CN116121882A - Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Flag抗体scFv1及其应用 - Google Patents

Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Flag抗体scFv1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种KLH‑Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其步骤包括：(1)用KLH‑Flag蛋白免疫新西兰大白兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E‑2sfi1‑scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。并公开了最终得到应用的单克隆抗体氨基酸序列。本发明通过噬菌体展示抗体库技术筛选得到高亲和力的兔源单链抗体,该抗体对Flag蛋白的亲和力高，特异性强,该抗体可用于制备Anti‑Flag亲和凝胶的抗体和可用于WB检测带有Flag标签的蛋白等。

Description

Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Flag抗体scFv1及其应用
技术领域
本发明专利涉及一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，以及筛选到的Flag抗体scFv1及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
FLAG-tag是一段由8个氨基酸残基组成的，N-DYKDDDDK-C(1012Da),其作用通常是作为标记标签。在蛋白表达纯化的生产中，可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来，使Flag标签连接在目的蛋白的C端或N端，然后将整合后的基因转入原核或真核细胞中。后续的检测和纯化主要通过FLAG-tag这段肽链形成的免疫决定簇与其单克隆抗体的特异性结合来实现。检测手段有免疫荧光(immunofluorescence)，免疫印记(Western Blotting)等。
因为Flag标签是蛋白类生物制品生产质控中最常用和最稳定的标签蛋白之一，在蛋白质表达纯化的科学研究和工业生产中应用广泛，市场需求量大，所以筛选一株对Flag标签具有高亲和力的抗体是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法。
一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：
(1)用Flag蛋白免疫兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；
(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；
(3)构建pCANTAB5E-2SFi1-scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；
(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。
步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：
步骤(2)中重链VH上游引物IgG-sfi1-VH-F和下游引物IgG-VH-R交叉配对混合后进行PCR，轻链VL上游引物IgG-VL-F和下游引物IgG-sfi1-VL-R一一配对混合进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等摩尔混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。
步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库，具体指取抗原与PBS混匀后包被于96孔板，用5％BSA作为封闭液，添加噬菌体单链抗体库室温孵育；
洗脱：加入100mM HCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集管内加入1MTris-HCl中和pH，再加入BSA溶液稀释；
洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2×YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG-NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；
重复上述步骤，进行4轮淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。
本发明还公开了一种Flag单克隆抗体scFv，其轻链可变区序列为：
DMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQSSQSVYLNNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCVGYKSSSIDGVAFGGGTELEIL(SEQ ID No.1)，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：QSSQSVYLNNDLA，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：YASTLAS，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：VGYKSSSIDGVA；
重链可变区序列为：
QQQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLHSYAMSWVRQAPGKGLEWIGTIEFNDNTYYASWPKGRFTISKTSTAVDLKMTSLTAADTGTYFCVRSSNGWSQTIWGPGTLVTVSS(SEQ ID No.2)，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：SYAMS，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：TIEFNDNTYYASWPKG，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：SSNGWSQTI。
命名为scFv1。
本发明的Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，可筛选得到具有高亲和力的兔源单链抗体，可构建出库容量2.4.0×109、重组噬菌体滴度为1.0×1013pfu/ml、重组率为100％的噬菌体单链抗体库。本发明的单链抗体可以通过大肠杆菌BL21表达得到。
附图说明
图1是提取的总RNA电泳图。
图2是轻链VL、重链VH基因的PCR产物凝胶电泳图。
图3是scFv基因PCR产物凝胶电泳图。
图4是pCANTAB5E-2sfi1质粒双酶切前后电泳图。
图5是连接产物电转化的平板图。
图6是菌落PCR鉴定图。
图7是该scFv抗体的亲和力检测结果(IgM-Flag-中间)
图8是该scFv抗体的亲和力检测结果(IgM-Flag-C端)。
图9是最终筛选出的抗体用于WB检测结果图。
具体实施方式
1.生物材料
新西兰大白兔，辉煌养殖场
2.实验试剂与耗材
表1实验试剂与耗材
实施例1噬菌体展示抗体库的构建
1.1动物免疫和脾细胞总RNA的提取
用Flag-KLH免疫约2kg的新西兰大白兔，每两周皮下免疫一次，初次免疫用弗式完全佐剂乳化Flag-KLH，加强免疫用非完全佐剂乳化，首次免疫剂量为0.5mg蛋白，以后每次免疫剂量为0.25mg,免疫2月后，即取脾脏前3天，用0.25mg的蛋白皮下冲击免疫。冲击免疫三天后，取脾脏组织块30-50mg。按照超纯RNA提取试剂盒(DNase I)的步骤提取总RNA。在液氮中充分研磨后加入1ml TRIzon Reagent，或在脾脏组织中加入1ml TRIzon Reagent后匀浆处理。样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。以每1ml TRIzon Reagent加入200μl三氯甲烷的比例加入三氯甲烷，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。
在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制),约600μl-700μl，颠倒混匀。将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15min。向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温3min，彻底晾干。将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，取1μl样品跑电泳检测提取效果，结果如图1，其余的RNA样品于-80℃冰箱保存待用。
1.2 scFv基因克隆及拼接
本发明采用翌圣生物公司的逆转录试剂盒，以提取新西兰大白兔脾脏细胞RNA为模板按照表2-1所示逆转录反应体系，加入RNA模板，RNase free Water, ⅢSuperMix,25℃5min,55℃孵育反转录15min，85℃加热5min反应得到cDNA。表2-2引物由上海生工合成。轻链可变区基因和重链可变区基因都以兔源cDNA为模板，轻链上游引物和下游引物混合进行PCR，重链上游引物和下游引物混合进行PCR，PCR反应添加成分如表2-3，并按照表2-4反应体条件进行PCR反应。对获得的轻链VL和重链VH的PCR产物上样于1.2％琼脂糖凝胶中，电泳观察其扩增结果，结果如图2，使用OMEGA公司胶回收试剂盒按照试剂盒实验步骤回收，回收产物-20℃保存。
将上一步回收的重链和轻链基因等摩尔混合作为模板，使用相对应的重链VH上游引物和轻链下游引物进行PCR，拼接成为scFv。PCR反应体系如表2-5，反应条件同表2-4中VH基因扩增条件。反应结束后上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3，使用OMEGA公司胶回收试剂盒按照试剂盒实验步骤回收，回收产物-20℃保存。
表2-1逆转录反应体系
表2-2所用引物
表2-3 PCR反应体系
组分 使用量
Prime STAR GXL Premix(2x) 25μl
引物F(10μM) 1μl
引物R(10μM) 1μl
Template(cDNA) 1μl
灭菌水 22μl
Total 50μl
表2-4 PCR扩增条件
目的片段 变性 退火 延伸 反应结束 循环次数
VL 98℃10s 55℃15s 68℃42s 4℃ 30
VH 98℃10s 60℃15s 68℃42s 4℃ 30
表2-5 PCR反应体系
1.3构建pCANTAB5E-2sfi1-scFv重组质粒
pCANTAB5E-2sfi1转化DH5α扩增，大提制备质粒。按照日本Takara公司酶切体系，对pCANTAB5E-2sfi1质粒和scFv片段分别进行Sfi1酶切处理，酶切反应如下表2-6所示。充分混匀，放置50℃水浴锅中，酶切2h。pCANTAB5E-2sfi1质粒酶切结束后经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，结果如图4，使用OMEGA公司胶回收试剂盒回收产物。使用YEASEN T4连接酶，将酶切处理的scFv基因片段和pCANTAB5E-2sfi1质粒，按表2-7中连接反应体系，20℃连接2h。
表2-6酶切反应体系
反应组分 体积
10×M buffer 16μl
Sfi1酶 8μl
pCANTAB5E-2sfi1/scFv 8μg
灭菌水 补至160μl
表2-7酶连体系
反应组分 体积
10× T4 DNA Ligase buffer 80μl
T4 DNA Ligase 80μl
pCANTAB5E-2sfi1(S) 4μg
ScFv(S) 2μg
灭菌水 补至800μl
1.4连接产物转化感受态TG1和库容及重组率测定
取TG1感受态细胞放置冰上融化后，加入1μl pCANTAB5E-2sfi1-scFv连接产物后轻轻混匀，沿管壁加入冰浴的电转杯中，放置5-10min后置于电转仪中，设置电压2.5kv，电击恒压时间5.0ms左右，电转化后立即加入1ml预热的SOC液体培养基，经37℃摇床震荡复苏培养1h。本次实验转化平行操作20管，每1μl电转一次，共转化20次，共获得20ml转化后感受态细胞。
转化复苏培养之后的菌液混合后取出100μl，10倍梯度稀释法进行稀释后取100μl涂在2×YT-C(含50mg/ml Carb)平板，37℃恒温培养箱倒置过夜计算库容，连接产物转化结果如图5。次日，取稀释平板中单菌落分散良好的平板挑取20个单菌落于2×YT-C(含50mg/ml Carb)液体培养基中，37℃，200rpm/min震荡培养过夜。20个扩大培养的单菌落各取1μl菌液作为模板，按照scFv基因拼接PCR体系进行菌液PCR，PCR产物跑电泳后于凝胶成像仪中分析结果，计算抗体库的重组率，PCR鉴定结果如图6。
计算公式：库容＝单菌落数量×稀释倍数×总体积(公式1-1)
重组率(％)＝阳性克隆/挑取单克隆个数(公式1-2)。
1.5噬菌体scFv抗体库的构建
1.5.1辅助噬菌体毒种制备
取过夜培养的TG1菌液按照1:100的比例接种于5ml SOB培养基中,37℃，200rpm/min震荡培养到OD600达0.4-0.6后加入5μl的M13KO7 helper phage，37℃，200rpm/min震荡培养1h后再加入5μl卡那霉素(50mg/ml),37℃，200rpm/min摇床培养1h。将培养好的菌液转接到100ml 2×YT液体培养基，加入卡那霉素(50mg/ml)至终浓度50μg/ml，37℃，200rpm/min过夜培养。次日，将过夜培养的菌液分装到50ml离心管中，4℃，12000rpm/min,离心20min,将上清转移至高温灭菌的500ml锥形瓶，加入为初始菌液1/5体积PEG/NaCl，本次操作加入体积为20ml,混匀之后分装到新的50ml离心管，冰上沉析2h后4℃，12000rpm/min,离心10min弃掉上清，用2ml(1/50体积)的1×PBS重悬沉淀，转移至无菌离心管中，再次12000rpm/min,4℃,离心5min小心取上清，用0.22μM滤膜过滤除菌，加入最终浓度50％甘油，分装到无菌离心管中，-20℃保存。
1.5.2辅助噬菌体毒种滴定
将制备好的噬菌体液用1％ BSA(in 1×PBS)作稀释液进行10倍梯度稀释，取稀释倍数10-4，10-6，10-8，10-10，10-12的菌液10μl至OD600达0.4-0.6的TG1中，将稀释液和TG1作为阴性对照，37℃静置30min,摇床培养30min；培养结束后将上述5个稀释梯度的菌液和两个阴性对照涂在卡那霉素(含50mg/ml)的平板上，37℃过液培养。次日，计算平板上的克隆数，按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu/ml),一般要达到1012才可以后续实验。计算公式：噬菌体滴度＝单克隆数×稀释倍数×10(公式1-3)。
1.5.3初级噬菌体抗体库的构建
取转化保存的剩余培养物20ml加入到380ml 2×YT-C(25μg/ml Carb)培养基中37℃、200rpm摇床培养1h，加入Carb至终浓度50μg/ml，继续培养1h。按照感染复数moi＝20:1加入辅助噬菌体M13KO7 10μl于上述培养物中，先于37℃、60rpm轻摇30min利于噬菌体侵染，再放置摇床震荡培养30min。将培养液在无菌超净台内转移至灭菌的离心管中，5000rpm离心15min，小心去上清。无菌条件下用400ml 2×YT-CK(50mg/ml Carb和50mg/ml Kan)培养基重悬细菌沉淀，震荡培养过夜。次日，将过夜的菌液全部转入无菌50ml离心管中，12000rpm 4℃离心20min。
将上清转移至新的无菌锥型瓶中，加入为初始菌液1/5体积的PEG-NaCl(80ml),冰上静置1h沉析。12000rpm、4℃离心20min后去除上清，离心管倒扣2-5min，尽可能去除多余液体。用1/50起始菌液体积的1％ BSA(in 1×PBS)重悬沉淀，转至1.5ml无菌管，12000rpm离心5min，去除沉淀，上清转移至新的1.5ml无菌管，上清即为初级抗体库，加甘油至50％于-20℃保存。测定重组噬菌体的滴度，方法同1.5.2。
实施例2噬菌体抗体库筛选
2.1酶标板筛选法特异性抗体的筛选
将10μg/ml的scFv-Flag融合蛋白加入酶标孔板，每一轮每个蛋白一个孔，每个孔100μL，4℃，包被过夜；去除96孔板里的包被液，每孔加入200μL的5％BSA，同时设置空白对照，空白孔直接加入200μL 5％BSA作为封闭液，室温下，在摇床上孵育2h；倒扣去除BSA封闭液，用200μL PBST清洗10次后，往抗原孔和BSA对照孔中加入100μL的噬菌体抗体库，室温下，在摇床上孵育2h；弃除抗体库液体，每孔加入200μL PBST，清洗10次，拍干；向孔中各加入100μL 100mM HCl,室温孵育5min后将产物洗脱下来加入40μL的1M Tris-HCl中和，混匀；将获得的洗脱产物各加入到含1mL TG1(OD600＝0.4-0.6)中，37℃，220rpm,孵育1h后，各取液体20μL进行适宜倍数的稀释，并在含有Carb抗性的LB固体平板上进行滴度实验后，置于37℃孵育过夜；再分别加入1μL辅助噬菌体于蛋白管的EP管中(保证终浓度为1010pfu/ml的辅助噬菌体)，37℃，220rpm,孵育1h；将上述约1ml EP管中培养液转入50ml 2×YT-CK(50mg/ml Carb和50mg/ml Kan)培养基中，37℃，220rpm,孵育过夜，第二天按照建库的方法收集噬菌体，重复以上操作四轮，第一轮使用抗体库原液；第二到第三轮加入的抗体库由前一天的过夜摇菌收集而来，获得每轮滴度实验的结果，比较每一轮的筛选有没有富集；根据滴度结果验证筛选是否成功，再挑选单克隆进行PCR菌落鉴定。
表3-1 4轮筛选条件
第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 第四轮筛选
抗原包被浓度(μg/ml) 10 10 10 10
洗涤次数 8 8 8 8
表3-2 4轮筛选结果
2.2Gator Prime检测细菌裂解液中表达的抗体
根据挑选富集后的单克隆的PCR菌落鉴定得到了96个单克隆，并提取这96个单克隆的质粒，转HB2151感受态细胞诱导，表达后用Gator Prime检测细菌裂解液中表达的抗体，具体操作如下：挑取单克隆过夜培养，带3个空载阴性对照，将过夜培养的菌液按照1：100用2YT-C(Carb 50mg/ml)稀释到OD600＝0.1，37℃，220rpm/min震荡培养到OD600＝0.6-0.8，加入0.2M IPTG(终浓度为0.1mM),16℃，220rpm/min过夜培养。次日，将诱导后的菌液5000rpm，5min收集菌体，收集好的菌体加入裂解液(PBS+溶菌酶)后用超声波破碎仪破碎15分钟后12000rpm,离心20min后取上清备用。将Flag抗原用生物素标记后过夜透析并检测其浓度。用SA探针先固化biotin-Flag,然后分别与制备好的裂解液结合。扣减3个阴性对照的response值之后6个阳性克隆的实验结果如表3-3.
表3-3裂解液中抗体的表达量
Sample Name Response(nm)
scFv-1# 1.35
scFv-2# 2.18
scFv-3# 0.44
scFv-4# 0.15
scFv-5# 0.73
scFv-6# 1.3
实施例3 scFv大肠杆菌表达纯化和ELISA鉴定以及亲和力检测
以上6个阳性噬菌体克隆送测序。获得的scFv1-6的基因序列和相应氨基酸序列，获得scFv基因序列后使用NCBI BLAST中的Immunoglobulin BLAST和Nucleotide.nucleotide BLAST分析软件，分析出CDR1，CDR2，CDR3区域(NumberingScheme:Kabat)。根据scFv测序结果，构建pET-Duet1-scFv表达载体。引物设计序列如下表3-4。
表3-4 scFv表达载体构建引物
以阳性克隆提取的质粒为模板，PCR扩增得到scFv片段，PCR扩增获得pET-Duet1的片段，一步克隆法构建PET-Duet1-scFv，菌落PCR鉴定阳性后，抽提质粒，测序验证构建正确。
将构建好的PET-Duet1-scFv质粒转化BL21(DE3)中，挑单克隆扩增到1L，OD600为0.6-0.8时加入IPTG终浓度0.1mM 16℃过夜诱导表达。诱导结束后对菌液进行离心，去上清，每1L菌液得到的菌体加入50ml PBS重悬，冰浴用匀浆破菌仪破菌5min后，导入离心管，12000rpm/min，4℃离心30min，上清转入新的离心管。用镍柱亲和纯化菌裂解液上清。1ml的镍亲和介质与上清4℃孵育1小时后，装入重力层析柱，流穿(FT)过后，用20ml的含30mM咪唑的PBS洗涤，用10mM，30mM，50mM，100mM，250mM咪唑的PBS洗脱，对洗脱产物用10kD的浓缩管浓缩。最终选用250mM的洗脱产物使用Nanodrop OD280测蛋白浓度，scFv1，scFv2，scFv3，scFv4，scFv5，scFv6的量分别为0.72mg，0.061mg，0.13mg，0.92mg，0.47mg，0.055mg。
将scFv稀释到1μg/ml后二倍梯度稀释，Flag包板，BSA封闭，对scFv稀释样本进行检测，二抗使用HRP标记的抗flag-tag抗体，BSA包被和封闭作对照。ELISA结果如下表所示，6个scFv均与Flag结合，与BSA对照不结合，其中scFv1的亲和力最强。
表1-10 ELISA结果
取纯化后的scFv-1抗体，用Gator Prime检测抗体的亲和力，具体操作如下：将scFv-1用生物素标记后过夜透析并检测其浓度。用SA探针先固化biotin-Flag融合蛋白(分别在中间和C端位置带有Flag标签的IgM抗体),然后分别与标记好的scFv-1结合。检测其亲和力，抗体的亲和力检测结果如下图7，图8所示。
实施例4应用最终筛出的一株Flag抗体scFv1进行WB检测在不同位置带有Flag标签的融合蛋白A
4.1样品处理
4.1.1取在不同位置携带Flag标签的三种融合蛋白A(分别在蛋白A的N端，C端和中间部分带有Flag标签)各100ng加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS Buffer，还原电泳需在上样缓冲液中加入DTT至终浓度10mM混匀。
4.1.2将上样样品于金属浴中，100℃加热5min使蛋白变性后即可上样。
4.2电泳：
4.2.1吸取上样样本20uL至加样孔。
4.2.2加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时。
4.3考染的染色脱色：
4.3.1电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将两块玻璃板分开，取出凝胶，放入清水中浸泡；
4.3.2打开转膜仪电源，将一片吸水纸浸泡在转膜液中，一片吸水纸浸泡在染色液中备用；
4.3.3取出转膜盒，在负极面依次放上浸泡转膜液的吸水纸，电泳凝胶，浸泡染色液的吸水纸，仔细用小瓷碾反复压除凝胶与吸水纸之间的气泡，盖上正极面，旋紧，将转膜盒插入转膜仪中；
4.3.4调节电压至30V，时间为5min，点击染色键，开始染色；
4.3.5染色结束后，取出凝胶，浸泡在清水中，拍照并分析；
4.4 WB的转膜：
4.4.1电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将两块玻璃板分开，取出凝胶，放入清水中浸泡；
4.4.2打开转膜仪电源，将两片吸水纸浸泡在转膜液中，一片凝胶大小的PVDF膜浸泡在膜缓冲液中备用；转膜缓冲液转膜前半小时冰浴备用；
4.4.3取出转膜盒，在负极面依次放上浸泡转膜液的吸水纸，PVDF膜，电泳凝胶，另一张浸泡转膜液的吸水纸，每铺一层，仔细用小瓷碾反复压除气泡，盖上正极面，旋紧，将转膜盒插入转膜仪中，并插紧连接对应泵的软管；
4.4.4点击冲洗，排除管道气泡后，调节电压至30V，时间为15min，点击转膜键，开始转膜；
4.4.5转膜结束后，取出PVDF膜，浸泡在清水中，降温，冲洗；
4.5 WB的杂交和显色：
4.5.1用PBST缓冲液配制50mL,5％的脱脂奶粉备用；
4.5.2将PVDF膜浸泡在15mL 5％的脱脂奶中，放置在平皿内，在水平脱色摇床上，室温封闭1小时；
4.5.3向封闭好的脱脂奶中，按1：5000加入scFv1(带His标签)作为一抗，室温杂交1小时；
4.5.4倒去杂交液，用PBST浸泡摇晃，清洗PVDF膜5遍，每遍5分钟；
4.5.5将清洗好的PVDF膜浸泡在15mL 5％的脱脂奶中，向脱脂奶中按1：5000加入抗His标签的抗体作为二抗，室温杂交1小时；
4.5.6倒去杂交液，用PBST浸泡摇晃，清洗PVDF膜5遍，每遍5分钟；
4.5.7各取200uL显色液的A,B液，等比例混合，备用；
4.5.8取出清洗好的PVDF膜，于暗室处，在膜上均匀滴加混合好的显色液，无光处静置5min；
4.5.9取出显色好的PVDF膜，用凝胶成像系统曝光后拍照，进行分析，结果如图9所示。
综上所述，该Flag抗体针对Flag标签的亲和力高，特异性强，可用于WB检测带有Flag标签的蛋白。

Claims (7)

1.一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：
(1)用KLH-Flag蛋白免疫新西兰大白兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；
(2)利用PCR技术，以步骤(1)获得的cDNA为模板，扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；
(3)构建pCANTAB5E-2sfi1-scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；
(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，用scFv-Flag融合蛋白从中筛选出阳性克隆；
其中步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：
IgG-sfi1-VH-F1：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCGGCCCAGTCGCTGGAG
IgG-sfi1-VH-F2：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCYGGCCCWGTCGCTGGAG
IgG-sfi1-VH-F3：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCGCTGGAG
IgG-sfi1-VH-F4：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCNGGCRCAGTCGWTGGAG
IgG-sfi1-VH-F5：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCGHTGGAG
IgG-sfi1-VH-F6：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCNKTGGAG
IgG-sfi1-VH-F7：ACCCAGCTGACCGTCACWCAWCCKGCCCWGTCGCTGGAG
IgG-sfi1-VH-R1：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT
IgG-sfi1-VH-R2：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCAGGCN
IgG-sfi1-VH-R3：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAATHGACGGTGACCAGGGT
IgG-sfi1-VH-R4：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGARGACGGTGACCAGGGT
IgG-sfi1-VL-F1：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATCTNACCCAGACTCCATCC
IgG-sfi1-VL-F2：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATATHACCCAGARTCCATCC
IgG-sfi1-VL-F3：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATCTGACCCRGACTCDATCC
IgG-sfi1-VL-F4：AGTGGTGGTGGAGGATCTGABCTGACCCYGACTCCNTCC
IgG-sfi1-VL-F1：GGCCAGATCGGCCAAGGANGGTCAGWTTGGT
IgG-sfi1-VL-R2：GGCCAGATCGGCCAAKGACGGTRAGCTTGGT
IgG-sfi1-VL-R3：GGCCAGATCGGCCAAKGYCGNTCAGCTTGGT
IgG-sfi1-VL-R4：GGCCAGATCGGCCAAGGRCGKTCAGCTTGGT；
其中引物中B、Y、K、W、N、H、R、D等除了A、T、C、G以外的核苷酸均为简并，
具体含义为：R:A/G
Y:C/T
K:G/T
W:A/T
H:A/T/C
B:G/T/C
D:G/A/T
N:A/T/C/G。
2.根据权利要求1所述的Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中重链VH上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，轻链VL上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等摩尔混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。
3.根据权利要求2所述的Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于：步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库，具体指取抗原与PBS混匀后包被于96孔板，用PVA溶液封闭，添加噬菌体单链抗体库，加入BSA溶液孵育，所述抗原为KLH-Flag蛋白；
洗脱：加入100mM HCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集孔内加入1MTris-HCl中和pH混匀；
洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2×YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG-NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；
重复上述步骤，进行4-5次淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。
4.一种Flag抗体scFv-1，其特征在于：
轻链可变区序列为：
DMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQSSQSVYLNNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCVGYKSSSIDGVAFGGGTELEIL，
其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：QSSQSVYLNNDLA，
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：YASTLAS，
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：VGYKSSSIDGVA；
重链可变区序列为：
QQQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLHSYAMSWVRQAPGKGLEWIGTIEFNDNTYYASWPKGRFTISKTSTAVDLKMTSLTAADTGTYFCVRSSNGWSQTIWGPGTLVTVSS，
其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：SYAMS，
重链可变区CDR2氨基酸序列为：TIEFNDNTYYASWPKG，
重链可变区CDR3氨基酸序列为：SSNGWSQTI。
5.权利要求4所述的Flag抗体scFv-1的表达质粒，所述质粒载体为pET-Duet1。
6.权利要求4所述的Flag抗体scFv-1的原核表达载体，所述载体为大肠杆菌。
7.权利要求4所述的Flag抗体scFv-1在纯化或沉淀带有Flag标签的融合蛋白或蛋白复合物中的应用。
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