Ki67免疫组化染色结果表明,FCTpM纳米制剂有效下调了肿瘤细胞Ki67的表达,表现为肿瘤切片ki67图中代表肿瘤细胞增殖的深褐色阳性细胞在FCTpM组只有部分存在,表明肿瘤细胞的增殖受到了明显的抑制。这再次佐证了FCTpM纳米制剂具有良好的抗肿瘤作用。此外,肿瘤切片的ROS免疫荧光染色结果为:代表ROS水平的红色荧光在FCTpM组显示出更强的荧光强度,这再次佐证了纳米制剂,可以产生足够的ROS使自身到达肿瘤组织后快速降解,实现药物的可控释放以及充分发挥CDT协同SDT的抗肿瘤效果。
Claims (10)
1.一种氧化响应性纳米制剂的制备方法,所述包括以下步骤:
步骤一:在37℃±0.2℃的温度条件下,将3-巯基丙酸、丙酮和三氟乙酸混合并搅拌;反应5h后,将混合物冷却以促进结晶;然后,用正己烷和水洗涤产品并干燥,得到白色固体HOOC-TK-COOH;其中3-巯基丙酸和丙酮的物质的量的比为5:3;
步骤二:将FeCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、TK和三乙胺的混合物分散在一个容量瓶中,加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇溶液(VDMF/V乙醇=5/3),直到混合物的体积达到13mL;分散均匀后,将混合物转移到50mL的特氟隆内衬不锈钢高压釜中,在150℃下反应12h;在离心并清洗混合物后,得到固体B;其中FeCl2·4H2O和CuCl2·2H2O的物质的量的比为1:0.1~1;
步骤三:在37℃±0.2℃的温度条件下,将步骤二中得到的固体B与焦脱镁叶绿酸a(ppa)按照质量比1:0.1~10的比例进行混合,混合后搅拌24h,然后,通过离心得到固体C;
步骤四:在37℃±0.2℃的温度条件下,将预先溶解在去离子水中的MnCl2·4H2O加入到固体C分散液中(0.4wt%),并搅拌2h;然后,用氨水(25wt%)将分散液的pH值调整到11后,剧烈搅拌4h,随后进行洗涤和离心,得到新型氧化响应性纳米制剂;其中MnCl2·4H2O和固体C的质量的比为2:5。
2.根据权利要求1所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述步骤一中3-巯基丙酸和丙酮的物质的量的比为5:3。
3.根据权利要求1或2所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述步骤二FeCl2·4H2O和CuCl2·2H2O的物质的量的比为1:0.1~1;所述步骤二中使用高压反应釜使用的温度是150℃;所述步骤二中溶剂DMF和乙醇的体积比是5:3。
4.根据权利要求3所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述步骤三中固体B与ppa按照质量比1:0.1~10。
5.根据权利要求4所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述步骤四中用氨水调溶液的pH最终的pH值为11;所述步骤四中MnCl2·4H2O和固体C的质量的比为2:5;所述步骤四中固体C的质量百分比为0.4wt%。
6.根据权利要求5所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述纳米制剂能够用于制备药物,特别是抗肿瘤药物。
7.根据权利要求6所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述的纳米制剂能够氧化响应降解,实现药物的可控释放。
8.根据权利要求7所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述化学动力学剂能够用于制备具有CDT/SDT协同治疗功能的药物。
9.根据权利要求8所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述化学动力学剂具有三种金属元素,提高CDT治疗效率。
10.根据权利要求9所述的一种氧化响应纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤研究,其特征在于:所述纳米制剂能够用于缓解肿瘤缺氧,增强CDT/SDT治疗效果。
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