CN116179538A - 一种高质量样品前处理试剂及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物样DNA保存试剂和保存方法。所述保护试剂蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂和核酸保护剂。所述保存方法通过将唾液样品保存在所述保护试剂中从而对唾液样品中的DNA进行保护。本发明可以实现唾液样品的DNA在环境条件下的稳定运输和保存，尤其适合于传染性样品的安全运输；在提取纯化后能够以高得量获得高质量的DNA，能够确保唾液中DNA在保存过程中的完整性；可快速灭活唾液样品中的病原体微生物，抑制各种病毒或细菌生长，杜绝二次传染；可以避免对唾液样品造成过度稀释。

Description

一种高质量样品前处理试剂及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及唾液样品的保存和核酸提取方法。

背景技术

目前分子生物学中，基于核酸扩增的分子技术已日益用于法医、军事、人类医药以及科学研究等方面。如在法医鉴定方面，通过提取家属的DNA以进行核酸扩增可对死者的身份进行辨认；又如在人类健康方面，通过对检测者的血液、其他体液或细胞中的DNA进行检测，并进行核酸扩增，收集其相关基因信息后，分析其所含有的各种基因情况，使人们了解自己的基因信息，预知身体患病的风险，从而通过改善自己的生活环境，养成良好生活习惯等方式，避免或延缓疾病的发生。

一般用于提取基因组DNA的体液通常来自静脉血液(主要提取其中的白细胞)，但使用血液作为检测来源具有很多缺点。首先，血液的采集需要经过训练的专业人员操作；其次，血液采集是侵入性方式，经常给供试者带来一定程度的不适和疼痛；此外，血液采集过程还需要避免一些血源性病原体造成的感染。

从唾液中提取DNA的方式相对于传统的从血液中提取DNA的方式来说，具有如下优点。首先，采集过程简单方便，无需经专业训练的人员即可操作。其次，这种方式为非侵入式采集方式，可避免对受检者造成不必要的不适和疼痛。再其次，更为关键的是，唾液样品往往可以由受试者自己采集，然后通过相应的保存技术运输至实验室进行核酸检验。

但是，在唾液保存过程中，需要维持DNA的完整性，抑制核酸酶对DNA的降解作用，以及防止细菌、真菌等微生物对DNA纯度的污染。因此如何使唾液在长时间保存下还能通过核酸提取过程获得纯度较高且质量较好的DNA，成为唾液样品是否可以取代血液样品成为基因检测的关键所在。

中国专利CN102919218B公开了一种人体唾液保存用组合物及其制备方法，其组分和含量如下：pH为6-8.5的Tris-HCl 5-20mmol/L，EDTA0.5-2mmol/L，NaOAc 2.5-3.5mol/L，蔗糖0.1-0.4mol/L，N-乙酰基-5-甲氧基色胺1-3mmol/L，对羟基苯甲酸丙酯1-4mg/mL，重氮烷基咪唑脲1-3mg/mL，蛋白酶K10μ0/mL，体系pH7.5-8.5。该样品保存液可以与唾液1∶1体积保存唾液中的DNA，且可以在室温下保存4个月左右，高温(40度)保存7天以上。该方案中用到蛋白酶K，蛋白酶K的室温活性会不可避免地逐渐降低，导致本身样品保存液的保质期较短，长期保存DNA的能力也是会受到很大的影响，此外，该方案未能系统研究唾液样品保存与下游核酸提取之间的关系。

中国专利CN105695447公开了一种用于保存唾液中DNA的组合物，包括变性剂、缓冲液、螯合剂、氯化钠和聚乙二醇。该专利的发明人认为该方案通过荧光定量PCR稳定检出保存15个月的唾液DNA，但我们从实施例中看到经过保存的唾液样品，提取到大部分DNA的A260/280纯度都小于1.7，质量较差，且普遍浓度较低。

中国专利CN108220281A公开一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用，较为系统性地考虑了唾液样品保存和核酸提取之间的关系，但该保存液得到的DNA浓度较低，且保存液含有蛋白酶K，不可避免地会有和中国专利CN102919218B方案一样的缺陷。

此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对唾液样品的高质量样品前处理试剂(本文有时简称为“保存试剂”)其处理方法(本文有时称为“保存方法”)。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种生物样品DNA保存试剂，所述保存试剂包含蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂、核酸保护剂和溶剂；其中，所述蛋白变性剂为高氯酸钠。

在一些优选的实施方式中，所述溶剂为水或水性缓冲液。

在另一些优选的实施方式中，所述生物样品DNA保存试剂包含：质量体积百分比为30-50％(例如为40％)的高氯酸钠、终浓度为10-500mM(例如为20、50、100或200mM)的缓冲剂、质量体积百分比为1-20％(例如为2、5、10或15％)的表面活性剂、终浓度为1-200mM(例如为10、100或150mM)的螯合剂和质量体积百分比为0.05-5％(例如为0.1、1或2％)的核酸保护剂。

在一些优选的实施方式中，所述生物样品DNA保存试剂的pH为5.5-10.5(例如为8.0、8.5或9.0)。优选的，所述生物样品DNA保存试剂的pH为8.0-9.5。

在一些优选的实施方式中，所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、硼酸钠、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N，N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合。

在一些更优选的实施方式中，所述缓冲液为乙磺酸钠、柠檬酸、硼酸钠、N，N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合。

在一些更优选的实施方式中，所述缓冲剂为柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵和酒石酸钠中的一种或任意几种的组合，并且所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20-400mM(例如50、100或200mM)的柠檬酸、20-200mM(例如50或100mM)的硼酸钠、50-500mM(例如100、200、300或400mM)的乙酸铵、10-200mM(例如20、50、100或150mM)的酒石酸钠。

在一些更优选的实施方式中，所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20-200mM(例如50或100mM))的硼酸钠、50-500mM(例如100、200、300或400mM)的乙酸铵、10-200mM(例如20、50、100或150mM)的酒石酸钠。

在一些优选的实施方式中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂。

其中，所述表面活性剂优选选自Brij 35、Brij 56、Brij 58、十二烷基硫酸钠、NP40、聚乙二醇辛基苯基醚、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Span-80、Span-20、Span-40、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、松香基季铵盐阳离子表面活性剂、乙撑基双(十六酰胺丙基二甲基溴化铵)、十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵和椰油基葡萄糖苷羟丙基三甲基氯化铵中的一种或任意几种的组合。

在一些优选的实施方式中，所述表面活性剂可以为十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵的一种或任意几种的组合。

在一些更优选的实施方式中，所述保存试剂包含十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵作为表面活性剂，并且该表面活性剂在所述保存试剂中的质量体积百分比为1-20％(例如2、5、10或15％)的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵。

其中，所述螯合剂优选为EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、水杨酸、三草酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、N，N’-乙二胺二琥珀酸、邻菲咯啉、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸、酒石酸钠、三乙醇胺中的一种或任意几种的组合。

在一些优选的实施方式中，所述螯合剂可以为柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸、酒石酸钠中的一种或任意几种的组合。

在一些更优选的实施方式中，所述螯合剂为柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸、酒石酸钠中的一种或任意几种的组合。所述螯合剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：1-50mM(例如5、10、20、30或40mM)的二亚乙基三胺五乙酸、5-60mM(例如10、20或50mM)的柠檬酸钠、2-100mM(例如10、20或50mM)的酒石酸、10-200mM(例如20、50或100mM)的酒石酸钠。

在一些进一步优选的实施方式中，所述保存试剂包含20-50mM(例如30或40mM)的酒石酸钠作为螯合剂。

其中，所述核酸保护剂优选为尿素、儿茶素、花青素、花白素、类黄酮，木酚素、N-乙酰氨基己糖、聚乙二醇200、聚乙二醇2000、聚乙二醇8000、聚丙烯酸(优选分子量为1000至4000的聚丙烯酸，例如分子量为2000的聚丙烯酸)、聚丙烯酰胺(优选分子量为20000至40000的聚丙烯酰胺，例如分子量为28000的聚丙烯酰胺)中的一种或任意几种的组合。

在一些优选的实施方式中，所述核酸保护剂为儿茶素、聚乙二醇2000、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺中的一种或任意几种的组合。更优选的是，所述核酸保护剂为儿茶素和聚丙烯酸的组合。本发明人研究发现，儿茶素和聚丙烯酸的组合能够使得生物样品中DNA在长期保存过程中不容易发生降解，保存质量非常好。

在一些更优选的实施方式中，所述核酸保护剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：质量体积百分比0.1-2％(例如0.5或1％)的儿茶素、0.1-1％(0.2、0.5或0.8％)聚丙烯酸。

在一些进一步优选的实施方式中，所述保存试剂包含儿茶素和聚丙烯酸的组合作为核酸保护剂，在这种情况下，所述保存试剂包含质量体积百分比0.1-2％(例如0.5或1％)的儿茶素和0.1-1％(0.2、0.5或0.8％)聚丙烯酸。

本发明人还发现，当采用高氯酸钠作为蛋白变性剂时，在所述表面活性剂为十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵的情况下，可以以少量的保护试剂实现对较大量的生物样品中的DNA进行保护。以生物样品为唾液样品的情况为例，唾液样品和保存试剂的体积为甚至可以为10∶1；不过优选为4∶1，使得生物样品在保存过程中基本不被稀释。

在一些优选的实施方式中，所述生物样品DNA保存试剂包含：质量体积百分比为30-50％的高氯酸钠、10-500mM的缓冲剂、质量体积百分比为1-20％的表面活性剂、终浓度为1-200mM的螯合剂和质量体积百分比为0.05-5％的核酸保护剂。其中，所述缓冲剂为20-200mM的硼酸钠、50-500mM乙酸铵和10-200mM酒石酸钠的一种或任意几种的组合；

其中，所述表面活性剂为质量体积百分比(在所述保护试剂中，下同)为1-20％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵；

其中，所述螯合剂为20-50mM的酒石酸钠；

其中，所述核酸保护剂为质量体积百分比0.1-2％的儿茶素和0.1-1％聚丙烯酸组合。

其中，所述保存试剂的pH优选为8.0-9.5。

在一些优选的实施方式中，所述保存试剂包含：质量体积百分比为50％的高氯酸钠、400mM乙酸铵、质量体积百分比为4％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、50mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.5％的儿茶素和质量体积百分比为0.5％聚丙烯酸，pH9.0。

在另一个优选的实施方式中，所述保存试剂包含：质量体积百分比为30％的高氯酸钠、250mM硼酸钠、质量体积百分比为6％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、20mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.1％的儿茶素和质量体积百分比为1％聚丙烯酸，pH9.5。

在一些实施方式中，所述保存试剂在环境温度下在60天至5年的保存期内使唾液样品中的高分子量基因组DNA降解不超过50％，优选不超过30％，更优选不超过20％，所述高分子量基因组DNA为23kb以上的基因组DNA。

在一些优选的实施方式中，所述保存试剂可以在环境温度下稳定保存唾液中人类基因组DNA至少60天。

在一些优选的实施方式中，所述保存试剂可以在环境温度下稳定保存唾液中的人类基因组DNA至少180天，或至少270天，或至少1年，或至少2年，或至少3年，或至少5年。

其中，所述高分子量DNA为23kb以上的DNA；“稳定保存”为在保存期内高分子量DNA降解不超过50％。优选的是，所述高分子量DNA降解不超过30％。更为优选的，所述高分子量DNA降解不超过20％。

本发明在第二方面提供了一种保存唾液样品的方法，其中将所述唾液样品保存在本发明第一方面所述的保护试剂中。

在一些优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

a)获得唾液样品；

b)使唾液样品与生物样品DNA保存试剂接触并混匀，形成均匀混合物；

c)将唾液样品以所述均匀混合物的形式对其中的DNA进行保存；

其中，所述生物样品DNA保存试剂为本发明第一方面所述的生物样品DNA保存试剂。

在保护期内，可以进行常温储存和/或运输。

在另一些优选的实施方式中，所述唾液样品和所述保存试剂的体积为1∶10-10∶1；更优选为1∶4-4∶1；进一步优选为1∶1-4∶1；更进一步优选为4∶1。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)可实现唾液样品的DNA在环境条件下的稳定运输和保存，对样品保存液中的核酸进行提取纯化后，获得的DNA质量好、得量高，可完成PCR、qPCR、NGS等各种基因检测及分析实验；

(2)确保唾液中DNA在保存过程中的完整性，即获得高分子量的DNA；

(3)可以快速灭活唾液样品中的病原体微生物，抑制各种病毒或细菌生长，杜绝二次传染，实现传染性样品的安全运输。

(4)保存时，唾液样品和生物样品DNA保存试剂的体积可以为4∶1，基本未对唾液样品稀释。

附图说明

图1为实施例2所述8个不同受试者的2mL唾液样品与0.5mL Solution SA混匀保存后，使用磁珠法唾液DNA快速提取试剂进行DNA提取后的DNA凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

制备例1

本制备例提供一种生物样品DNA保存试剂(Solution SA)，包括以下组成：质量体积百分比为50％的高氯酸钠、400mM乙酸铵、质量体积百分比为4％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵(所聚合的氧乙烯醚基的重复单元的数量为10)、50mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.5％的儿茶素和质量体积百分比为0.5％聚丙烯酸(分子量为2000)，余量为水，pH9.0。

制备例2

本制备例提供一种生物样品DNA保存试剂(Solution SB)，质量体积百分比为30％的高氯酸钠、250mM硼酸钠、质量体积百分比为6％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、20mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.1％的儿茶素和质量体积百分比为1％聚丙烯酸，余量为水，pH9.5。

制备例3

本制备例提供一种生物样品DNA保存试剂(Solution V1)，包括以下组成：质量体积百分比为50％的高氯酸钠、400mM乙酸铵、质量体积百分比为4％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、50mM酒石酸钠，余量为水，pH9.0。

制备例4

本制备例提供一种生物样品DNA保存试剂(Solution V2)，质量体积百分比为30％的高氯酸钠、250mM硼酸钠、质量体积百分比为6％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、20mM酒石酸钠，余量为水，pH9.5。

实施例1：使用制备例1至4的样品保存液(或称为保存试剂)和市场唾液样品保存液保存人类唾液中基因组DNA

受拭者使用凉水重洗口腔三次，然后等待5min至唾液分泌，然后将唾液吐至专门的收集管中，分别取2mL新鲜唾液与0.5mL实施例1-4配制的样品保存液混匀，取2mL新鲜唾液与2mL市售唾液样品保存液(货号CY-98000A，深圳市华晨阳科技有限公司)等体积混合以制备唾液与样品保存液的均匀混合物。

将上述均匀混合物样品在环境温度下(25℃)分别存放第0天，第30天、第180天和第360天进行提取。上述准备好的样品使用苏州白垩纪生物科技有限公司公司试剂盒《离心柱法通用型基因组DNA提取试剂盒》(Cat#CNA20590M)进行提取，每次使用200μL均匀混合物样品进行提取，100μL洗脱液进行洗脱。从表1中得知，唾液样品保存于制备例1制备的Solution SA和制备例2制备的Solution SB，效果明显优于制备例3制备的Solution V1和制备例4制备的Solution V2和市售唾液样品保存液，且制备例1和制备例2中的DNA保存试剂在室温下长期保存唾液中基因组DNA有明显优势。从表1中Nanodrop上测试数据上表明DNA的浓度差比率从第0天至第360天下降少于10％。而制备3和制备例4制备的DNA保存试剂因为不含核酸保护剂随着时间的推移明显出现了下降。同时我们发现市售的样品保存液因为只能1∶1与唾液样品保存，本身在初始第0天的DNA浓度就不如本发明制备的DNA保存试剂。这表明本发明的DNA保存试剂不仅拥有良好的唾液DNA长期保存效果，而且相对市场上的1∶1保存液来说，对于唾液样品的浓缩则可以获得更多浓度的核酸。

A：浓度差比率＝(第0天浓度-第360天浓度)/第0天浓度

B.DNA浓度的吸光度测定

260nm下的吸光度测量(A260nm)常被用于定量DNA。在260nm下1.0的吸光度对应于50ng/μL浓度的纯双链DNA。利用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Fisher ScientificInc)确定在各种条件下经过或不经本发明样品保存液处理的纯化唾液样品的DNA收率。将2μL体积的各DNA样品置于底座上并经220nm至350nm扫描，并测量在230nm、260nm和280nm下的吸光度。通过NanoDrop 2000c软件报告样品DNA浓度(ng/μL)、A260/A280比和A260/A230比。

C.储存在稳定化样品保存液中的样品中的DNA的完整性

将上述提取的样品的DNA产物取5μL在120伏特下通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离15分钟。将凝胶在室温下在蒸馏水中的1μg/mL溴化乙锭(EtBr)中染色15分钟，冲洗并在UV透射器上利用成像系统(UVP LLC)照相。当凝胶上的染色带清晰并且与DNA梯相比＞23Kb时，确定DNA被稳定化并且完整，DNA Marker尺寸作为参考。

表1：不同保存试剂在室温下保存唾液中基因组DNA测试

实施例2

让受拭者使用凉水重洗口腔三次，然后等待5min至唾液分泌，然后将唾液吐至收集管中，取来自8个不同受试者的2mL新鲜唾液(S1至S8)与0.5mL制备例1配制的SolutionSA混匀，室温保存7天后，置于55℃水浴中加速保存220天(相当于室温25℃存放5年)。并使用磁珠法唾液DNA快速提取试剂进行提取，检测数据如表2。将DNA进行跑胶检测，结果如图1所示，将样品在55℃加速220天后，依然有清晰的主带。

所述磁珠法唾液DNA快速提取试剂包括：(1)裂解结合液；(2)磁珠悬浮液；(3)第一清洗液；(4)第二清洗液；(5)洗脱液。其中，所述裂解结合液的组成为：100mM马来酸、3.5MN-丁基双胍盐酸盐、0.5M碘化钠、25mM酒石酸钠、0.5％的十二烷基苯磺酸钠、2％Brij 30、15％的聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)三嵌段共聚物和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为6.0。所述磁珠悬浮液由纳米磁珠和分散液组成，所述纳米磁珠(购自苏州白垩纪生物科技有限公司的MagH1 Silica(100nm硅羟基磁珠)的质量体积百分数为10％(以磁珠悬浮液的体积计)；所述分散液以该分散液的总量计包含20体积％的PEG400和余量的水；所述磁珠悬浮液pH为5.0。所述第一清洗液由以下组分组成：100mM Tris-HCl，2M盐酸胍和60％乙醇，并且pH为7.5。所述第二清洗液由以下组分组成：25mM Tris-HCl，100mM氯化钠和70％甘油，并且pH为8.0。所述洗脱液为包含10mM Tris-HCl的水溶液，并且pH为8.0。

提取包括如下步骤：

(1)样品准备：上述室温储存的样品使用前进行涡旋混匀。

(2)样品裂解：取400μL上述样品加入600μL本发明实施例4提供的裂解结合液和20μL磁珠悬浮液并于室温涡旋振荡6分钟裂解并结合；

(3)核酸吸附：磁性分离后弃去上清液，留吸附后磁珠；

(4)清洗1：向步骤(3)所得的吸附后磁珠中加入500μL所述第一清洗液，混匀2分钟后磁性分离以使磁珠完成吸附，弃去液体，得到第一清洗磁珠；

(5)清洗2：向步骤(4)所得磁珠中加入500μL所述第二清洗液，混匀2分钟后磁性分离以使磁珠完成吸附，弃去液体，得到第二清洗磁珠；

(6)样品洗脱：向步骤(5)所得的第二清洗磁珠中加入100μL洗脱液并于56℃孵育5分钟以完成洗脱，磁性分离后收集洗脱后所得的核酸溶液。

表2：室温保存7天与55℃加速220天的提取检测

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

还应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种生物样品DNA保存试剂，其特征在于，所述保存试剂包含蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂、核酸保护剂和溶剂；其中，所述的蛋白变性剂为高氯酸钠。

2.根据权利要求1所述的保存试剂，其特征在于，所述保存试剂包含：质量体积百分比为30-50％的高氯酸钠、终浓度为10-500mM的缓冲剂、质量体积百分比为1-20％的表面活性剂、终浓度为1-200mM的螯合剂和质量体积百分比为0.05-5％的核酸保护剂。

3.根据权利要求1或2所述的保存试剂，其特征在于：

所述保存试剂的pH为5.5-10.5；优选的是，所述保存试剂的pH为8.0-9.5；

另外优选的是，所述溶剂为水或水性缓冲液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、硼酸钠、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合；

优选的是，所述缓冲剂为乙磺酸钠、柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵、N,N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合；

更优选的是，所述缓冲剂为柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵和酒石酸钠中的一种或任意几种的组合，并且所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20-400mM的柠檬酸、20-200mM的硼酸钠、50-500mM的乙酸铵、10-200mM的酒石酸钠；

进一步优选的是，所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20-200mM的硼酸钠、50-500mM的乙酸铵、10-200mM的酒石酸钠。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂；

优选的是，所述表面活性剂选自Brij 35、Brij 56、Brij 58、十二烷基硫酸钠、NP40、聚乙二醇辛基苯基醚、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Span-80、Span-20、Span-40、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、松香基季铵盐阳离子表面活性剂、乙撑基双(十六酰胺丙基二甲基溴化铵)、十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵和椰油基葡萄糖苷羟丙基三甲基氯化铵中的一种或任意几种的组合；

更优选的是，所述表面活性剂为十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵的一种或任意几种的组合；

进一步优选的是，所述保存试剂包含十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵作为表面活性剂，并且该表面活性剂在所述保存试剂中的质量体积百分比为1-20％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵；

更进一步优选的是，所述十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵和十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵中所聚合的氧乙烯醚基重复单元的数量各自独立地为8至20，例如为10至12。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述螯合剂为乙二胺四乙酸、次氮基三乙酸、水杨酸、三草酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、N,N'-乙二胺二琥珀酸、邻菲咯啉、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸、酒石酸钠、三乙醇胺中的一种或任意几种的组合；

优选的是，所述螯合剂为柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸、酒石酸钠中的一种或任意几种的组合；更优选的是，所述螯合剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：1-50mM二亚乙基三胺五乙酸、5-60mM的柠檬酸钠、2-100mM酒石酸、10-200mM的酒石酸钠；

进一步优选的是，所述保存试剂包含20-50mM酒石酸钠作为螯合剂。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述核酸保护剂为尿素、儿茶素、花青素、花白素、类黄酮，木酚素、N-乙酰氨基己糖、聚乙二醇200、聚乙二醇2000、聚乙二醇8000、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺中的一种或任意几种的组合；

优选的是，所述核酸保护剂为儿茶素、聚乙二醇2000、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺中的一种或任意几种的组合；

更优选的是，所述核酸保护剂为儿茶素和聚丙烯酸的组合；

进一步优选的是，所述核酸保护剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：质量体积百分比0.1-2％的儿茶素、0.1-1％聚丙烯酸；

更进一步优选的是，所述保存试剂包含儿茶素和聚丙烯酸的组合作为核酸保护剂，更优选所述保存试剂包含质量体积百分比0.1-2％的儿茶素和0.1-1％聚丙烯酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述保存试剂包含质量体积百分比为30-50％的高氯酸钠、10-500mM的缓冲剂、质量体积百分比为1-20％的表面活性剂、终浓度为1-200mM的螯合剂和质量体积百分比为0.05-5％的核酸保护剂；

优选的是：所述保存试剂包含硼酸钠、乙酸铵和酒石酸钠中的一种或任意几种的组合，并且所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20-200mM的硼酸钠、50-500mM乙酸铵、10-200mM酒石酸钠；

所述保存试剂包含质量体积百分比为1-20％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵作为表面活性剂；

所述保存试剂包含20-50mM酒石酸钠作为螯合剂；

所述保存试剂包含质量体积百分比0.1-2％的儿茶素和0.1-1％聚丙烯酸的组合作为核酸保护剂；

所述保存试剂的pH为8.0-9.5。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的保存试剂，其特征在于：

所述保存试剂包含质量体积百分比为50％的高氯酸钠、400mM乙酸铵、质量体积百分比为4％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、50mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.5％的儿茶素和质量体积百分比为0.5％聚丙烯酸，并且所述保存试剂的pH为9.0；

另外优选的是，所述保存试剂包含质量体积百分比为30％的高氯酸钠、250mM硼酸钠、质量体积百分比为6％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、20mM酒石酸钠、质量体积百分比为0.1％的儿茶素和质量体积百分比为1％聚丙烯酸，并且所述保存试剂的pH为9.5；

更优选的是，所述保存试剂在环境温度下在60天至5年的保存期内使唾液样品中的高分子量基因组DNA降解不超过50％，优选不超过30％，更优选不超过20％，所述高分子量基因组DNA为23kb以上的基因组DNA。

10.一种保存唾液样品的方法，其特征在于，将所述唾液样品保存在权利要求1至9中任一项所述的保护试剂中。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)获得唾液样品；

b)使唾液样品与生物样品DNA保存试剂接触并混匀，形成均匀混合物；

c)将唾液样品以所述均匀混合物的形式对其中的DNA进行保存；

其中，所述生物样品DNA保存试剂为权利要求1至9中任一项所述的生物样品DNA保存试剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：

所述保存在环境稳定下进行；和/或

所述唾液样品和所述保存试剂的体积为1:10-10:1；优选为1:4-4:1；更优选为1:1-4:1；进一步优选为4:1。

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