CN116139341A - 一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用，由京尼平交联的脱细胞猪颞下颌关节盘与定向冷冻聚乙烯醇复合而成，内为京尼平交联的脱细胞基质，聚乙烯醇渗入脱细胞基质中形成网络结构，并外覆包裹于脱细胞基质表面。使用冻干后渗透法将PVA掺入脱细胞猪颞下颌关节盘中，再使用定向冻结法制成凝胶。随后使用京尼平对材料进行交联。本发明还包括上述方法制得的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其应用。本发明所得复合材料同时具有PVA的高润滑、高弹性，又具有脱细胞基质的高机械强度，且能够满足颞下颌关节盘自然形态要求；有效解决了现有颞下颌关节盘修复材料性能单一或应用缺陷等问题。

Description

一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及颞下颌关节盘假体技术领域，具体涉及一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
颞下颌关节(TMJ)是一个复杂的机械和生物学关节，参与日常生活如进食和说话。颞下颌关节盘是关节的基本组成部分，对颞下颌关节的协调性和生理机能至关重要。在颞下颌关节的日常运动中，关节盘在吸收载荷、减少摩擦和保护髁突表面方面起着关键作用，它在髁突表面承受着巨大而复杂的循环力。许多疾病，包括骨关节炎(OA)、创伤、强直和肿瘤，都可能导致椎间盘破坏或退变。受损的关节盘会损伤颞下颌关节结构，进一步加重关节功能丧失。目前对关节盘相关颞下颌关节疾病的主要治疗是非侵入性和微创性治疗(例如，咬合夹板，关节内注射)，这只是姑息性的。对于严重的病例，全关节置换是最后的选择。目前尚无有效的临床修复策略来重建受损颞下颌关节盘的生物和机械功能。
具有长期生物相容性和仿生功能的受损关节盘重建可维持颞下颌关节复合体的稳定性和功能，进而挽救与关节盘相关的颞下颌关节疾病。迄今为止，工程再生关节盘或人工关节盘的替换已经被探索，一般基于3D打印技术和逐层纳米组装。但与原生关节盘相比，其形态、内部结构和机械模量仍有一定差距。复杂的制造技术和生物材料生产工艺也限制了这些关节盘取代基在临床的应用。目前尚不存在一种具有仿生大体形态和内部微结构的有效且易于制备的关节盘假体。同时，材料来源的选择仍然是该领域的一个挑战，主要材料的选择范围从天然的颞肌筋膜组织到合成的大分子材料。然而，它们的组织学和力学性能与颞下颌关节盘有很大的不同。尽管已经获得了一些有前景的体外结果，但很少有材料结构可以在体内恢复关节盘功能。
与其他材料相比，脱细胞化细胞外基质(dECM)因其优良的生物相容性和优越的生物力学性能被认为是一种理想的生物材料。它通常可以通过从细胞外基质中去除细胞成分的简单脱细胞过程获得。基于脱细胞的组织(或器官)重建不仅可以解决生物材料和生物制造的问题，而且可以保证较高的转化价值。从理论上讲，脱细胞化细胞外基质可以保留ECM的所有结构和生化成分，保持机体的各向异性和粘弹性，这是传统方法难以实现的。然而，关于脱细胞化细胞外基质在软组织修复材料中的应用尚存一些缺陷，如脱细胞化细胞外基质体内环境易降解的问题，以及脱细胞处理后，其机械性能的明显下降等。
PVA是一种由聚乙酸乙烯羟基化得到的合成聚合物，广泛应用于医疗设备。多项临床研究表明PVA的生物安全性和生物相容性高，不可降解，且具有高润滑性，具有接近天然软骨组织的生物力学特性。但在颞下颌关节盘修复材料的应用中机械性能上还有显著不足。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用，原材料成本低廉，加工性能好，制备流程简单易操作，所得复合材料同时具有PVA的高润滑、高弹性，又具有脱细胞基质的高机械强度，且能够满足颞下颌关节盘自然形态要求，同时抗降解性能显著，便于推广使用；有效解决了现有颞下颌关节盘修复材料性能单一或应用缺陷等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将清洗后的猪颞下颌关节盘进行冻融循环处理，然后置于蛋白提取缓冲液中在4℃温度下浸泡12-48h，纯水冲洗，再置于0.1-0.5wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡6-48h，纯水冲洗，最后置于1-5wt％SDS水溶液中处理1-6h，纯水冲洗，冷冻干燥，得脱细胞颞下颌关节盘；
(2)将步骤(1)所得脱细胞颞下颌关节盘置于5-20wt％聚乙烯醇水溶液中，在4-60℃温度下浸泡12h-5d，然后转移至底部导热四周隔热的容器中，并以0.1-1mm/min的速度沉降于冷冻液中，得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶；
(3)将步骤(2)所得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶置于4℃预冷的浓度为0.5-2M的柠檬酸钠水溶液中盐析12-72h，纯水冲洗，然后置于0.1-0.625wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联1-7d，纯水冲洗，得定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
进一步，步骤(1)中，在-80-4℃温度区间冻融处理2-4次。
进一步，步骤(1)中，蛋白提取缓冲液为0.5-2M盐酸胍嘧啶、0.1-0.2M无水乙酸钠和0.1-0.2M乙二胺四乙酸的混合溶液，pH值为8。
进一步，蛋白提取缓冲液为1.5M盐酸胍嘧啶、0.1M无水乙酸钠和0.1M乙二胺四乙酸的混合溶液。
进一步，步骤(1)中，置于0.25wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡12h；置于5wt％SDS水溶液中处理3h。
进一步，步骤(2)中，聚乙烯醇型号为1799、2099、2399或2699型；置于10wt％聚乙烯醇水溶液中，在37℃温度下浸泡3d。
进一步，步骤(2)中，以1mm/min的速度沉降于冷冻液中，冷冻液为冰乙醇或液氮。
进一步，步骤(3)中，置于4℃预冷的浓度为1.5M的柠檬酸钠水溶液中盐析24h。
进一步，步骤(3)中，置于0.5wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联5d。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所得聚乙烯醇交联脱细胞基质复合材料内为京尼平交联(交联度为30-100％)的脱细胞基质，聚乙烯醇渗入脱细胞基质中形成网络结构，并外覆包裹于脱细胞基质表面；所用原材料成本低廉，加工性能好，制备流程简单易操作，所得复合材料同时具有PVA的高润滑、高弹性，又具有脱细胞基质的高机械强度，且能够满足颞下颌关节盘自然形态要求，同时抗降解性能显著，便于推广使用；有效解决了现有颞下颌关节盘修复材料性能单一或应用缺陷等问题。
2、本发明通过PVA渗透胶原蛋白内形成双网络结构，京尼平处理提高dECM交联度，双重手段提高材料机械力学特性；高弹性PVA的复合解决dECM脱细胞后糖胺聚糖流失带来的粘弹性下降问题，通过定向冻结PVA得到高度各向异性材料；PVA水凝胶具有高润滑和高含水特性，并且不可降解，与交联后的dECM双重手段提高材料的抗降解性。
3、本发明所得聚乙烯醇交联脱细胞基质复合材料复合体机械性能强，抗降解能力强，高润滑高含水，粘弹性能好，材料结构形态类似天然关节盘，生物相容性好，使用安全，可达到理想颞下颌关节盘替代物要求，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同型号不同浓度PVA水凝胶拉伸力学示意图；
图2为不同型号浓度PVA水溶液黏度曲线；
图3为不同型号PVA/dECM复合体拉伸、压缩力学示意图；
图4为京尼平交联前后复合材料拉伸、压缩力学示意图；
图5为复合材料植入兔皮下4周及12周大体照片及HE染色结果；
图6为体外胶原酶环境材料留存率及兔皮下植埋4周及12周的材料降解率；
图7为交联度及降解度检测结果；
图8为体外胶原酶降解实验结果。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将清洗后的猪颞下颌关节盘在-80℃/6h-4℃/6h进行3次冻融循环处理，然后置于蛋白提取缓冲液中在4℃温度下浸泡24h，纯水冲洗，再置于0.25wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡12h，纯水冲洗，最后置于5wt％SDS水溶液中处理3h，纯水冲洗，冷冻干燥，得脱细胞颞下颌关节盘；蛋白提取缓冲液为1.5M盐酸胍嘧啶、0.1M无水乙酸钠和0.1M乙二胺四乙酸的混合溶液，pH值为8；
(2)将步骤(1)所得脱细胞颞下颌关节盘置于10wt％浓度的2099型聚乙烯醇水溶液中，在37℃温度下浸泡3d，然后转移至底部导热四周隔热的容器中，并以1mm/min的速度沉降于冷冻液中，得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶；
(3)将步骤(2)所得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶置于4℃预冷的浓度为1.5M的柠檬酸钠水溶液中盐析24h，纯水冲洗，然后置于0.5wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联5d，纯水冲洗，得定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
实施例2
一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将清洗后的猪颞下颌关节盘在-80℃/6h-4℃/6h进行3次冻融循环处理，然后置于蛋白提取缓冲液中在4℃温度下浸泡12h，纯水冲洗，再置于0.2wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡12h，纯水冲洗，最后置于1wt％SDS水溶液中处理2h，纯水冲洗，冷冻干燥，得脱细胞颞下颌关节盘；蛋白提取缓冲液为1M盐酸胍嘧啶、0.1M无水乙酸钠和0.1M乙二胺四乙酸的混合溶液，pH值为8；
(2)将步骤(1)所得脱细胞颞下颌关节盘置于8wt％聚乙烯醇水溶液中，在20℃温度下浸泡2d，然后转移至底部导热四周隔热的容器中，并以1mm/min的速度沉降于冷冻液中，得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶；
(3)将步骤(2)所得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶置于4℃预冷的浓度为1M的柠檬酸钠水溶液中盐析12h，纯水冲洗，然后置于0.2wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联2d，纯水冲洗，得定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
实施例3
一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将清洗后的猪颞下颌关节盘在-80℃/6h-4℃/6h进行3次冻融循环处理，然后置于蛋白提取缓冲液中在4℃温度下浸泡36h，纯水冲洗，再置于0.5wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡36h，纯水冲洗，最后置于4wt％SDS水溶液中处理6h，纯水冲洗，冷冻干燥，得脱细胞颞下颌关节盘；蛋白提取缓冲液为2M盐酸胍嘧啶、0.2M无水乙酸钠和0.2M乙二胺四乙酸的混合溶液，pH值为8；
(2)将步骤(1)所得脱细胞颞下颌关节盘置于15wt％聚乙烯醇水溶液中，在50℃温度下浸泡4d，然后转移至底部导热四周隔热的容器中，并以1mm/min的速度沉降于冷冻液中，得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶；
(3)将步骤(2)所得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶置于4℃预冷的浓度为2M的柠檬酸钠水溶液中盐析78h，纯水冲洗，然后置于0.625wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联6d，纯水冲洗，得定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
实验例
1、将实施例1所示制备方法分别采用1799、2099、2399和2699型聚乙烯醇制备聚乙烯醇交联脱细胞基质复合材料，按照关节盘前后方向制备成长约20mm，两端宽度约8mm，中心宽度约1mm，厚约1mm的哑铃形试样条，以5mm/min的速度拉伸至试样断裂(n＝5)；取应力应变曲线的线弹性区曲线拟合计算得出弹性模量，其结果见图1。
由图1可知，聚乙烯醇聚合度越高，浓度越高，成胶后的材料拉伸模量及抗拉强度越高。
2、使用流变仪的黏度-时间模式，对不同型号浓度的PVA水溶液进行检测，制作黏度曲线，其结果见图2。图2中，最右侧从上到下依次为2399-10％-3、2099-10％-1、2699-5％-4和2399-5％-2。
由图2可知，随着聚合度和浓度的提升，PVA水溶液粘度也随之升高，不利于材料灌注。因此优选出2099型10％PVA水溶液用于下游实验。
3、按照实验1的方式制备dECM/PVA复合体样本，并对其拉伸力学性能进行检测，其结果见图3。图3中，30％处从上到下依次为2399-5％PVA/dECM、2099-10％ PVA/dECM、2699-5％ PVA/dECM、新鲜关节盘、1799-5％ PVA/dECM和2099-10％ PVA/dECM。
由图3可知，脱细胞处理后dECM的抗拉强度显著下降，随着PVA与dECM的复合，材料的抗拉强度明显提升，超越了新鲜关节盘水平。
4、将复合体制备成直径6mm，厚约2mm的圆柱形试样，以2mm/min的速度压缩至60％应变(n＝5)；取应力应变曲线的线弹性区曲线拟合计算得出弹性模量，其结果见图4。图4中，PVA/dECM压缩应力应变曲线中，从上到下依次为2399PVA/dECM、Fresh disc、2099PVA/dECM和dECM。
由图4可知，脱细胞处理后dECM的压缩模量显著下降，随着PVA与dECM的复合，材料的压缩模量也得到回升。
5、京尼平交联前后dECM/PVA复合体的拉伸、压缩力学性能检测；京尼平交联复合体后，按照1、4方式制备样本进行检测，其结果见图5。图5中，拉伸应力应变曲线中，最高峰从上到下依次为P-G-dECM、G-dECM、P-dECM、Fresh和dECM；压缩应力应变曲线中，从上到下依次为P-G-dECM、Fresh、G-dECM、P-dECM和dECM。
由图5可知，京尼平对复合材料进行交联后，复合材料的抗拉强度和拉伸模量、压缩模量再次提升，超过新鲜关节盘水平，具备高机械强度。
6、使用dECM、PVA/dECM、Genipin-dECM、Genipin-PVA-dECM四个组作为实验组，用于探究PVA物理包裹和京尼平交联对于材料体内降解性能的影响。选用新西兰大白兔6只(体重2-2.5kg，雌性)，术前禁食8小时，戊巴比妥钠麻醉后于兔背部制备长约5cm的皮肤切开，钝性分离皮肤，显露皮下筋膜组织。将材料使用3-0丝线缝合固位于皮下筋膜上，共缝2针。聚维酮碘消毒术区后，缝合关闭创口。术后使用青霉素钠80mg/只肌肉注射3天预防感染。4周，12周后收样，进行HE切片染色及降解率检测，其结果见图6。
由图6可知，兔皮下植埋4周及12周大体照片显示，皮下植埋4周后，dECM即出现形态的崩解，说明已开始发生材料降解，12周后，dECM完全降解，材料消失。而PVA/dECM、G/dECM及P-G-dECM组材料保持了大体形态的完好。HE染色显示4周时VA/dECM、G/dECM及P-G-dECM组材料均未出现明显降解。12周时，PVA/dECM组四周出现胶原纤维的断裂，消失，说明出现了低程度的降解，G/dECM组出现了细胞的长入，以及少量新生胶原纤维的产生。P-G-dECM组既未观察到明显的胶原纤维断裂，又无细胞入侵，体现出最佳的抗降解效果。
7、交联度检测：
交联程度被认为是交联样品中的结合氨基与脱细胞盘中的游离氨基的比值。采用茚三酮测定法测定。样本首先被冷冻干燥并称重。将重为15-20毫克的单独样品用在1ml茚三酮溶液加热至100℃，20min；冷却至室温后，每个样品用4ml 50％异丙醇稀释。然后以甘氨酸为标准，在570nm处从溶液的光吸光度中检测游离氨基的数量。
交联程度计算如下：
Degree of degredation＝M0-Mt/M0×100％
交联程度，其中M0为非交联天然软骨中游离氨基的数量，Mt为交联软骨中剩余的氨基的数量，均归一化到组织干重。
降解度检测：
茚三酮检测酶解后样品中游离氨基的数量，相比天然软骨中的游离氨基，样品组游离氨基的增量代表降解水平。
降解率的计算如下：
Degree of degredation＝MT-M0/M0×100％
其结果见图7；图7中从左到右依次为dECM、PVA-dECM、Genipin-dECM和P-G-dECM。
由图7可知，皮下植埋12W后，dECM完全降解，PVA-dECM组降解率为45.7％，较4w时(23％)降解进一步加重。说明PVA无法阻隔体内环境酶对材料的作用。Genipin-dECM原始交联度约80％，皮下植埋12后，交联度发生下降，降至60％，与4w无统计学差异，说明京尼平交联样本在植埋早期受到酶作用交联度下降，随着时间推移逐渐稳定。P-G-dECM皮下植埋后交联度较之前轻微下降(76％)，与植埋前无统计学差异，证明皮下植埋后未发生明显降解。
8、用猪颞下颌关节盘脱细胞基质作为胶原酶抗性试验的阳性对照。
Figure BDA0003999559520000091
盘(每个时间点每组n＝5)冷冻干燥，使用精确至0.01mg的分析天平称重；然后分别在1ml 0.1％wt/vol 1型胶原酶(300u/mg)和含有1％抗生素-抗真菌溶液的PBS中37℃摇晃搅拌孵育，溶液每48小时更换一次，在孵育的第1，3，5，7，10，15，30天收集样本，用蒸馏水洗涤两次，每次60分钟，冷冻干燥后称重；最终重量除以原始重量，以确定消化后保留的质量百分比，其结果见图8。图8中，从上到下依次为G-dECM、PVA/dECM、dECM和FRESH。
由图8可知，在体外胶原酶环境中，新鲜关节盘及dECM组在酶解7天后已完全降解。PVA/dECM组在酶解14天后质量接近恒定(剩余质量为不可降解的PVA)，即在14天后复合体中dECM完全降解。较前两组而言，延长了约1倍的降解时间。京尼平交联组在酶解30天后，剩余质量仍然维持在90％以上，证明京尼平交联后可极大的提升dECM的抗降解能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将清洗后的猪颞下颌关节盘进行冻融循环处理，然后置于蛋白提取缓冲液中在4℃温度下浸泡12-48h，纯水冲洗，再置于0.1-0.5wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡6-48h，纯水冲洗，最后置于1-5wt％SDS水溶液中处理1-6h，纯水冲洗，冷冻干燥，得脱细胞颞下颌关节盘；
(2)将步骤(1)所得脱细胞颞下颌关节盘置于5-20wt％聚乙烯醇水溶液中，在4-60℃温度下浸泡12h-5d，然后转移至底部导热四周隔热的容器中，并以0.1-1mm/min的速度沉降于冷冻液中，得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶；
(3)将步骤(2)所得定向冷冻的聚乙烯醇/脱细胞基质水凝胶置于4℃预冷的浓度为0.5-2M的柠檬酸钠水溶液中盐析12-72h，纯水冲洗，然后置于0.1-0.625wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联1-7d，纯水冲洗，得定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
2.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在-80-4℃温度区间冻融处理2-4次。
3.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白提取缓冲液为0.5-2M盐酸胍嘧啶、0.1-0.2M无水乙酸钠和0.1-0.2M乙二胺四乙酸的混合溶液，pH值为8。
4.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，置于0.25wt％的胰蛋白酶溶液中在37℃温度下浸泡12h；置于5wt％SDS水溶液中处理3h。
5.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚乙烯醇型号为1799、2099、2399或2699型；置于10wt％聚乙烯醇水溶液中，在37℃温度下浸泡3d。
6.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以1mm/min的速度沉降于冷冻液中，冷冻液为冰乙醇或液氮。
7.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，置于4℃预冷的浓度为1.5M的柠檬酸钠水溶液中盐析24h。
8.如权利要求1所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，置于0.5wt％京尼平水溶液中，在37℃温度下交联5d。
9.权利要求1-8任一项所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料的制备方法制得的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料。
10.权利要求9所述的定向冷冻聚乙烯醇/交联脱细胞基质复合材料在制备颞下颌关节盘修复材料中的应用。
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CN116603106A (zh) * 2023-06-05 2023-08-18 重庆生物智能制造研究院 猪腹膜脱细胞基质海绵支架及其制备方法

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