CN116172128A - 一种改善并保护中老龄雄性动物繁殖力的复合饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种改善并保护中老龄雄性动物繁殖力的复合饲料添加剂，所述复合饲料添加剂，包括以下组分：亚精胺、丙酮酸钠、谷氨酰胺、抗坏血酸、d‑生物素。其中亚精胺并未在之前的添加剂中使用过，且试验证实亚精胺与抗坏血酸以一定浓度比例联合施用对雄性精子活力各项指标改善显著。本发明提供的饲料添加剂能够显著提升中老龄雄性小鼠的精子活力，能使得睾丸中的精原干细胞自我更新以及分化能力均增强，且能降低睾丸中细胞的凋亡与衰老，提升繁殖性能，延长中老龄雄性动物配种使用年限，本发明所述产品具有较强的经济价值和市场应用价值。

Description

一种改善并保护中老龄雄性动物繁殖力的复合饲料添加剂

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及一种改善并保护中老龄雄性动物繁殖力的复合饲料添加剂。

背景技术

衰老对雄性繁殖能力有重大影响。中老年雄性在生殖轴上表现出明显的紊乱，类固醇生成受到的影响较大。内分泌变化，加上老化睾丸的形态和功能交替，导致睾丸激素产生减少。此外，衰老对精子活力，精子形态和浓度的多重影响表明，精子的质量随着时间的推移而下降。

有研究表明，啮齿动物的衰老伴随着睾丸的组织学变化和精子质量下降。在年龄较大的小鼠中，睾丸发生萎缩，精子活力降低，生精上皮退化，与年轻雌性配对时无法交配或交配后无法使雌性受孕。

中老龄雄性动物繁殖力减退的情况在雄性经济动物，如种公猪中也较为常见，种公猪的最佳适宜配种的年龄为2-4岁，但一般使用年限为4-6年，到使用后期繁殖能力大幅度降低。由于在长期的饲养环境中，对种公猪的采精较为频繁，同时环境温度的变化会影响种公猪的繁殖性能，长期投喂高能量的饲料，导致种公猪膘情过肥也会影响繁殖性能。总而言之，在目前的饲养管理中，还存在可提升的空间。以上因素都可能导致种公猪在使用后期繁殖性能降低，其使用年限降低，大大损害了经济效益。

目前提高雄性动物(种公畜)繁殖能力的技术主要是在饲料中加入添加剂，如公猪饲养过程中添加含有丰富维生素、氨基酸的松针；在饲料中添加适量的锌元素等。但目前的添加剂主要针对壮年的雄性动物，针对中老龄雄性动物生殖能力提高的研究则非常少见。

除此以外，目前常见的提高繁殖能力的饲料添加剂一般采用某一种元素或者是某种常见中药药材，多强调平衡营养或预防疾病，针对改善繁殖能力的添加剂也多注重于壮年动物的生殖力保护，而非中老龄雄性动物的繁殖力改善和保护。

因此，开发一种解决上述问题的改善并保护中老龄雄性动物睾丸繁殖能力的复合饲料添加剂是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种效果显著的能够改善并保护中老龄雄性动物繁殖能力的复合饲料添加剂，解决目前种公畜由于环境因素以及自然衰老导致的使用年限后期生殖力下降，从而导致生产效率低下，甚至面临淘汰，直接使得养殖成本升高的问题。本发明着眼于中老龄动物的繁殖力保护，目的在于延长种公畜的使用年限。

本发明通过亚精胺、丙酮酸钠、谷氨酰胺、抗坏血酸及d-生物素科学配伍，提高中老龄雄性动物的精子活力，通过提升睾丸中的精原干细胞自我更新以及分化能力，降低睾丸中细胞的凋亡和衰老，从而提升繁殖性能。本发明通过试验证明，若只添加丙酮酸钠、谷氨酰胺及d-生物素，则不能显著提高雄性精子活力，必须使用本配方才能达到显著效果。本发明还通过试验本饲料添加剂添加时间越长，改善效果越佳。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种能够改善并保护中老龄雄性动物睾丸生殖能力的复合饲料添加剂，包括以下组分：亚精胺、丙酮酸钠、谷氨酰胺、抗坏血酸、d-生物素。

以上所述的各种成分作用阐述如下：

亚精胺：亚精胺，spermidineH2N(CH2)3NH(CH2)4NH2，一种多胺。广泛分布在生物体内，是由腐胺(丁二胺)和腺苷甲硫氨酸生物合成的。亚精胺可抑制神经元NO合成酶(nNOS)，结合并沉淀DNA；也可用于纯化DNA结合蛋白，刺激T4聚核苷酸激酶活性。

丙酮酸钠：糖代谢过程中，丙酮酸作为无氧呼吸有氧呼吸产生二氧化碳前的重要中间产物。

谷氨酰胺：谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺，L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。谷氨酰胺可用于治疗胃及十二指肠溃疡、胃炎及胃酸过多，也用于改善脑功能。多用于改善智力发育不良的儿童和精神障碍、酒精中毒、癫痫患者的脑功能。也做营养增补剂。

抗坏血酸：又称维生素C，是一种多羟基化合物。结构类似葡萄糖，其分子中第2及第3位上两个相邻的烯醇式羟基极易解离而释出H⁺，故具有酸的性质，称L-抗坏血酸，其具有很强的还原能性。有研究证明中剂量维生素C(30mg·kg^－1·d^－1)可早期预防小鼠NAFLD的发生,也有利于小鼠NAFLD的后期治疗；而大剂量维生素C(90mg·kg^－1·d^－1)用于小鼠NAFLD的早期预防和后期治疗均存在潜在风险。

d-生物素：生物素，又称维生素H或辅酶R，是动物生长所必需的水溶性含硫维生素，是机体碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中不可或缺的维生素之一，仅d-生物素存在于自然界并具有生物学活性。生物素作为羧化酶的必需辅助因子，在维持上皮细胞组织结构的完整和健全中起重要作用[多数研究表明，在早期断奶仔猪和生长肥育猪饲粮中添加生物素，可提高蹄壳硬度、压缩性和抗压强度，减少蹄壳碎裂和蹄垫损害，改善皮肤和被毛状况，但并不能提高猪的增重和饲料转化率。Adams等则认为饲料中添加0.11mg/kg生物素可改善仔猪生产性能。Frigg等在总结了过去几十年生物素在商品肉猪的应用试验后认为，生物素推荐量应根据血浆中生物素的含量来确定。在生物素供给充足的情况下，血浆中生物素的含量应不低于600ng/L。猪日粮中有效生物素的推荐量为：早期断奶仔猪需要量200mg/t，添加量100～150mg/t；小猪需要量150mg/t，添加量50～100mg/t；生长猪需要量125mg/t，添加量30～70mg/t；肥育猪需要量50mg/t。众多研究证实，在母猪日粮中添加生物素，可提高窝产仔数、断奶仔猪数、断奶窝重和缩短断奶后重新发情的时间间隔。在实际应用时，往往要根据猪种、营养与饲料、饲养管理、疾病等影响生物素需要量的因素而加以调整。

优选地，各组分的浓度为：亚精胺200～400μM、丙酮酸钠0.5～1.5mg/mL、谷氨酰胺8～12mM、抗坏血酸4*10^-4～6*10^-4M、d-生物素40～60μg/mL。

优选地，各组分浓度为：亚精胺300μM、丙酮酸钠1mg/mL、谷氨酰胺10mM、抗坏血酸5*10-4M、d-生物素50μg/mL。

优选地，所述亚精胺，为分析标准品，GC≥98％，所述试剂购自上海源叶生物科技有限公司。

优选地，所述丙酮酸钠，纯度99％，所述试剂购于阿拉丁试剂。

优选地，所述谷氨酰胺，BR，99％，所述试剂购自上海源叶生物科技有限公司。

优选地，所述抗坏血酸,纯度≥99.0％，所述试剂购于美国Sigma-Aldrich公司。

优选地，所述d-生物素,纯度≥99.0％，所述试剂购于上海瑞永生物科技有限公司。

本发明还涉及上述复合饲料添加剂的制备工艺，包括如下步骤：

(1)将丙酮酸钠粉剂每0.1g用1mL去离子水溶解得到丙酮酸母液；

(2)将谷氨酰胺粉剂每0.145g用1mL去离子水溶解得到谷氨酰胺母液；

(3)将抗坏血酸粉剂每0.0176g用1mL去离子水溶解得到抗坏血酸母液；

(4)将d-生物素粉剂每0.01g用1mL去离子水溶解得到d-生物素母液；

(5)将上述(1)-(4)溶解后的试剂按照丙酮酸钠母液取100μL、谷氨酰胺母液取100μL、抗坏血酸母液取50μL、d-生物素母液取50μL混合均匀，并添加6mL的去离子水；

(6)将3μL浓度为1mol/L的亚精胺溶液添加到混合液中，混合均匀，采用去离子水将溶液定容至10mL，得到10mL复合饲料添加剂。

本发明还涉及一种饲料，包括上述的饲料添加剂。

本发明还涉及上述的复合饲料添加剂在制备改善并保护中老龄雄性动物睾丸繁殖性能在饲料中的应用。

优选地，所述复合饲料添加剂在所述饲料中添加量为80mL/kg。

本发明还提供上述复合饲料添加剂在改善并保护中老龄雄性动物睾丸生殖能力中的应用。

优选地，所述应用包括提升精子活力。

优选地，所述应用包括提升睾丸曲细精管中PLZF⁺细胞数量。

优选地，所述应用包括精原干细胞自我更新特异性标志物PLZF、分化标志物C-KIT、生殖细胞标志物MVH、细胞增殖标志物PCNA、精原细胞分化的标志物STRA8、减数分裂的标志物SYCP3、抗衰老的标志物Klotho表达量上升。

有益效果

本发明的复合饲料添加剂采用亚精胺、丙酮酸钠、谷氨酰胺、抗坏血酸及d-生物素科学配伍，提高中老龄雄性动物的精子活力，通过提升睾丸中的精原干细胞自我更新以及分化能力，降低睾丸中细胞的凋亡，从而提升繁殖性能。

附图说明

图1为本发明实施例1对照组与实验组小鼠精子活力指标的统计结果图；

图2为本发明实施例1对照组与实验组小鼠精原干细胞及精原细胞相关标志物的表达变化pcr结果；

图3为本发明实施例1对照组与实验组小鼠精原干细胞自我更新、分化及凋亡相关标志物的表达变化WB结果；

图4为本发明实施例1对照组与实验组小鼠睾丸组织免疫组化PLZF检测结果；

图5为本发明实施例2对照组与实验组小鼠精子活力指标的统计结果图；

图6为本发明实施例2对照组与实验组小鼠精原干细胞及精原细胞相关标志物的表达变化pcr结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本发明的特点和改善效果会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、实验动物

选择100日龄雄性ICR小鼠11只，随机分为两组，对照组5只，试验组6只，适应性饲喂20天，自由采食饮水。当小鼠为120日龄时，进行添加剂饲喂，试验阶段为30天。

2、日粮与实验设计

本试验所用小鼠日粮购于协同生物，为实验用鼠维持饲料，符合GB 14924.1《实验动物配合饲料通用质量标准》、GB 13078《饲料卫生标准》、GB 14924.2《实验动物配合饲料卫生标准》和GB 14924.3《实验动物配合饲料营养成分》。对照组饲喂基础日粮，试验组为在基础日粮中添加80mL/kg添加剂。连续饲喂30天后，取小鼠两侧附睾，收集精子进行检测；取一侧睾丸进行组织包埋；取另一侧睾丸提取RNA以及蛋白，样品待测。

3、饲养管理

ICR小鼠购自南京医科大学动物繁育中心。小鼠饲养、管理和实验操作按照《实验动物管理条例》相关规定进行。

饲养实验分别于实验开始、每次饲喂添加剂及试验结束称重，试验过程中记录采食量，试验结束后计算小鼠全阶段平均采食量。

数据分析采用SPSS17.0软件，作图使用GraphPad Prism 5。

4、结果与分析

由表1可知，饲喂添加剂的试验组中老龄小鼠随着饲喂时间的增加体重无明显变化或在一定时期内略有增加；对照组中老龄小鼠的体重随着时间的变化逐渐减少，且状态也逐渐变差。

表1添加剂饲喂试验中小鼠体重变化

由表2及图1可知，与对照组相比，试验组小鼠的精子活力有明显的提升，其中精子数量及密度均较对照组相比大幅度上升(P<0.01)，精子的总活力显著增加(P<0.01)，向前运动的精子比例显著增加(P<0.01)，快速运动的精子比例显著增加(P<0.1)，无活力的精子比例显著降低(P<0.01)，说明该饲料添加剂能够起到保护和改善中老龄小鼠精子活力的作用。

表2添加剂饲喂试验后对照组与试验组小鼠精子活力指标情况

由表3及图4可知，与对照组相比，试验组小鼠的睾丸曲细精管中PLZF+细胞数量有一定的增加。

表3添加剂饲喂试验后对照组与试验组小鼠睾丸组织免疫组化PLZF⁺细胞数量情况

由图2可知，与对照组相比，试验组小鼠精原干细胞自我更新特异性标志物PLZF及分化标志物C-KIT表达量显著上升，生殖细胞标志物MVH表达量显著上升，细胞增殖标志物PCNA表达量显著上升，同时精原细胞分化的标志物STRA8表达量显著上升，减数分裂的标志物SYCP3表达量显著上升，抗衰老的标志物Klotho表达量上升。

由图3可知，与对照组相比，试验组小鼠精原干细胞自我更新特异性标志物PLZF表达量显著上升，同时精原细胞分化的标志物STRA8表达量显著上升，抗凋亡标志物BCL2以及凋亡标志物BAX表达量均上升。

实施例2

1、实验动物

选择100日龄雄性ICR小鼠10只，随机分为四组，对照组分为两组，对照一组2只，对照二组2只；实验组分为两组，试验一组3只，试验二组3只，适应性饲喂20天，自由采食饮水。当小鼠为120日龄时，进行添加剂饲喂，试验阶段为30天。

2、日粮与实验设计

本试验所用小鼠日粮购于协同生物，为实验用鼠维持饲料，符合GB 14924.1《实验动物配合饲料通用质量标准》、GB 13078《饲料卫生标准》、GB 14924.2《实验动物配合饲料卫生标准》和GB 14924.3《实验动物配合饲料营养成分》。如表4所示，对照组两组饲喂基础日粮15天后，对照一组继续饲喂基础日粮，对照二组饲喂添加减去亚精胺以及抗坏血酸的饲料添加剂的基础日粮，继续饲喂15天；试验组两组前15天在基础日粮中添加80mL/kg添加剂，后15天试验一组开始饲喂基础日粮，试验二组继续饲喂含添加剂日粮。30天饲喂期完成后，取小鼠两侧附睾，收集精子进行检测；取一侧睾丸进行组织包埋；取另一侧睾丸提取RNA以及蛋白，样品待测。

表4小鼠添加剂饲喂分组情况表

3、饲养管理

ICR小鼠购自南京医科大学动物繁育中心。小鼠饲养、管理和实验操作按照《实验动物管理条例》相关规定进行。

饲养实验分别于实验开始、每次饲喂添加剂及试验结束称重，试验过程中记录采食量，试验结束后计算小鼠全阶段平均采食量。

数据分析采用SPSS17.0软件，作图使用GraphPad Prism 5。

4、结果与分析

由表5可知，饲喂添加剂的试验组中老龄小鼠随着饲喂时间的增加体重无明显变化或在一定时期内略有增加，其中持续饲喂饲料添加剂的试验2组小鼠体重略有增加但总体来说处于稳定的水平；对照组中老龄小鼠的体重随着时间的变化逐渐减少，且状态也逐渐变差，对照2组在第15天后添加了去除亚精胺和抗坏血酸的饲料添加剂，小鼠体重并没有恢复或增长，小鼠状态与对照1组相比也无明显变化。

表5添加剂饲喂试验中小鼠体重变化

由表6及图5可知，与对照组相比，试验组两组小鼠的精子活力均有明显的提升，其中精子数量及密度均较对照组相比大幅度上升，精子的总活力显著增加，向前运动的精子比例显著增加，快速运动的精子比例显著增加，无活力的精子比例显著降低。与试验1组相比，实验2组精子活力各项指标的提升更为明显，说明持续饲喂饲料添加剂能够改善小鼠精子活力；与对照1组相比，对照2组小鼠的精子活力各项指标并没有明显提升，说明减去添加剂配方中的亚精胺和抗坏血酸后，添加剂的作用明显下降，总体来说该饲料添加剂能够起到保护和改善中老龄小鼠精子活力的作用。

表6添加剂饲喂试验后对照组与试验组小鼠精子活力指标情况

由图6可知，与对照组相比，试验组小鼠精原干细胞自我更新特异性标志物PLZF及分化标志物C-KIT表达量显著上升，生殖细胞标志物MVH表达量显著上升,细胞增殖标志物PCNA表达量显著上升,同时精原细胞分化的标志物STRA8表达量显著上升，减数分裂的标志物SYCP3表达量显著上升,抗衰老的标志物Klotho表达量上升。与试验1组相比，实验2组的提升更为明显，说明持续饲喂饲料添加剂能够改善小鼠精子活力；与对照1组相比，对照2组小鼠的各项标志物表达并没有明显提升，说明减去添加剂配方中的亚精胺和抗坏血酸后，添加剂的作用明显下降，结果表明该饲料添加剂能够起到保护和改善中老龄小鼠精子活力的作用。

综上可知，试验组小鼠精子活力有明显提升，同时精原干细胞的自我更新和分化均有提升，精原细胞的分化以及减数分裂均有增加，细胞增殖能力升高，凋亡在一定程度上有所减少。这说明本发明的复合饲料添加剂能够提高中老龄雄性动物的精子活力，通过提升睾丸中的精原干细胞自我更新以及分化能力，降低睾丸中细胞的凋亡，从而提升繁殖性能。

Claims (10)

1.一种改善并保护中老龄雄性动物繁殖力的复合饲料添加剂，其特征在于，复合饲料添加剂所述包括以下组分：亚精胺、丙酮酸钠、谷氨酰胺、抗坏血酸和d-生物素。

2.根据权利要求1所述的复合饲料添加剂，其特征在于，各组分的浓度为：亚精胺200～400μM、丙酮酸钠0.5～1.5mg/mL、谷氨酰胺8～12mM、抗坏血酸4*10^-4～6*10^-4M、d-生物素40～60μg/mL。

3.根据权利要求1所述的复合饲料添加剂，其特征在于，按照添加所需浓度，各组分的浓度为：亚精胺300μM、丙酮酸钠1mg/mL、谷氨酰胺10mM、抗坏血酸5*10^-4M、d-生物素50μg/mL。

4.一种权利要求1-3任一项所述复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将丙酮酸钠粉剂每0.1g用1mL去离子水溶解得到丙酮酸母液；

将谷氨酰胺粉剂每0.145g用1mL去离子水溶解得到谷氨酰胺母液；

将抗坏血酸粉剂每0.0176g用1mL去离子水溶解得到抗坏血酸母液；

将d-生物素粉剂每0.01g用1mL去离子水溶解得到d-生物素母液；

将上述溶液按照丙酮酸钠母液取100μL、谷氨酰胺母液取100μL、抗坏血酸母液取50μL、d-生物素母液取50μL混合均匀，并添加6mL的去离子水；

将3μL浓度为1mol/L的亚精胺溶液添加到混合液中，混合均匀，采用去离子水将溶液定容至10mL，得到10mL复合饲料添加剂。

5.一种饲料，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的复合饲料添加剂。

6.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，所述复合饲料添加剂在饲料中添加量为80mL/kg。

7.权利要求1-3任一项所述的复合饲料添加剂在改善并保护中老龄雄性动物睾丸生殖能力中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括提升精子活力。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括提升睾丸曲细精管中PLZF⁺细胞数量。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括精原干细胞自我更新特异性标志物PLZF、分化标志物C-KIT、生殖细胞标志物MVH、细胞增殖标志物PCNA、精原细胞分化的标志物STRA8、减数分裂的标志物SYCP3、抗衰老的标志物Klotho表达量上升。

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