CN116172986A - D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用 - Google Patents

D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了D‑柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用。发明人通过对D‑柠檬烯化合物对耐药菌进行了抑菌研究,发现D‑柠檬烯对替加环素耐药菌存在较好的抑制活性。抗菌活性测试显示,D‑柠檬烯在128~1024μg/mL的浓度条件下能够有效抑制临床分离替加环素耐药菌的生长,能有效抑制临床替加环素耐药不动杆菌细菌的生长。此外,D‑柠檬烯与替加环素联用对耐替加环素的不动杆菌具有一定的抑菌效果,可以增强替加环素对一些耐药菌的效果。因此,化合物D‑柠檬烯具有非常大的医药应用前景,可用于制备无毒抗耐药菌的药物或作为无毒抗耐药菌药物开发的先导化合物,而且既可单独使用也可与替加环素联合使用,可缓解目前缺少新型有效抗耐药菌物的困境,满足医疗用药需求。

Description

D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用
技术领域
本发明属于天然化合物抗耐药菌技术领域,尤其涉及D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用。
背景技术
细菌耐药性问题日益严重,耐药造成的临床治疗问题亟待解决,寻找不易产生细菌耐药性的抗生素替代药物迫在眉睫,因此新型抗耐药菌药物的研究成为当下药物研发领域的重点研究方向之一。
替加环素是二甲胺四环素衍生物,不受四环素抗性机制的影响,主要是通过抑制细菌30S核糖体亚基来抑制病原菌RNA的转录并最终停止蛋白质的合成来发挥其抗菌性能。近年,替加环素耐药不可避免的出现,其主要在多重耐药和碳青霉烯耐药的大肠杆菌中发现,一些基因的突变可降低对替加环素的敏感性,与此同时,四环素破坏酶Tet(X),是一种独特的四环素酶失活机制,已被证实在体外具有降解所有的四环素类药物的特性。
D-柠檬烯(CAS:5989-27-5)主要用作食用香料,用以配制白柠檬、柑橘类及香辛料类香精。D-柠檬烯还具有杀虫、杀螨、除草等多方面的生物活性,对人畜低毒、安全性高的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用,以应对耐药菌的挑战,满足医疗用药需求。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用。
D-柠檬烯的结构式为
Figure BDA0004147201290000011
耐药菌为替加环素耐药不动杆菌细菌。
替加环素耐药不动杆菌细菌为耐替加环素变异不动杆菌(Tigecycline-resistant Acinetobacter variabilis)、耐替加环素辛德勒不动杆菌(Tigecycline-resistant Acinetobacter schindleri)、耐替加环素印度不动杆菌(Tigecycline-resistant Acinetobacter indicus)。
耐替加环素辛德勒不动杆菌为辛德勒不动杆菌BDT2091,耐替加环素印度不动杆菌为印度不动杆菌BDT201。
抗耐药菌药物,以D-柠檬烯为活性成分。
上述抗耐药菌药物,以替加环素和D-柠檬烯为活性成分。
针对目前日趋严重的耐药菌的挑战,发明人通过对D-柠檬烯化合物对耐药菌进行了抑菌研究,发现D-柠檬烯对替加环素耐药菌存在较好的抑制活性。抗菌活性测试显示,所示D-柠檬烯在128~1024μg/mL的浓度条件下能够有效抑制临床分离替加环素耐药菌的生长,显示了较好的抑菌活性,能有效抑制临床替加环素耐药不动杆菌细菌的生长。此外,D-柠檬烯与替加环素联用对耐替加环素的不动杆菌具有一定的抑菌效果,可以增强替加环素对一些耐药菌的效果。因此,化合物D-柠檬烯具有非常大的医药应用前景,可用于制备无毒抗耐药菌的药物或作为无毒抗耐药菌药物开发的先导化合物,而且既可单独使用也可与替加环素联合使用,这在一定程度上可缓解目前缺少新型有效抗耐药菌物的困境,满足医疗用药需求。
附图说明
图1是化合物D-柠檬烯对耐替加环素不动杆菌的生长抑制曲线图,图中:aBDT201,b BDT2044,c BDT2076,d BDT2091。
图2是不同浓度化合物D-柠檬烯对耐替加环素不动杆菌的活性氧的释放的影响结果图,图中:a BDT201,b BDT2044,c BDT2076,d BDT2091。
具体实施方式
实施例1D-柠檬烯对耐替加环素不动杆菌的体外最小抑菌浓度测定
使用耐替加环素不动杆菌(变异不动杆菌BDT2044、辛德勒不动杆菌BDT2091、印度不动杆菌BDT201和BDT2076)对化合物D-柠檬烯进行体外抗菌活性测试,使用MHB肉汤进行测试,每个测试重复三遍。
化合物与菌液的配置:首先将待测化合物D-柠檬烯用DMSO配制,得到浓度为81920μg/mL的储备液,将替加环素用无菌水配制,得到浓度为1280μg/mL的储备液。分别挑取菌落于LB肉汤中,将菌液培养至对数生长期。
微量肉汤稀释法:按照美国临床实验室标准委员会(Clinical and LaboratoryStandards Institute,CLSI)推荐的肉汤微量稀释法,按照倍比稀释法,将抗菌药物储存液用MHB肉汤稀释成10个梯度,依次加入96孔板前10个孔中,每孔50μL。用MHB肉汤将测试菌株稀释成105~106CFU/mL,在每排前10孔中各加入稀释后菌液50μL。第11孔加100μL MHB肉汤作为阴性对照,第12孔加100μL稀释菌液作阳性对照。37℃培养18~24h,观察各孔培养液中细菌的生长情况,以抑制细菌生长的药物最小浓度作为测试药物的MIC值,每种药物同时做3个平行。具体测试结果如下表1。
表1测试结果
Figure BDA0004147201290000031
从表1的测试结果可以看出,本发明的化合物D-柠檬烯对耐替加环素的不动杆菌具有一定良好的的抑菌效果,最小抑菌浓度在128~1024μg/mL。
实施例2D-柠檬烯和替加环素联用对耐替加环素不动杆菌的抑制效果
使用耐替加环素不动杆菌(变异不动杆菌BDT2044、辛德勒不动杆菌BDT2091、印度不动杆菌BDT201和BDT2076)对化合物D-柠檬烯与替加环素联用进行体外抗菌活性测试,使用MHB肉汤进行测试,每个测试重复三遍,结果用FICI表示。
棋盘法联用:在96孔板中使用倍比稀释法,从左到右前10个孔倍比稀释粘菌素替加环素,从上到下前8个孔倍比稀释化合物D-柠檬烯,使每个孔中培养基的体积为50μL,然后向每个孔中加入50μL的108CFU/mL的菌液。37℃培养18~24h,观察各孔培养液中细菌的生长情况,以抑制细菌生长的药物最小浓度作为测试药物的FICI值,每种药物同时做3个平行。具体测试结果如下表2。
表2测试结果
菌株 替加环素+D-柠檬烯(FICI)
BDT201 <0.5
BDT2076 2
BDT2044 1
BDT2091 <0.5
注:拮抗:FICI>2;无关:1<FICI≤2相加:0.5<FICI≤1;协同:FICI≤0.5
从表2的测试结果可以看出,本发明的化合物D-柠檬烯与替加环素联用对耐替加环素的不动杆菌具有一定的抑菌效果,可以增强替加环素对一些耐药菌的效果。
实施例3D-柠檬烯对耐替加环素不动杆菌的生长抑制作用
单个菌落挑取置于LB液体培养基中,在37℃恒温摇床中过夜培养。然后分别将1.5mL菌液加入至150mL的LB液体培养基中,分别加入不同浓度的D-柠檬烯(1/2MIC、MIC),用DMSO作为对照,置于37℃震荡培养箱中培养,每隔一定时间取出一部分菌液检测其OD600nm值,连续检测12h。记录所有时间点的吸光值汇总形成曲线。每个药物浓度均设置独立的对照组用以去除药物本身的吸光值。具体测试结果如下图1。
生长曲线测试结果显示化合物D-柠檬烯的1/2MIC浓度可抑制耐替加环素不动杆菌的生长,在MIC浓度下完全抑制了耐替加环素不动杆菌的生长,而对照组DMSO并未对细菌的生长产生明显的影响。
实施例4D-柠檬烯对耐替加环素不动杆菌活性氧的影响
活性氧检测:通过使用ROS检测试剂盒测定活性氧的含量。试剂盒中DCFH-DA转变为DCF(绿色荧光)代表ROS的释放,将耐替加环素的不动杆菌培养至对数生长期,用PBS重悬菌液3次后使最终体积在9mL,加入9μL DCFH-DA使其浓度为1%,37℃避光混匀30min,再加入相应浓度的化合物D-柠檬烯,使D-柠檬烯的浓度分别为0、1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC,在96孔细胞板中每孔加入200μL菌液与化合物的混合液,同时使用DMSO溶剂作为阴性对照,使用试剂盒中的B液作为阳性对照,分别做3个平行。37℃恒温箱孵育30min,使用488nm激发波长,525nm发射波长,多功能酶标仪检测不同浓度的化合物刺激菌体细胞前后活性氧的含量变化。
菌体细胞要维持正常的状态,需要一定的活性氧来进行正常的生理活动,然而过量的活性氧会破坏菌体细胞蛋白、脂质和DNA,导致菌体细胞损伤,进而导致细菌的破裂死亡。具体检测结果如下图2。
活性氧检测结果显示不同浓度的化合物D-柠檬烯与没有经过处理的菌体细胞相比较,化合物D-柠檬烯均可以明显增强耐替加环素的不动杆菌的活性氧水平,使菌体受到氧化应激进而破裂死亡,阴性对照DMSO并没有对菌体的活性氧有明显的影响。因此,化合物D-柠檬烯具有良好的抑菌作用,可应用于制备无毒抗耐药菌的药物或作为无毒抗耐药菌药物开发的先导化合物(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:not significant)。

Claims (7)

1.D-柠檬烯在制备抗耐药菌药物中应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述D-柠檬烯的结构式为
Figure FDA0004147201280000011
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述耐药菌为替加环素耐药不动杆菌细菌。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述替加环素耐药不动杆菌细菌为耐替加环素变异不动杆菌、耐替加环素辛德勒不动杆菌、耐替加环素印度不动杆菌。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述耐替加环素辛德勒不动杆菌为辛德勒不动杆菌BDT2091,耐替加环素印度不动杆菌为印度不动杆菌BDT201。
6.一种抗耐药菌药物,其特征在于以D-柠檬烯为活性成分。
7.根据权利要求6所述的抗耐药菌药物,其特征在于以替加环素和D-柠檬烯为活性成分。
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