CN116135211A - 瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用 - Google Patents

瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用。本申请提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖在预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病药品中的应用。本申请首次提出瓜蒌薤白药对粗多糖可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，减少主动脉整体斑块、减少主动脉根部斑块、降低血脂水平，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。另外，与西药相比，本申请瓜蒌薤白药对粗多糖抗动脉粥样硬化，长期服用具有安全性强，不良反应小的特点，抑制动脉粥样硬化有关的慢性疾病。与瓜蒌薤白药对相比，本申请实施例中的瓜蒌薤白药对粗多糖更容易被患者接受，且服用剂量更小。

Description

瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用。
背景技术
冠心病，即冠状动脉粥样硬化，由于冠状动脉血管发生血管粥样硬化导致血管狭窄或堵塞引起心肌细胞缺血或缺氧。临床上主要表现为胸痛胸闷、呼吸困难等症，严重时甚至引发晕厥休克、死亡，现已成为威胁人类健康的“头号杀手”。随着人们生活水平的逐步提高，以冠心病为主的心血管疾病面临着快速增长的严峻局面，同时伴随社会环境恶化、生活压力增加以及饮食结构改变而呈现患者日益年轻化。冠心病作为一种高发病率和高死亡率的慢性疾病，其治疗给个人及社会带来了巨大的经济负担，成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。
冠心病的现代医学治疗手段主要是药物治疗、经皮冠脉介入和冠脉搭桥手术，这些手段虽在算时间能够达到很好的治疗效果，但对于冠心病这类慢性复杂疾病来说只能治标不治本，长期使用会出现各种各样的副作用，比如血管再狭窄、药物依耐性、术后焦虑等，不仅无法阻止病情进一步发展，并且很难达到彻底治愈的效果。
发明内容
针对现有技术本申请的目的在于提供一种瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用，旨在解决现有药物治疗长期使用会出现各种各样的副作用的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
本申请第一方面提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖在预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病药品中的应用。
本申请的瓜蒌薤白药对粗多糖长期服用具有安全性强，不良反应小的特点，本申请首次提出瓜蒌薤白药对中的粗多糖为药对中缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平的主要贡献成分，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。与西药相比，例如辛伐他汀，本申请实施例瓜蒌薤白药对粗多糖抗动脉粥样硬化，长期服用具有安全性强，不良反应小的特点，抑制动脉粥样硬化有关的慢性疾病。与瓜蒌薤白药对全成分相比，本申请中的瓜蒌薤白药对粗多糖更容易被患者接受，且服用剂量更小，约为瓜蒌薤白药对服用剂量的24.30％、毒副作用小。
第二方面，本申请提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，包括如下步骤：
对瓜蒌薤白药对进行多糖提取处理，得到多糖水提液；
对多糖水提液进行醇沉处理，得到含有瓜蒌薤白药对粗多糖的沉淀物。
本申请中提供的提取方法，从瓜蒌薤白药对中提取粗多糖，相较于单体化学药物的合成，生产工艺更加简单，且来源中药及天然药物，提取原料具有安全性、成本低和环保特点，具有广泛的应用潜力和良好的开发前景。另外，通过对瓜蒌薤白药对粗多糖提取，以简化复方成分，大大降低了服用剂量，改善现有瓜蒌薤白系列经方口感差及临床使用实用性较差的现状。本申请实施例提取方法得到的瓜蒌薤白药对粗多糖可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。
第三方面，本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖，包括上述文中提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
本申请实施例粗多糖从瓜蒌薤白药对中提取，以简化复方成分，大大降低了服用剂量，改善现有瓜蒌薤白系列经方口感差及临床使用实用性较差的现状。本申请实施例瓜蒌薤白药对粗多糖可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平(TC,TG,LDL-C)，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。
第四方面，本申请实施例提供了一种口服剂，包括上述文中瓜蒌薤白药对粗多糖。
正是由于本申请提供的口服剂，包括上述文中瓜蒌薤白药对粗多糖。因此，本申请提供的口服剂可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平。此外，本申请提供的口服剂更容易被患者接受，且相比瓜蒌薤白药对服用剂量更小、毒副作用小。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的瓜蒌薤白药对粗多糖的提取工艺流程图；
图2为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对组(GLXB)和瓜蒌薤白药对粗多糖组(GLXBP)不同处理的Thp-1泡沫化细胞染色图
图3为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对组(GLXB)和瓜蒌薤白药对粗多糖组(GLXBP)不同处理的Thp-1泡沫化细胞染色后OD520水平柱状图；
图4为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对组(GLXB)和瓜蒌薤白药对粗多糖组(GLXBP)不同处理的Thp-1泡沫化细胞TC含量水平柱状图；
图5为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠的体重变化图；
图6为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠的主动脉整体油红O染色图；
图7为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠的主动脉整体斑块水平柱状图；
图8为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠的主动脉根部油红O染色图；
图9为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠的主动脉根部斑块水平柱状图；
图10为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠血清中总甘油三酯(TG)水平柱状图；
图11为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠血清中总胆固醇(TC)水平柱状图；
图12为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平柱状图；
图13为本申请实施例提供的Control组、Model组、SV组、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(GLXBP-L)和瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(GLXBP-H)小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平柱状图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b，或c中得至少一项(个)”，或，“a,b，和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施条例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施条例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施条例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施条例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
瓜蒌薤白药对最早出自于东汉医圣张仲景提出治疗“胸痹心痛”的三个经典名方中，包括：瓜蒌薤白白酒汤、瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤，均含有瓜蒌薤白药对。胸痹心痛，即对应现代医学中的冠心病。这三个经方是中医“宣痹通阳，痰浊论治”治疗胸痹心痛的基础经方，对中医治疗胸痹之病有着重大贡献，历经了近两千年的临床考验。目前临床上通过煎煮制得汤剂服用，煎煮形式实用性差，而且中药汤剂口感差，导致患者长期服用的接受度差。因此，有必要解决包含瓜蒌薤白药对的经方口感差及临床使用实用性较差的现状。
第一方面，本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖在预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病药品中的应用。
本申请实施例为了改善现有药物治疗的副作用，本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖在预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病药品中的应用。一方面，本申请实施例的瓜蒌薤白药对粗多糖长期服用具有安全性强，不良反应小的特点，本申请实施例首次提出瓜蒌薤白药对粗多糖可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平(TC、TG、LDL-C)，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。另一方面，与西药相比，例如辛伐他汀，本申请实施例瓜蒌薤白药对粗多糖抗动脉粥样硬化，长期服用具有安全性强，不良反应小的特点，抑制动脉粥样硬化有关的慢性疾病。与瓜蒌薤白药对相比，本申请实施例中的瓜蒌薤白药对粗多糖更容易被患者接受，且服用剂量更小，约为瓜蒌薤白药对服用剂量的24.30％、毒副作用小，改善了现有瓜蒌薤白系列经方口感差及临床使用实用性较差的现状。
在一些实施例中，按60kg/人计，粗多糖的有效剂量为每天18～36g/人，如每天18g/人、每天27g/人、每天36g/人等，其中g为瓜蒌薤白药对粗多糖的给药重量，kg为人体体重，与瓜蒌薤白药对相比可减少服用剂量，以满足实际用药情况。
在一些实施例中，按小鼠计，粗多糖有效剂量为每天3.6～7.2g/kg，如3.6g/kg、7.2g/kg等，其中g为瓜蒌薤白药对粗多糖的给药重量，kg为小鼠体重，与瓜蒌薤白药对相比可减少服用剂量，以满足实际用药情况。
在一些实施例中，通过发明人研究表明，瓜蒌薤白药对粗多糖为药对中发挥预防和/或治疗由巨噬细胞泡沫化和/或胆固醇升高引起的动脉粥样硬化疾病的主要贡献成分。具体的，减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。
第二方面，本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，请参考图1所示，包括如下步骤：
步骤S10：对瓜蒌薤白药对进行多糖提取处理，得到多糖水提液；
步骤S20：对多糖水提液进行醇沉处理，得到含有瓜蒌薤白药对粗多糖的沉淀物。
本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，操作简单，提取效率高。首先，通过对瓜蒌薤白药对进行加热提取处理，得到含有的瓜蒌薤白药对粗多糖的水提液，但瓜蒌薤白药对粗多糖的浓度低，其使用不符合实际使用要求，本申请实施例中的瓜蒌薤白药对粗多糖制备工艺流程相较于单体化学药物，更加简单，且来源中药及天然药物，提取原料具有安全性、成本低、更环保，具有广泛的应用潜力和良好的开发前景。然后，对多糖提液进行浓缩处理、醇沉处理以提高瓜蒌薤白药对粗多糖的浓度，得到含有瓜蒌薤白药对粗多糖的沉淀物，且其浓度较高。
步骤S10：
步骤S10中，实施例中，瓜蒌薤白药对包括全瓜蒌和薤白，且全瓜蒌和薤白质量比为1:1～1.5:1，如1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1等，通过调整全瓜蒌和薤白的质量比，能够调整瓜蒌薤白药对粗多糖的成分，有利于提高预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病的效果。具体的，本申请实施例提供的包含瓜蒌薤白药对的三个系列经方均能提取出瓜蒌薤白药对粗多糖，其中，瓜蒌薤白药对的三个系列经方分别是瓜蒌薤白白酒汤、瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤。
在一些实施例中，在多糖提取处理的步骤之前，还包括对瓜蒌薤白药对进行脱脂处理的步骤。
在一些实施例中，脱脂处理的方法包括如下步骤：
用乙醇对瓜蒌薤白药对进行第一热回流处理。
本申请实施例提供的脱脂处理方法中乙醇能够溶解瓜蒌薤白药对的脂类，且结合回流处理的步骤，可得到脂含量较低的滤渣。当然，还可以对瓜蒌薤白药对进行破碎的处理，以提高瓜蒌薤白药对的提取率。
在一些实施例中，第一热回流处理的温度为75～80℃，如75℃、77℃、80℃等，便于提高对瓜蒌薤白药对的脱脂率。
在一些实施例中，第一热回流处理的次数为2～3次，如2次、3次等，每次回流时间为1～2h，如1h、1.5h、2h等，以提高脱脂的效果。
在一些实施例中，乙醇的浓度为95％，瓜蒌薤白药对与乙醇的固液比为1g:10mL～1g:20mL，如1g:10mL、1g:15mL、1g:20mL等，可提高对瓜蒌薤白药对的脂类溶解率，提高脱脂效果。
步骤S20：
步骤S20中，实施例中，多糖提取处理包括如下步骤：
用水对瓜蒌薤白药对进行第二热回流处理，能使瓜蒌薤白药对粗多糖溶于水中。
在一些实施例中，第二热回流处理的温度为95～100℃，如95℃、97℃、100℃等，便于提高对瓜蒌薤白药对粗多糖的提取率。
在一些实施例中，第二热回流处理的次数为2～3次，如2次、3次等，每次回流时间为1～2h，如1h、1.5h、2h等，以提高提取效果。
在一些实施例中，沉淀物中瓜蒌薤白药对粗多糖的浓度为0.5～1g/mL，如0.5g/mL、0.7g/mL、0.9g/mL、1g/mL等，沉淀物中具有较高浓度的瓜蒌薤白药对粗多糖，后续如果将其制成药剂，与瓜蒌薤白药对相比，能够减少药剂的使用量。
在一些实施例中，醇沉处理中，乙醇的终浓度为78～82％，如78％、80％、82％等，能够降低沉淀物中的杂质量，同时除去沉淀物中醇溶组分。
第三方面，本申请实施例提供了一种瓜蒌薤白药对粗多糖，包括上述文中提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
本申请实施例粗多糖从瓜蒌薤白药对中提取，以简化复方成分，大大降低了服用剂量，改善现有瓜蒌薤白系列经方口感差及临床使用实用性较差的现状。本申请实施例瓜蒌薤白药对粗多糖可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平(TC、TG、LDL-C)，可通过降低血脂活性起到保护血管的作用。
在一些实施例中，以瓜蒌薤白药对粗多糖的质量为100wt％计，总糖含量为65.88～69.38wt％，蛋白质含量为10.25～12.09wt％，还原糖含量为4.43～6.48wt％，糖醛酸含量为9.28～11.17wt％。
第四方面，本申请实施例提供了一种口服剂，包括上述文中瓜蒌薤白药对粗多糖。
正是由于本申请实施例提供的口服剂，包括上述文中瓜蒌薤白药对粗多糖。因此，本申请实施例提供的口服剂可缓解动脉粥样硬化相关的生理指标及组织病理学变化，包括减少主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、降低血脂水平。此外，本申请实施例提供的口服剂更容易被患者接受，且相比瓜蒌薤白药对服用剂量更小(约为原药对服用剂量的24.30％)、毒副作用小。
在一些实施例中，本申请实施例中瓜蒌薤白药对粗多糖可制作成多种可服用的口服剂，例如口服剂为片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸中的任一种。
为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例瓜蒌薤白药对粗多糖以及其提取方法、应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。其中，以下实施例所用的原料或试剂均为市售或自制。
以下实施例所用的瓜蒌(植物基源：Trichosanthes kirilowii Maxim.)和薤白(植物基源：Allium macrostemon Bge.)中药材购自津村制药有限公司。
以下实施所用的C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠的实验动物生产许可证号为：SCXK(京)2019-0008，均购自北京维通利华实验动物中心。高脂饲料为“西方饮食饲料”，含21％脂肪、0.15％胆固醇、15.5％蛋白质，购自广东省医学实验动物中心。
1瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法
实施例A1
本实施例提供一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，包括如下步骤：
步骤S10(预脱脂处理)：全瓜蒌90g、薤白60g，剪碎，以95％乙醇按固液比1g:10mL(w/v)加热回流脱脂3次，每次2h，过滤得预脱脂滤渣；
步骤S20(沸水提取)：将滤渣按料液比1g:10mL(w/v)沸水提取3次，每次2h，过滤得多糖提液(共约4200mL)；
步骤S30(醇沉)：对多糖水提液进行旋转蒸发浓缩至约300mL，按乙醇终浓度80％进行醇沉，4℃静置过夜，得到含有瓜蒌薤白药对粗多糖的沉淀物。
步骤S40(冻干)：将沉淀物采用冷冻干燥成冻干粉后，即为瓜蒌薤白药对粗多糖，避光常温干燥条件下保存。
实施例A2
本实施例提供一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，包括如下步骤：
步骤S20(沸水提取)：全瓜蒌90g、薤白60g，剪碎，以沸水按固液比1g:10mL(w/v)，沸水提取3次，每次2h，过滤得瓜蒌薤白药对水提液(共约4200mL)；
步骤S30(醇沉)：瓜蒌薤白药对水提液进行旋转蒸发浓缩至约300mL，按乙醇终浓度80％进行醇沉。
步骤S40(冻干)：4℃静置过夜，沉淀部分采用冷冻干燥成冻干粉后，即为瓜蒌薤白药对粗多糖，避光常温干燥条件下保存。
2瓜蒌薤白药对粗多糖
实施例B1
按照实施例A1的步骤S10至步骤S40提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
实施例B2
按照实施例A1的步骤S10至步骤S40提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
实施例B3
按照实施例A1的步骤S10至步骤S40提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
对比例B1
阳性药辛伐他汀片(SV，10mg/片)
对比例B2
瓜蒌薤白药对
性能测试
1.分析瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率
测量实施例A1和实施例A2中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率，且重复实施例A1步骤S10至步骤S40和实施例A2中的步骤S20至步骤S40，取三次重复试验的的瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率取平均值。然后，用实施例A1中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率取平均值与对比例A2中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率相比，其结果请参考表1所示。
表1预脱脂与不脱脂对瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率比较(n＝3)
Figure BDA0004114019700000111
Figure BDA0004114019700000121
从表1中可看出，比较了脱脂(三次重复实施例A1中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率取平均值)与不脱脂(三次重复实施例A2中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率取平均值)对瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率，脱脂有利于瓜蒌薤白药对粗多糖的提取，可提高瓜蒌薤白药对粗多糖的提取效率，进而醇沉前脱脂有利于后续瓜蒌薤白药对粗多糖的提取。
2.对瓜蒌薤白药对粗多糖进行成分分析
测量实施例B1至实施例B3是对重复三次实施例A1中的瓜蒌薤白药对粗多糖组分的分析结果，其结果请参考表2所示。
表2瓜蒌薤白药对粗多糖中总糖、蛋白质、还原糖、糖醛酸含量测定结果
Figure BDA0004114019700000122
从表2中可看出，实施例B1至实施例B3中瓜蒌薤白药对粗多糖的提取率均值为24.30％，粗多糖中的总糖含量均值为67.70％，蛋白质含量均值为11.15％，还原糖含量均值为5.27％，糖醛酸含量均值为10.43％。
3.分析瓜蒌薤白药对粗多糖对巨噬细胞泡沫化的影响
分析实施例B1提取的瓜蒌薤白药对粗多糖对巨噬细胞泡沫化的影响
(1)细胞来源与培养条件：
Thp-1单核细胞来源于美国ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA，USA)，细胞采用RPMI 1640培养液加入1％P/S(100unit/ml青霉素和100mg/ml链霉素)、10％FBS(胎牛血清)和1mM丙酮酸钠溶液于5％CO2，37℃，湿度95％的条件下培养。
(2)细胞给药溶液配制：
ox-LDL(2.0mg/mL)来源于广州奕元生物技术有限公司。实验中ox-LDL造模剂量为50μg/mL，与不含血清的RPMI 1640培养液混合，配制得到模型组给药培养液(简称Model组)。
对照组中为不添加干预药物，不含ox-LDL，不含血清的RP1640培养液(简称Control组)。
阳性药辛伐他汀片(10mg/片，对比例B1中所含药品)生产厂家为广东彼迪药业有限公司，去包衣粉碎。阳性药组给药溶液为10μM辛伐他汀，50μg/mL ox-LDL不含血清的RPMI1640培养液(简称SV组)。
GLXBP药对多糖组给药溶液为2mg/mL瓜蒌薤白药对粗多糖提取物(收率24.30％)，50μg/mL ox-LDL不含血清的RPMI 1640培养液(简称GLXBP组)。
GLXB药对组给药浓度为2.8mg/ml瓜蒌薤白药对提取物(收率34.30％)，50μg/mLox-LDL不含血清的RPMI 1640培养液(简称GLXB组)。
(3)实验方法
①细胞油红O染色及吸光度测定：
Thp-1单核细胞以100×104个/孔接种于12孔板中，每孔加入含200nM PMA的2mL培养液，孵育并诱导细胞贴壁。24h后，弃去培养液，换成各组别药物培养液，再次孵育24h。平行3次。
配制工作液：饱和油红O染液(G1015)生产厂家为武汉赛维尔生物科技有限公司。临用前，6mL饱和油红O染液与4mL蒸馏水充分混合均匀，用定性滤纸过滤2次，滤液置于65℃避光水浴30min，自然冷却后得到油红O工作液，现配现用。
细胞准备：吸弃细胞培养液，向孔板边缘缓慢加入PBS清洗细胞2次。每孔加入2mL4％多聚甲醛固定液室温固定30min，然后PBS清洗2次。
细胞染色：每孔加入0.5mL 60％异丙醇覆盖细胞20s，吸弃60％异丙醇，稍微晾干水分。每孔加入0.5mL油红O工作液覆盖细胞，37℃避光染色30min。去除染色液，加入60％异丙醇分化20s，纯水洗3次，每次5min。最后每孔加入0.3mL纯水，采集图像。
吸光度测定：每孔加入0.4mL 60％异丙醇，200rpm振摇3min，测定OD 520。
②细胞总胆固醇酶法测定：
Thp-1单核细胞以300×104个/孔接种于6孔板中，每孔加入含200nM PMA的2mL培养液，孵育并诱导细胞贴壁。24h后，弃去培养液，换成各组别药物的培养液，再次孵育24h。
细胞用PBS清洗2次，轻柔吹打，而后用细胞刮板刮下细胞，将细胞悬液离心，弃上清液，取细胞沉淀。加入50μL裂解液，震荡混匀，静置10min。取10μL上清液用于BCA法测定蛋白质含量，其余上清液70℃加热10min，然后室温离心(2000rpm，5min)，取上清液用于酶法测定。
细胞总胆固醇酶法测定试剂盒(E1015)生产厂家为北京普利莱基因技术有限公司。按R1:R2＝4:1比例配制工作液(现配现用)，将5mM胆固醇标准品用无水乙醇稀释为625、312.5、156、78、39μM，用于标准曲线建立。
向96孔板中各孔分别加入190μL工作液，然后分别加入10μL标准品或待测样品，室温反应20min后测定OD550。以每mg蛋白浓度校正胆固醇含量。
(4)实验结果
请参考图2至图4所示，图3、图4中*表示组间有统计学差异，**表示组间差异显著,***表示组间差异极其显著，瓜蒌薤白药对粗多糖组能够显著降低ox-LDL诱导Thp-1单核巨噬细胞泡沫化的形成(p<0.05)，并且与瓜蒌薤白药对组(SV)无显著性差异。瓜蒌薤白药对粗多糖组能够显著抑制ox-LDL诱导Thp-1单核巨噬细胞中总胆固醇的含量(p<0.05)，并且与瓜蒌薤白药对组无显著性差异。
4.分析瓜蒌薤白药对粗多糖对改善ApoE-/-模型小鼠的动脉粥样硬化的影响
分析实施例A1提取的瓜蒌薤白药对粗多糖对改善ApoE-/-模型小鼠的动脉粥样硬化的影响。
(1)实验动物：
选取8周健康雄性SPF级ApoE-/-小鼠18只和C57BL/6J小鼠6只，体重在(25±1.0)g之间。于清洁级动物房，室温(22±2)℃，相对湿度为30％-40％，采用人工控制室内照明，保持12h光照和黑暗交替循环。适应性喂养一周，C57BL/6J小鼠作为正常对照组(简称Control组)、ApoE-/-小鼠称量体重后进行随机分组为模型组(简称Model组)、阳性药辛伐他汀片(简称SV组)、瓜蒌薤白药对粗多糖低剂量组(简称GLXBP-L组)、瓜蒌薤白药对粗多糖高剂量组(简称GLXBP-H组)和瓜蒌薤白药对组(简称GLXB组)。
(2)造模及给药：
ApoE-/-小鼠均给予高脂饲料12周，C57BL/6J小鼠给予普通饮食喂养12周。GLXBP-L组灌胃剂量为3.6g/kg/day(按提取物冻干粉剂，即原药材15g/kg/day)，GLXBP-H组灌胃剂量为7.2g/kg/day(按提取物冻干粉剂，即原药材30g/kg/day)，GLXB组灌胃为10.2g/kg/day(按提取物冻干粉剂，即原药材60g/kg/day)，Control组和Model组灌胃等体积生理盐水。每周称量各组小鼠重量并记录。连续灌胃给药12周。
(3)生物样本采集及前处理：
血清样本：末次干预给药后，各组小鼠禁食不禁水12h后，用1％戊巴比妥钠麻醉后，采用眼球摘除法，从眼眶静脉丛采集血液样本，置于血清采集管中常温静置1h后，1500rpm 4℃离心15min，取上清液即得血清。采用罗氏全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。
主动脉整体和根部：各组小鼠取血后，腹部朝上固定于泡沫板上，打开腹腔和胸腔，小心剥离心脏和主动脉，分离主动脉直至髂主动脉分支处，小心剥离外周的脂肪，取出主动脉用预冷的生理盐水润洗干净，并用4％多聚甲醛固定得到主动脉整体部位，油红染色后，用体视显微镜拍照。以斑块占总血管面积的百分比计算动脉粥样硬化的相对严重程度。将连有部分心脏(用以定位)的胸段主动脉在4％多聚甲醛中固定得到主动脉根部位，OCT包埋后，从主动脉窦顶部开始，每隔切一张冰冻切片厚10μm，挑选斑块形态完好的主动脉根部冰冻切片，油红O染色，采集图像观察斑块占主动脉根部横切面的百分比，计算动脉粥样硬化的相对严重程度。
(4)实验结果
请参考图5所示，相比Model组，GLXB、GLXBP-L和GLXBP-H组从第2周开始，能够显著降低ApoE-/-小鼠的体重，且与Control组相比，未表现出显著性差异，且GLXB和GLXBP-H组无显著性差异。请参考图6和图7所示，图7、图9、图10、图11、图13中#表示与Control组比较有统计学差异，##表示与Control组比较有显著性差异，###表示与Model组比较差异极其显著；*表示与Model组比较有统计学差异，**表示与Model组比较有显著性差异,***表示与Model组比较差异极其显著。相比Model组，GLXB、GLXBP-L和GLXBP-H组能够显著减少主动脉整体斑块(p<0.01,p<0.001)，且GLXB和GLXBP-H组无显著性差异(p＝0.23)。请参考图8和图9所示，相比Model组，不同剂量组的瓜蒌薤白药对粗多糖和药对组能够不同程度减少主动脉根部斑块，其中GLXBP-H组可以显著降低主动脉斑块面积(p<0.05)，且GLXB和GLXBP-H组无显著性差异(p＝0.92)。请参考图10至图13所示，不同剂量组的瓜蒌薤白药对粗多糖和药对组能够不同程度地降低ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，并且GLXBP-H组的改善效果具有显著性差异(p<0.05)，GLXB和GLXBP-H组无显著性差异(p＝0.23)。
综上所述，本申请实施证实了瓜蒌薤白药对粗多糖可以缓解动脉粥样硬化相关的病理组织形态及生理指标变化，包括体重增加、主动脉整体斑块、主动脉根部斑块、TC、TG、LDL-C含量。与瓜蒌薤白药对组比较，瓜蒌薤白药对粗多糖对于改善动脉粥样硬化的药效没有显著性差异，说明瓜蒌薤白药对粗多糖部位为瓜蒌薤白药对发挥治疗动脉粥样硬化的药效成分。此外，瓜蒌薤白药对粗多糖对于这类动脉粥样硬化等慢性病患者来说，服用剂量低于药对整体提取物，并且多糖类成分相比于小分子化学成分更容易被患者接受，长期服用毒副作用小。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.瓜蒌薤白药对粗多糖在预防和/或治疗动脉粥样硬化疾病药品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，按60kg/人计，所述粗多糖的有效剂量为每天18～36g/人；
或/和，按小鼠计，所述粗多糖有效剂量为每天3.6～7.2g/kg。
3.一种瓜蒌薤白药对粗多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
对瓜蒌薤白药对进行多糖提取处理，得到多糖水提液；
对所述多糖水提液进行醇沉处理，得到含有瓜蒌薤白药对粗多糖的沉淀物。
4.如权利要求3所述提取方法，其特征在于，在所述多糖提取处理的步骤之前，还包括对所述瓜蒌薤白药对进行脱脂处理的步骤；
或/和，所述多糖提取处理包括如下步骤：
用水对所述瓜蒌薤白药对进行第二热回流处理；
或/和，还包括对所述沉淀物进行冻干处理；
或/和，所述瓜蒌薤白药对包括全瓜蒌和薤白的混合物，所述全瓜蒌和薤白质量比为1.5:1.5～1.5:1。
5.如权利要求4所述提取方法，其特征在于，所述脱脂处理的方法包括如下步骤：
用乙醇对所述瓜蒌薤白药对进行第一热回流处理。
6.如权利要求5所述提取方法，其特征在于，所述第一热回流处理的温度为75～80℃；
所述乙醇的浓度为95％，所述瓜蒌薤白药对与乙醇的固液比为1g:10mL～1g:20mL。
7.如权利要求4所述提取方法，其特征在于，所述第二热回流处理的温度为95～100℃。
8.如权利要求4所述提取方法，其特征在于，所述沉淀物中瓜蒌薤白药对粗多糖的浓度为0.5～1.0g/mL；
或/和，所述醇沉处理中，醇的终浓度为78～82％。
9.一种瓜蒌薤白药对粗多糖，其特征在于，包括如权利要求3-8任一项所述提取方法制备得到的瓜蒌薤白药对粗多糖。
10.一种口服剂，其特征在于，包括权利要求9所述瓜蒌薤白药对粗多糖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103623189A (zh) * 2012-08-28 2014-03-12 吴宗贵 一种消退和逆转动脉粥样硬化斑块的复方中药制剂及其制备方法

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