CN116124854A - 一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台，提供了该平台的制备和检测方法。具体涉及基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备和基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法。首次利用葫芦[7]脲在电化学发光生长激素传感平台表面选择性识别并捕获生长激素，并利用基于主客体策略改性金纳米簇提高了生长激素传感平台的稳定性和灵敏度。本发明属于电化学发光检测技术领域。
Description
技术领域
在本发明涉及一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台，提供了该平台的制备和检测方法。具体涉及基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备及基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法。本发明属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
生长激素是脑垂体所分泌的一种重要的激素，它可以促进骨骼、内脏和全身的生长，促进蛋白质合成，是生物研究中非常重要的物质。因此，准确、快速的对生长激素进行测定有着非常重要的意义。近年来，电化学发光传感平台因其分析速度快、灵敏度高、线性范围宽等优点在生长激素检测中得到了广泛应用。基于此，本发明设计了一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台用于人生长激素的检测。在本发明中，首次把葫芦[7]脲对生长激素的特异性识别引入到电化学发光领域。在传统的电化学发光生长激素传感平台中，捕获生长激素的靶向抗体是电化学发光生长激素传感平台的关键组成部分。因此，靶向抗体在传感平台固相表面的密度、空间构象、生长激素结合位点的方向等因素对靶向抗体生物活性具有重要影响，从而对生长激素分析的灵敏度和准确性影响非常大。所以，利用葫芦[7]脲对生长激素进行靶向识别为构建新型电化学发光生长激素传感平台提供了一种可靠的方法。葫芦[7]脲由七个由亚甲基连接的甘脲基组成，在氢键效应、离子偶极子、疏水作用等多种非共价键的作用下，会与特定客体发生结合从而形成稳定的主客体络合物。蛋白质的末端序列具有高度特异性，生长激素的N端有一个罕见的苯丙氨酸残基，可以特异的与葫芦[7]脲进行结合。经实验证明，葫芦[7]脲可以在电化学发光传感平台的电极表面选择性的识别并捕获生长激素。此外，将葫芦[7]脲固定于传感平台表面后，也会增强电极表面电子的传输。这不仅避免了复杂的实验操作，降低了对操作者和操作环境的严苛要求，且减少了传感平台的制备成本。另外我们利用主客体策略将巯基乙酸和苯丙氨酸保护的金纳米簇进行改性。葫芦[7]脲具有优异的刚性和超分子识别能力，可以作为“智能分子枷锁”识别和限制金纳米簇表面苯丙氨酸配体的振动和相互作用，有效地抑制了纳米簇的非辐射弛豫。且基于主客体策略改性金纳米簇具有较强的稳定性，减少了纳米簇在水溶液中的团聚。将基于主客体策略改性金纳米簇作为发光体应用在电化学发光生长激素传感平台可以大大的提高传感平台的灵敏度的稳定性。本发明的原理是随着捕获生长激素的浓度的增加，通过金-氨键连接到生长激素传感平台表面的基于主客体策略改性金纳米簇数量就越多，电化学发光信号就随之增强。此外，本发明设计的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台也为其它大分子蛋白质的分析检测提供了一种新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备和检测方法，实现对生长激素的快速、准确检测。
本发明的技术方案如下：
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台，其特征在于，制备步骤如下：
（1）基于主客体策略改性金纳米簇的制备
1）将50 ~ 500 μL质量分数为2%的氯金酸分散于10 mL乙醇中，然后注入0.2 ~1.0 mL巯基乙酸，搅拌10 ~ 60 min后，加入2 ~ 10 mg苯丙氨酸，继续搅拌20 ~60 min，形成无色分散体；
2）室温下将1 ~ 10 mg 葫芦[7]脲与分散体混合；反应10 ~ 120 min后，得到的溶液以8000 ~ 12,000 rpm的转速离心；在超纯水中洗涤多次，将本品分散于1 mL超纯水中，即制得基于主客体策略改性金纳米簇；
（2）基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备
1）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将6 μL、0.5 ~ 5 mg/mL葫芦[7]脲水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
3）将6 μL生长激素溶液滴加到电极表面，用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
所述生长激素溶液，为标准溶液或样品溶液；
4）将5 ~ 10 μL的基于主客体策略改性金纳米簇滴加到电极表面，晾干后用pH7.4的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台。
2. 如1所述的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为500 ~ 800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ -1.6 V，扫描速率为0.1 ~ 0.2 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为10 mmol/L ~ 80 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的生长激素标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
本发明的有益成果
（1）首次把葫芦[7]脲对生长激素的特异性识别引入到电化学发光领域，利用葫芦[7]脲会与生长激素N端苯丙氨酸发生结合从而形成稳定的主客体络合物的特性，在传感平台表面选择性识别并捕获生长激素。这不仅降低了对操作者和操作环境的严苛要求，并减少了实验步骤和传感平台的制备成本。
（2）利用主客体策略将巯基乙酸和苯丙氨酸保护的金纳米簇进行改性。葫芦[7]脲具有优异的刚性和超分子识别能力，可以作为“智能分子枷锁”识别和限制金纳米簇表面苯丙氨酸配体的振动和相互作用，有效地抑制了金纳米簇的非辐射弛豫。且基于主客体策略改性金纳米簇具有较强的稳定性，减少了纳米簇在水溶液中的团聚。将基于主客体策略改性金纳米簇作为发光体应用在电化学发光生长激素传感平台可以大大的提高传感平台的灵敏度和稳定性。
（3）本发明将主客体策略应用在电化学发光生长激素传感平台的靶标识别和信号放大中。构建基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台可应用于生长激素的灵敏检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.0005 ng/mL ~500 ng/mL）和检出限低（低至0.0002 ng/mL）的优点。
附图说明
图1为基于实施例1得到的基于主客体策略改性金纳米簇的透射电子显微镜图和紫外可见吸收光谱图；
图2为基于实施例2得到的基于主客体策略改性金纳米簇的透射电子显微镜图和紫外可见吸收光谱图；
图3为基于实施例3得到的基于主客体策略改性金纳米簇的透射电子显微镜图和紫外可见吸收光谱图；
图4为基于实施例4得到的电化学发光生长激素传感平台的工作曲线：I＝1453+7076lg c(R2＝0.996)；线性范围为0.0005ng/mL～500ng/mL；LOD＝0.0004ng/mL(S/N＝3)；
图5为基于实施例5得到的电化学发光生长激素传感平台的工作曲线：I＝1467+7451lg c(R2＝0.996)；线性范围为0.0005ng/mL～500ng/mL；LOD＝0.0003ng/mL(S/N＝3)；
图6为基于实施例6得到的电化学发光生长激素传感平台的工作曲线：I＝1356+8014lg c(R2＝0.996)；线性范围为0.0005ng/mL～500ng/mL；LOD＝0.0002ng/mL(S/N＝3)。
实施例1
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备，包括以下步骤：
（1）基于主客体策略改性金纳米簇的制备
1）将50 μL质量分数为2%的氯金酸分散于10 mL乙醇中，然后注入0.2 mL 巯基乙酸，搅拌10 min后，加入2 mg苯丙氨酸，继续搅拌20 min，形成无色分散体；
2）室温下将1 mg 葫芦[7]脲与分散体混合；反应10 min后，得到的溶液以8000rpm的转速离心；在超纯水中洗涤多次，将本品分散于1 mL超纯水中，即制得基于主客体策略改性金纳米簇；
（2）基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备
1）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将6 μL、0.5 mg/mL葫芦[7]脲水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
3）将6 μL生长激素溶液滴加到电极表面，用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
所述生长激素溶液，为标准溶液或样品溶液；
4）将5 μL的基于主客体策略改性金纳米簇滴加到电极表面，晾干后用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台。
实施例2
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备，包括以下步骤：
（1）基于主客体策略改性金纳米簇的制备
1）将200 μL质量分数为2%的氯金酸分散于10 mL乙醇中，然后注入0.5 mL 巯基乙酸，搅拌30 min后，加入6 mg苯丙氨酸，继续搅拌30 min，形成无色分散体；
2）室温下将5 mg 葫芦[7]脲与分散体混合；反应60 min后，得到的溶液以10,000rpm的转速离心；在超纯水中洗涤多次，将本品分散于1 mL超纯水中，即制得基于主客体策略改性金纳米簇；
（2）基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备
1）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将6 μL、3 mg/mL葫芦[7]脲水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
3）将6 μL生长激素溶液滴加到电极表面，用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
所述生长激素溶液，为标准溶液或样品溶液；
4）将8 μL的基于主客体策略改性金纳米簇滴加到电极表面，晾干后用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台。
实施例3
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备，包括以下步骤：
（1）基于主客体策略改性金纳米簇的制备
1）将500 μL质量分数为2%的氯金酸分散于10 mL乙醇中，然后注入1.0 mL 巯基乙酸，搅拌60 min后，加入10 mg苯丙氨酸，继续搅拌60 min，形成无色分散体；
2）室温下将10 mg 葫芦[7]脲与分散体混合；反应120 min后，得到的溶液以12,000 rpm的转速离心；在超纯水中洗涤多次，将本品分散于1 mL超纯水中，即制得基于主客体策略改性金纳米簇；
（2）基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备
1）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将6 μL、5 mg/mL葫芦[7]脲水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
3）将6 μL生长激素溶液滴加到电极表面，用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
所述生长激素溶液，为标准溶液或样品溶液；
4）将10 μL的基于主客体策略改性金纳米簇滴加到电极表面，晾干后用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台。
实施例4
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，实施例1所制备的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ -1.6 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0的含浓度为10 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的生长激素标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
实施例5
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，实施例2所制备的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ -1.6 V，扫描速率为0.15 V/s；
（2）在10 mL、pH 7.4的含浓度为40 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的生长激素标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
实施例6
基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，实施例3所制备的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ -1.6 V，扫描速率为0.2 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.5的含浓度为80 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的生长激素标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
实施例7
实施例4-6电化学发光生长激素传感平台的检测，信号线性范围为（0.0005 ng/mL~500 ng/mL），检出限低至（0.0002 ng/mL）。
Claims (2)
1.一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台，其特征在于，制备步骤如下：
（1）基于主客体策略改性金纳米簇的制备
1）将50 ~ 500 μL质量分数为2%的氯金酸分散于10 mL乙醇中，然后注入0.2 ~ 1.0 mL巯基乙酸，搅拌10 ~ 60 min后，加入2 ~ 10 mg苯丙氨酸，继续搅拌20 ~ 60 min，形成无色分散体；
2）室温下将1 ~ 10 mg 葫芦[7]脲与分散体混合；反应10 ~ 120 min后，得到的溶液以8000 ~ 12,000 rpm的转速离心；在超纯水中洗涤多次，将本品分散于1 mL超纯水中，即制得基于主客体策略改性金纳米簇；
（2）基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的制备
1）分别用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将6 µL、0.5 ~ 5 mg/mL葫芦[7]脲水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
3）将6 μL生长激素溶液滴加到电极表面，用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
所述生长激素溶液，为标准溶液或样品溶液；
4）将5 ~ 10 μL的基于主客体策略改性金纳米簇滴加到电极表面，晾干后用pH 7.4的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台。
2.如权利要求1所述的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的基于主客体策略电化学发光生长激素传感平台为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为500 ~ 800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ -1.6 V，扫描速率为0.1 ~ 0.2 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为10 mmol/L ~ 80 mmol/L过硫酸钾的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的生长激素标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
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| WO2019232485A1 (en) * | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Nvigen, Inc. | Accurate blood test to predict cancer incidence, recurrence, guide and monitor treatment intervention |
-
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Patent Citations (2)
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