CN116196402A - 表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合cart在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在肿瘤治疗中的应用。本发明提供了一种溶瘤腺病毒、双特异性抗体和CART三种肿瘤免疫疗法的联合应用。重组溶瘤腺病毒表达并分泌MUC16‑BiTE，其能够桥接肿瘤细胞和CART细胞，诱导免疫突触形成，并刺激CART细胞活化；重组溶瘤腺病毒能够溶解肿瘤细胞、增加CART细胞浸润、产生促炎性环境，促进实体瘤免疫激活并克服肿瘤的免疫抑制。重组后获得的MUC16‑BiTE，其能同时靶向CART细胞CD3抗原和肿瘤细胞MUC16抗原，既增强了CART的靶向性、同时避免了BiTE全身用药引起的不良反应，增加CART对实体瘤的杀伤效果。

Description

表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在肿瘤治疗中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤。由于前沿的研究，筛查、诊断、手术等治疗方法的进步，许多癌症的生存率有了很大的提高，但是卵巢癌的生存率几十年来变化不大。卵巢癌的标准治疗方案是手术和铂类-紫杉醇联合化疗，尽管取得了一定的进步，但是绝大多患者仍然很快复发、转移、耐药，一旦发生这种情况，多数患者就会面临无有效方法可用。因此，迫切需要改进卵巢癌患者的疗法。
肿瘤免疫治疗已成为肿瘤学中最有前途的治疗方法之一，它主要通过激活免疫系统以诱导肿瘤免疫监视或者逆转肿瘤免疫逃逸来发挥抗瘤作用。研究证明，卵巢癌是一种免疫性肿瘤，卵巢癌的生存率可因肿瘤浸润淋巴细胞(尤其是CD3+T细胞)的存在得到很大的提高。与此同时，由T调节细胞等抑制性细胞介导的免疫逃避机制与较差的存活率相关。基于以上，上皮性卵巢癌患者可能从免疫治疗中获益。
Chimeric antigen receptor T cell(CAR-T)是一种新型的过继细胞转移免疫疗法，其关键是通过基因修饰使T细胞表达专门设计的CAR，可以和肿瘤表面的抗原直接结合，从而不依赖于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制，激活T细胞并杀死表达特定抗原的肿瘤细胞，由于其在血液恶性肿瘤中的优异效果，获得了广泛的临床关注。因此，CAR-T治疗也给实体肿瘤患者带来了新的希望，在卵巢癌中的一些研究包括临床前动物模型研究和注册的临床研究，都显示出有希望的结果。Chekmasova等发现靶向MUC-CD的一代和二代CAR-T细胞对卵巢癌细胞具有特异性的杀伤作用。分泌IL-12的靶向MUC-16的CAR-T在小鼠移植模型中表现出非常强的抗肿瘤效果，开始进入一期临床实验。但是实体肿瘤复杂的肿瘤微环境，对CAR-T细胞有明显的免疫抑制作用，并使CAR-T细胞难以有效归巢到肿瘤组织，多种免疫治疗的联合应用，为实体瘤的治疗提供了一个方向。
溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus,OAd)是对腺病毒基因结构进行有目的改造，使病毒能有选择的在特定肿瘤细胞中复制，不断裂解肿瘤细胞，同时又对周围正常的细胞无杀伤力。OAds可以通过多种机制促进抗肿瘤免疫反应。OAds诱发促炎环境，可募集T细胞并破坏T细胞浸润的物理屏障，增加肿瘤的T细胞浸润。OAds可以刺激促炎性细胞因子的产生以及肿瘤微环境中免疫抑制细胞的消耗。OAds感染产生的促炎环境还可以将免疫抑制细胞类型(例如M2巨噬细胞)转化为更具抗肿瘤性的表型。另外OAdss还可以上调参与抗原加工和呈递的途径，包括增加肿瘤相关抗原(TAA)释放、增加APC和肿瘤细胞上主要组织相容性复合物(MHC)I类和MHC II类的表达，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。
双特异性T细胞衔接器(Bispecific T-cell engagers,BiTE)由两个单链可变片段(ScFv)组成的双特异性单链抗体，其中一个结合癌细胞上的肿瘤相关抗原，另一个结合T细胞表面标记CD3，可以同时靶向癌细胞和T细胞，将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物，诱导免疫突触形成，刺激T细胞活化，杀伤肿瘤细胞。BiTE结合T细胞抗原阳性靶细胞，独立于HLA呈现，并能激活任何T细胞与相邻靶细胞结合和破坏。此外，BiTE介导的T细胞活化可以克服肿瘤相关免疫抑制的限制性因素，从而导致衰竭的肿瘤特异性T细胞的活化和增殖。博纳吐单抗(Blinatumomab)是2014年获得FDA快速批准的CD19BiTE，用于治疗复发或难治性B-ALL，明显好于标准化疗方案。然而，BiTE血清半衰期短，需要长期连续进行静脉给药，毒性较高。此外，BiTE在实体瘤中的应用，由于肿瘤微环境的渗透问题和由于脱靶效应造成的剂量限制毒性等原因，效果受限。为了增加BiTE的功效并减少持续全身给药引起的不良副作用，BiTE在肿瘤部位的局部表达可刺激肿瘤浸润T细胞而无全身毒性。用溶瘤腺病毒作为载体来表达BiTE分子是一个有效的优化方法。
MUC16是粘蛋白家族(MUC)家族的成员之一，属于I型跨膜粘蛋白。MUC16作为MUC家族中最大的糖蛋白，其基因位于人染色体19p13.2，由179kb基因组DNA编码，共编码了22152个氨基酸。该蛋白由两个结构域组成：释放结构域(CA-125)和保留结构域(MUC-CD)。其中释放结构域是一个由多个重复序列组成的大的切割和释放结构域，释放到血液中，成为卵巢癌的血清标志物CA-125；保留结构域包括残余的非重复胞外片段、跨膜区和细胞质尾部，保留在细胞表面，并且仅在正常组织(包括子宫、输卵管、卵巢和眼睛的角膜表面)低水平表达，因此可作为一个极具吸引力的靶点。目前已经有使用针对MUC16的抗体治疗卵巢癌的方法，比如奥戈伏单抗(Oregovomab)是目前已进入III期临床的抗MUC16抗体。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在肿瘤治疗中的应用。本发明为了增加CART细胞的抗肿瘤免疫反应，将溶瘤腺病毒与CART治疗联合应用起来，通过溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞，产生促炎性环境，克服肿瘤免疫微环境的免疫抑制，促进实体瘤的免疫激活，增加肿瘤相关抗原(TAA)释放和CART细胞浸润。同时将BiTE(尤其是表达MUC16-BiTE)装载至溶瘤腺病毒，病毒感染肿瘤细胞后，能够同时分泌BiTE,能够同时靶向CART细胞CD3抗原和肿瘤细胞抗原(MUC16)，实现肿瘤细胞和CART细胞的桥接。这大大加大了CART细胞对实体瘤尤其是卵巢癌的杀伤作用。编码BiTE的重组腺病毒能够显著增加CART的细胞毒性，表现为对对实体瘤尤其是卵巢癌的杀伤作用显著提升。体外细胞实验结果显示即便是对于靶抗原表达量少的卵巢癌细胞用重组腺病毒感染后24小时后，CART细胞以E:T＝2：1的低效靶比便可对肿瘤细胞产生强细胞毒性，表现为杀伤24小时后，癌细胞存活率可低至15％左右。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在制备抗肿瘤药物中的应用。
其中，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒具体为表达BiTE(尤其是表达MUC16-BiTE)的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE，该重组溶瘤腺病毒的一个具体实施例，具体可参见CN113969266A；所述CAR-T细胞具体可以为MUC16-CAR-T细胞。
所述肿瘤为实体瘤，所述实体瘤尤其指卵巢癌，特别是产生抗性的卵巢癌。
所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞在治疗过程中的用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×107个，优选为5×109PFU：1×107个。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物包括上述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞。
其中，具体为表达BiTE(尤其是表达MUC16-BiTE)的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE，该重组溶瘤腺病毒的一个具体实施例，具体可参见CN113969266A；所述CAR-T细胞具体可以为MUC16-CAR-T细胞。
所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞的用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×107个，优选为5×109PFU：1×107个。
经试验证明，上述组合物可用于肿瘤，诸如实体瘤，尤其指卵巢癌，特别是产生抗性的卵巢癌。
本发明的第三个方面，提供一种实体瘤治疗的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的上述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒和CART细胞。所述实体瘤尤其指卵巢癌。
相较于现有技术，本发明的优势在于：本发明提供了一种溶瘤腺病毒、双特异性抗体和CART三种肿瘤免疫疗法的联合应用。重组溶瘤腺病毒，表达并分泌一种双特异性抗体，尤其是MUC16-BiTE，其能够桥接肿瘤细胞和CART细胞，诱导免疫突触形成，并刺激CART细胞活化；重组溶瘤腺病毒能够溶解肿瘤细胞、增加CART细胞浸润、产生促炎性环境，促进实体瘤免疫激活并克服肿瘤的免疫抑制。尤其是，重组后获得的MUC16-BiTE，其能同时靶向CART细胞CD3抗原和肿瘤细胞MUC16抗原，既增强了CART的靶向性、同时避免了BiTE全身用药引起的不良反应，并且通过BiTE对免疫微环境的激活作用，增加了CART对实体瘤的杀伤效果，比如对于靶抗原表达量少的肿瘤细胞，表现出加强的杀伤作用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例2中构建的MUC16-CAR-T的感染效率。
图2为本发明实施例2中MUC16-CART对卵巢癌各细胞的杀伤作用。
图3为本发明实施例2中OAd-MUC16-BiTE介导的CART细胞对卵巢癌细胞OV90的杀伤作用结果。
图4为本发明实施例3中体内杀瘤实验的结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在制备抗肿瘤药物中的应用。
其中，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒具体为表达BiTE(尤其是表达MUC16-BiTE)的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE，该重组溶瘤腺病毒的一个具体实施例，具体可参见CN113969266A；所述CAR-T细胞具体可以为MUC16-CAR-T细胞。
经试验证明，表达双特异性抗体(MUC16-BiTE)的溶瘤腺病毒(OAd-MUC16-BiTE)可以提高MUC16-CART细胞对卵巢癌细胞的细胞毒性，尤其是对MUC16表达量比较少的OV90细胞，表现为重组腺病毒感染后24小时后，CART细胞以E:T＝2：1的低效靶比便可对肿瘤细胞产生强细胞毒性，即杀伤24小时后，癌细胞存活率可低至15％左右。在体外，基于卵巢癌PDX模型，MUC16-CART和OAd-MUC16-BiTE联用也显示出更好的抗肿瘤作用。相较于单纯的施与MUC16-CART，本发明重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE和MUC16-CART联用表现出更为优异的效果，因为该疗法还包括病毒对肿瘤细胞的直接裂解作用和间接引起宿主的抗肿瘤免疫作用，多种治疗方法协同作用达到更好的杀伤效果。
所述肿瘤为实体瘤，在本发明的一个具体实施方式中，所述实体瘤尤其指卵巢癌，特别是产生抗性的卵巢癌。
所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞在治疗过程中的用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×107个，优选为5×109PFU：1×107个。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物包括上述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞。
其中，具体为表达BiTE(尤其是表达MUC16-BiTE)的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE，该重组溶瘤腺病毒的一个具体实施例，具体可参见CN113969266A；所述CAR-T细胞具体可以为MUC16-CAR-T细胞。
具体的，所述MUC16-CAR-T细胞是由靶向MUC16的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
所述靶向MUC16的嵌合抗原受体其至少包含抗MUC16单链抗体ScFv，其至少包含抗体的可变轻链区(VL)和可变重链区(VH)；所述可变轻链区其氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述可变重链区序列选自如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。所述可变轻链区和可变重链区通过连接链(linker)进行连接。进一步的，所述MUC16单链抗体为VH-linker-VL型ScFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
更具体的，所述靶向MUC16的嵌合抗原受体还可以包括EF1a启动子、信号肽、人Fc铰链区、CD8跨膜区、CD28和4-1BB胞内区序列胞内信号分子、CD3序列等。本发明的一个具体实施方式中，所述靶向MUC16的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
具体的，所述CAR-T细胞可采用如下方法制备得到，如用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述靶向MUC16的嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。
所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞的用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×107个，优选为5×109PFU：1×107个。
经试验证明，上述组合物可用于肿瘤，诸如实体瘤，尤其指卵巢癌，特别是产生抗性的卵巢癌。
所述组合物可以为药物，此时，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。
所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、无机(包括金属)颗粒、黏粒或质粒载体。
所述药物还可与其他预防和/或治疗肿瘤(尤其是卵巢癌)的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。
本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的第三个方面，提供一种实体瘤治疗的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的上述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒和CART细胞。所述实体瘤尤其指卵巢癌。
其中，所述“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物个体的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1MUC16-CAR-T的构建
获取靶向MU16抗体的scFv序列，构建CAR序列结构，CAR序列结构依次包含EF1a启动子，信号肽序列，靶向MU16抗体的scFv序列，人Fc铰链区序列，CD8跨膜区序列，CD28和41BB胞内区序列(T细胞活化的第二信号)，胞内信号分子CD3序列(T细胞活化的第一信号)(靶向MUC16的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；同时，为方便后续筛选检测，插入EGFP荧光报告基因，并使用2A连接。采用第二代慢病毒包装系统psPAX2和pMD2.G，慢病毒表达载体于HEK293T细胞系通过Lipofectamine 3000进行病毒包装，包装的并对进行浓缩、纯化，然后感染T细胞，得到靶向MUC16的CAR-T细胞(MUC16-CAR-T)，流式细胞术分析EGFP阳性细胞。
实施例2体外杀瘤实验
1、使用Luciferase发光强度法检测对靶细胞(卵巢癌细胞HEY及过表达细胞系HEY-MUC16、SKOV3及过表达细胞系SKOV3-MUC16、OV90、OVCAR3)的杀伤能力。
1)将稳定表达Luciferase(荧光素酶)的靶细胞按1×104铺于96孔板中；
2)将MUC16CART细胞按效靶比20：1，10：1，5:1的比例加入靶细胞中；
3)8h后对靶细胞进行Luciferase的发光强度检测；
具体操作按照Bright-LumiTM萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天，RG051M)说明书进行。
4)肿瘤抑制率＝1-(实验组流明值-空白对照组流明值)/(阴性对照组流明值-空白对照组流明值)×100％。
实验结果见图1。
2、使用Luciferase发光强度法检测联合应用对靶细胞(卵巢癌细胞OV90)的杀伤能力
1)将稳定表达Luciferase(荧光素酶)的靶细胞按1×104铺于96孔板中；
2)按MOI＝1将病毒加入孔中；
3)加入病毒24小时后，将MUC16CART细胞按效靶比2：1的比例加入靶细胞中；
4)24h后对靶细胞进行Luciferase的发光强度检测；
具体操作按照Bright-LumiTM萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天，RG051M)说明书进行。
5)肿瘤抑制率＝1-(实验组流明值-空白对照组流明值)/(阴性对照组流明值-空白对照组流明值)×100％。
体外杀伤实验结果如图2和图3所示。
由图2实验结果可知，MUC16-CART对卵巢癌细胞的杀伤呈剂量依赖性及抗原表达量依赖性。对于抗原表达量比较低的细胞系，如OV90，在高效靶比20：1的情况下杀伤作用依旧不明显。但由图3结果可知，当加入携带双特异性抗体MUC16-BiTE的溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE后，CART细胞以E:T＝2：1的低效靶比便可对肿瘤细胞产生强细胞毒性。
实施例3体内杀瘤实验
1)构建了卵巢癌PDX模型。
2)将PDX P2代的肿瘤匀浆，接种到小鼠皮下。
3)1周后，将小鼠随机分为5组(每组5只)，在第0天和第3天瘤内注射5×109PFUOAd或OAd-MUC16-BiTE或者PBS，每轮病毒注射后1天，通过尾静脉向小鼠注射1×107CART细胞或者等体积的PBS。
4)在指定分析时间，所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(200mg/kg)安乐死，然后切除肿瘤。
体内杀瘤结果如图4所示，PBS组显示出最快的肿瘤生长，OAd-MUC16-BiTE的给药显着增强了MUC16-CART的抗肿瘤功效，并且相比于给药OAd的治疗组效果明显。
以上实施例表明，本发明的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE可靶向肿瘤细胞表达分泌双特异性抗体MUC16-BiTE，通过BiTE激活免疫微环境，在肿瘤部位刺激肿瘤浸润CART细胞而无全身毒性，可显著增加CART细胞对卵巢癌的杀伤效果。
本发明中涉及的氨基酸及核苷酸序列：
(1)MUC16-VL氨基酸序列
DIELTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNQLAWYQQKPGQSPELLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQSYNLLTFGPGTKLEVKR
(2)MUC16-VL核苷酸序列
GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACCAGTTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCAGGACAGTCTCCTGAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCCAGCAATCTTATAATCTACTCACGTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTCAAACGG
(3)MUC16-VH氨基酸序列
VKLQESGGGFVKPGGSLKVSCAASGFTFSSYAMSWVRLSPEMRLEWVATISSAGGYIFYSDSVQGRFTISRDNAKNTLHLQMGSLRSGDTAMYYCARQGFGNYGDYYAMDYWGQGTTVTVSS
(4)MUC16-VH核苷酸序列
GTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTCAAAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCCTGGGTTCGCCTGAGTCCGGAGATGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGCAGTGCTGGTGGTTACATCTTCTATTCTGACAGTGTGCAGGGACGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGCACCTGCAAATGGGCAGTCTGAGGTCTGGGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGCAGGGATTTGGTAACTACGGTGATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
(5)VH-linker-VL型MUC16单链抗体核苷酸序列
GTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTCAAAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCCTGGGTTCGCCTGAGTCCGGAGATGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGCAGTGCTGGTGGTTACATCTTCTATTCTGACAGTGTGCAGGGACGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGCACCTGCAAATGGGCAGTCTGAGGTCTGGGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGCAGGGATTTGGTAACTACGGTGATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACCAGTTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCAGGACAGTCTCCTGAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCCAGCAATCTTATAATCTACTCACGTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTCAAACGG
(6)靶向MUC16的嵌合抗原受体的核苷酸序列
GAGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTCAAAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCCTGGGTTCGCCTGAGTCCGGAGATGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGCAGTGCTGGTGGTTACATCTTCTATTCTGACAGTGTGCAGGGACGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGCACCTGCAAATGGGCAGTCTGAGGTCTGGGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGCAGGGATTTGGTAACTACGGTGATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACCAGTTGGCTTGGTACCAGCAAAAACCAGGACAGTCTCCTGAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCCAGCAATCTTATAATCTACTCACGTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTCAAACGGCGCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCATGGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCA
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒联合CART在制备抗肿瘤药物中的应用；
其中，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒具体为表达MUC16-BiTE的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE；
所述CAR-T细胞具体为MUC16-CAR-T细胞；
所述MUC16-CAR-T细胞是由靶向MUC16的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述实体瘤为卵巢癌，进一步为产生抗性的卵巢癌。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×10 7个。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞；
其中，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒具体为表达MUC16-BiTE的重组溶瘤腺病毒OAd-MUC16-BiTE；
所述CAR-T细胞具体为MUC16-CAR-T细胞；
所述MUC16-CAR-T细胞是由靶向MUC16的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
6.如权利要求5所述组合物，其特征在于，所述靶向MUC16的嵌合抗原受体其至少包含抗MUC16单链抗体ScFv，其至少包含抗体的可变轻链区和可变重链区；所述可变轻链区其氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述可变重链区序列选自如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述可变轻链区和可变重链区通过连接链进行连接；
所述MUC16单链抗体为VH-linker-VL型ScFv，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
所述靶向MUC16的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.如权利要求5所述组合物，其特征在于，所述表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒与CAR-T细胞的用量比例控制在为1-10×109PFU：0.1-5×10 7个。
8.如权利要求5-7任一项所述组合物，其特征在于，所述组合物用于肿瘤治疗，所述肿瘤为实体瘤，包括卵巢癌，进一步为产生抗性的卵巢癌。
9.如权利要求8所述组合物，其特征在于，所述组合物为药物，所述药物还包括药学上可接受的载体。
10.一种实体瘤治疗的方法，其特征在于，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求5-9任一项所述组合物；
所述实体瘤包括卵巢癌。
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