CN116173204A - 一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针及其制备方法和应用，属于化学合成、生物分析检测、肿瘤成像和治疗技术领域；在本发明中，构建两亲性的小分子探针1‑Zn‑PPA和1‑NLG，探针1‑Zn‑PPA和1‑NLG能够在溶液中共组装形成共组装纳米探针1‑NPs；所述纳米探针1‑NPs在肿瘤EPR效应以及探针表面cRGD的靶向作用下能够在肿瘤部位聚集，并在肿瘤还原环境中存在的GSH作用下解组装释放出含Gd的亲水性小分子2‑Gd、光/声敏药物Zn‑PPA‑SH和免疫佐剂药物NLG919；所述纳米探针1‑NPs能够实现对活体肿瘤的声动力治疗/光动力治疗/免疫治疗的联合治疗；所述纳米探针1‑NPs在荧光成像、磁共振成像以及制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中有着很好的应用。

Description

一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学合成、生物分析检测、肿瘤成像和治疗技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
癌症(也称之为肿瘤)是一类与细胞异常增殖、分化、迁移和侵袭相关的恶性疾病。目前，针对癌症的治疗方式有多种，如手术治疗、化学治疗、放射治疗和光动力治疗，但是现有的治疗方式缺乏实时监测及定点调控能力，因此研究人员将目光转移至肿瘤本身环境中。
肿瘤细胞所处的特殊环境被称为肿瘤微环境，其与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，该环境主要包括许多过表达的酶受体、过表达的酶和一些特殊的理化性质，其中肿瘤内的谷胱甘肽(GSH)含量相较于正常组织更高。因此，研究人员针对该特性发展了一些GSH激活的诊疗探针用于提高肿瘤诊断的精准度并增强药物的作用效果，这些探针往往是通过将荧光成像基团和药物片段共价结合，从而实现对肿瘤的成像与治疗。现有的探针尽管能够在一定程度上实现对肿瘤的诊断治疗，但仍存在一定的局限性：单一的成像模式难以实现对肿瘤的精准成像，单一的治疗方法对肿瘤的治疗能力有限，尤其对于一些容易复发转移的肿瘤更加有限。因此，需要发展一种能够对肿瘤精准成像且治疗能力更有效的肿瘤诊疗探针。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针及其制备方法和应用。在本发明中，构建了两亲性的小分子探针1-Zn-PPA和1-NLG，探针1-Zn-PPA和1-NLG能够在溶液中共组装形成共组装纳米探针1-NPs；所述纳米探针1-NPs在肿瘤EPR(实体瘤的高通透性和滞留)效应以及探针表面cRGD的靶向作用下能够在肿瘤部位聚集，并在肿瘤还原环境中存在的GSH作用下解组装释放出含Gd的亲水性小分子2-Gd、光/声敏药物Zn-PPA-SH和免疫佐剂药物NLG919；所述纳米探针1-NPs能够实现对活体肿瘤的声动力治疗/光动力治疗/免疫治疗的联合治疗；所述纳米探针1-NPs在荧光成像、磁共振成像以及制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中有着很好的应用。
本发明中首先提供了一种两亲性小分子探针，所述探针包含以下结构：
(1)刚性连接骨架氨基荧光素片段(AO-Luc)；
(2)可靶向肿瘤的cRGD片段；
(3)可用于MR成像的DOTA-Gd片段；
(4)可被GSH切断的二硫键；
(5)用于声-光动力治疗的Zn-PPA片段或用于免疫治疗的IDO1抑制剂NLG919片段。
具体的，包含可用于声-光动力治疗的Zn-PPA片段的两亲性小分子探针记为1-Zn-PPA，其结构式为：
Figure SMS_1
包含可用于免疫治疗的IDO1抑制剂NLG919片段的两亲性小分子探针记为1-NLG，其结构式为：
Figure SMS_2
本发明中还提供了上述两亲性小分子探针的制备方法，所述两亲性小分子探针包括1-NLG和1-Zn-PPA，具体步骤如下所示：
(1)中间体的准备：
化合物1的制备：将1-环己基-2-(5H-咪唑并[5,1-A]异吲哚-5-基)乙醇(记为化合物NLG919)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与三光气(二(三氯甲基)碳酸酯)溶于溶剂1中，加热搅拌回流进行反应1，反应结束后除去溶剂1和剩余的三光气，得到中间体A；向中间体A中加入溶剂2和2-[2-(吡啶基)连硫基]乙醇，在搅拌条件下进行反应2，反应结束后真空旋蒸，洗脱，纯化，得到1-环己基-2-(5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-基)乙基(2-(吡啶-2-基二硫醚)乙基)碳酸酯，记为化合物1；
化合物2的制备：将焦脱镁叶绿酸a(记为化合物PPA)、2-(吡啶-2-基连硫基)乙烷-1-胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)溶于溶剂3中，在搅拌条件下进行反应3，反应结束后，真空旋蒸，纯化，洗脱，得到化合物2；
化合物3的制备：将2-氨基-5-氰基苯并噻唑(NH2-CBT)、DMAP与三光气(二(三氯甲基)碳酸酯)溶于溶剂4中，加热搅拌回流进行反应4，反应完成后除去溶剂4和三光气，得到中间体B；
向中间体B中加入2-三苯基巯基乙醇和溶剂5并在搅拌条件下进行反应5，反应完成后真空旋蒸、洗脱、纯化，得到中间体C；
向中间体C中加入溶剂6、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)进行反应6，反应结束后加入二氧化锰在搅拌条件下进行反应7，反应结束后真空旋蒸，洗脱，纯化，得到化合物3；
化合物4的制备：将化合物氨基PEG炔基(NH2-PEG4-Alkyne)、N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Boc-Lys(Fmoc)-OH)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和DIPEA溶于溶剂7，在搅拌条件下进行反应8，反应结束后真空旋蒸，洗脱，纯化，得到中间体D；
将中间体D溶于含三氟乙酸的溶剂8，然后进行反应9，反应结束后真空旋蒸除去三氟乙酸和溶剂8得到化合物4；
化合物5的制备：将化合物3、化合物4、HBTU和DIPEA溶于溶剂9中发生反应10，旋蒸除去溶剂9得到中间E；
将中间体E溶于含有哌啶的溶剂10中进行反应11，反应结束后真空旋蒸，纯化，洗脱，得到化合物5。
化合物6的制备：将化合物5、DOTA活化酯、DIPEA溶于溶剂11中发生反应12，反应完成后，减压旋蒸除去溶剂11得到中间体F；
将中间体F和GdCl3溶于溶剂12中发生反应13，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到化合物6；
化合物7的制备：将化合物6、叠氮取代的RGDfK环肽(cRGD-N3)、铜粉溶于溶剂13中发生反应14，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到化合物7；
(2)两亲性小分子探针的制备：
所述1-NLG的制备方法为：
将化合物7溶于含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的溶剂14中进行反应15，反应结束减压旋蒸除去溶剂14，加入冷乙醚收集沉淀物，然后将沉淀物和化合物1溶于溶剂14中进行反应16，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到1-NLG；
所述1-Zn-PPA的制备方法为：将化合物7溶于含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的溶剂14中进行反应17，反应结束减压旋蒸除去溶剂14，加入冷乙醚收集沉淀物，然后将沉淀物、化合物2和氯化锌溶于溶剂14中进行反应18，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到1-Zn-PPA；
具体的，步骤(1)中，化合物1制备过程中，化合物NLG919、三光气、2-[2-(吡啶基)连硫基]乙醇、DMAP的摩尔比为1：0.33：1：1～1：1：3：10；
所述溶剂1为甲苯、硝基苯、氯苯或苯中的任一种，优选为甲苯；
溶剂2为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈中的任一种，优选为二氯甲烷；
所述反应1的条件为：在80～140℃下反应1～8h，优选为在110℃下反应3h；
所述反应2的条件为：在20～30℃下反应1～8h，优选为在室温条件下反应2h。
具体的，步骤(1)中，化合物2制备过程中，化合物PPA、2-(吡啶-2-基二硫基)乙胺、HBTU、DIPEA的摩尔比为1：1：1：1～1：2：2：6；
所述溶剂3包括二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈中的任一种；
所述反应3的条件为在20～30℃下反应1h以上，优选为1-5h，进一步优选为2h。
具体的，步骤(1)中，化合物3制备过程中，所述NH2-CBT、三光气、DMAP、2-三苯基巯基乙醇、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦、N,N-二异丙基胺和二氧化锰的摩尔比为1:0.33:1:1:1:1:1:1～1:1:3:3:3:3:6:20；
所述溶剂4为甲苯、硝基苯、氯苯或苯中的任一种，优选为甲苯；
溶剂5为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈中的任一种，优选为二氯甲烷
溶剂6为体积比为1:4～4:1的A液与B液的混合溶液，其中A液为二氯甲烷或氯仿，B液为甲醇或乙腈；优选体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液。
所述反应4的条件为：在80～140℃下反应1～8h，优选为在110℃下反应3h；
所述反应5的条件为：在20～30℃下反应1～8h，优选为在室温条件下反应2h；
所述反应6的条件为：在20～30℃下反应1～8h，优选为在室温条件下反应1h；
所述反应7的条件为：在20～30℃下反应8～24h，优选为在室温条件下反应14h。
具体的，步骤(1)中，化合物4制备过程中，NH2-PEG4-Alkyne、Boc-Lys(Fmoc)-OH、HBTU和DIPEA的摩尔比为1：1：1：1～1：2：2：6；所述三氟乙酸在溶剂中的含量为5％-90％v/v；优选为5％；
所述溶剂7包括但不限于二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈，优选为四氢呋喃；
所述溶剂8包括但不限于二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈，优选为二氯甲烷；
所述反应8和反应9的条件均为在20～30℃下反应1～8h，均优选为在室温条件下反应2h。
具体的，步骤(1)中，化合物5制备过程中，所述化合物3、化合物4、HBTU和DIPEA的摩尔比为1:1:1:2～1:3:3:6；所述哌啶在溶剂中的含量为5-90％v/v，优选为20％；
所述溶剂9包括但不限于二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙腈，优选为无水四氢呋喃；
所述溶剂10包括但不限于乙腈、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，优选为N，N-二甲基甲酰胺；
所述反应10和反应11的条件均为在20～30℃下反应1～8h，优选为在室温条件下反应2h。
具体的，步骤(1)中，化合物6制备过程中，所述化合物5、DOTA活化酯、DIPEA、GdCl3的摩尔比为1：1：1：1～1：2：6：10；
其中，所述溶剂11包括但不限于氯仿、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷，优选为无水二氯甲烷；
所述溶剂12包括但不限于乙腈、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂，优选为体积比为1：1的N，N-二甲基甲酰胺与水混合溶剂；
所述反应12的条件为：在20～30℃下反应4～12h，优选为在室温条件下反应8h；
所述反应13的条件为：在20～30℃下反应6～24h，优选为在室温条件下反应14h。
具体的，步骤(1)中，化合物7制备过程中，其中，所述化合物6、cRGD-N3、铜粉的摩尔比为1：1：0.2-1：3：3；
所述溶剂13包括但不限于二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、叔丁醇和水的混合溶剂，优选为体积比为1：1的叔丁醇和水混合溶剂；
所述反应14的条件为在20～30℃下反应6～24h，优选为在室温条件下反应14h。
具体的，步骤(2)，1-NLG的制备中：所述化合物7和化合物1的摩尔比为1：1～1:2；所述三氟乙酸、三异丙基硅烷和溶剂14的体积比为5:94:1-90:5:5；
1-Zn-PPA的制备过程中：所述化合物7、化合物2、氯化锌的摩尔比为1：1：1～1：2：10；三氟乙酸、三异丙基硅烷和溶剂14的体积比为5:94:1-90:5:5。
具体的，步骤(2)中，所述溶剂14包括A液与B液的混合溶液，其中A液为二氯甲烷或氯仿，B液为甲醇或乙腈；优选体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶液；
所述反应15～18的温度为20-30℃下反应1～6h，优选为室温下反应2h。
本发明中还提供了一种谷胱甘肽激活的共组装纳米探针，所述谷胱甘肽激活的共组装纳米探针记为1-NPs，其由两亲性小分子探针1-Zn-PPA和1-NLG共组装得到，所述1-Zn-PPA和1-NLG的摩尔比为10:0-0:10且均不为0，最优比例为1:1.1。
本发明中还提供了上述1-Zn-PPA、1-NLG或1-NPs在荧光成像中的应用。
本发明中还提供了上述1-Zn-PPA、1-NLG或1-NPs在磁共振成像中的应用。
本发明中还提供了上述1-NPs在磁共振/荧光双模态成像中的应用。
本发明中还提供了上述1-NPs在活体肿瘤的声动力治疗/光动力治疗/免疫治疗的联合治疗中的应用。
本发明中还提供了上述1-Zn-PPA、1-NLG或1-NPs在制备治疗肿瘤药物或制备杀伤肿瘤装置中的应用。
其中，所述肿瘤包括：肺癌、胃癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌、头颈癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、急性骨髓性白血病等。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
磁共振/荧光双模态成像能够实现对肿瘤进行高分辨、高灵敏的精准成像，同时声-光动力疗法和免疫疗法相结合的方式可以实现对肿瘤的更有效的治疗，并抑制肿瘤转移。本发明中提供的谷胱甘肽激活的共组装纳米探针1-NPs能够用于活体肿瘤的磁共振/荧光双模态成像。本发明中将含有可用于声-光动力治疗的Zn-PPA片段的1-Zn-PPA探针和含有可用于免疫治疗的IDO1抑制剂NLG919片段的1-NLG探针在溶液中共组装形成共组装纳米探针1-NPs，其为构建磁共振/荧光双模态成像并用于声-光动力疗法和免疫疗法相结合的激活型分子探针提供了一种新思路，有望应用于恶性肿瘤的成像检测及治疗。
本发明中提供的共组装纳米探针1-NPs由于分子间的聚集作用，具有较高的纵向弛豫率、淬灭的近红外荧光和声-光动力活性以及IDO1抑制活性共组装纳米探针1-NPs在EPR效应以及探针表面cRGD的靶向作用下能够在肿瘤部位聚集，并在肿瘤还原环境中的GSH作用下解组装释放出2-Gd、Zn-PPA-SH和NLG919。并且，释放出的2-Gd可被快速清除，能够降低重金属在体内长时间蓄积引起的毒副作用；而释放出的Zn-PPA-SH可与肿瘤细胞内的白蛋白结合，恢复近红外荧光信号同时延长药物在肿瘤内的滞留时间，增强声-光动力作用，杀伤肿瘤细胞；释放出的NLG919降低犬尿氨酸与色氨酸的比值，降低调节T细胞对毒性T细胞的抑制作用，进一步增强肿瘤杀伤作用。所述共组装纳米探针1-NPs能够有效蓄积在肿瘤部位，被GSH激活后并在光照和超声的联合作用下能够有效抑制肿瘤的生长、复发和转移。
附图说明
图1为两亲性小分子探针1-Zn-PPA和1-NLG的合成路线图。
图2为两亲性小分子探针1-Zn-PPA(a)和1-NLG(b)的化学结构。
图3为两亲性小分子探针1-Zn-PPA和1-NLG在溶液中共组装形成探针1-NPs的过程图。
图4为探针1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内杀伤肿瘤的机理图。
图5为探针1-NPs在溶液中的DLS分析图，插图为TEM图。
图6为探针1-NPs在PBS溶液或DMSO溶液中的紫外吸收谱图(a)和荧光光谱图(b)。
图7为探针1-NPs在37℃、GSH的条件下孵育2h前后的HPLC分析图(a)和荧光光谱图(b)。
图8为探针1-NPs在37℃、GSH的条件下孵育20、40、60、80、100、120分钟前后的DLS分析图。
图9为探针1-NPs在37℃与GSH孵育2h前后的弛豫率测定情况图。
图10为探针1-NPs在含或不含GSH条件下释放出Zn-PPA-SH和NLG919的情况图。
图11为探针1-NPs在含或不含GSH且在不同处理条件下的DCF荧光增强情况图。
图12为探针1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内后肿瘤内0、2、4和8h的磁共振成像图(a)和肿瘤内的磁共振信号的量化数据(b)。
图13为探针1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内后肿瘤内0、4、8、12、24、48和72h的近红外荧光成像图(a)和肿瘤内的近红外荧光信号的量化数据(b)。
图14为小鼠离体器官荧光成像图及量化数据。
图15为小鼠肿瘤切片的荧光成像图，Scale bar：200μm。
图16为尾静脉给药后不同时间点Zn和Gd的生物分布情况图。
图17为4T1小鼠的治疗流程图(a)和小鼠肿瘤体积生长曲线(b)。
图18为肿瘤在不同治疗条件下27天时的代表图像。
图19为不同治疗条件下100天内小鼠的存活率。
图20为不同处理组小鼠的肿瘤切片H&E和TUNEL染色图。
图21为不同处理组小鼠肿瘤内的钙网蛋白含量(a)、高迁移率蛋白1含量(b)、树突状细胞成熟率(c)、细胞坏死因子-α含量(d)、白介素-6含量(e)、干扰素-γ含量(f)。
图22为不同处理组的小鼠肿瘤组织内T细胞浸润情况。
图23为不同处理组的小鼠肿瘤组织内辅助T细胞的含量(a)、细胞毒性T细胞的含量(b)、犬尿氨酸和色氨酸的比值(c)、调节T细胞的含量(d)、毒性T细胞与调节T细胞的比值(e)，其中Ⅰ：生理盐水组，Ⅱ：1-NPs组，Ⅲ：1-NPs+光照组，Ⅳ：1-NPs+超声组，Ⅴ：1-Zn-PPA+超声+光照组，Ⅵ：1-NPs+超声+光照组。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：两亲性小分子探针1-NLG和1-Zn-PPA的制备
两亲性小分子探针1-NLG和1-Zn-PPA的合成路线图如图1所示，具体的制备方法为：
1.中间体的合成：
(1)化合物1的合成：
将三光气(21mg,0.07mmol)，N,N-二甲基吡啶(75.8mg,0.62mmol)和NLG919(50mg,0.18mmol)溶解在10mL无水二氯甲烷溶液中，在氩气保护情况下室温搅拌1h，TLC监测反应完全后在氩气保护下将2-[2-(吡啶基)连硫基]乙醇(35mg,0.18mmol)加入到反应液中，室温搅拌3h后蒸干溶剂，经半制备高效液相纯化得35mg白色固体，记为化合物1，两步收率共40％。
化合物1的1H NMR谱图为：(500MHz,Chloroform-d)δ9.09(s,1H),8.53(d,J＝5.0Hz,1H),7.83–7.76(m,2H),7.73–7.68(m,1H),7.67–7.63(m,1H),7.58–7.49(m,3H),7.24(ddd,J＝6.8,5.0,1.9Hz,1H),5.56(t,J＝5.5Hz,1H),4.80(ddd,J＝11.3,5.6,2.3Hz,1H),4.32(t,J＝6.3Hz,2H),3.04(t,J＝6.4Hz,2H),2.63–2.33(m,2H),1.81–1.56(m,7H),1.31–0.93(m,8H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ154.4,148.5,143.2,138.5,138.2,131.1,129.8,129.6,126.5,124.2,121.7,121.5,120.9,109.8,78.3,65.7,61.7,53.4,42.0,36.8,28.0,27.7,26.0,25.7,25.6.，这说明了化合物1(NLG-SS-Pyr)的成功制备。
(2)化合物2的合成：
向溶有PPA(60mg,0.10mmol),2-(吡啶-2-基连硫基)乙烷-1-胺(22mg,0.12mmol)和HBTU(49mg,0.13mmol)的10mL无水二氯甲烷溶液中加入N,N-二异丙基胺(119μL,0.65mmol)，反应液在室温条件下搅拌3h，TLC监测反应完全后蒸干溶剂，经柱层析纯化后得70mg暗绿色固体，记为化合物2，收率92％。
化合物2的1H NMR谱图为：(500MHz,Chloroform-d)δ9.31(d,J＝9.5Hz,2H),8.52(s,1H),7.92(dd,J＝17.8,11.5Hz,1H),7.34(d,J＝4.4Hz,1H),7.11–7.01(m,2H),6.97(s,1H),6.22(dd,J＝17.8,1.3Hz,1H),6.14(dd,J＝11.6,1.3Hz,1H),6.06(t,J＝4.9Hz,1H),5.34–4.97(m,2H),4.51–4.47(m,1H),4.43–4.29(m,1H),3.61(q,J＝7.4Hz,3H),3.51(s,3H),3.38(s,3H),3.39–3.31(m,2H),3.19(s,3H),2.66(t,J＝5.6Hz,2H),2.57–2.41(m,1H),2.32–2.20(m,1H),1.80(d,J＝7.3Hz,3H),1.65(t,J＝7.6Hz,4H),1.25(s,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ196.1,172.3,171.9,160.4,158.5,154.9,150.5,149.5,148.9,148.8,144.9,141.5,137.7,137.4,136.4,136.1,136.0,135.8,131.6,130.4,129.1,128.2,122.6,121.1,120.9,120.6,119.6,106.0,103.9,97.1,93.1,51.7,49.8,48.0,38.7,37.0,32.6,30.0,29.7,23.1,19.4,17.4,12.1,11.9,11.2.HRMS:calcd.for C40H42N6O2S2 +[(M+H)+]:703.2889；found 702.9395.，这说明了化合物2的成功制备。
(3)化合物3的合成：
将2-氨基-5-氰基-苯并噻唑(220mg,1.25mmol)和DMAP(152mg,1.25mmol)溶于50mL干甲苯中，然后将三光气(370mg,1.25mmol)溶于5mL干燥甲苯中，在氮气保护作用下，于0℃逐滴加入反应混合物中，然后在120℃下继续搅拌3小时。反应结束后减压旋蒸去除甲苯，并将残留物溶解在15mL干燥的DCM中。将2-三苯基巯基乙醇(357mg,1.0mmol)溶于5mL干DCM中，然后在0℃逐滴加入反应混合物中，在室温下继续反应过夜，反应结束后减压旋蒸除去溶剂、柱层析纯化得白色化合物。
将白色化合物(250mg,0.48mmol)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(145mg,0.40mmol)、L-半胱氨酸(59mg,0.48mmol)和N,N-二异丙基胺(0.5mL,2.88mmol)加入到含有10mL二氯甲烷和10mL甲醇的混合溶剂中，反应液在室温条件下搅拌1h，HPLC检测反应完成后，向上述混合溶液中加入已活化的二氧化锰粉末(417mg,4.8mmol)室温下搅拌过夜。HPLC检测反应完成后，用硅藻土过滤除去二锰粉末，收集滤液浓缩经柱层析纯化，得390mg深黄色固体，记为化合物3，收率79％。
化合物3的HRMS：calcd.for C33H26N3O4S3 +[(M+H)+]:624.1085；found 623.6874.，这说明了化合物3的成功制备。
(4)化合物4的合成：
向溶有氨基-PEG-炔基(300mg,1.30mmol)，Boc-Lys(Fmoc)-OH(666mg,1.43mmol)和HBTU(540mg,1.43mmol)的50mL无水四氢呋喃溶液中加入N,N-二异丙基胺(770μL,4.32mmol)，室温条件下搅拌3h，TLC监测反应完全后蒸干溶剂，然后加入10mL含10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室温搅拌2h，HPLC检测反应完成后蒸干溶剂，加入少量乙酸乙酯溶解，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，分离有机相，干燥过滤浓缩经柱层析纯化后，得760mg无色油状物，记为化合物4，收率85％。
化合物4的HRMS：calcd.for C37H51N3NaO9 +[(M+Na)+]:704.3513.；found704.2507.这说明了化合物4的成功制备。
(5)化合物5的合成：
向溶解有化合物3(132mg,0.17mmol)，化合物4(150mg,0.22mmol)和HBTU(72mg,0.19mmol)的10mL无水四氢呋喃溶液中加入N,N-二异丙基胺(91μL,0.49mmol)，反应液在室温条件下搅拌3h。HPLC检测反应完成后旋干溶剂，向固体残留物中加入5mL含20％哌啶的无水N,N-二甲基甲酰胺，反应液在室温条件下搅拌2h，HPLC检测反应完成后旋干溶剂，残渣通过半制备高效液相分离纯化得110mg黄色固体，记为化合物5，两步收率共66％。
化合物5的HRMS:calcd.for C50H57N6O8S3 +[(M+H)+]:965.3400；found 964.7095.这说明了化合物5的成功制备。
(6)化合物6的合成：
向溶解有化合物5(90mg,0.09mmol)和DOTA活化酯(78mg,0.10mmol)的无水二氯甲烷溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，95μL,0.54mmol)，反应液在氩气保护下室温搅拌过夜。HPLC检测反应完成后旋干溶剂，向固体残留物中加入10mL N,N-二甲基甲酰胺/水(1/1，v/v％)混合溶剂，然后加入六水合氯化钆(568mg,1.53mmol)室温搅拌10min后，加入饱和碳酸氢钠溶液将反应体系pH调至中性后室温搅拌过夜。HPLC检测反应完成后，反应液经半制备高效液相分离纯化得98mg黄色固体，记为化合物6，总收率70％。
化合物6的HRMS:calcd.for C66H79GdN10NaO15S3 +[(M+Na)+]:1528.4027；found1527.4828.这说明了化合物6的成功制备。
(7)化合物7的合成：
向溶解有化合物6(95mg,0.06mmol)和cRGD-N3(51mg,0.07mmol)的10mL叔丁醇/水(1：1，v/v％)混合溶剂中，加入铜粉(16mg,0.24mmol)，室温条件下搅拌6h。HPLC检测反应完成后，蒸干溶剂，残渣通过半制备高效液相分离纯化得115mg黄色固体，收率85％。
化合物7的HRMS:calcd.For C93H118GdN21O22S3 +[(M+H)+]:2135.7242；found:2135.6316.这说明了化合物7的成功制备。
2.两亲性小分子探针1-NLG和1-Zn-PPA的合成：
1-NLG的合成：
将化合物7(48mg,0.02mmol)溶解在5mL二氯甲烷、三氟乙酸和三异丙基硅烷(v：v：v＝50：46：4)组成的混合溶液中，反应液在室温条件下搅拌1h，HPLC检测到反应完成后，蒸干溶剂，加入冰乙醚，离心过滤收集浅黄色沉淀物，溶解在10mL甲醇溶液中并加入化合物1(20mg,0.02mmol)，反应液在室温条件下搅拌过夜，反应结束后蒸干溶剂。HPLC检测到反应完成后，蒸干残渣，通过半制备高效液相分离纯化得59mg白色固体1-NLG，收率67％。
1-NLG的HRMS:calcd.for C95H129GdN23O25S4 +[(M+H)+]:2276.76,found MALDI-MS:m/z2277.70,found HRMS[(M+2H)2+]:m/z 1139.3331.这说明了化合物1-NLG的成功制备，其化学结构如图2b所示。
1-Zn-PPA的合成：
将化合物7(38mg,0.016mmol)溶解在5mL二氯甲烷、三氟乙酸和三异丙基硅烷(v：v：v＝50：46：4)组成的混合溶液中，反应液在室温条件下搅拌1h，HPLC检测到反应完成后，蒸干溶剂，加入冰乙醚，离心过滤收集浅黄色沉淀物，溶解在10mL甲醇溶液中并加入化合物2(9mg,0.016mmol)，反应液在室温条件下搅拌过夜，HPLC检测反应完成后向反应液中加入氯化锌20mg继续室温搅拌6h。HPLC检测反应完成后，蒸干溶剂，残渣通过半制备高效液相分离纯化得23mg暗绿色固体1-Zn-PPA，收率61％。
1-Zn-PPA的HRMS:calcd.for C109H139GdN26O24S4Zn2+[M2+]:2546.79,found MALDI-MS:m/z 2548.60,found HRMS[(M+H+Na)2+]:m/z 1284.5454.这说明了化合物1-Zn-PPA的成功制备，其化学结构如图2a所示。
实施例2：1-NPs的性能考察
本实施例中通过图3的原理将探针1-Zn-PPA和1-NLG在溶液中自组装成1-NPs，并考察了1-NPs在溶液中的组装性能、光谱性能和GSH激活解组装性能。
(1)1-NPs在溶液中的组装性能研究：
将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mLPBS缓冲液中，混匀后对反应液进行DLS分析。
将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液中，将溶液逐滴加到碳网上，然后引流，真空抽干，然后用透射电子显微镜对样品进行拍摄。
图5为探针1-NPs在溶液中的DLS分析及TEM分析图，从图中可以看出，探针1-Zn-PPA与1-NLG可共组装成平均粒径为100nm左右的纳米颗粒，即1-NPs。
(2)1-NPs在溶液中的光谱性能研究
将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液或DMSO溶液中，混匀后对溶液进行紫外吸收光谱测试，测试结果如图6a所示。
图6a为探针1-NPs在PBS溶液或DMSO溶液中的紫外吸收谱图，从图中可以看出，Zn-PPA的Q带发生红移，说明其形成了组装体1-NPs。
对于荧光光谱分析，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液或DMSO溶液中，混匀后对溶液进行荧光光谱测试。
图6b为探针1-NPs在PBS溶液或DMSO溶液中的荧光光谱图，从图中可以看出，在PBS溶液中，Zn-PPA于672nm处的荧光淬灭，也反映出组装体1-NPs的形成。
(3)1-NPs在溶液中的GSH激活解组装性能研究
对于HPLC分析，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液中，与1mM的GSH在37℃条件下共孵育2h前后，将溶液分别注入HPLC进行分析。
图7a为探针1-NPs在37℃与GSH孵育2h前后的HPLC分析图，从图中可以看出，经GSH激活后，1-NPs中的1-Zn-PPA(tR＝15.5min)和1-NLG(tR＝18.3min)可以被有效地还原为裂解产物2-Gd(tR＝11.5min)、Zn-PPA-SH(tR＝24.8min)和NLG919(tR＝18.5min)。
对于荧光光谱分析，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液中，与1mM的GSH在37℃条件下共孵育2h前后，在荧光计上记录溶液的荧光光谱。
图7b为探针1-NPs在37℃与GSH孵育2h前后的荧光光谱图，从图中可以看出，在GSH和白蛋白存在下，1-NPs的AO-Luc(547nm)和Zn-PPA-SH(672nm)处的双通道荧光得以增强，相较于加入GSH前分别提高了约500和85.9倍。
对于DLS分析，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS含有5％白蛋白的缓冲液中，与1mM的GSH在37℃条件下共孵前后，在反应进行20、40、60、80、100和120min时，对反应液进行DLS分析。
图8为探针1-NPs在37℃与GSH孵育20、40、60、80、100、120分钟前后的DLS分析，从图中可以看出，，1-NPs与GSH孵育2小时后，其平均粒径从约100nm降至约6nm，尺寸与白蛋白相似，表明由GSH有效介导了1-NPs的解组装。
对于弛豫率测定，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于PBS缓冲液中，然后稀释成五种不同浓度(0、0.025、0.05、0.075和0.1mM)的溶液，与10mM GSH在37℃条件下共孵2h前后，在0.5T MR扫描仪上反演测得溶液中的T1值，r1纵向弛豫率表示为1/T1和[Gd]浓度拟合曲线的斜率。
图9为探针1-NPs在37℃与GSH孵育2h前后的弛豫率测定，从图中可以看出，当1-NPs分解成小分子产物2-Gd后，其r1值从18.7±0.3mM-1s-1下降到7.3±0.2mM-1s-1，表明在解组装后，1-NPs的r1弛豫率下降，T1增加。
对于药物释放测定，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液中，与1mM的GSH在37℃条件下共孵育2h前后，将溶液分别注入HPLC分析Zn-PPA-SH和NLG919的释放情况。
图10为探针1-NPs在含或不含GSH条件下释放出的Zn-PPA-SH和NLG919，从图中可以看出，1-NPs在与GSH孵育后可以快速释放出Zn-PPA-SH和NLG919，并在2h内实现完全释放。
对于探针产生ROS能力的测定，将探针1-Zn-PPA与1-NLG以摩尔比1：1.1的比例配置于DMSO溶液中，将混合探针(20μM)溶于1mL PBS缓冲液中，与2μM DCFH-DA和1mM GSH在37℃条件下共孵育2h前后，分别对溶液进行不处理、超声处理(1.0W/cm2,50％duty,1.0MHz)、光照处理(130mW/cm2,671nm)、超声和光照联合处理后，用荧光计记录溶液的荧光光谱。
图11为探针1-NPs在含或不含GSH条件下在不同处理条件下DCF荧光增强情况，从图中可以看出，1-NPs与GSH共孵育，经超声和光照射后，所产生的ROS相较于空白组分别增加了约2.5倍和3.6倍，在超声和光联合照射下可进一步增加到～5.8倍。
综上表明共组装纳米探针1-NPs可以有效被GSH还原解组装，释放出光/声敏药物Zn-PPa-SH和免疫佐剂药物NLG919，并在HSA的级联激活以及光/声的联合作用下实现ROS产生能力的激活增强。
实施例3：探针的磁共振/荧光双模态成像原位肿瘤治疗应用
1.小鼠肿瘤模型的建立：
实验动物：将6-8周龄的BALB/b雌性小鼠(购自南京大学(中国南京)模型动物研究中心(MARC))根据机构动物护理和使用委员会的规定饲养和使用
为了建立原位4T1肿瘤，将约3×106 4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞，购买自Stem CellBank,Chinese Academy of Sciences(Shanghai,China))悬浮在RPMI1640细胞培养基(10％FBS)/matrigel基质胶(50/50，v/v％)混合物中，然后注射到小鼠右下侧乳房垫，接种7-10天后肿瘤生长至约100mm3的大小，用于磁共振和荧光成像及肿瘤治疗。
2.1-NPs的探针的磁共振/荧光双模态成像应用：
(1)小鼠活体磁共振成像：
本实施例中向4T1荷瘤小鼠的尾静脉注射含有1-NPs的PBS溶液(注射用量为0.03mmol/kg，以Gd金属离子的用量为标准)，在注射的0、2、4和8h后分别使用小鼠体线圈通过1T小动物磁共振扫描仪采集小鼠磁共振图像，将采集到的图像进行处理，圈出肿瘤区域磁共振信号进行定量分析，分析结果如图12所示。
图12为探针1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内后肿瘤内0、2、4和8h的磁共振成像图(a)和肿瘤内的磁共振信号的量化数据(b)，从图中可以看出，注射纳米探针1h后肿瘤内MR信号明显增加，注射后4h信号强度达到最大。对肿瘤部位MR信号进行定量分析，结果显示平均信号增强(％SE)超过80％，这说明NP-cRGDs能够被有效输运到肿瘤部位。
(2)小鼠活体荧光成像：
本实施例中向4T1荷瘤小鼠的尾静脉注射200μL含有1-NPs的PBS溶液，其中1-NPs的浓度为200μM，分别在注射的0、4、8、12、24、48和72h后使用小动物荧光成像仪采集小鼠荧光图像，将采集到的图像进行处理，圈出肿瘤区域荧光信号进行定量分析，分析结果如图13所示。
图13为探针1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内后肿瘤内0、4、8、12、24、48和72h的近红外荧光成像图(a)和肿瘤内的近红外荧光信号的量化数据(b)，从图中可以看出，纳米探针经尾静脉注射进体内后，肿瘤部位的近红外荧光先逐渐增强，在注射后8h时肿瘤部位荧光强度达到最大，说明纳米探针可以通过αvβ3整联蛋白介导的主动靶向作用蓄积到肿瘤部位，并能够被肿瘤细胞内部高表达的还原性GSH激活解组装。
(3)离体器官荧光成像：
本实施例中向4T1荷瘤小鼠的尾静脉注射200μL含有1-NPs的PBS溶液，其中1-NPs的浓度为200μM，在注射24h后处死小鼠，分离并收集肿瘤及包括脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺在内的主要器官，并采集它们的荧光图像，将采集到的图像进行处理，圈出肿瘤区域荧光信号进行定量分析，分析结果如图14所示。
从图14中可以看出，相较于器官组织，肿瘤具有最强的荧光，其中肿瘤组织的荧光最强，表明纳米探针通过αvβ3整合素介导的主动靶向作用实现了肿瘤部位的有效蓄积和激活。此外，肾脏和肝脏也出现一定强度的荧光，这可能是由于探针在肝脏中有部分激活并且其释放出的小分子光敏剂产物一部分通过肾脏清除所致。
(4)肿瘤组织切片的荧光成像：
本实施例中向4T1荷瘤小鼠的尾静脉注射200μL含有1-NPs的PBS溶液，其中1-NPs的浓度为200μM，在注射12h后处死小鼠，分离收集肿瘤，使用切片机将肿瘤组织切割成10μm厚的切片，并在倒置荧光显微镜下采集切片的荧光图像，结果如图15所示。
从图15中可以看出，肿瘤细胞内观察到明显的ZnPPA-SH和Oxy-Luciferin双通道荧光，证实了NP-cRGDs可以在肿瘤中被有效激活。
(5)Zn和Gd的生物分布测试：
本实施例中向4T1荷瘤小鼠的尾静脉注射200μL含有1-NPs的PBS溶液，其中1-NPs的浓度为200μM，分别在注射4、24或48h后处死小鼠，分离收集肿瘤及主要器官，用稀硝酸对组织进行消解，稀释后用ICP-MS测定分析各组织内Zn和Gd元素含量，分析结果如图16所示。
从图16中可以看出，探针注射4h后，肿瘤中Gd(III)和Zn(II)的摄取分别达到25％ID/g和24％ ID/g，而在24h和48h，肿瘤中Zn(II)的量分别为～21％ ID/g～16％ ID/g，肿瘤中Gd(III)的量分别为～8％ ID/g和～7％ ID/g，表明纳米探针在还原环境解组装后，2-Gd可以快速从肿瘤清除，而Zn-PPA-SH由于与肿瘤内部的白蛋白结合，延长了其在肿瘤中的停留时间，有助于提高对肿瘤的声-光动力治疗效果。
(6)1-NPs的体内抗肿瘤效果研究：
将肿瘤体积达到100mm3的4T1荷瘤小鼠随机分为6组，分别为作如下处理：
I)生理盐水；II)1-NPs；III)1-NPs+超声；IV)1-NPs+激光；V)1-Zn-PPA+超声+激光；VI)1-NPs+超声+激光；
其中，II～VI组中，1-NPs和1-Zn-PPA的给药剂量以螯合Zn离子的焦脱镁叶绿酸a(Zn-PPA)6.35mg/kg为标准。III-VI组在给药8h后，用激光(671nm,130mW/cm2)或超声(2.0W/cm2,50％duty,1.0MHz)对小鼠肿瘤部位进行治疗5min，每隔两天记录小鼠的体重和肿瘤尺寸。待治疗7天后，处死小鼠分离收集肿瘤并固定在4％福尔马林溶液中，脱水后进行H&E和TUNEL染色。
从图16～19中可以看出，II组的肿瘤生长曲线略慢于I组，但肿瘤体积仍随时间增加而不断增大，说明NP-cRGDs中的1-NLG对肿瘤生长有一定的抑制作用，但其抑制作用有限。V组小鼠在SPDT的作用下对肿瘤的前期生长表现出有效的抑制效果，但在治疗15天后复发，肿瘤体积快速增大。用1-NPs+超声+激光(第VI组)治疗后，小鼠的肿瘤生长大大减慢，该组肿瘤在30天后完全消除(图18)。相较于其他对照组，1-NPs+US+激光治疗的小鼠(第VI组)在100天时的存活率为100％，表明1-NPs+US+激光可以有效延长4T1荷瘤小鼠的存活率(图19)。不同处理后肿瘤组织切片的苏木精和伊红(H&E)和TUNEL染色也证实了1-NPs+超声+激光可以诱导更多的4T1肿瘤细胞死亡(图20)。
图4展示了1-NPs在活体上杀伤肿瘤的机理。1-NPs经尾静脉注射入小鼠体内，在表面cRGD的作用下于肿瘤部位蓄积，在肿瘤细胞内GSH的作用下解组装释放出2-Gd片段，恢复547nm处的荧光，释放出的Zn-PPA-SH与细胞内的白蛋白结合后恢复677nm处的近红外荧光，并在超声及光照的联合作用下释放出ROS杀伤肿瘤细胞并诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，催化树突状细胞成熟，增强抗原提呈作用，招募细胞毒性T细胞杀伤肿瘤细胞，释放出的NLG919能够抑制IDO1的作用，下调犬尿氨酸与色氨酸的比值，减弱调节T细胞对毒性T细胞的抑制作用，进一步增强细胞毒性T细胞对肿瘤的杀伤作用。
(7)1-NPs引起体内免疫效果研究：
将肿瘤体积达到100mm3的4T1荷瘤小鼠随机分为6组，分别为作如下处理：
I)生理盐水；II)1-NPs；III)1-NPs+超声；IV)1-NPs+激光；V)1-Zn-PPA+超声+激光；VI)1-NPs+超声+激光；
其中，II～VI组中，1-NPs和1-Zn-PPA的给药剂量以Zn-PPA 6.35mg/kg为标准。III-VI组在给药8h后，用激光(671nm,130mW/cm2)或超声(2.0W/cm2,50％duty,1.0MHz)对小鼠肿瘤部位进行治疗5min，给药第7天处死小鼠取血并收集肿瘤和淋巴结，将肿瘤或淋巴结剪成小块并研磨过40μm细胞筛，收集细胞悬浮液用于流式细胞分析。小鼠血液放置于4℃冰箱过夜后离心取上清液用ELISA试剂盒测量血清中TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量。将肿瘤组织裂解，收集裂解液，通过HPLC对其进行犬尿氨酸与色氨酸比例分析。分析结果如图21～23所示。
从图21a和21b中可以看出，1-NPs+超声+激光(第VI组)治疗组的肿瘤中CRT蛋白外翻程度和HMGB1释放率显着高于1-NPs+超声(第III组)或1-NPs+NIR(第IV组)治疗组。从图21c中可以看出，V组(50.0±4.1％)和VI组(55.5±2.3％)淋巴结中的成熟DC比例显着高于盐水处理的小鼠(I组，13.7±1.8％)，表明1-NPs+超声+激光的ICD诱导有助于促进淋巴结中的DC成熟，从而增强抗原提呈作用，激活下游免疫效应。从图21d和21f中可以看出，仅用1-NPs治疗的小鼠(第II组)中TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平都与生理盐水治疗的对照组小鼠的效果(第I组)相似，而1-NPs+超声+激光(第VI组)治疗组小鼠中各细胞因子均处在较高水平，分别为～3.0和～3.7。
从图22和23a～b中可以看出，V组和VI组的辅助性T细胞和细胞毒性T细胞数量显著增加，表明声-光动力治疗比单独光动力或声动力治疗能够招募更多效应T细胞向肿瘤组织浸润。
从图23c中可以看出，相比于I对照组，缺少1-NLG的V组肿瘤组织内犬尿氨酸与色氨酸的比值增加，而III组、IV组和VI组肿瘤组织内犬尿氨酸与色氨酸的比值明显降低，表明探针1-NLG可以通过抑制IDO1的活性来抑制色氨酸的代谢。
从图23d和图23e中可以看出，VI组肿瘤细胞中Foxp3和CD25标记的调节T细胞含量相较于I组明显减少，说明1-NPs有效抑制了肿瘤中的免疫抑制效应。通过对肿瘤细胞内毒性T细胞和调节T细胞进行量化计算，发现VI组中细胞毒性T细胞与调节性T细胞的比率最高。
综上，纳米探针1-NPs能在声-光动力治疗的协同作用下，激活产生更强的ICD效应，催化DC细胞成熟，招募效应T细胞浸润并降低调节T细胞引起的免疫抑制效应，发挥更好的抗肿瘤效果。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种两亲性小分子探针，其特征在于，所述探针包含以下结构：
(1)刚性连接骨架氨基荧光素片段(AO-Luc)；
(2)可靶向肿瘤的cRGD片段；
(3)可用于MR成像的DOTA-Gd片段；
(4)可被GSH切断的二硫键；
(5)Zn-PPA片段或NLG919片段。
2.根据权利要求1所述的两亲性小分子探针，其特征在于，包含Zn-PPA片段的两亲性小分子探针记为1-Zn-PPA，其结构式为：
Figure FDA0003854109590000011
包含NLG919片段的两亲性小分子探针记为1-NLG，其结构式为：
Figure FDA0003854109590000012
3.权利要求1所述的两亲性小分子探针的制备方法，所述两亲性小分子探针包括1-NLG和1-Zn-PPA；
所述1-NLG的制备方法为：
将化合物7溶于含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的溶剂中进行反应，反应结束减压旋蒸除去溶剂，加入冷乙醚收集沉淀物，然后将沉淀物和化合物1溶于溶剂中进行反应，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到1-NLG；
所述1-Zn-PPA的制备方法为：
将化合物7溶于含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的溶剂中进行反应，反应结束减压旋蒸除去溶剂，加入冷乙醚收集沉淀物，然后将沉淀物、化合物2和氯化锌溶于溶剂中进行反应，反应结束后真空旋蒸，纯化，冻干，得到1-Zn-PPA；
所述化合物1的结构式为：
Figure FDA0003854109590000021
所述化合物2的结构式为：
Figure FDA0003854109590000022
所述化合物7的结构式为：
Figure FDA0003854109590000023
4.根据权利要求3所述的两亲性小分子探针的制备方法，其特征在于，1-NLG的制备过程中：
所述化合物7和化合物1的摩尔比为1：1～1:2；
所述三氟乙酸、三异丙基硅烷和溶剂的体积比为5:94:1-90:5:5。
5.根据权利要求3所述的两亲性小分子探针的制备方法，其特征在于，1-Zn-PPA的制备过程中：
所述化合物7、化合物2、氯化锌的摩尔比为1：1：1～1：2：10；
所述三氟乙酸、三异丙基硅烷和溶剂的体积比为5:94:1-90:5:5。
6.根据权利要求3所述的两亲性小分子探针的制备方法，其特征在于，1-NLG和1-Zn-PPA的制备过程中，涉及到的溶剂均为A液与B液的混合溶液，其中A液为二氯甲烷或氯仿，B液为甲醇或乙腈；
涉及到的反应均在20-30℃下反应1～6h。
7.一种基于权利要求1所述两亲性小分子探针的谷胱甘肽激活的共组装纳米探针，其特征在于，所述谷胱甘肽激活的共组装纳米探针由两亲性小分子探针1-Zn-PPA和1-NLG共组装得到，记为1-NPs。
8.根据权利要求7所述的谷胱甘肽激活的共组装纳米探针，其特征在于，所述1-Zn-PPA和1-NLG的摩尔比为10:0-0:10且均不为0。
9.根据权利要求8所述的谷胱甘肽激活的共组装纳米探针，其特征在于，所述1-Zn-PPA和1-NLG的摩尔比为1:1.1。
10.权利要求1或2所述的两亲性小分子探针1-Zn-PPA或1-NLG、权利要求7～9任一项所述的谷胱甘肽激活的共组装纳米探针1-NPs包括如下应用：
(1)在荧光成像中的应用；和/或
(2)在磁共振成像中的应用；和/或
(3)在磁共振/荧光双模态成像中的应用；和/或
(4)在制备治疗肿瘤药物中的应用；和/或
(5)在制备杀伤肿瘤装置中的应用；和/或
(6)在肿瘤激活的声动力治疗/光动力治疗/免疫治疗的联合治疗中的应用。
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