CN116196398A - 一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法，属于医药技术领域，本发明将血红蛋白通过点击化学的方法修饰到纳米颗粒表面，形成稳定且标准化的蛋白冠，从而减少了单核吞噬系统的摄取，延长了血液循环时间，增加了肿瘤相关巨噬细胞M2型细胞对蛋白纳米笼的摄取，从而提高了肿瘤靶向效率。本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼，其血液半衰期t1(fast)从46.5min延长至56.0min，而t2(slow)从411.5min延长至645.4min。冠化血红蛋白明显延长了蛋白纳米笼的血液半衰期。本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼有望用于肿瘤相关巨噬细胞M2型的再极化，从而推动蛋白纳米笼肿瘤免疫治疗的临床转化。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法。
背景技术
当静脉注射的纳米药物进入生理环境时会不可避免地与血液发生相互作用，从而赋予纳米药物新的生物界面，这一界面被称为纳米药物的蛋白冠。由于蛋白冠来源于机体本身，蛋白冠介导的靶向递送不仅会降低纳米药物的免疫原性和毒性，而且通过选择纳米递送系统的表面蛋白冠有望实现肿瘤个性化治疗。纳米递送载体的表面性质决定了蛋白冠的组分和数量，而蛋白冠又对外源纳米递送系统的活体行为、亚细胞分布、免疫应答和靶点富集有巨大影响。因此，蛋白冠于纳米递送系统是一把双刃剑，一方面纳米递送系统表面吸附“无益”血浆蛋白不仅会降低其肿瘤靶向性，而且会激活巨噬细胞，增加细胞因子的分泌。另一方面，吸附“有益”血浆蛋白，则可增加纳米递送系统的血液循环时间和生物安全性，甚至可增强靶点富集效率。例如纳米颗粒表面结合白蛋白会提高其在血液中的“隐藏”性能减缓药物系统清除从而增加血液循环时间和生物安全性，聚苯乙烯纳米颗粒表面结合凝聚素可以减少巨噬细胞的吞噬实现免疫逃逸，载脂蛋白E结合到脂质体纳米药物表面极大地增强了脑部肿瘤富集效率，Mishra等人也报道细菌结合玻连蛋白(VTN)可以“伪装”免疫系统，阻碍宿主先天性免疫补体级联的应答。所以，选择性的吸附“有益”蛋白冠不仅会减少单核吞噬系统对纳米药物的吞噬，延长纳米药物的血液循环时间，而且有望会提高肿瘤靶向性。
目前纳米药物蛋白冠化的方法主要是将纳米药物与血浆孵育，通过调节纳米颗粒的表面性质以动态吸附的方法制备生物分子冠化的纳米载体，然而，血红蛋白虽然在血浆中的丰度相对较高，大约是0.11mg/mL，但是传统吸附方法难以形成稳定和标准化的蛋白冠，因此可能会弱化蛋白冠介导的延长血液循环时间的能力。为此，本发明提供一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法。
发明内容
本发明提供了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法，有效解决了传统的吸附方法难以形成稳定和标准化的蛋白冠，利用被动吸附的方法导致血浆蛋白冠化效率低和丰度低的问题，同时构建了一种减少巨噬细胞吞噬，延长血液循环时间，增加肿瘤靶向效率的纳米体系。
本发明提供了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将末端琥珀酰亚胺酯活化的叠氮-聚乙二烯连接子(N3-PEGLinker)加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液中，室温下，于160rpm振荡反应，通过氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼表面，于4℃避光孵育，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到蛋白纳米笼-叠氮(PNC-N3)溶液；
将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子加入到血红蛋白溶液中，于160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血浆蛋白Hb上，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔；
S2，将S1的血红蛋白-环炔加入到S1的PNC-N3溶液中，室温下，于160rpm避光振荡反应，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
优选的，S1中，所述蛋白纳米笼溶液与末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEG Linker的摩尔比为1:30～200。
优选的，所述末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker的分子量为3400。
优选的，所述蛋白纳米笼溶液的浓度为4mg/mL。
优选的，S1中，所述血红蛋白溶液与末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子的摩尔比为1:2～15。
优选的，所述血红蛋白溶液的浓度为5～10mg/mL。
优选的，S2中，按照蛋白纳米笼溶液与血红蛋白1:100～500的摩尔比将S2的血红蛋白-环炔加入到S1的PNC-N3溶液中。
优选的，S1中，所述避光振荡反应2h。
优选的，S2中，所述室温下振荡反应2h，于4℃避光孵育2h。
本发明还提供了一种由上述构建方法得到的血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法，本发明将筛选出的有益血浆蛋白血红蛋白通过点击化学的方法修饰到纳米颗粒表面，形成稳定且标准化的蛋白冠，从而减少了单核吞噬系统的摄取，延长了血液循环时间，增加了肿瘤相关巨噬细胞M2型细胞对蛋白纳米笼的摄取，从而提高了肿瘤靶向效率。本发明构建的血红蛋白冠化的蛋白纳米笼，其血液半衰期t1(fast)从46.5min延长至56.0min，而t2(slow)从411.5min延长至645.4min。冠化血红蛋白明显延长了蛋白纳米笼的血液半衰期。综上，本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼有望用于肿瘤相关巨噬细胞M2型的再极化，从而推动蛋白纳米笼肿瘤免疫治疗的临床转化。
附图说明
图1为本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼与单核巨噬细胞M0和诱导分化的M2型巨噬细胞的相互作用图；其中，a图为血红蛋白冠化的蛋白纳米笼与单核巨噬细胞RAW264.7的相互作用；b图为血红蛋白冠化的蛋白纳米笼与IL-4诱导分化的M2型巨噬细胞的相互作用；Cy5标记蛋白纳米笼，DAPI染核；
图2为本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼血液半衰期测定图；其中，a图为经尾静脉注射后不同时间点血液中PNC-5KN3和PNC-5KN3-Hb荧光强度曲线图进行二相拟合图；b图为二相拟合得到的PNC-5KN3和PNC-5KN3-Hb的血液半衰期图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述试验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。
本发明中蛋白纳米笼溶液的配置过程如下：
将前期研究中保存的菌株E.coliRosetta(DE3)/pET32a-5hcVP1平行接入8支5mLLB液体培养基中，分别加入终浓度50μg/mL的氨苄青霉素和氯霉素，37℃，200rpm培养8h，然后将5mL菌液分别转接入8个500mLLB三角瓶中，加入相应含量的氨苄青霉素和氯霉素，37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6时，加入终浓度1mM的IPTG，25℃诱导培养12h，然后6000rpm，4℃，15min收集菌体，将菌体沉淀用缓冲溶液(10mMTris-HCl,pH7.2,1mMCaCl2,250mMNaCl,and5％glycerol)清洗一次后，继续重悬于200mL缓冲溶液中进行压力破碎，破碎后以10000rpm离心30min，留取上清。
将破碎上清置于冰水浴中搅拌，缓慢加入固体硫酸铵至85％饱和度，继续搅拌45min，10000rpm离心30min，弃上清；硫酸铵沉淀重悬于200mL组装溶液(10mMTris-HCl,pH7.2,1mMCaCl2,1MNaCl,and5％glycerol)中，4℃缓慢搅拌过夜，10000rpm离心30min，取上清；上清于4℃，55000r/min(贝克曼Type90Ti转子)超速离心1h，弃上清，将沉淀重悬于解聚溶液(10mM Tris-HCl,pH8.8,200mMNaCl,2mMEDTA,10mMDTT和5％glycerol)，4℃缓慢搅拌溶解过夜；溶解液于4℃，55000r/min(贝克曼Type90Ti转子)超速离心1h，上清即为目的蛋白5hcVP1五聚体。
将0.5mg/mL的5hcVP1五聚体放入8-14kDa的透析袋，在组装溶液中于4℃透析10000倍以上，将组装的产物用100kDa的超滤管浓缩至11mL(4℃，4200rpm)，浓缩后的组装产物缓慢加入蔗糖密度梯度离心管(离心管标记为10等份，从上到下为F1-F10，分别铺10％-50％的蔗糖，以5％为递增单位)，每管加入约1.8mL浓缩的组装产物，于4℃38000rpm离心(贝克曼SW41转子)4h，将每一层蔗糖条带小心取出，其中F4和F5中分布的物质即为蛋白纳米笼，将其放入8-14kDa的透析袋中进行脱糖，在1×PBS中于4℃透析10000倍以上，最后利用100kDa的超滤管将蛋白纳米笼浓缩至4mg/mL。
实施例1
一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，包括以下步骤：
S1，将2mg末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker(购自Nanocs公司，分子量3400)以PNC：N3-PEGLinker＝1:40的摩尔比加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液(1mL，4mg/mL)中，室温160rpm振荡反应2h，通过蛋白纳米笼表面的氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼PNC表面，然后4℃避光孵育2h使反应充分，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到PNC-N3溶液。
S2，将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子(购自Nanocs公司)以血浆蛋白：环炔-聚乙二烯连接子＝1:5的摩尔比加入到血红蛋白(10mg/mL)溶液中，室温160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血红蛋白上，然后利用10kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔。
S3，将反应产物血红蛋白-环炔(10mg/mL，500μL)以PNC：血红蛋白＝1：200的摩尔比加入到上述修饰好的PNC-N3溶液中，室温避光160rpm振荡反应2h，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
实施例2
一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，包括以下步骤：
S1，将2mg末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker(购自Nanocs公司，分子量3400)以PNC：N3-PEGLinker＝1:30的摩尔比加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液(1mL，4mg/mL)中，室温160rpm振荡反应2h，通过蛋白纳米笼表面的氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼PNC表面，然后4℃避光孵育2h使反应充分，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到PNC-N3溶液。
S2，将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子(购自Nanocs公司)以血浆蛋白：环炔-聚乙二烯连接子＝1:2的摩尔比加入到血红蛋白(5mg/mL)溶液中，室温160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血红蛋白上，然后利用10kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔。
S3，将反应产物血红蛋白-环炔(10mg/mL，500μL)以PNC：血红蛋白＝1：100的摩尔比加入到上述修饰好的PNC-N3溶液中，室温避光160rpm振荡反应2h，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
实施例3
一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，包括以下步骤：
S1，将2mg末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker(购自Nanocs公司，分子量3400)以PNC：N3-PEGLinker＝1:200的摩尔比加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液(1mL，4mg/mL)中，室温160rpm振荡反应2h，通过蛋白纳米笼表面的氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼PNC表面，然后4℃避光孵育2h使反应充分，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到PNC-N3溶液。
S2，将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子(购自Nanocs公司)以血浆蛋白：环炔-聚乙二烯连接子＝1:15的摩尔比加入到血红蛋白(8mg/mL)溶液中，室温160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血红蛋白上，然后利用10kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔。
S3，将反应产物血红蛋白-环炔(10mg/mL，500μL)以PNC：血红蛋白＝1：500的摩尔比加入到上述修饰好的PNC-N3溶液中，室温避光160rpm振荡反应2h，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
实施例4
一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，包括以下步骤：
S1，将2mg末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker(购自Nanocs公司，分子量3400)以PNC：N3-PEGLinker＝1:80的摩尔比加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液(1mL，4mg/mL)中，室温160rpm振荡反应2h，通过蛋白纳米笼表面的氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼PNC表面，然后4℃避光孵育2h使反应充分，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到PNC-N3溶液。
S2，将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子(购自Nanocs公司)以血浆蛋白：环炔-聚乙二烯连接子＝1:8的摩尔比加入到血红蛋白(7mg/mL)溶液中，室温160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血红蛋白上，然后利用10kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔。
S3，将反应产物血红蛋白-环炔(10mg/mL，500μL)以PNC：血红蛋白＝1：300的摩尔比加入到上述修饰好的PNC-N3溶液中，室温避光160rpm振荡反应2h，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
实施例5
一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，包括以下步骤：
S1，将2mg末端琥珀酰亚胺酯活化的N3-PEGLinker(购自Nanocs公司，分子量3400)以PNC：N3-PEGLinker＝1:150的摩尔比加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液(1mL，4mg/mL)中，室温160rpm振荡反应2h，通过蛋白纳米笼表面的氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N3基团引入蛋白纳米笼PNC表面，然后4℃避光孵育2h使反应充分，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N3-PEGLinker，得到PNC-N3溶液。
S2，将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子(购自Nanocs公司)以血浆蛋白：环炔-聚乙二烯连接子＝1:12的摩尔比加入到血红蛋白(9mg/mL)溶液中，室温160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血红蛋白上，然后利用10kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔。
S3，将反应产物血红蛋白-环炔(10mg/mL，500μL)以PNC：血红蛋白＝1：400的摩尔比加入到上述修饰好的PNC-N3溶液中，室温避光160rpm振荡反应2h，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
上述实施例1～5制备得到的血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的技术效果近似，本发明仅以实施例1为例，其制备得到的血红蛋白冠化的蛋白纳米笼与单核巨噬细胞M0和诱导分化的M2型巨噬细胞的相互作用如图1所示，血红蛋白冠化的蛋白纳米笼PNC血液半衰期测定如图2所示。
由图1可知，血红蛋白冠化的蛋白纳米笼可以屏蔽单核巨噬细胞的吞噬，又可以实现M2型巨噬细胞的内在化，血红蛋白冠化的蛋白纳米笼在血液循环中可以减少单核吞噬系统的吞噬，延长血液循环时间，又可以增加肿瘤相关巨噬细胞M2型细胞对蛋白纳米笼的摄取，该体系有望用于肿瘤相关巨噬细胞M2型的再极化，从而加强肿瘤免疫治疗。由图2可知，血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的血液半衰期t1(fast)从46.5min延长至56.0min，而t2(slow)从411.5min延长至645.4min，综上，冠化血红蛋白明显延长了蛋白纳米笼的血液半衰期。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将末端琥珀酰亚胺酯活化的叠氮-聚乙二烯连接子加入到蛋白纳米笼溶液中，室温下振荡反应，于4℃避光孵育，除去游离的叠氮-聚乙二烯连接子，得到蛋白纳米笼-叠氮溶液；
将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子加入到血红蛋白溶液中，振荡反应，除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔；
S2，将S1的血红蛋白-环炔加入到S1的蛋白纳米笼-叠氮溶液中，避光振荡反应，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1中，所述蛋白纳米笼溶液与末端琥珀酰亚胺酯活化的叠氮-聚乙二烯连接子的摩尔比为1:30～200。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述末端琥珀酰亚胺酯活化的叠氮-聚乙二烯连接子的分子量为3400。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述蛋白纳米笼溶液的浓度为4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1中，所述血红蛋白溶液与末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子的摩尔比为1:2～15。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述血红蛋白溶液的浓度为5～10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S2中，按照蛋白纳米笼溶液与血红蛋白1:100～500的摩尔比将S1的血红蛋白-环炔加入到蛋白纳米笼-叠氮溶液中。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1中，所述避光振荡反应2h；S2中，所述室温下振荡反应2h，于4℃避光孵育2h。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的构建方法得到的血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。
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