CN116115653A - 猴头菇菌丝体活性物质用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物的用途 - Google Patents
猴头菇菌丝体活性物质用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种猴头菇菌丝体活性物质用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物的用途。猴头菇菌丝体活性物质可用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物。所述猴头菇菌丝体活性物质是由以下列步骤制备而成：(a)取猴头菇菌丝体于平板培养基上，于15‑35℃的温度下培养7‑15天；(b)将步骤(a)培养后的猴头菇菌丝体接种至烧瓶内，于15‑35℃、pH 2‑8的环境培养3‑5天；(c)将步骤(b)培养后的猴头菇菌丝体接种于发酵槽内，于15‑35℃、pH 4.5‑5.5的环境下搅拌培养7‑15天，形成含有猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体发酵液。
Description
技术领域
本发明关于一种猴头菇菌丝体活性物质的用途，特别是指以猴头菇菌丝体制备用以预防或治疗视网膜病变的组合物。
背景技术
老年性黄斑部病变(Age-related macular degeneration,AMD)是负责视力和色觉的视网膜黄斑部渐进退化性的疾病，主要是由中央视网膜感光接受器死亡所引起。位于感光层和脉络膜之间的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞也与早期AMD的发病机制有关。如其名称“老年性”所述，AMD的患病率随着年龄的增长而逐渐增加，成为老年人失明的主要原因。
AMD的发病机制与许多因素有关，如代谢紊乱，免疫，炎症，活性氧物质(reactiveoxygen species；ROS)等。近年的研究显示ROS所造成的氧化压力是AMD的主要致病因子。在过去的几十年中，用来治疗AMD的方法包括：(1)光凝固雷射(laserphotocoagulation)、(2)经瞳热疗雷射(transpupillary thermotherapy TTT)、(3)光动力疗法(photodynamictherapy PDT)、(4)抗血管生成疗法(antiangiogenic therapy)、(5)营养补充疗法、(6)基因治疗、(7)抗氧化剂与(8)合并上述疗法等，但手术疗法具副作用，且术后失明率仍在增加。因此，开发具有较低毒性的新型治疗剂对于AMD的预防或治疗相当重要。
猴头菇Hericium erinaceus(Bull.)Pers是一种珍贵的药膳兼用真菌，主要分布于纬度较高的温带地区。《中国野菜食谱大全》认为其可治消化不良、胃溃疡、胃炎、胃痛、胃胀及神经衰弱等病症，显示猴头菇除美味以外，具有胃部保护功能，可作为食药两用菇。1994年起Kawagishi从猴头菇菌丝体分离纯化得到多种猴头素(A、B、C等)，猴头素可刺激老鼠星状细胞，增加神经生长因子分泌量(NGF)，而NGF可治疗智力衰退、神经衰弱等疾病，故猴头菇亦被认为可促进神经及大脑健康。然而，目前并无研究指出猴头菇对视网膜病变具有疗效。
发明内容
本发明提供一种猴头菇(Hericium erinaceus)菌丝体活性物质的用途，其是用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物。该猴头菇菌丝体活性物质的制备方法包括下列步骤：
(a)取一猴头菇菌丝体于平板培养基上，于15-35℃的温度下培养7-15天；
(b)将步骤(a)培养后的猴头菇菌丝体接种至一烧瓶内，于15-35℃、pH 2-8的环境下培养3-5天；
(c)将步骤(b)培养后的猴头菇菌丝体接种于一发酵槽内，于15-35℃、pH 4.5-5.5的环境下搅拌培养7-15天，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体发酵液。
一实施例中，制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(d)：将该猴头菇菌丝体发酵液冷冻干燥后磨粉，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体冻干粉。
一实施例中，制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(e)：将该猴头菇菌丝体冻干粉以一溶剂萃取，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体萃取液。
一实施例中，制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(f)：将该猴头菇菌丝体萃取液干燥，以获得该猴头菇菌丝体活性物质。
一实施例中，在步骤(e)中的溶剂为乙醇，且该猴头菇菌丝体冻干粉以乙醇重复萃取两次。
一实施例中，步骤(b)的烧瓶培养为震荡培养，且转速为10-250rpm。
一实施例中，该视网膜病变为黄斑部病变。
一实施例中，步骤(c)中该发酵槽进一步通入一气体，该气体包括空气、氧气、二氧化碳、氦气或其组合，该发酵槽的槽压为0.5-2.0kg/cm2且通气速率为0.5-1VVM。
一实施例中，该组合物为医药组合物，且该医药组合物进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。
一实施例中，该组合物为食品添加剂。
一实施例中，该组合物的施用方式为口服、滴剂及栓剂。
为使本发明的上述及其他方面更为清楚，下文特举实施例，并配合所附图式进行说明。
附图说明
图1为各组小鼠的光学断层扫描(Optical Coherence Tomography)图；
图2为图1的视网膜厚度测量结果；
图3中的A为各组小鼠眼睛的苏木精&伊红染色(H&E stain)照片，图3中的B为图3中的A的虚线框放大图；
图4A为图3中的A所示的内核层INL厚度测量结果，图4B为图3中的A所示的外核层ONL厚度测量结果。
具体实施方式
猴头菇菌丝体来源
本发明的实施例所用的猴头菇(Hericium erinaceus)菌种，购置于中国台湾地区‘财团法人食品工业研究所’，寄存编号为BCRC 35669。该菌株可由BCRC的官方网站(https://catalog.bcrc.firdi.org.tw/)直接购得，为公众可轻易取得的菌株。但本发明所述的猴头菇活性物质不限于由此菌种所得。
菌丝体液体培养
将猴头菇菌丝体接种于平板培养基上，于适当温度15-35℃(较佳为25℃)下培养7-15天，刮取菌丝接种于烧瓶内。在15-35℃(较佳为25℃)，pH 2-8(较佳为pH 4-7，更佳为pH 5.5)，震荡速率100-250rpm的条件下培养3-5天，然后将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在15-35℃(较佳为25℃)，槽压0.5-2.0kg/cm2，pH 4.5-5.5，10-150rpm搅拌速度或不搅拌(air lift)情况，以0.5-1VVM通气速率通入空气，或空气、氧气、二氧化碳、氮气及上述气体的混合物(较佳者为空气)，培养时间为7-15天内，即得猴头菇菌丝体发酵液。此发酵液包括菌丝体与澄清液。前述培养条件仅为示例，使用者可视情况调整。
本发明使用的烧瓶培养基、发酵槽培养基配方可如下：
其中该综合性碳氮源可为谷类(如：麦粉类)或豆类(如：黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)。该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铁等。该糖类可为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等。特别说明的是，本发明使用的培养基并不限于上述成份或比例，使用者可视实际情况进行调整。
发酵液干燥
此猴头菇菌丝体发酵液可进一步通过干燥步骤制备为冻干粉等其他剂型。干燥方法包括但不限于：喷雾干燥、热风干燥、滚筒干燥、冷冻干燥或其他方式。
冻干粉萃取-乙醇萃取
取猴头菇菌丝体冻干粉加入25倍体积的乙醇进行第1次萃取，利用超声波震荡萃取1小时，取悬浮液进行离心。离心后取上清液，将残渣重复上述萃取步骤，以乙醇进行第二次萃取。第二次萃取获得的上清液与第一次萃取的上清液混合，经减压浓缩，得膏状的猴头菇菌丝体乙醇萃取物，其中包含猴头菇菌丝体活性物质。重复萃取两次的原因是为了获得较高的产率。
上述猴头菇菌丝体发酵液、猴头菇菌丝体冻干粉、猴头菇菌丝体乙醇萃取物皆含有本发明的猴头菇菌丝体活性物质。以下根据上述方法制备猴头菇菌丝体活性物质，并进行生物实验评估其功效。
实施例一：猴头菇菌丝体活性物质制备
菌株：本发明中实施例所用的猴头菇(Hericium erinaceus)菌种购自于财团法人食品工业研究所，寄存编号为BCRC 35669。
平板培养：将菌丝体接种于平板培养基上，培养基为马铃薯糊精培养基(PotatoDextrose Agar,PDA)，于25℃下培养7天。
烧瓶培养：刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基配方，在25℃，pH 5.0下，于震荡机上以转速120rpm震荡培养5天；
培养基配方：
发酵槽培养：培养基同上，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在25℃，槽压1.0kg/cm2，pH 5.0下，50rpm搅拌速度，以1.0VVM通气速率通入空气，培养12天，得猴头菇菌丝体发酵液。该猴头菇菌丝体发酵液经冷冻干燥可得猴头菇菌丝体冻干粉。
萃取物制备：将猴头菇菌丝体冻干粉加入为冻干粉25倍重量的95v/v％乙醇进行第一次萃取，接着利用超声波以震荡速率120rpm萃取一小时，取悬浮液进行离心，离心后取上清液。将第一次萃取的残渣重复上述萃取步骤以85v/v％乙醇进行第二次萃取。两次萃取离心得到的上清液混合，经减压浓缩，得膏状的猴头菇菌丝体乙醇萃取物(简称醇萃物)。
结果：20公吨发酵槽培养完毕的猴头菇菌丝体发酵液经冷冻干燥后，可得约320公斤冻干粉，再经二次萃取步骤，可得约20公斤乙醇萃取物。以下生物实验是以猴头菇菌丝体乙醇萃物进行。
实施例二视网膜病变动物模型及相关指标的分析
视网膜病变小鼠动物模型的建立
碘酸钠(Sodium iodate,NaIO3)为一种稳定的氧化剂，已被证明是一种诱导视网膜变性的有效物质。碘酸钠引起的视网膜变性与视网膜色素上皮细胞(RPE)的区域性丧失相关，同时也会出现区域性萎缩的一些形态学特征。已有许多研究利用不同的哺乳动物的物种证实了NaIO3对生物视网膜具有毒性，包括绵羊、兔子、大鼠和小鼠。上述的研究指出在视网膜中，NaIO3主要标靶为RPE细胞，可诱导其死亡，如坏死(necrosis)、细胞凋亡(apoptosis)或细胞自噬(autophagy)，其次是脉络膜毛细血管萎缩(choriocapillarisatrophy)和全视网膜变性(panretinal degeneration)。
近年来，研究学者以低剂量NaIO3(15-35mg/kg)来诱导小鼠产生老年性黄斑部病变(Age-related macular degeneration,AMD)模型，发现其与视功能下降以及局部性RPE流失和外部视网膜损伤有关，与干性AMD的共同发病机制极为相似，因此近年来大多以此模型来探讨RPE再生及AMD的预防。
本实施例使用40mg/kg剂量NaIO3诱导小鼠产生AMD，以此动物模型评估猴头菇菌丝体活性物质对于视网膜病变(特别是黄斑部病变)的预防及治疗效果。
实验动物：品系Balb/c雄性小鼠购自中国台湾地区‘实验动物中心’，年龄约6-8周，体重约26.21±1.76g。小鼠饲养于中山医学大学实验动物中心，提供正常洁净饲料及饮水，饲养环境为12小时照光及12小时黑暗的循环光照，温度控制在20±2℃，湿度控制在50±5％。
喂食剂量与实验步骤
本试验共进行21天，试验进行前将小鼠分为4组，每组6只：
(1)空白对照组(Mock)：以静脉注射(i.v.)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)100μL后，并以每日口服方式给予PBS 200μL。
(2)负对照组：以静脉注射(i.v.)给予碘酸钠NaIO3 40mg/kg，诱发AMD，并以每日口服方式给予PBS 200μL。
(3)猴头菇乙醇萃取物组(实验组)：先以每日口服方式给予实施例一制得的猴头菇乙醇萃取物100mg/kg 14天后，再以静脉注射给予碘酸钠NaIO3 40mg/kg诱发AMD，之后再每日喂食猴头菇乙醇萃取物100mg/kg 7天。
各组小鼠在实验21天后牺牲进行视网膜损伤程度检测及相关指标分析。
视网膜损伤程度检测及相关指标分析
1.眼底影像侦测
使用Phoenix-Micro IV眼底影像侦测系统，可检测光学眼底镜、荧光眼底造影以及视网膜断层扫描仪，并以此依据评估小鼠视网膜组织完整性与平滑度改变。图1为各组小鼠注射碘酸钠第7天后的光学断层扫描(Optical Coherence Tomography)图。
对图1小鼠以视神经为中心，鼻侧与颞侧300μm-600μm的范围(水平线示意处的长度即为300μm)进行6次厚度(垂直线范围)测量后，计算其平均值，可得小鼠的视网膜厚度，其结果见图2。
参照图1的光学断层扫描图，Mock组垂直线标记部分可看出视网膜结构完整。至于仅给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)的视网膜排列较不规则、松散，且组织间的排序较不平滑、界线较为模糊，有明显视网膜扭曲的情形发生。而通过猴头菇菌丝体萃取物预先处理的小鼠组别(HE)与仅给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)相比，视网膜排列不规则与模糊的情形明显较少。
图2所示的视网膜厚度测量的结果则显示(其中＊号标记表示与单独给予NaIO3组别相比，p<0.05，有显著差异)，与空白对照组(Mock)相比，单独给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)在接受碘酸钠注射7天后，视网膜厚度有明显变薄情形。而通过猴头菇菌丝体萃取物(HE)预先处理的小鼠组别与单独给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)相比，虽然厚度仍有变薄，但仍有显著回升。
据此，可得知本发明实施例的猴头菇菌丝体萃取物可减缓碘酸钠NaIO3所诱导的小鼠视网膜扭曲与变薄，进而改善AMD的情形。
2.组织病理分析(H&E stainine)
将各组小鼠于注射碘酸钠第7天后进行牺牲采血，眼睛做组织切片后，以苏木精和伊红染色，区别RPE的结构与型态，其照片如图3中的A所示。图3中的B为图3中的A的虚线框放大图，用以观察内核层(Inner nuclear layer,INL)与外核层(Outer nuclear layer,ONL)厚度，以及观察发炎细胞的数量。
INL及ONL层厚度测试皆是以视神经为中心，在其鼻侧与颞侧300μm-600μm进行6次厚度(图3中的B所示的线段与INL、ONL标记)测量后，计算其平均值，其结果分别列于图4A与图4B，其中＊号标记表示与单独给予NaIO3组别相比，p<0.05，有显著差异。
与空白对照组(Mock)相比，单独给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)在接受碘酸钠注射7天后，视网膜ONL与INL层厚度皆有变薄的情形。而通过猴头菇菌丝体萃取物(HE)预先处理的小鼠组别与单独给予碘酸钠的小鼠组别(NaIO3)相比，可显著减缓碘酸钠诱导的小鼠视网膜ONL与INL层厚度变薄。
据此，可得知本发明实施例的猴头菇菌丝体萃取物可减缓碘酸钠(NaIO3)诱导的小鼠视网膜内核层与外核层变薄，进而改善AMD的情形。
实施例三组合物制备
本实施例的猴头菇菌丝体活性物质若应用于医药用途，则以下组合物1的态样作为例示性实例。
组合物1：取实施例一的猴头菇菌丝体活性物质的冻干粉或水萃物(20wt％)，与作为润滑剂的硬脂酸镁(8wt％)、作为防腐剂的二氧化硅(7wt％)充分混合，并溶于纯水(65wt％)中，存放于4℃备用。前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。
不过，虽然实施例二中的猴头菇菌丝体活性物质是以口服方式喂食小鼠，但实际应用上亦可采用如滴剂、栓剂等其他方式。
本实施例的猴头菇菌丝体活性物质若以液体剂型应用于食品用途，则以下组合物2的态样作为例示性实例。
组合物2：取实施例一的猴头菇菌丝体活性物质的冻干粉或水萃物(20wt％)，与作为防腐剂的苯乙醇(8wt％)、作为稀释剂的甘油(7wt％)、作为稀释剂的蔗糖(10wt％)充分混合，并溶于纯水(55wt％)中，存放于4℃备用。前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。
Claims (11)
1.一种猴头菇菌丝体活性物质用于制备预防或治疗视网膜病变的组合物的用途，其中该猴头菇菌丝体活性物质的制备方法包括下列步骤：
(a)取一猴头菇菌丝体于平板培养基上，于15-35℃的温度下培养7-15天；
(b)将步骤(a)培养后的猴头菇菌丝体接种至一烧瓶内，于15-35℃、pH 2-8的环境培养3-5天；
(c)将步骤(b)培养后的猴头菇菌丝体接种于一发酵槽内，于15-35℃、pH 4.5-5.5的环境下搅拌培养7-15天，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体发酵液。
2.如权利要求1所述的用途，其中制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(d)：将该猴头菇菌丝体发酵液冷冻干燥后磨粉，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体冻干粉。
3.如权利要求2所述的用途，其中制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(e)：将该猴头菇菌丝体冻干粉以一溶剂萃取，形成含有该猴头菇菌丝体活性物质的猴头菇菌丝体萃取液。
4.如权利要求3所述的用途，其中制备该猴头菇菌丝体活性物质的步骤还包括步骤(f)：将该猴头菇菌丝体萃取液干燥，以获得该猴头菇菌丝体活性物质。
5.如权利要求3或4所述的用途，其中在步骤(e)中，该溶剂为乙醇，且该猴头菇菌丝体冻干粉以乙醇重复萃取两次。
6.如权利要求1所述的用途，其中步骤(b)的烧瓶培养为震荡培养，且转速为10-250rpm。
7.如权利要求1所述的用途，其中该视网膜病变为黄斑部病变。
8.如权利要求1所述的用途，其中步骤(c)中该发酵槽进一步通入一气体，该气体包括空气、氧气、二氧化碳、氦气或其组合，该发酵槽的槽压为0.5-2.0kg/cm2且通气速率为0.5-1VVM。
9.如权利要求1所述的用途，其中该组合物为医药组合物，该医药组合物进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。
10.如权利要求1所述的用途，其中该组合物为食品添加剂。
11.如权利要求1所述的用途，其中该组合物的施用方式包括口服、滴剂及栓剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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