CN116115631A - 一种防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物新适应症技术领域,具体公开了一种防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂及其制备方法和应用。本发明通过科学实验证明了该外用白芨多糖制剂可促使二硝基氟苯(DNFB)诱导的大鼠急、慢性湿疹病症在短时间内快速消退,其防治效果明显优于中、西医临床常用的对照药物(复方黄柏液、冰黄肤乐软膏、复方醋酸地塞米松乳膏),也能快速抑制组胺和4‑氨基吡啶联合用药诱导的小鼠瘙痒体征,其防治效果也接近于中、西医临床常用的对照药物(青鹏软膏、复方醋酸地塞米松乳膏)。
Description
技术领域
本发明涉及药物新适应症技术领域,具体涉及一种防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂及其制备方法和应用。
背景技术
湿疹是一种由多种内因(如慢性消化系统疾病、内分泌失调或精神紧张、失眠、过度疲劳、情绪变化等)、外因(如环境、气候变化、日光、及各种动物皮毛、植物、化妆品等)引起表皮及真皮浅层出现局限性多型皮疹及渗出倾向或浸润、肥厚为特征,伴有剧烈瘙痒,易反复发作的皮肤疾患。在所有皮肤病里,湿疹的发病率是最高的。同时湿疹会带来皮肤损伤,急性湿疹产生大面积的皮损、丘疱疹,有渗出倾向;慢性湿疹的患处皮肤会明显增厚,出现苔藓样变,且容易反复发作,十分影响患者的日常工作和生活。
目前,西医临床将湿疹归类为变态反应性疾患,并以尽快缓解瘙痒、控制皮肤炎症,恢复皮肤屏障功能,从而提高患者的生活质量为治疗原则。西医多采用内外兼治法,常建议患者口服扑尔敏、西替利嗪、氯雷他定、盐酸奥洛他定、特非那定等抗组胺药,同时结合外用糖皮质激素(如强的松、复方醋酸地塞米松乳膏等)及非激素治疗药物的钙调神经磷酸抑制剂和钙制剂(乳酸钙、葡萄糖酸钙等),或者配合炉甘石洗剂(初发无渗出液时使用)、3%硼酸溶液(有较多渗出或出现糜烂时使用)等局部外洗。虽然上述疗法及药物的使用简单,但其临床的实际治疗效果并不理想,长期反复使用可能引发皮肤萎缩、色素沉着等不良反应,且停药后容易复发,甚至引起内分泌代谢紊乱,难以较好控制。
因此,积极寻找一种能够减少炎性细胞募集、促进皮肤屏障功能恢复的药物,并找到突破性的湿疹治疗方法,成为许多医药学者关注的重点,也是本发明的主要目的。
发明内容
针对上述现有技术中的缺乏防治湿疹、瘙痒的特效药物的问题:
本发明的第一个目的在于提供一种有效防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂。
本发明的第二个目的在于提供一种上述防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂之制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂之医药用途。
本发明的发明构思如下:
湿疹是一种由多种内因(如慢性消化系统疾病、内分泌失调或精神紧张、失眠、过度疲劳、情绪变化等)、外因(如环境、气候变化、日光、及各种动物皮毛、植物、化妆品等)引起表皮及真皮浅层出现局限性多型皮疹及渗出倾向或浸润、肥厚为特征,伴有剧烈瘙痒,易反复发作的皮肤疾患。在所有皮肤病中,湿疹的发病率是最高的。
从局部皮肤的组织结构之病变来看,急性期湿疹患者的患部表皮呈海绵水肿状,棘层内及角层下有水疱,并可见局限性淋巴细胞及中性粒细胞浸润;其真皮浅层小血管扩张以及血管周围轻度以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。一旦恶化成亚急性,甚至慢性湿疹时,表皮会出现增厚、角化过度、明显海绵水肿以及真皮浅层小血管周围明显炎性细胞浸润、毛细血管数目增多,甚至内皮细胞肿胀和增生等异常变化。
目前,西医临床上防治湿疹是以尽快缓解瘙痒、控制皮肤炎症,恢复皮肤屏障功能,从而提高患者的生命质量为治疗原则。西医多采用内外兼治法,常建议患者口服扑尔敏、西替利嗪、氯雷他定、特非那定等抗组胺药,同时结合外用糖皮质激素及非激素治疗药物的钙调神经磷酸抑制剂和钙制剂,或者配合炉甘石洗剂、3%硼酸溶液等局部外洗。虽然上述疗法及药物的使用简单,但其临床的实际治疗效果并不理想,甚至产生各种不良反应,且病情易反复发作,难以较好控制。
当然,从湿疹的定义可得知,皮肤瘙痒是其重要的临床表现之一,更是严重影响患者的生活质量,且迫切需要及时有效治疗的最重要体征。
针对瘙痒的治疗,西医临床首先强调避免接触变应原、停用可疑药物和有效治疗原发病,同时以抗组胺H1和H2受体拮抗剂、糖皮质激素(对于儿童群体,尚无外用糖皮质激素的标准方案)、免疫调节等为主,但常因出现不良反应无法长期应用,致使治疗间断后,瘙痒又很快复发。
白芨多糖被报道具有免疫及修复化学性肝损伤的作用,也被发现具有修复皮肤屏障的效果,但白芨多糖能否防治湿疹、瘙痒就有待科学研究了。于是申请人进行了大量的科学实验检证,通过分别建立急、慢性湿疹以及瘙痒的动物模型,研究所制备的白芨多糖经外用局部给药对病症的治疗作用。研究结果证实了白芨多糖既可促使二硝基氟苯(DNFB)诱导的大鼠急、慢性湿疹病症,还能快速抑制组胺和4-氨基吡啶联合用药诱导的小鼠瘙痒体征,并快速促进修复各模型动物创面的皮肤组织结构;在防治湿疹方面,其效果明显优于西医、中医临床常用的对照药物(①抗炎西药:外用复方醋酸地塞米松乳膏;②具有清热燥湿、活血祛风、止痒消炎的中成药:外用复方黄柏液、冰黄肤乐软膏、奇正青鹏软膏)。
为了实现第一个目的,本发明采用了如下技术措施:
一种防治湿疹、瘙痒的白芨多糖外用药物,所述外用药物中白芨多糖浓度为1mg/ml。
为了实现第二个目的,本发明采用了如下技术措施:
一种上述防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖制剂的制备方法,将白芨多糖制成皮肤外用药物所能接受的任何剂型。
一种较为简单的制备方法,可采取如下步骤:
将白芨多糖干粉末溶于含Tween 80及甘油的超纯水中制备得到水相,将蛋黄卵磷脂溶于食用植物油中制备得到油相,按油相与水相体积比为1:4的比例将油相滴入水相中,搅拌后高速剪切、高压均质,得到白芨多糖溶液。具体操作步骤如下:
白芨多糖溶液的配制步骤:①将白芨多糖干粉末溶于超纯水中,在所得溶液中加入Tween 80以及甘油,得到含白芨多糖的水相(其中Tween 80的终浓度是1.25% V/V;甘油的终浓度是2.81% V/V);②将蛋黄卵磷脂溶于食用植物油中制备得到油相(蛋黄卵磷脂的终浓度是6% W/V,g/ml)。③在60℃恒温水浴的条件下,按油相与水相的体积比为1:4的比例,将油相滴入水相中,在1500r/min的条件下搅拌10min。④在20000rpm的条件下高速剪切2min,然后在1000bar的条件下高压均质3次即得到白芨多糖溶液,所得白芨多糖溶液中的白芨多糖的含量等于1mg/ml。
所述食用植物油选自芝麻油、花生油、椰油、豆油、亚麻油、蓖麻油和橄榄油中的至少一种,优选自芝麻油和椰油中的至少一种。
为了实现本发明的第三个目的,本发明还采用了如下技术措施:
本发明同时也提供了上述外用白芨多糖制剂在制备防治湿疹、瘙痒药物中的应用。
所述湿疹、瘙痒是由致敏和/或致炎药物所致。
白芨是我国名贵的传统中草药之一,因其具有良好的收敛止血、保湿、延缓皮肤衰老、消肿生肌之功效,在促进皮肤皲裂、破损的皮肤修复中有很高的药用价值。白芨多糖是从传统中药白芨提取而得的葡甘聚糖,被发现具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、促进胃消化等作用,是一种低毒、安全的高分子聚合物,具有很大的开发价值。那么源自于白芨的白芨多糖能否有效防治湿疹、瘙痒等皮肤问题,还有待大量的科学举证。
与现有技术相比,本发明具有以下优点和效果:
研究结果表明经外用给予本发明中的白芨多糖外用药物之后能快速消除湿疹、瘙痒之疾苦。其防治效果明显优于或接近于西医、中医临床常用的对照药物(①抗炎、抗过敏的西药:复方醋酸地塞米松乳膏;②具有清热燥湿、活血祛风、止痒消炎的中成药:外用复方黄柏液、冰黄肤乐软膏、奇正青鹏软膏)。
本发明中的白芨多糖外用药物对防治湿疹、瘙痒具有以下优势:①药物成本低;②外用使用方便,见效很快,效果佳。
附图说明
图1为受试药物对急性湿疹患部皮肤的影响及其损伤程度的评分图。A为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及复方黄柏液(HBXJ)对实验大鼠患部皮肤外观的影响图;B为其评分图。图中*、**和***分别标识与模型组相比,P值小于0.05、0.01和0.001。图中标尺为1厘米。
图2为受试药物对急性湿疹患部皮肤病理结构的影响及其病理评分图。A为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及复方黄柏液(HBXJ)对实验大鼠患部皮肤病理组织的影响(HE染色结果)图;B为其评分图。图中白色线段表示大鼠增厚的皮肤组织表皮层;白色箭头表示炎性细胞浸润;白色空心箭头表示皮下纤维组织;图中*、**和***分别标识与模型组相比,P值小于0.05、0.01和0.001。图中标尺为200微米(物镜:×4)和50微米(物镜:×20)。
图3为受试药物对慢性湿疹患部皮肤的影响及其损伤程度的评分图。A为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及冰黄肤乐(BHFL)对实验大鼠患部皮肤外观的影响图;B为其评分图。图中*、**和***分别标识与模型组相比,P值小于0.05、0.01和0.001。图中标尺为1厘米。
图4为受试药物对慢性湿疹患部皮肤病理结构的影响及其病理评分图。A为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及冰黄肤乐(BHFL)对实验大鼠患部皮肤病理组织的影响(HE染色结果)图;B为其评分图。图中白色线段表示大鼠增厚的皮肤组织表皮层;白色箭头表示炎性细胞浸润;白色空心箭头表示皮下纤维组织;图中*、**和***分别标识与模型组相比,P值小于0.05、0.01和0.001。图中标尺为200微米(物镜:×4)和50微米(物镜:×20)。
图5为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及青鹏软膏(QP)对实验小鼠瘙抓频率的影响图。横轴的“-1”标识造模前的测试结果;*、**、***标识为P<0.05、0.01以及0.001,并分别为在相应的时间点,受试药物组与模型组间差异性比较。
图6为白芨提取物(Bletilla striata)、白芨多糖(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏(DXMS)以及青鹏软膏(QP)对实验小鼠瘙抓部位皮肤结构病理学改变(HE染色图以及右下方的病理学评分图)的影响图。在HE染色图中在HE病理图中白色线段表示表皮增厚;白色实心箭头表示炎性细胞浸润;白色空心箭头表示皮下纤维组织。**、***标识为P<0.01及0.001,并分别为在相应的时间点,受试药物组与模型组间差异性比较。图中标尺为100微米(物镜:×4)和50微米(物镜:×20)。
具体实施方式
下面申请人将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明,目的在于使本领域技术人员对本申请有更加清楚的理解和认识。
实施例1:一种防治湿疹、瘙痒的外用白芨多糖的制备方法,其步骤如下。
白芨多糖溶液的配制步骤:①将白芨多糖干粉末(购自于四川省维克奇生物科技有限公司,其纯度≥90%)溶于超纯水中,在所得溶液中加入Tween 80以及甘油,得到含白芨多糖的水相(其中Tween 80的终浓度是1.25% V/V;甘油的终浓度是2.81% V/V);②将蛋黄卵磷脂溶于芝麻油中制备得到油相(蛋黄卵磷脂的终浓度是6% W/V,g/mL)。③在60℃恒温水浴的条件下,按油相与水相的体积比为1:4的比例,将油相滴入水相中,然后在1500r/min的条件下搅拌10min。④在20000rpm的条件下高速剪切2min,然后在1000bar的条件下高压均质3次即得到白芨多糖溶液,所得白芨多糖溶液中的白芨多糖的含量等于1mg/ml。
白芨提取物的制备:将1.62L芝麻油置入容器中,然后加入白芨的干粉末20g,搅拌均匀;置于胶体磨中在常温环境下循环研磨5h。停止后,再经过闪式提取装置20000rpm高速剪切3次(每次5min);负压过5000目筛,收集滤油,得外用白芨提取物,分装于100ml灭菌瓶后密闭储存。
实施例2实施例1制备的白芨多糖溶液对DNCB诱导的大鼠接触性急性湿疹模型的影响
受试动物为雄性的6周龄SPF级SD大鼠24只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食,饲养期间温度保持在25±1℃,明暗周期为12小时。
1)分组建模与给药
将24只大鼠随机均分为6组:空白组、模型组、白芨提取物组、白芨多糖组、复方醋酸地塞米松乳膏组、复方黄柏液组。
在适应性饲养7天后,每只大鼠用剃毛刀紧贴皮肤粗略剪去背部实验位置鼠毛,暴露皮肤位置的区域大小约为3cm×3cm的区域,再用脱毛膏再次脱毛,脱毛后立即用温水彻底洗净,使实验部位皮肤裸露以备用。脱毛1天后,除空白组不做任何损伤处理外,将其余组所有大鼠都实施乙醚吸入麻醉,并置于固定架上,然后用7%DNCB丙酮溶液100μL外涂大鼠裸露背部皮肤致敏;脱毛2天后,同法强化涂抹1次,再次致敏;脱毛7天后,在大鼠背部裸露皮肤用移液枪外涂1%DNCB丙酮溶液20μL激发。以大鼠背部区域出现明显的渗出、丘疹、红斑等为造模成功。
在给药当天,除空白组外,模型组大鼠的创伤部位涂抹0.25ml生理盐水;白芨提取物组、白芨多糖组则分别予以各组大鼠的创伤部位涂抹白芨提取物、白芨多糖(1mg/ml;实施例1制备的白芨多糖溶液)各0.25ml;复方醋酸地塞米松乳膏组予以各组大鼠的创伤部位涂抹复方醋酸地塞米松乳膏(华润三九医药股份有限公司)0.25ml;复方黄柏液组予以各组大鼠的创伤部位涂抹复方黄柏液(山东汉方制药有限公司)0.25ml。每天给药1次,连续给药3次。
2)急性湿疹造模前后受试大鼠的皮肤大体观察
选择造模成功当天、给药1天后、给药2天后和给药3天后等4个时间段,用索尼单反微距照相机记录大鼠背部创面,得到各时段急性湿疹大鼠皮肤变化图。针对皮肤致敏反应实验评分标准表对各组大鼠背部皮损的严重程度(表1)进行评分,且评估过程中,为了避免主观因素,需至少两个人(本例为3人)同时进行独立评估,结果取平均值。
表1.皮肤致敏反应实验评分标准表。
3)受试大鼠创伤组织的HE染色和病理分析
给药3天后,采用麻醉方法处死所有受试动物,取下创伤部位的皮肤组织,用纱布包裹后,置于福尔马林溶液中固定24h。然后将皮肤组织依次进行流水冲洗、脱水、石蜡包埋,接着进行组织切片、HE常规染色,并在光学显微镜下观察并拍照。
大鼠皮损组织的病理评分:在光学显微镜下,按照下面炎性评分表(表2)对大鼠皮肤组织进行病理学评分,并以mean±SEM表示。
表2.大鼠皮损组织的病理评分。
4)实验结果
(1)DNCB诱导急性湿疹大鼠的皮肤大体观察
如图1所示,经DNCB诱导的大鼠急性湿疹造模成功当天至给药3天后的期间,可以观察到空白组大鼠皮肤为淡红色,细致滑嫩,质地柔软,皮肤纹理清晰可见。
a)模型组大鼠造模成功后当天创面出现重度红斑、重度水肿,并伴有渗出、焦痂形成:给药1天后,模型组大鼠创面皮肤焦痂面积变小,仍有大面积鳞屑,红斑和水肿程度稍微减轻;给药2天后,模型组大鼠皮肤创面进一步减小,焦痂仍然存在,且痂皮颜色变深,但红斑、水肿较1天后程度减轻;给药3天后,创面仍有小部分痂皮,且伴随较明显红斑、水肿。
b)而相比模型组,模拟临床用药的复方醋酸地塞米松乳膏组和复方黄柏液组(给药1天后仍有大面积焦痂且痂皮颜色较深;给药2天后留有小部分焦痂,伴有红斑水肿;给药3天后痂皮仍未完全脱落)有一定改善。
c)相比模型组,白芨提取物组大鼠皮肤在给药1天后结痂且痂皮颜色变深;给药2天后痂皮部分脱落,痂面周围仍有水肿、红斑;给药3天后留有小部分痂皮、红斑。
d)相比白芨提取物组的恢复效果,白芨多糖组的表现较好:给药第1天后痂皮颜色变深且焦痂面积变小;给药第2天后焦痂、鳞屑大部分脱落,留有红斑、水肿;给药第3天后红斑、水肿消失,留有小面积鳞屑和痂皮未脱落。
从实验造模成功至给药3天后的期间,根据皮肤致敏反应实验评分标准表对各组大鼠背部皮损的严重程度进行评分(满分为14分;评分表见表1),空白组大鼠评分记为0分,根据急性湿疹大鼠外观评分图(图1)可以发现:
(1)模型组大鼠从造模成功当天到给药3后天整体评分变化趋势较缓慢;
(2)相比模型组,各受试药物组评分变化差异较大:
在给药1天后,相比模型组(12.5±0.3;P<0.001),复方醋酸地塞米松乳膏组(11.3±0.5)和复方黄柏液组(12.3±0.3)的外观评分均有一定改善;
在给药2天后,相比模型组(10.0±0.4),复方醋酸地塞米松乳膏组(6.0±0.4;P<0.01)和复方黄柏液组(8.0±0.7)的外观评分均有一定改善;
在给药3天后,相比模型组(8.5±0.3),复方醋酸地塞米松乳膏组(4.0±0.4;P<0.01)和复方黄柏液组(3.5±0.5;P<0.01)大鼠皮肤虽仍然有痂皮、红肿,但展示了对皮肤有较好的修复能力和治疗效果。
在给药1天后,相比模型组的大鼠外观评分(12.5±0.3),白芨提取物组(10.7±0.2;P<0.05)、白芨多糖组(10.2±0.3;P<0.01)的大鼠皮肤外观评分均较小;
在给药2天后,相比模型组的大鼠外观评分(10.0±0.4),白芨提取物组(6.0±0.4;P<0.01)、白芨多糖组(5.7±0.2;P<0.01)的大鼠皮肤外观评分较接近;
在给药3天后,相比模型组的大鼠外观评分(8.5±0.3),通过比较发现,白芨提取物组(3.3±0.5;P<0.01)和白芨多糖组(2.8±0.4;P<0.001)评分较接近。
(2)DNCB诱导急性湿疹大鼠创伤组织的HE染色观察和病理分析
给药3天后(实验第10天),采用麻醉方法将所有受试大鼠处死,取其创伤部位皮肤组织,进行HE染色后,得到病理分析结果如图2所示。
可以看到空白组大鼠表皮层和真皮层细胞排列正常,无水肿,且可见大量毛囊及其他附属器官,未见异常的病理学形态改变。
a)相比空白对照组,模型组大鼠皮肤组织呈现:①表皮层结构欠完整,表皮层与真皮层比例失调,角质层、颗粒层增厚,棘层肥厚,表皮突增宽延长;②真皮层可见大量汗腺增生和炎性细胞浸润;③其皮肤组织的病理评分(2.7±0.5;P<0.001)显著少于空白组(10.0±0.0)。
b)与模型组相比,复方醋酸地塞米松乳膏组疗效不甚明显:①表皮层结构较紊乱粗糙,表皮过度角化,角质层、颗粒层增厚较模型组并未明显改善,表皮突增宽延长;②真皮层可见毛囊等皮肤附属器生发且伴有大量炎性细胞浸润和红细胞外溢;③其皮肤组织病理评分(4.7±0.5)略高于模型组。
c)同时,对比模型组,复方黄柏液组的治疗效果也不太理想:①表皮层虽结构完整,但角质层增厚、棘层肥厚无明显改善,表皮突增宽延长;②真皮层可见毛囊等皮肤附属器生发且伴有炎性细胞浸润和红细胞外溢;③其皮肤组织的病理评分(6.0±0.4;P<0.01)较高于模型组。
d)白芨提取物组大鼠皮肤组织:①皮肤全层结构完整,表皮可见明显角化,角质层、颗粒层增厚;②真皮层可见毛囊等皮肤附属器生发且伴有中度炎性细胞浸润,组织间充血水肿;③其皮肤组织的病理评分(6.0±0.4;P<0.001)较高于模型组。
e)而白芨多糖组的效果较明显:①皮肤全层结构完整,皮肤角质层较模型组变薄,表皮突略微增宽延长;②真皮层可见大量毛囊等皮肤附属器生发,未见明显炎性细胞浸润和红细胞外溢;③其皮肤组织病理评分(6.5±0.6;P<0.001)显著多于模型组。
实施例3实施例1制备的白芨多糖溶液对DNCB诱导的大鼠接触性慢性湿疹模型的影响
受试动物为雄性的6周龄SPF级SD大鼠24只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食,饲养期间温度保持在25±1℃,明暗周期为12小时。
1)分组建模与给药
将24只大鼠随机均分为6组:空白组、模型组、白芨提取物组、白芨多糖组、复方醋酸地塞米松乳膏组、冰黄肤乐软膏组。
在适应性饲养7天后,每只大鼠用剃毛刀紧贴皮肤粗略剪去背部实验位置鼠毛,暴露皮肤位置的区域大小约为3cm×3cm的区域,再用脱毛膏再次脱毛,脱毛后立即用温水彻底洗净,使实验部位皮肤裸露以备用。脱毛后第1天,除空白组不做任何损伤处理外,将其余组所有大鼠都实施乙醚吸入麻醉,并置于固定架上,然后用7% DNCB丙酮溶液100μL外涂大鼠裸露背部皮肤致敏;1周后对大鼠背部剪毛区域再次去毛,次日外涂5%DNCB丙酮溶液50μL,进行第2次致敏。此后继续致敏,每5天1次,连续3次。以大鼠背部区域出现皮肤增厚、表面粗糙、丘疹、红肿等皮肤外观改变为造模成功。
在造模实验成功后第3天,除空白组外,模型组大鼠的创伤部位涂抹0.25ml生理盐水;白芨提取物组、白芨多糖组则分别予以各组大鼠的创伤部位涂抹白芨提取物、白芨多糖(1mg/ml;实施例1制备的白芨多糖溶液)各0.25ml;复方醋酸地塞米松乳膏组予以大鼠的创伤部位涂抹复方醋酸地塞米松乳膏0.25ml;冰黄肤乐软膏组予以大鼠的创伤部位涂抹冰黄肤乐软膏(西藏海容唐果药业有限公司)0.25ml。每天1次,连续给药3次。
2)慢性湿疹造模前后受试大鼠的皮肤大体观察
选择造模成功当天以及给药1天后、3天后等3个时间段,用索尼单反微距照相机记录大鼠背部创面,得到各时段慢性湿疹大鼠皮肤变化图。针对皮肤致敏反应实验评分标准表(表1)对各组大鼠背部皮损的严重程度进行评分,且评估过程中,为了避免主观因素,采用两个人同时进行独立评估,结果取平均值。
3)受试大鼠创伤组织的HE染色和病理分析
给药3天后,先拍照再采用麻醉方法处死所有受试动物,取下创伤部位的皮肤组织,用纱布包裹后,置于福尔马林溶液中固定24h。然后将皮肤组织依次进行流水冲洗、脱水、石蜡包埋,接着进行组织切片、HE常规染色,并在光学显微镜下观察并拍照。
大鼠皮损组织的病理评分:在光学显微镜下,按照炎性评分表(表2)对大鼠皮肤组织进行病理学评分,并以mean±SEM表示。
4)实验结果
(1)DNCB诱导慢性湿疹大鼠的皮肤大体观察
a)如图3所示,DNCB诱导大鼠慢性湿疹造模成功至给药3天后的期间,可以观察到空白组大鼠皮肤为淡红色,细致滑嫩,质地柔软,皮肤纹理清晰可见。
b)模型组大鼠造模成功后创面有重度红斑、重度水肿,并伴有严重剥脱、鳞屑:给药1天后,模型组大鼠创面皮肤鳞屑、剥脱面积变小,红斑和水肿程度稍微减轻;给药3天后,模型组大鼠皮肤创面进一步减小,鳞屑、剥脱仍然存在,且仍有红斑、水肿情况。
c)相比模型组,模拟临床用药的复方醋酸地塞米松乳膏组和冰黄肤乐软膏组(给药1后天仍有大面积鳞屑且痂皮颜色较深;给药3天后仍有小部分痂皮未脱落,伴有红斑水肿)有一定疗效。
d)白芨提取物组大鼠皮肤在给药第1天后结痂且痂皮颜色变深,痂面周围有红斑和水肿;给药第3天后痂皮部分脱落,留有小部分痂皮,且痂皮周围伴有红斑、水肿。
e)相比白芨提取物组的恢复效果,白芨多糖组的表现较好:给药1天后痂面面积变小;给药3天后鳞屑大部分脱落,留有小部分痂皮,伴有小面积红斑。
从实验造模成功至给药3天后的期间,根据皮肤致敏反应实验评分标准表对各组大鼠背部皮损的严重程度进行评分(满分为12分),空白组大鼠评分记为0分。
a)根据慢性湿疹大鼠外观评分图(图3)可以发现,模型组大鼠从造模成功当天到给药3天后的整体评分变化趋势较缓慢;
b)而阳性对照药组评分变化明显:
给药1天后,相比模型组(10.0±0.4;P<0.001),复方醋酸地塞米松乳膏组(8.8±0.5)和冰黄肤乐软膏组(6.8±0.5;P<0.05)大鼠皮肤外观评分相比模型组的变化较小。
在给药3天后,相比模型组(6.7±0.6),复方醋酸地塞米松乳膏组(4.0±0.4)和冰黄肤乐软膏组(3.5±0.6)的大鼠皮肤还仍然有痂皮、红肿。
d)相比模型组,白芨提取物组和白芨多糖组也展现了不错的的修复效果:
在给药1天后,相比模型组大鼠外观评分(10.3±0.3),白芨提取物组(6.8±0.3;P<0.001)、白芨多糖组(6.0±0.4;P<0.01)的大鼠皮肤外观评分均较小;
给药3天后,模型组大鼠外观评分为7.3±0.4;通过组间比较,可发现白芨多糖组评分最低(3.3±0.3;P<0.01),白芨提取物组(3.8±0.3;P<0.01)效果稍微弱于白芨多糖组。
2)DNCB诱导慢性湿疹大鼠创伤组织的HE染色观察和病理分析
给药3天后,采用麻醉方法将所有受试大鼠处死,取其创伤部位皮肤组织,进行HE染色后,得到病理分析结果如图4所示。可以看到空白组大鼠表皮层和真皮层细胞排列正常,无水肿,且可见大量毛囊及其他附属器官,无任何异常的病理学形态改变。
a)相比空白对照组,模型组大鼠皮肤组织呈现:①表皮层结构模糊,表皮层与真皮层比例失衡,可见明显角化,角质层、颗粒层增厚,棘层肥厚,表皮突增宽延长;②真皮层炎性细胞浸润;③其皮肤组织的病理评分(1.5±0.3;P<0.001)显著少于空白组(10.0±0.0)。
b)相比模型组,复方醋酸地塞米松乳膏组(3.8±0.5;P<0.05)疗效不甚明显:①表皮层结构模糊,过度角化,角质层、颗粒层增厚与模型组相比无明显改善,棘层肥厚;②真皮层增厚,可见纤维过度增生且伴有中度炎性细胞浸润;③其皮肤组织病理评分略高于模型组。
c)同时,相比模型组,冰黄肤乐软膏组(5.2±0.4;P<0.01)的治疗效果也不太理想:①表皮层增厚与模型组相比无明显改善,过度角化,细胞间隙增厚,棘层肥厚无明显减轻,表皮突增宽延长;②真皮层增厚,可见纤维过度增生且伴高度炎性细胞浸润和红细胞外溢;③其皮肤组织的病理评分较高于模型组。
相比较模型组,白芨提取物组和白芨多糖组也展现了一定的修复疗效:
d)白芨提取物组大鼠皮肤组织:①表皮层结构不太清晰,表皮层增厚,细胞间隙增厚;②真皮层有炎性细胞浸润,间质充血水肿;③其皮肤组织的病理评分(5.0±0.4;P<0.001)较高于模型组。
e)而白芨多糖组的皮肤组织表现较好:①表皮层清晰完整,皮肤角质层较模型组变薄,角化物质轻微增厚;②真皮层有少量中性粒细胞浸润;③其皮肤组织病理评分(6.7±0.2;P<0.001)显著多于模型组。
实施例4实施例1制备的白芨多糖溶液对组胺和4-氨基吡啶联合用药瘙痒模型的影响
受试动物为雄性的6周龄的SPF级KM小鼠30只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食,饲养期间温度保持在25±1℃,明暗周期为12小时。
1)分组建模与给药
将健康SPF级KM小鼠30只,随机均分成6组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、白芨提取物组(Bletilla striata)、白芨多糖组(BSP)、复方醋酸地塞米松乳膏组(DXMS)、奇正青鹏软膏组(QP)。在适应性饲养7天后,每只小鼠用剃毛刀紧贴皮肤粗略剪去颈背部耳后毛发,暴露皮肤位置的区域大小约为直径1.0cm左右的圆形区域,再用脱毛膏再次脱毛;脱毛后立即用温水彻底洗净,使实验部位皮肤裸露以备用;脱毛1天后,录像记录各组小鼠给药前的瘙痒频率;脱毛2天后除对照组不做皮下注射外,将其余组所有小鼠颈背部位皮下注射组胺(2mg/ml,50μl)和4-氨基吡啶(0.8mg/ml,50μl),用于诱导小鼠的瘙抓行为。
在建模过程中,除空白对照组外,分别给模型组、白芨提取物组、白芨多糖组、复方醋酸地塞米松乳膏组、奇正青鹏软膏组的动物予以皮下注射组胺(2mg/ml,50μl)和4-氨基吡啶(0.8mg/ml,50μl),立即置于透明观察箱中观察30min,并用数码摄像机记录瘙抓潜伏期和瘙抓总次数。第二次注射造模药时提前给除对照组和模型组外,其余各组每只小鼠剃毛部位涂抹白芨提取物、白芨多糖(1mg/ml;实施例1制备的白芨多糖溶液)、复方醋酸地塞米松乳膏(华润三九医药股份有限公司)、奇正青鹏软膏(西藏奇正藏药股份有限公司),持续4天,直至实验结束。
2)受试小鼠的挠痒的行为学观察和瘙痒评分
通过小鼠行为学挠痒数观察各组之间的瘙痒严重程度。在小鼠颈背部皮下注射组胺和4-氨基吡啶后,立刻将小鼠放入透明观察笼,并在无人安静的环境中拍摄30min,记录小鼠挠痒行为的次数。以小鼠抬起后爪刮擦剃过的区域,并将爪子放回地板或嘴巴至停止记作1次瘙抓(连续瘙抓也记作1次)。记录各组小鼠瘙痒频率(图5)。
3)受试小鼠创面组织的HE染色和病理分析
每天一次,给药4天后(也就是实验结束日),采用麻醉方法处死所有受试动物,取下创伤部位的皮肤组织,用纱布包裹后,置于福尔马林溶液中固定24h。然后将皮肤组织依次进行流水冲洗、脱水、石蜡包埋,接着进行组织切片、HE常规染色,并在光学显微镜下观察,对皮肤组织进行病理学评分(图6)。
4)实验结果
(1)瘙痒小鼠的案例分析
在拟实施记录6个时间段(给造模药前1天、仅给造模药当天、给治疗药1天后、2天后、3天后、4天后),对由组胺和4-氨基吡啶联合用药引起瘙痒的小鼠进行透明观察笼中30min瘙抓次数记录(其结果如图5所示)。
a)由图5可以看出本次实验造模方案十分成功,各组小鼠在造模当天给予造模药后瘙抓频率显著提高,在30min内瘙抓频率普遍在30-40次范围内。给药后1、2、3、4天后空白组的瘙抓次数无明显改变(分别是1.2±0.3、1.4±0.2、2.0±0.5、1.6±0.4);
b)与空白组相比较,在给药后1、2、3、4天后模型组小鼠的瘙抓频次数显著增高(分别是37.8±1.8,P<0.001;36.6±1.8,P<0.001;35.0±1.3,P<0.001;34.2±1.5,P<0.001)。在实验期间空白组与模型组小鼠的瘙痒频率保持相对稳定,说明本造模方案是成功的。
c)与模型组相比较,经过给药后1、2、3、4天后复方醋酸地塞米松乳膏组的小鼠的瘙抓次数(分别是28.6±3.1,P<0.01;16.0±0.7,P<0.001;15±1.3,P<0.001;16.4±2.3,P<0.001)也随着给药时间的推移而呈现明显下降,亦具有显著性差异。结果说明复方醋酸地塞米松乳膏对由组胺和4-氨基吡啶联合用药引起的瘙痒也具有不错的治疗效果。
d)与模型组相比较,经过给药后1、2、3、4天后奇正青鹏软膏组小鼠的瘙抓次数(分别是25.8±0.9,P<0.001;22.8±1.4,P<0.001;21.0±2.2,P<0.001;17.3±2.0,P<0.001)也随着给药时间的推移呈现出明显的下降,具有显著性差异,提示青鹏软膏对由组胺和4-氨基吡啶联合用药引起的瘙痒也表现出较好的治疗效果。
e)与模型组相比较,经过给药后1、2、3、4天后,白芨多糖组小鼠的瘙抓次数(分别是37.4±1.9;20.4±1.5,P<0.001;23.8±3.9,P<0.01;22.2±1.3,P<0.001)也随着给药时间的推移呈现出明显的下降,并在给药后2、3、4天后有显著性差异。结果表明白芨多糖对由组胺和4-氨基吡啶联合用药引起的瘙痒具有一定的缓解效果。
f)与模型组相比较,经过给药后1、2、3、4天后,白芨提取物组小鼠的瘙抓次数(分别是30.8±1.9;28.6±1.8;22.2±2.4,P<0.001;20.8±1.8,P<0.001)也随着给药时间的推移呈现明显的下降,并在给药后3、4天后有显著性差异。结果表明白芨提取物对由组胺和4-氨基吡啶联合用药引起的瘙痒具有一定的治疗效果。
(2)组织病理学实验结果
将所有受试小鼠脱颈椎处死后(造模4天后),取其患部皮肤行HE染色后的病理分析结果如图6所示。
a)由图6A可以看出,空白组小鼠表皮层结构完整,上皮细胞呈极性排列;皮下可见大量毛囊及其他附属器官,未见水肿和炎细胞巢浸润等异常的病理学形态改变。
b)相比空白对照组,模型组小鼠瘙抓部位的皮肤:①表皮层部分缺失且结构紊乱,表皮层明显增厚;②真皮层可见明显水肿和大量炎细胞巢浸润;③其皮肤组织的病理评分(2.0±0.3,P<0.001)显著少于空白组(9.0±0.3)。
c)相比模型组,复方醋酸地塞米松乳膏组小鼠瘙抓部位的皮肤呈现:①表皮层结构完整,轻度增厚;②真皮层可见毛囊增生和轻度水肿以及少量炎性细胞浸润;③其皮肤组织病理评分(6.8±0.3;P<0.001)显著高于模型组。
d)相比于模型组,青鹏软膏组小鼠瘙抓部位的皮肤呈现:①表皮层结构完整,轻度增厚;②真皮层可见少量毛囊增生以及少量炎细胞浸润;③其皮肤组织病理评分(5.4±0.2;P<0.001)显著高于模型组。
e)相比于模型组,白芨提取物组小鼠瘙抓部位的皮肤呈现:①表皮层结构完整,轻度增厚,上皮细胞排列尚可;②真皮层可见毛囊等皮肤附属器增生;③其皮肤组织病理评分(4.6±0.2,P<0.001)高于模型组。
f)相比于模型组,白芨多糖组小鼠瘙抓部位的皮肤呈现:①表皮层结构部分缺失,②真皮层可见毛囊等皮肤附属器增生和局灶性炎细胞浸润;③其皮肤组织病理评分(3.4±0.2,P<0.01)高于模型组。
Claims (6)
1.白芨多糖在制备防治湿疹和/或瘙痒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述湿疹和/或瘙痒是由致敏和/或致炎药物所致。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,将白芨多糖制成皮肤外用药物所能接受的任何剂型。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,将白芨多糖干粉末溶于含Tween80及甘油的超纯水中制备得到水相,将蛋黄卵磷脂溶于食用植物油中制备得到油相,按油相与水相体积比为1:4的比例将油相滴入水相中,搅拌后高速剪切、高压均质,即得。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,水相中:Tween 80的终浓度是1.25%V/V,甘油的终浓度是2.81%V/V;油相中:蛋黄卵磷脂的终浓度是6%W/V,g/mL。
6.根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于,所述食用植物油选自芝麻油、花生油、椰油、豆油、亚麻油、蓖麻油和橄榄油中的至少一种。
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