CN113952372B - 一种用于治疗特应性皮炎的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种银柴胡超临界萃取物的用途,用于制备治疗特应性皮炎的药物,该银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:甘油磷脂0.5%‑0.6%、鞘脂0.02%‑0.03%、甘油酯9%‑11%、固醇类85%‑90.5%、孕烯醇酮脂0.01%‑0.02%、脂肪酰0.3%‑0.4%、糖脂0.07%‑0.09%。本发明提供的用于治疗特应性皮炎的组合物成分天然、安全、且无副作用,对特应性皮炎的治疗效果与地塞米松相当。
Description
技术领域
本发明属于中草药化学成分的提取技术领域,具体涉及一种用于治疗特应性皮炎的组合物及其用途。
背景技术
银柴胡为宁夏道地药材,其石竹科繁缕属植物银柴胡(Stellaria dichotomaL.var.lanceolata Bge.)的干燥根,性寒味甘,文献记载银柴胡具有清虚热、除疳热等功效。目前发现的银柴胡活性成分主要有17种挥发性物质、7种甾醇类、3种酚酸类、10种环肽类及7种生物碱类。有文献表明,银柴胡在解热抗炎、抗过敏、抗癌、促进血管舒张等方面已有应用,也被用来治疗自敏性皮炎和接触性皮炎,文献记载许多含有银柴胡的煎剂可治疗过敏性疾病,疗效均较显著,比如辛乌汤可治疗过敏性鼻炎;以银柴胡为主要成分,加防风、乌梅、五味子、甘草、组成过敏煎,用来治疗过敏性皮肤病荨麻疹,银柴胡主要起到清虚热,除疳热,清热凉血的功效。
随着社会的发展和生活环境的改变,人们患上过敏性疾病概率也在逐年上升,据相关报道,全球约有30%的人为过敏性疾病所困扰。而过敏性疾病常伴随皮肤黏膜的变态反应,即过敏性皮肤病。其常指由过敏原所引起的变态反应,由于过敏原的不同,从而引起不同的过敏反应类型,如荨麻疹、特应性皮炎、湿疹等,但其共同的临床表现常为瘙痒不止,缠绵难愈,反复发作,极大影响了患者的正常生活,甚至会影响患者的心理健康。糖皮质激素类药物,钙调神经磷酸酶抑制剂,外用抗微生物制剂,抗组胺药和抗炎症介质药物,免疫抑制剂等缓解特应性皮炎的症状。 但是,上述药物存在较大的不良反应,并且,多数患者对激素类药物存在顾虑,这些不仅给特应性皮炎治疗带来了极大的困难,同时,也给患者的生活带来了极大的困扰,此外,这些药物对于个别患者来说存在较差的耐受性。 因此,仍然需要一种药物,既不会给患者带来副作用,同时,也能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展,缓解患者皮肤瘙痒、湿疹等症状,并且,还能够应用于各类别的患者,对患者具有良好的耐受性。因此,抗过敏药物的研究是目前社会所急迫、所必须的。
发明内容
为了解决以上技术问题,本发明提供了一种用于治疗特应性皮炎的组合物,该用于治疗特应性皮炎的组合物以重量百分比计,含有以下组分:
固醇88.111%、甘油酯10.868%、脂肪酰0.362%、孕烯醇酮脂0.013%、甘油磷脂0.532%、糖脂0.085%、鞘脂0.029%。
进一步地,该用于治疗特应性皮炎的组合物采用超临界萃取法从银柴胡中萃取制得。
现有技术中,银柴胡可用于治疗自敏性皮炎和接触性皮炎,但未公开其可以用于治疗特应性皮炎;本发明意外地发现,通过本申请的方法提取得到的银柴胡超临界萃取物可以单独用于治疗特应性皮炎,无需与任何其他的药物进行配伍,其治疗效果与激素类药物地塞米松相当;本发明提供的银柴胡超临界萃取物在30℃以下时为膏状,高于30℃时为液态,因此需要在30℃以下保存。
另一方面,本发明还提供了一种银柴胡超临界萃取物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗特应性皮炎,所述银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:
甘油磷脂0.5%-0.6%、鞘脂0.02%-0.03%、甘油酯9%-11%、固醇类85%-90.5%、孕烯醇酮脂0.01%-0.02%、脂肪酰0.3%-0.4%、糖脂0.07%-0.09%;
该用于治疗特应性皮炎的组合物的有效剂量为2mg/kg~10mg/kg。
另一方面,本发明还提供了一种银柴胡超临界萃取物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗皮肤瘙痒,所述银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:
甘油磷脂0.5%-0.6%、鞘脂0.02%-0.03%、甘油酯9%-11%、固醇类85%-90.5%、孕烯醇酮脂0.01%-0.02%、脂肪酰0.3%-0.4%、糖脂0.07%-0.09%;
该用于治疗特应性皮炎的组合物的有效剂量为2mg/kg~10mg/kg。
另一方面,本发明还提供了一种银柴胡超临界萃取物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗特应性皮炎导致的皮肤损伤,所述银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:
甘油磷脂0.5%-0.6%、鞘脂0.02%-0.03%、甘油酯9%-11%、固醇类85%-90.5%、孕烯醇酮脂0.01%-0.02%、脂肪酰0.3%-0.4%、糖脂0.07%-0.09%;
该用于治疗特应性皮炎的组合物的有效剂量为2mg/kg~10mg/kg。
另一方面,本发明还提供了一种银柴胡超临界萃取物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗特应性皮炎导致的皮肤干燥,所述银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:
甘油磷脂0.5%-0.6%、鞘脂0.02%-0.03%、甘油酯9%-11%、固醇类85%-90.5%、孕烯醇酮脂0.01%-0.02%、脂肪酰0.3%-0.4%、糖脂0.07%-0.09%;
该用于治疗特应性皮炎的组合物的有效剂量为2mg/kg~10mg/kg。
进一步地,银柴胡超临界萃取物的制备方法包括以下步骤:
(1)将银柴胡药材粉碎至40-60目;
(2)将粉碎后的银柴胡投入萃取釜中,设定萃取釜的萃取温度为40-50℃、萃取压力为25-35Mpa,分离釜Ⅰ的压力为6MPa-10MPa,温度为50℃-60℃,萃取釜的分离釜Ⅱ的压力为6MPa-10MPa,温度为30℃-40℃,萃取时间为1-3h,即得治疗特应性皮炎的银柴胡超临界萃取物。
进一步地,步骤(2)中设定萃取釜的萃取温度为 47 ℃,萃取压力 35 MPa,萃取时间为3h。
进一步地,步骤(2)中设定萃取釜的萃取温度为 50℃,萃取压力 30 MPa,萃取时间为3h。
进一步地,步骤(2)中设定萃取釜的萃取温度为45℃,萃取压力 30 MPa,萃取时间为2h。
进一步地,银柴胡超临界萃取物为外用医药品。
进一步地,银柴胡超临界萃取物为外用化妆品。
本发明提供的用于治疗特应性皮炎的组合物成分天然、安全、且无副作用,对特应性皮炎的治疗效果与地塞米松相当。
附图说明
图1.为银柴胡超临界萃取物对小鼠抓挠次数的影响柱状图;与 Contoul 组比较,# p < 0.05,## p < 0.01,###p<0.0001;与 模型组比较,* p < 0.05,** p <0.01,***p<0.001(n=8);
图2为小鼠皮肤病变的临床变化;
图3.为银柴胡超临界萃取物对AD小鼠皮损评分的影响;
图4.为银柴胡提取物对AD小鼠皮损组织病理学的影响;HE染色(200×);
图5a.为银柴胡提取物对AD小鼠肥大细胞浸润的影响;TB染色 (200×),图中箭头指示为肥大细胞;
图5b.为肥大细胞数量统计结果,与 Contoul 组比较,# p < 0.05,## p <0.01,###p<0.001;与 模型组比较,* p < 0.05,** p < 0.01,***p<0.001;
图6a.为银柴胡超临界萃取物对小鼠血清中IgE含量的影响;
图6b.为银柴胡超临界萃取物对小鼠血清中IL-4含量的影响;
图6c.为银柴胡超临界萃取物对小鼠血清中IFN-γ含量的影响。
具体实施方式
1 材料
1.1 材料
动物:ICR小鼠,雌鼠(SPF)级,6-8周龄,体重18-20g,环境温度保持在 22±1℃,湿度保持在 50~60%,宁夏医科大学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(宁)2020-0001。
药品与试剂:银柴胡药材超临界CO2萃取物;复方醋酸地塞米松乳膏,规格:10g(含醋酸地塞米松7.5mg),批准文号: 国药准字 H41024619,购自河南大新药业有限公司;免疫球蛋白E( immunoglobulin,IgE) 、白细胞介素-4( interleukin-4,IL-4) 、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)酶联免疫吸附( ELISA) 试剂盒,均购自上海酶联生物科技有限公司;伊红染液购自北京索莱宝科技有限公司;甲苯胺蓝染液购自北京雷根生物技术有限公司,2,4-二硝基氯苯(DNCB)购自美国 Sigma公司;
仪器:切片机(德国 LEICA 公司),摊片机(德国 LEICA 公司);展片机(德国LEICA 公司);低温离心机(德国,Siemens 公司);LEICA DM2000 显微镜(德国 LEICA 公司);酶标仪(美国PerkinElmer公司)。
2 实验方法
2.1 银柴胡药材超临界萃取方法
将银柴胡药材粉碎至过60目筛得银柴胡药材粉末,称取1500g银柴胡药材粉末投入5L萃取釜中,设定萃取斧的压力为35MPa,温度为47℃,时间为3h、分离釜Ⅰ的压力为6MPa,温度为60℃、分离釜Ⅱ的压力为6MPa,温度为60℃,当温度达到实验要求时,开启二氧化碳气瓶,通过高压泵对萃取釜、分离釜进行加压,当压力达到实验所要求的数值时,进行萃取,记录时间,每隔30min,从分离釜Ⅰ、Ⅱ放料。即得银柴胡超临界萃取物5g(固体含量为4.11g),该银柴胡超临界萃取物的成分分布见表1。
2.2 动物分组
将ICR(SPF)小鼠在恒定的室温(25±2℃)和湿度(50%±10%)条件下适应性喂养一周,每只鼠20g左右,给予充足的饲料,保证自由饮水,一周后剔除各组小鼠背毛2*2cm2左右的面积,随机分组:①空白组②模型组③银柴胡治疗组根据给药剂量不同分为五组(Treat1:15μl/天、Treat2:30μl/天、Treat3:60μl/天、Treat4:120μl/天、Treat5:240μl/天)④阳性对照组(地塞米松软膏120μl),每组8只,分笼饲养。
2.3 AD模型建立及给药方法
以小鼠脱毛24h后为实验第1天,①空白组小鼠不造模,1-7天给予溶剂(丙二醇:乙醇=7:3)100 μl于皮肤上每天一次,处理时间节点以及剂量同模型组。②模型组:1%DNCB溶液100μl涂抹于小鼠的脱毛区。为期7天(每天涂抹一次),同样的方法给药,第8-21天开始改用 0.1%DNCB100μl溶液涂抹(隔一天涂抹一次),用药结束后观察记录小鼠皮肤表面情况。③治疗组:1%DNCB溶液100μl涂抹于小鼠的脱毛区。为期7天(每天涂抹一次),第8-21天开始对小鼠进行给药治疗,用不同剂量(Treat1:15μl/天、Treat2:30μl/天、Treat3:60μl/天、Treat4:120μl/天、Treat5:240μl/天)的银柴胡超临界萃取物进行涂抹,第8-21天每天1次,同时用0.1%DNCB100μl溶液涂抹(隔一天涂抹一次)。④阳性对照组:1%DNCB溶液100μl涂抹于小鼠的脱毛区。为期7天(每天涂抹一次),第8-21天开始对小鼠进行给药治疗,用0.1mg/d地塞米松进行涂抹,第8-21天每天1次,每次100μl,同时用0.1%DNCB100μl溶液涂抹(隔一天涂抹一次)。
2.3 皮肤损伤严重程度及皮损评分
在实验第7天,第14天、第21天给药 24 h时分别进行皮损评分,参照SCORAD 评分标准(如表2所示),对各组小鼠背部的皮肤损伤情况进行观察,包括红斑、水肿、脱屑、结痂等症状,按照无( 0 分) 、轻度( 1 分) 、中度( 2 分) 、重度( 3 分) 等级进行评分,试验结果见图2和图3。
表2.SCORAD 评分标准
2.4 各组小鼠抓挠次数
在实验第21天记录给药后10min内各组小鼠对身体各部位的抓挠次数,试验结果见图1。
2.5 以苏木精-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色(TB)检测小鼠皮肤组织病理变化
小鼠处死后,收集每组小鼠背部皮肤组织,置于10%中性甲醛中固定备用。取出固定24h后的皮肤组织,经过脱水透明,石蜡包埋,制成6μm厚的切片。HE、TB染色后,在光学显微镜下观察小鼠的皮肤组织病理变化,试验结果分别见图4和图5a;每张皮肤切片随机选取5 个区域测量(n=3),计算肥大细胞数量,肥大细胞数量统计结果见图5b。
2.6 以ELISA法检测血清IgE、IL-4及IFN-γ水平
各组小鼠采取眼球取血于EP管中,将EP管置于预冷的4℃离心机,3500rpm离心15min,取上清液,根据ELISA试剂盒中的方法对血清中IgE、IL-4及IFN-γ水平进行检测,试验结果见图6a、6b、6c。
2.7 统计学处理
所有数据的统计分析均使用 GraphPad Prism 8.0.1 软件,计量资料采用x±SEM表示。单向ANOVA分析,然后进行Dunnett事后检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。同一实验重复三次,取其平均值。
2 结果
2.1 银柴胡超临界萃取物对AD小鼠抓挠次数以及皮损评分的影响
2.1.1 抓挠次数
银柴胡超临界萃取物对DNCB诱导的AD小鼠搔抓行为的影响
为了评估不同剂量银柴胡治疗对DNCB诱导的AD小鼠的止痒作用,我们记录并分析了第21天每组小鼠的搔抓行为,结果如图1所示,与模型组相比,Treat2及Treat3 组的小鼠的抓挠次数明显减少;Treat4、Treat5与阳性对照组的小鼠抓挠次数与模型组对比差异极显著(p < 0.001),说明银柴胡超临界萃取物能够有效抑制AD小鼠的瘙痒行为,且随着用药剂量的增加而增强,当剂量达到120μl、240μl时分别与阳性对照组的抑制效果相当,止痒效果较好。
2.1.2 皮损评分
DNCB 致敏的小鼠模型,通过动态观察以及记录不同时间点小鼠背部皮损状况以及搔抓行为。由图2可见,经过一段时间治疗后,模型组小鼠的背部皮肤依旧表现出局部红斑,结痂和干燥,而药物组随着给药剂量不同,其皮损严重程度改善效果不同,在给药剂量达到120μl、240μl时效果最为明显,与阳性对照组一样都有效改善小鼠皮肤表面结痂,红斑及干燥症状。图3表明,随着致敏激发次数增多,模型组小鼠皮损逐渐加重,总评分明显升高(p< 0.01),第7天时,模型组小鼠背部皮损评分达 8.44 ± 0.42。空白组皮损评分为0,给药1周后(即实验第14天),相对于模型组,Treat2组及Treat3组皮损开始出现明显改善,皮炎平分显著性下降(p< 0.05)。值得注意的是,Treat4及Treat5 组在实验第14天时,即取得极显著的治疗效果(p< 0.001),随着治疗周期的延长(第21天),Treat4及Treat5治疗组与阳性对照组的皮损评分无显著差异。因此,银柴胡超临界萃取物与地塞米松在治疗中都能够快速起到抗炎作用。
2.2小鼠背部皮肤病理变化
2.2.1 各组小鼠背部皮损组织病理学影响
HE染色结果如图4所示:空白组:皮肤各部分结构完整,细胞形态正常,角质层薄且连续,上皮层次分明结构完整,真皮层中毛囊、皮脂腺排列规整。模型组:角质层结构部分脱落、角化过度伴有角化不全。上皮层棘细胞增生,形成丁突,大部分区域棘层细胞间水肿(海绵水肿)。基底层部分有基底下疱、疱内有大量炎细胞浸润、大量淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞弥漫。真皮层内毛囊、皮脂腺减少,毛囊内角化物显著增多,小血管扩张充血。处理1及处理2:角质层仍然角化过度,上皮层棘细胞层增厚,细胞间小部分区域水肿,真皮浅层局部有血管扩张充血,真皮下层存在大量炎细胞。处理3角质层小部分角化过度,无脱落,真皮层少量炎性细胞浸润。处理4和5:角质层大部分正常角化,上皮层棘细胞明显变薄,真皮层毛囊、皮脂腺正常、排列规整(主要在真皮浅层)、数量减少,少量炎性细胞浸润。阳性对照组:角质层结构完整,但脱落明显。上皮层棘细胞变薄,真皮层少量炎性细胞浸润。
TB染色结果如图5a所示:与正常对照组相比,AD模型组、Treat1-5及阳性对照小鼠背部皮肤组织中肥大细胞数量显著增多,差异有统计学意义(p<0.001),如图5b所示,与AD模型组相比,Treat1组小鼠背部皮肤组织中肥大细胞数量降低,差异无统计学意义,Treat2组肥大细胞数量有显著降低差异有统计学意义(p<0.01),Treat3-5组肥大细胞数量极显著降低,差异有统计学意义(p<0.001),并且减少的程度与治疗药物的剂量相关,最佳给药剂量为120ul与240μl。
2.3 治疗前后小鼠各组血清 IgE 、IL-4、IFN-γ 浓度变化
银柴胡超临界萃取物对于小鼠血清与皮肤中IL-4﹑IgE以及IFN-γ的影响
AD发病的急性期以及慢性期伴随着血清中诸多细胞因子的变化,解剖当天获取小鼠血清,采用 ELISA 试剂盒对血清以及皮肤中的IgE﹑IL-4以及IFN-γ进行检测,结果见图6a、6b、6c。血清中IgE的大量生成已被公认为患者患AD的典型标志。本实验中,局部反复应用 DNCB于小鼠剃毛区域后,模型组小鼠的血清总IgE水平极显著性增加(p <0.001),随着银柴胡超临界萃取物剂量的增加小鼠的血清总IgE 水平明显降低,Treat4和Treat5相比于模型组差异有统计学意义(p <0.001,p <0.01)。阳性对照组血清总IgE 水平显著降低(p <0.01)。同时我们实验结果发现,相较于空白对照组,模型组小鼠血清的Th2型炎症因子IL-4以及Th1型炎症因子IFN-γ水平显著提高了(p < 0. 01)。对比模型组,治疗组Treat2-4小鼠血清中IL-4和IFN-γ含量下降明显(p<0.05或者p<0.01),阳性对照组对小鼠血清中IL-4和IFN-γ含量下降不明显,差异无显著性意义(p<0.05,p>0.05)。从对血清中IgE﹑IL-4 以及 IFN-γ的抑制作用来看最佳给药剂量为120ul。
综上,仅为本发明之较佳实施例,不以此限定本发明的保护范围,凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆为本发明专利涵盖的范围之内。
Claims (3)
1.一种银柴胡超临界萃取物在制备治疗特应性皮炎药物中的用途,其特征在于,所述银柴胡超临界萃取物以重量百分比计,含有以下组分:
甘油磷脂0.5%-0.6%、鞘脂0.02%-0.03%、甘油酯9%-11%、固醇类85%-90.5%、孕烯醇酮脂0.01%-0.02%、脂肪酰0.3%-0.4%、糖脂0.07%-0.09%;
所述用于治疗特应性皮炎的组合物的有效剂量为2mg/kg~10mg/kg。
2.如权利要求1所述的银柴胡超临界萃取物在制备治疗特应性皮炎药物中的用途,其特征在于,所述用于治疗特应性皮炎的组合物以重量百分比计,含有以下组分:
固醇类88.111%、甘油酯10.868%、脂肪酰0.362%、孕烯醇酮脂0.013%、甘油磷脂0.532%、糖脂0.085%、鞘脂0.029%。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述药物为外用药物。
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