CN116148365A - 一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法 - Google Patents

一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种SARS‑CoV‑2S1蛋白的检测方法。在该方法中，将SARS‑CoV‑2S1蛋白用溶液酶解的预处理方式获得S1肽段，利用C18色谱柱实现样品分离，再用orbitrap高分辨质谱进行数据采集。先在质谱的数据依赖性模式(DDA)下进行S1肽段样品的数据采集，挑选出6‑10条高强度、肽段匹配谱图数(PSM)较多的特异性肽段，构建出平行反应监测模式(PRM)的肽段库；最后根据构建的PRM肽段库进行SARS‑CoV‑2S1蛋白的鉴定。该技术能够实现SARS‑CoV‑2S1蛋白的高灵敏度、高精确度检测，有望成为核酸检测在人体微量病毒检测和货物表面微量病毒检测中的重要补充方法，在遏制SARS COV‑2的传播中发挥重要作用。

Description

一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法
技术领域
本发明涉及一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，病毒颗粒表面的刺突糖蛋白(S 蛋白)作为冠状病毒感染宿主细胞的关键蛋白，结合宿主细胞的血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)，宿主细胞内2型跨膜丝氨酸蛋白酶将S蛋白裂解成 S1和S2两部分，S1具有与宿主细胞结合的受体结合区(RBD)，变异性较大，在不同病毒或同一病毒不同毒株间有明显差异。因此，实现SARS-CoV-2S1蛋白的高灵敏、特异性检测，对于阻断新冠病毒传播具有重要意义。
对于实现新型冠状病毒的快速、准确检测，目前最常用的检测技术包括核酸检测、血清学检测等方法。SARS-CoV-2核酸检测是在采用宏基因组新一代测序技术确定核酸序列的基础上，主要以病毒基因组中3段保守序列(开放读码框1ab、核壳蛋白N、包膜蛋白E)作为检测靶标，采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS-CoV-2核酸。作为新型冠状病毒检测的“金标准”，核酸检测具备操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，能检测出处于窗口期的患者；但采样时间与位置、实验操作、诊断试剂质量、病毒变异、病毒载量差异等问题会导致“假阴性”结果出现。
血清学检测SARS-CoV-2抗体，即靶向免疫球蛋白M、G(IgM、IgG)。 IgM在病毒感染早期1周左右出现，是急性期感染的诊断指标，但浓度相对较低、维持时间较短；IgG在病毒感染后3周左右出现，并在体内较长时间存在，抗体滴度有一个持续增高的过程。血清学检测操作简单快捷，可作为核酸检测的有效补充；但由于病毒进入机体到产生特异性抗体需要一段窗口期，检测也可能出现“假阴性”，而且基于N或S蛋白的抗体血清学检测易受到内源性或外源性干扰物的影响而出现“假阳性”。国家药监局特别强调，SARS-CoV-2抗体检测并不适用于一般人群的大规模筛查；现已审批的抗体检测试剂盒仅用于核酸检测阴性疑似病例的补充检测或在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。
基于质谱的组学分析技术，具有高通量、高灵敏度和操作简单等优势，能够对核酸、蛋白质、代谢物进行精准定性和定量表征，已被广泛应用于传染病诊断、生物标志物发现、病原体鉴定和致病机理等研究。
在本专利中，针对目前新型冠状病毒检测“假阳性”、“假阴性”等问题，发展了基于靶向质谱平行反应监测模式的SARS-CoV-2 S1蛋白的高灵敏检测方法，利用分离技术减少干扰物的影响，同时结合高灵敏度的质谱检测技术，以实现SARS-CoV-2 S1蛋白检测的灵敏性、特异性和可靠性。
发明内容
本发明的目的是提供一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法，通过本发明的方法解决了新型冠状病毒检测“假阳性”、“假阴性”的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)提取和纯化SARS-CoV-2 S1蛋白：将SARS-CoV-2病毒颗粒在 60000-80000g高转速下离心1-3h，破碎病毒颗粒；再用70％甲酸振荡悬浮沉淀物，随后加入等体积的乙腈振荡；然后用14000-16000g离心5-20min，取出上清液，即提取出的蛋白质溶液；最后利用尺寸排阻色谱进行 SARS-CoV-2 S1蛋白的纯化。
(2)SARS-CoV-2 S1蛋白样品预处理：将SARS-CoV-2 S1蛋白用水溶解，加入尿素溶液混匀；添加二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦在37-56℃处理 0.5-2h，将S1蛋白进行变性还原处理；随后加入碘乙酰胺，室温避光烷基化25-40min；加入碳酸氢铵溶液稀释尿素，最后加入胰蛋白酶酶解12-16h；将得到的肽段用除盐柱进行除盐处理，并冻干，得到SARS-CoV-2S1肽段样品。
(3)构建蛋白质数据库：从网站Uniprot(https://www.uniprot.org/)里下载SARS-CoV-2蛋白(P0DTC2)的全部序列，选取其中从13–685位的氨基酸序列，即为SARS-CoV-2 S1蛋白序列；再通过软件pFind (http://pfind.ict.ac.cn/software/pFind/index.html)自动添加入污染物库，即为构建的蛋白质数据库。
(4)构建PRM模式的肽段库：将SARS-CoV-2 S1肽段样品上样至液质联用，利用25μm内径、10-15cm长的C18反相色谱柱(填料粒径为1.9μm)，通过65min的分离梯度进行样品分离，采用orbitrap高分辨质谱的DDA模式进行质谱数据采集，Full MS扫描在Orbitrap上实现；在采集周期内，按强度从高至低将2-7价母离子进行二级谱碎裂，获得质谱的原始数据文件 (包括一级谱和二级谱)；以构建的蛋白质数据库为数据检索库，将质谱采集的原始文件采用软件Proteome Discoverer(Thermo Fisher)和Maxquant (https://www.maxquant.org/)进行数据检索；根据鉴定到的肽段，选取强度和PSM数都在前12名的6-10条高强度、PSM数较多的SARS-CoV-2 S1 蛋白的特异性肽段，构建出PRM模式的肽段库。
(5)待分析肽段样品的鉴定：构建的PRM模式的肽段库包括： DIADTTDAVR，SWmESEFR，GWIFGTTLDSK，FASVYAWNR，HTPINLVR， VGGNYNYLYR，NIDGYFK，QIAPGQTGK。将待分析的SARS-CoV-2 S1 肽段样品上样至液质联用，利用25μm内径、10-15cm长的C18反相色谱柱 (填料粒径为1.9μm)，通过65min的分离梯度进行样品分离，利用构建的 PRM模式的肽段库进行目标肽段的采集，以构建的蛋白质数据库为数据检索库，通过Proteome Discoverer进行数据检索，若含有2条及以上PRM肽段库中的肽段，则表示待分析的肽段样品中有SARSCoV-2 S1蛋白存在，否则代表分析的肽段样品中无SARS CoV-2 S1蛋白存在。
本发明涉及一种SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法。在该方法中，将 SARS-CoV-2 S1蛋白用溶液酶解的预处理方式获得S1肽段，利用C18色谱柱实现样品分离，再用orbitrap高分辨质谱进行数据采集。先在质谱的DDA 模式下进行S1肽段样品的数据采集，挑选出6-10条高强度、PSM数较多的特异性肽段，构建出PRM模式的肽段库；最后根据构建的PRM肽段库进行SARS-CoV-2 S1蛋白的鉴定。该技术能够实现SARS-CoV-2 S1蛋白的高灵敏度、高精确度检测，有望成为核酸检测在人体微量病毒检测和货物表面微量病毒检测中的重要补充方法，在遏制SARS COV-2的传播中发挥重要作用。
本发明还提供了一种通用型构建靶向质谱平行反应监测模式的方法流程，以实现其余多种病毒(如H1N1，MERS等)的高灵敏检测和区分。本发明具有如下优点：
(1)本发明通过直接检测病毒抗原以实现新型冠状病毒的检测，与检测RNA和抗体的方法相比，能够实现早诊断、快速、准确。
(2)本发明将色谱分离技术和高分辨质谱检测技术相结合，构建出 PRM模式的肽段库，既降低了干扰物的影响，同时又实现了目标蛋白的高特异性、高灵敏检测。
(3)本发明从液质联用至构建PRM模式的肽段库的整个流程，同样为其余病毒(如H1N1，MERS等)的特异性、高灵敏检测提供了方法模板。
附图说明
图1：SARS-CoV-2 S1蛋白的检测方法的构建流程；
图2：液相上C18反相分离柱的65min分离梯度；
图3：在DDA模式下，20ng SARS-CoV-2 S1蛋白的序列覆盖图；
图4：构建的PRM模式的8条高强度、丰富PSM的SARS-CoV-2 S1特异性肽段。
具体实施方式
实施例1
整个实验流程如图1所示：
(1)将107个SARS-CoV-2病毒颗粒在65000g高转速下离心1h，破碎病毒颗粒；然后用100μl 70％(v/v)甲酸振荡悬浮沉淀物，随后加入等体积的乙腈剧烈振荡；最后用16000g离心5min，取出上清液，即提取出的蛋白溶液。
(2)将提取出的病毒蛋白溶液利用尺寸排阻色谱进行纯化，使用 TOSOH的TSK-GELG2000SW凝胶色谱柱(7.5mm×300mm)，流动相为含0.1mmol/L NaCl的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)，流速为1ml/min，检测波长为280nm，得到纯化的SARS-CoV-2 S1蛋白。
(3)将SARS-CoV-2 S1蛋白用水溶解，配制成1mg/ml浓度，取30μl S1蛋白水溶液加入24μl 8M尿素混匀，加入1.44μl 0.33M二硫苏糖醇溶液， 56℃下处理1h，将S1蛋白进行变性还原处理；随后加入1.2μl 1M碘乙酰胺溶液，室温避光烷基化30min；加入400μl 50mM碳酸氢铵溶液稀释尿素，再加入1μg胰蛋白酶酶解14h。将得到的肽段样品用C18填料的除盐柱(填料粒径5μm，孔径
Figure BDA0003370264790000041
)进行除盐处理，上样后用流动相A相【含2％(v/v) 乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液】洗三遍，再用流动相B相【含80％ (v/v)乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液】进行洗脱。将脱盐后的肽段样品冻干，用0.1％(v/v)甲酸复溶，得到SARS-CoV-2 S1肽段样品。
(4)从Uniprot(https://www.uniprot.org/)里下载SARS-CoV-2蛋白 (P0DTC2)的全部序列，选取其中从13–685位的氨基酸序列，即为S1 蛋白序列；通过软件pFind(http://pfind.ict.ac.cn/software/pFind/index.html) 自动添加入污染物库，即为构建的蛋白质数据库。
(5)将20ng SARS-CoV-2 S1肽段样品上样至液质联用，利用25μm内径、12cm长的C18反相色谱柱(填料粒径为1.9μm)，流动相A相：含0.1％ (v/v)甲酸的超纯水溶液，B相：含80％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，通过65min的分离梯度(如图2所示)进行样品分离，采用orbitrap高分辨质谱的DDA模式进行质谱数据采集，Full MS扫描在Orbitrap上实现；在2s采集周期内，按强度从高至低将2-7价母离子进行二级谱碎裂，获得质谱的原始数据文件(包括一级谱和二级谱)；以构建的蛋白质数据库为数据检索库，将质谱采集的原始文件采用软件Proteome Discoverer(Thermo Fisher)和Maxquant(https://www.maxquant.org/)进行数据检索；根据鉴定到的肽段(如图3序列覆盖图里所示)，选取强度和PSM 数都在前12名的8条高强度、PSM数较多的SARS-CoV-2 S1蛋白的特异性肽段，构建出PRM模式的肽段库(如图4所示)。构建的PRM模式的肽段库包括：DIADTTDAVR，SWmESEFR，GWIFGTTLDSK，FASVYAWNR， HTPINLVR，VGGNYNYLYR，NIDGYFK，QIAPGQTGK。
(6)将0.1pg待分析的SARS CoV-2 S1肽段样品(约为100个SARS CoV-2病毒颗粒)利用25μm内径、12cm长的C18反相色谱柱(填料粒径为1.9μm)，流动相A相：含0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，B相：含80％ (v/v)乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，通过65min的分离梯度(如图2所示)进行样品分离，采用构建的PRM肽段库中的肽段作为采集目标进行质谱数据采集，以构建的蛋白质数据库为数据检索库，利用Proteome Discoverer进行检索，成功鉴定到SARS CoV-2 S1蛋白存在(序列覆盖度为 9％，鉴定到6条肽段，PSM数为26)。
实施例2
操作如实施例1中步骤(1)-(5)所示。
(6)将0.02pg待分析的SARS CoV-2 S1肽段样品(约为20个SARS CoV-2病毒颗粒)利用25μm内径、12cm长的C18反相色谱柱(填料粒径为1.9μm)，流动相A相：含0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，B相：含80％ (v/v)乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，通过65min的分离梯度(如图2所示)进行样品分离，采用构建的PRM肽段库中的肽段作为采集目标进行质谱数据采集，以构建的蛋白质数据库为数据检索库，利用Proteome Discoverer进行检索，成功鉴定到SARS CoV-2 S1蛋白存在(序列覆盖度为 5％，鉴定到2条肽段，PSM数为10)。
实施例3
操作如实施例1中步骤(1)-(5)所示。
(6)将0.01pg待分析的SARS CoV-2 S1肽段样品(约为10个SARS CoV-2 病毒颗粒)利用25μm内径、12cm长的C18反相色谱柱(填料粒径为1.9μm)，流动相A相：含0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，B相：含80％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)甲酸的超纯水溶液，通过65min的分离梯度(如图2所示) 进行样品分离，采用构建的PRM肽段库中的肽段作为采集目标进行质谱数据采集，以构建的蛋白质数据库为数据检索库，利用Proteome Discoverer 进行检索，成功鉴定到SARS CoV-2 S1蛋白存在(序列覆盖度为4％，鉴定到3条肽段，PSM数为15)。

Claims (7)

1.一种SARS-CoV-2S1蛋白的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用离心破裂SARS-CoV-2病毒颗粒，再用甲酸和乙腈进行蛋白质提取，最后通过尺寸排阻色谱进行S1蛋白的纯化；
(2)利用溶液酶解的方法，进行蛋白质样品预处理；
(3)利用C18色谱柱实现样品分离，再用orbitrap高分辨质谱进行数据采集；
(4)利用DDA模式挑选出特异性肽段，构建出PRM模式的肽段库；
(5)利用构建的PRM肽段库进行待分析肽段样品的SARS-CoV-2S1蛋白的鉴定。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的提取蛋白质溶液的过程为：将SARS-CoV-2病毒颗粒在60000-80000g高转速下离心1-3h，破碎病毒颗粒；然后用50-80％(v/v)甲酸振荡悬浮沉淀物，随后加入等体积的乙腈振荡；最后用14000-16000g离心5-20min，取出上清液，即提取出的蛋白质溶液。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的溶液酶解方法包括：将SARS-CoV-2S1蛋白用水溶解，加入尿素溶液混匀；添加二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦在37-56℃处理0.5-2h，将S1蛋白进行变性还原处理；随后加入碘乙酰胺，室温避光烷基化25-40min；加入碳酸氢铵溶液稀释尿素，最后加入胰蛋白酶酶解12-16h；将得到的肽段用除盐柱进行除盐处理，并冻干，得到SARS-CoV-2S1肽段样品。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)所述的C18色谱柱包括：25μm内径、10-15cm长的C18反相柱，填料粒径为1.9μm。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)过程为：
从Uniprot(https://www.uniprot.org/)里下载SARS-CoV-2蛋白(P0DTC2)的全部序列，选取其中从13–685位的氨基酸序列，即为S1蛋白序列；通过软件pFind(http://pfind.ict.ac.cn/software/pFind/index.html)自动添加入污染物库，即为构建的蛋白质数据库；
将SARS-CoV-2S1肽段样品上样至液质联用，经过梯度分离后，采用DDA模式进行数据采集，Full MS扫描在Orbitrap上实现；在采集周期内，按强度从高至低将2-7价母离子进行二级谱碎裂，获得质谱的原始数据文件(包括一级谱和二级谱)；以构建的蛋白质数据库为数据检索库，将质谱采集的原始文件采用软件Proteome Discoverer(Thermo Fisher)和Maxquant(https://www.maxquant.org/)进行数据检索；根据鉴定到的肽段，选取强度和PSM数都在前12名的6-10条高强度、PSM数较多的SARS-CoV-2S1蛋白的特异性肽段，构建出PRM模式的肽段库。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)所述的PRM模式的肽段库包括：DIADTTDAVR，SWmESEFR，GWIFGTTLDSK，FASVYAWNR，HTPINLVR，VGGNYNYLYR，NIDGYFK，QIAPGQTGK。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)将待分析的肽段样品利用C18反相色谱柱分离后，采用构建的PRM肽段库中的肽段作为采集目标进行质谱数据采集，以构建的蛋白质数据库为数据检索库，利用软件Proteome Discoverer(Thermo Fisher)进行数据检索；若含有2条及以上PRM肽段库中的肽段，则表示待分析的肽段样品中有SARS CoV-2S1蛋白存在，否则代表分析的肽段样品中无SARS CoV-2S1蛋白存在。
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