CN116113639A - 活性降低的glp-1r激动肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰高血糖素样肽‑1受体(GLP‑1R)激动活性降低的GLP‑1R激动肽以及包含所述激动肽的融合分子。本发明还涉及编码GLP‑1R激动活性降低的GLP‑1R激动肽的核酸分子、包含GLP‑1R激动活性降低的GLP‑1R激动肽的药物组合物和组合以及包含GLP‑1R激动活性降低的GLP‑1R激动肽的试剂盒。本发明进一步涉及GLP‑1R激动活性降低的GLP‑1R激动肽作为药剂，特别是用于治疗肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、高血糖症、血脂异常、NASH和/或动脉粥样硬化的用途。

Description

活性降低的GLP-1R激动肽

技术领域

本发明涉及GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动活性降低的GLP-1R激动肽、包含所述激动肽的组合和融合分子、以及相应的核酸分子、药物组合物和试剂盒。本发明进一步涉及GLP-1R激动肽作为药剂，特别是用于治疗肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、高血糖症、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或动脉粥样硬化的用途。

背景技术

单独或与其他活性药物成分组合使用GLP-1R激动肽可能具有缺点。GLP-1R激动肽在较低血浆水平下已经是药学上有效的。在较高的血浆水平下，已知GLP-1(主要的GLP-1R激动剂)具有不良效应，例如，它诱导恶心和呕吐。相比之下，可以与GLP-1R激动肽组合的其他活性药物成分(例如，成纤维细胞生长因子21(FGF21)化合物)的药理作用通常在比GLP-1的发挥药理作用的血浆水平高的血浆水平下观察到。总之，这表明在单独或与另一种活性药物成分组合(例如，呈融合分子形式的FGF21化合物和GLP-1R激动肽)施用GLP-1R激动肽时，存在GLP-1介导的不良效应的风险。因此，需要克服这些挑战的新的GLP-1R激动肽。

发明内容

本发明的一个目的是提供GLP-1R激动活性降低的GLP-1R激动肽。此类GLP-1R激动肽可以例如用于平衡GLP-1R激动剂/FGF21化合物活性比以便实现两种活性剂的有益效果(例如，在体重、脂质和/或血糖控制等方面)，同时避免潜在的不良效应(例如，恶心和/或呕吐等)。

在一个方面中，本发明涉及一种GLP-1R激动肽，其GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约531倍，其中所述GLP-1R激动肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

X₁-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-X₁₂-X₁₃-L-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-F-X₂₃-E-W-L-X₂₇-X₂₈-X₂₉-G(SEQ ID NO:635)，

其中

X₁是H、Y或F，

X₁₀是K或L，

X₁₂是K、I或Q，

X₁₃是Q或L，

X₁₅是E、A或D，

X₁₆是E、K或S，

X₁₇是E、R或Q，

X₁₈是L、A或R，

X₁₉是V、A或F，

X₂₀是R、H、Q、K或I，

X₂₁是L、E、H或R，

X₂₃是I、Y或F，

X₂₇是I、L、K或E，

X₂₈是A、K、N或E，并且

X₂₉是G、T、K或V；

其中，任选地，所述氨基酸序列在其N末端进一步包含至少一个另外的氨基酸残基；并且

其中，任选地，所述氨基酸序列在其C末端进一步包含由多达约12个、约11个或约10个氨基酸残基组成的肽延伸部分。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

H-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-K-Q-L-E-E-E-X₁₈-V-X₂₀-L-F-I-E-W-L-K-A-X₂₉-G(SEQIDNO:636)，

其中

X₁₀是K或L，

X₁₈是A或R，

X₂₀是R或Q，并且

X₂₉是G或T；

其中，任选地，所述氨基酸序列在其N末端进一步包含至少一个另外的氨基酸残基；并且

其中，任选地，所述氨基酸序列在其C末端进一步包含由多达约12个、约11个或约10个氨基酸残基组成的肽延伸部分。

在一个实施方案中，所述至少一个另外的氨基酸残基是G或A。在一个实施方案中，所述至少一个另外的氨基酸残基是单个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述至少一个另外的氨基酸残基是G。

在一个实施方案中，所述肽延伸部分包含选自SEQ ID NO:566至621的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述肽延伸部分是单个氨基酸残基，例如P。在一个实施方案中，所述肽延伸部分包含氨基酸序列PSSGAPPPS(SEQ ID NO:605)或PKKIRYS(SEQ ID NO:598)或由所述氨基酸序列组成。

在另一个方面中，本发明涉及一种GLP-1R激动肽，其GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约531倍，其中所述GLP-1R激动肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：选自SEQ ID NO:261至552和554至565的氨基酸序列、或具有多达三个氨基酸残基取代的选自SEQ ID NO:261至552和554至565的氨基酸序列。

在一个实施方案中，在所述GLP-1R激动肽呈其分离形式时和/或在所述GLP-1R激动肽是融合分子的一部分时，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约531倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约482倍(或约9.449至约482.396倍)或约9至约319倍(或约9.449至约319.311倍)或约9至约121倍(或约9.449至约121.189倍)。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约319倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至少约9.4倍或至少约9.45倍或至少约9.5倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至少约10倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至多约482.4倍或至多约482.35倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至多约482倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约10至约482倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约10至约319倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约90至约100倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至少约18倍(或至少约18.268倍)。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约18至约501倍(或约18.268至约500.686倍)或约18至约469倍(或约18.268至约468.679倍)或约18至约313倍(或约18.268至约313.214倍)或约18至约123倍(或约18.268至约123.466倍)。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约18至约313倍。

在上述实施方案之一中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至少约18.2倍或至少约18.3倍。

在上述实施方案之一中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低至少约20倍或至少约50倍或至少约100倍。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约10倍至约500倍。在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约15倍至约500倍。在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约20倍至约500倍。在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约50倍至约500倍。在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约100倍至约500倍。在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)的GLP-1R激动活性相比降低约100倍至约300倍。

在一个实施方案中，作为融合分子的一部分的所述GLP-1R激动肽以约15pmol/L至约400pmol/L、或约20pmol/L至约400pmol/L、或约50pmol/L至约400pmol/L、或约100pmol/L至约400pmol/L的EC50激活人GLP-1R，如例如通过测量稳定表达人GLP-1R的细胞的cAMP反应所确定的。在一个实施方案中，人GLP-1R的激活是基本上如实施例4中所述确定的。

在一个实施方案中，呈其分离形式的所述GLP-1R激动肽以约7.5pmol/L至约250pmol/L、或约7.5pmol/L至约150pmol/L、或约7.5pmol/L至约100pmol/L、或约7.5pmol/L至约75pmol/L、或约8pmol/L至约75pmol/L、或约9pmol/L至约75pmol/L、或约9pmol/L至约60pmol/L的EC50激活人GLP-1R，如例如通过测量稳定表达人GLP-1R的细胞的cAMP反应所确定的。在一个实施方案中，人GLP-1R的激活是基本上如实施例4中所述确定的。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：选自包含SEQ ID NO:261至552和554至565或由其组成的组的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽包含SEQ ID NO:261或262的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述GLP-1R激动肽不包含SEQ ID NO:553和622至634中任一个的氨基酸序列或不由所述氨基酸序列组成。

在另一个方面中，本发明涉及一种GLP-1R激动肽，其包含选自SEQ ID NO:261至552和554至565的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在另一个方面中，本发明涉及一种GLP-1R激动肽，其包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在另一个方面中，本发明涉及一种组合，其包含如上文所定义的GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分。

在另一个方面中，本发明涉及一种融合分子，其包含如上文所定义的GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分。

在一个实施方案中，所述至少一种其他活性药物成分是FGF21化合物。

在另一个方面中，本发明涉及一种核酸分子，其编码如上文所定义的GLP-1R激动肽或如上文所定义的融合分子。

在另一个方面中，本发明涉及一种宿主细胞，其含有如上文所定义的核酸分子。

在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子或如上文所定义的宿主细胞。

在另一个方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子、如上文所定义的宿主细胞或如上文所定义的药物组合物。

在另一个方面中，本发明涉及如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子、如上文所定义的宿主细胞或如上文所定义的药物组合物，其用作药剂。

在另一个方面中，本发明涉及如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子或如上文所定义的宿主细胞或如上文所定义的药物组合物，其用于治疗选自以下的疾病或障碍：肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、高血糖症、血脂异常、NASH和动脉粥样硬化。

在一个实施方案中，所述疾病或障碍是糖尿病。在一个实施方案中，所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。

在另一个方面中，本发明涉及如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子、如上文所定义的宿主细胞或如上文所定义的药物组合物在制造用于治疗选自以下的疾病或障碍的药剂中的用途：肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、高血糖症、血脂异常、NASH和动脉粥样硬化。

在一个实施方案中，所述疾病或障碍是糖尿病。在一个实施方案中，所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。

在另一个方面中，本发明涉及一种治疗选自以下的疾病或障碍的方法：肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、高血糖症、血脂异常、NASH和动脉粥样硬化，所述方法包括向有需要的受试者施用如上文所定义的GLP-1R激动肽、如上文所定义的组合、如上文所定义的融合分子、如上文所定义的核酸分子、如上文所定义的宿主细胞或如上文所定义的药物组合物。

在一个实施方案中，所述疾病或障碍是糖尿病。在一个实施方案中，所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。

附图说明

图1是显示根据GLP-1衰减因子(12个月模拟)的不良效应(胃排空(GE)率)和药效学(即，HbA1c、甘油三酯、脂肪酸、非HDL、脂肪量)的EC50的图：

·对于大于9.449(其可以舍入为约9)的GLP-1衰减因子，GLP-1介导的胃肠不良效应(胃排空；GE率)的EC50大于药效学效应(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)的EC50；

·通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为121.189；即，在121.189(其可以舍入为约121)处，在GLP-1介导的效应(HbA1c)与FGF21介导的平均效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离处，存在药效学效应(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离(参见图2)；

·药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为319.311(其可以舍入为约319)；

·平均药效学(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)与不良效应(GE率)之间的最大距离为482.396(参见图2；其可以舍入为约482)；

·最大胃排空率为531.0；

(所有：垂直线)。

图2是显示根据GLP-1衰减因子(12个月模拟)的GE率和平均药效学效应(即，HbA1c、甘油三酯、脂肪酸、非HDL、脂肪量)的EC50的图：

·平均药效学(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)与不良效应(GE率)之间的最大距离为482.396(右侧垂直线；其可以舍入为约482)；

·通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为121.189(左侧垂直线；其可以舍入为约121)。曲线“(最大值-GE率)/范围”代表HbA1c与GE率之间的最大距离相对于HbA1c与FGF21介导的平均效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离的比率。在“(最大值-GE率)/范围”曲线的最小值处(即，在121.189处)，在GLP-1介导的效应(HbA1c)与FGF21介导的效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离处，存在药效学效应(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离。

图3是显示根据GLP-1衰减因子(3个月模拟)的不良效应(GE率)和药效学(HbA1c、甘油三酯、脂肪酸、非HDL、脂肪量)的EC50的图：

·对于大于18.268(其可以舍入为约18)的GLP-1衰减因子，GLP-1介导的胃肠不良效应(胃排空；GE率)的EC50大于药效学效应(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)的EC50；

·通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为123.466；即，在123.466(其可以舍入为约123)处，在GLP-1介导的效应(HbA1c)与FGF21介导的平均效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离处，存在药效学效应(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离(参见图4)；

·药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为313.214(其可以舍入为约313)；

·平均药效学(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)与不良效应(GE率)之间的最大距离为468.679(参见图4；其可以舍入为约469)；

·最大GE率是在500.686(其可以舍入为约501)处

(所有：垂直线)。

图4是显示根据GLP-1衰减因子(3个月模拟)的GE率和平均药效学效应(即，HbA1c、甘油三酯、脂肪酸、非HDL、脂肪量)的EC50的图：

·平均药效学(即，HbA1c、脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)与不良效应(GE率)之间的最大距离为468.679(右侧垂直线；其可以舍入为约469)；

·通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离为123.466(左侧垂直线；其可以舍入为约123)。曲线“(最大值-GE率)/范围”代表HbA1c与GE率之间的最大距离相对于HbA1c与FGF21介导的平均效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离的比率。在“(最大值-GE率)/范围”曲线的最小值处(即，在123.466处)，在GLP-1介导的效应(HbA1c)与FGF21介导的效应(即，脂肪量、非HDL、脂肪酸、甘油三酯)之间的最小距离处，存在药效学效应(HbA1c)的最大值与不良效应(GE率)之间的最大距离。

图5(A和B)是显示在CHO细胞中人FGF21受体功效的体外细胞测定(In-CellWestern(ICW))的结果的图。pFGFR描绘于(A)中，并且pERK描绘于(B)中。

图6(A至D)是显示不同GLP-1R激动剂的在HEK-293细胞中人胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体功效的体外细胞测定的结果的图。SEQ ID NO:2描绘于(A)中，SEQ ID NO:7描绘于(B)中，SEQ ID NO:8描绘于(C)中，并且SEQ ID NO:2、7和8描绘于(D)中。

图7(A至F)是显示在对雌性C57Bl/6小鼠或雄性食蟹猴单次皮下施用0.3mg/kg溶液后使用三种不同的生物分析方法得到的GLP-1R激动剂/FGF21 Fc融合蛋白的血浆浓度的图。(A)描绘了小鼠中的SEQ ID NO:2，(B)描绘了猴中的SEQ ID NO:2，(C)描绘了小鼠中的SEQ ID NO:7，(D)描绘了猴中的SEQ ID NO:7，(E)描绘了小鼠中的SEQ IDNO:8，并且(F)描绘了猴中的SEQ ID NO:8。

图8是显示在对雌性C57Bl/6小鼠单次皮下施用0.3mg/kg溶液后使用用于量化完整全长蛋白的生物分析方法得到的GLP-1R激动剂/FGF21 Fc融合蛋白和G-FGF21(SEQ IDNO:252)的血浆浓度的图。

图9是显示每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续28天的雌性饮食诱导的肥胖症(DIO)小鼠的体重发展的图。

图10是显示每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续28天的雌性DIO小鼠的累积食物摄入发展的图。

图11(A和B)是显示在第1天开始用GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照首次治疗后(A)或在第22天开始第四次治疗后(B)db/db小鼠的24小时血糖谱的图。数据是平均值±SEM；n＝8只/组。

图12是显示每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续36天的雌性db/db小鼠的血浆HbA1c含量的图。

图13(A和B)是显示在每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续8周后DIO NASH小鼠的肝脏重量和脂质含量的发展的图。(A)描绘了肝脏重量和脂质水平，(B)描绘了肝脏胆固醇和肝脏甘油三酯水平。

图14描绘了显示在每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续8周后DIO NASH小鼠的纤维化和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动得分的发展的图。

图15描绘了显示在每周一次给药GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和对照持续8周后DIO NASH小鼠中具有更高、相同或更低纤维化和NAFLD活动得分的动物数量的图。

具体实施方式

尽管下文详细描述了本发明，但应理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

在本文中，将更详细地描述本发明的某些要素。这些要素可以用具体实施方案来列出；然而，应当理解，特定的具体实施方案可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。差异性描述的实施例和示例性实施方案不应当解释为将本发明限制于仅明确描述的实施方案。本说明书应当被理解为支持并且涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或示例性要素的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应当考虑本申请的说明书公开本申请中所有所描述要素的任何排列和组合。

本文所用的术语是如“A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.

编辑,HelveticaChimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述定义的。

除非另有指示，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其解释于本领域的文献中(Sambrook,J.等人(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。

贯穿本说明书和之后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”等变化形式应理解为暗示包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)所用的术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”以及“所述”等应解释为同时覆盖单数和复数。在本文中列举值的范围仅旨在用作单独提到落在所述范围内的每个单独值的速记法。除非本文另有指示，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同在本文中单独列举所述值一样。除非本文另有指示或另外与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序来进行。在本文中提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“诸如”)的使用都仅旨在更好地说明本发明，并不对原本要求保护的本发明的范围施加任何限制。本说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为本发明的实践所必需。

贯穿本说明书的正文引用了若干文献。将本文无论在上文还是在下文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)都通过引用以其整体特此并入。本文的任何内容都不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于这样的披露内容。

如本文所用，术语“GLP-1R激动肽”是指结合至并激活GLP-1受体的肽，诸如GLP-1(作为主要的GLP-1R激动剂)。GLP-1R激动肽在本文中也可以简称为“GLP-1R激动剂”。

如本文所用，术语“肽”通常是指任何长度的氨基酸的多聚体形式，其例如包含约两个或更多个、或者约3个或更多个、或者约4个或更多个、或者约6个或更多个、或者约8个或更多个、或者约9个或更多个、或者约10个或更多个、或者约13个或更多个、或者约16个或更多个、或者约21个或更多个通过肽键共价连接的氨基酸。肽可以例如由多达100个氨基酸组成。如本文所用，术语“多肽”是指大肽。在一个实施方案中，术语“多肽”是指具有超过约100个氨基酸残基的肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用。

如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指天然存在的氨基酸、以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物，呈其D和L立体异构体形式，如果其结构允许此类立体异构体形式的话。氨基酸在本文中以其名称、其本领域已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。

如本文所用，在结合生物材料(诸如核酸分子、(多)肽、宿主细胞等)使用时，术语“天然存在的”是指在自然界中发现并且未经人为操纵的材料。

在结合氨基酸使用时，术语“天然存在的”是指20种常规氨基酸(即，丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y))以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)和吡咯啉-羧基赖氨酸(PCL)。

如本文所用，术语“非天然氨基酸”意在指代不是在任何生物体的遗传密码中天然编码或发现的氨基酸。它可以例如是纯合成的化合物。非天然氨基酸的例子包括但不限于羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、D-鸟氨酸、D-精氨酸、对氨基苯丙氨酸、戊基甘氨酸、哌啶酸和硫代脯氨酸。

如本文所用，术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物。氨基酸类似物包括天然氨基酸和非天然氨基酸，其被可逆或不可逆地化学阻断，或例如在其C末端羧基、其N末端氨基和/或其侧链官能团中的一个或任何组合处被化学修饰。此类类似物包括但不限于甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β甲基酯)、N-乙基甘氨酸、丙氨酸甲酰胺、高丝氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。

如本文所用，术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

如本文所用，术语“天然GLP-1(7-36)”是指具有SEQ ID NO:260的氨基酸序列的肽，所述序列任选地在其C末端包含酰胺基团。

在一个实施方案中，如本文所用，术语“GLP-1R激动活性”(或“GLP-1R激动效力”)是指GLP-1受体的激活。在一个实施方案中，所述术语是指体外激动活性/效力。在另一个实施方案中，所述术语是指体内激动活性/效力。在一个实施方案中，GLP-1受体的激活是通过测量在体外与激动剂接触时稳定表达GLP-1受体的细胞的cAMP反应来确定的。在一个实施方案中，细胞来自HEK-293细胞系。在一个实施方案中，GLP-1受体是人GLP-1受体。在一个实施方案中，GLP-1受体的激活是基本上如实施例4中所述确定的。在一个实施方案中，活性/效力是通过确定EC50值来量化的。

本发明提供了如本文所定义的根据SEQ ID NO:635和636的通式的GLP-1R激动肽。

在一些实施方案中，根据SEQ ID NO:635和636的通式的GLP-1R激动肽在其N末端包含至少一个另外的氨基酸残基。在一个实施方案中，至少一个另外的氨基酸残基是单个氨基酸残基。在一个实施方案中，至少一个另外的氨基酸残基选自：除了脯氨酸以外的天然存在的氨基酸；非天然氨基酸；氨基酸类似物；以及氨基酸模拟物。在一个实施方案中，至少一个另外的氨基酸残基选自G、A、N和C。在一个实施方案中，至少一个另外的氨基酸残基是G或A。在一个实施方案中，至少一个另外的氨基酸残基是G。

在一些实施方案中，根据SEQ ID NO:635和636的通式的GLP-1R激动肽在其C末端包含肽延伸部分。肽延伸部分可以例如由多达约12个、约11个、约10个或约9个氨基酸残基(例如，约7个、约8个或约9个氨基酸残基)组成。在一个实施方案中，肽延伸部分由选自SEQID NO:566至621的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，肽延伸部分是单个氨基酸残基，例如P。

本发明还提供了GLP-1R激动肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：选自SEQ ID NO:261至552和554至565的氨基酸序列以及这些氨基酸序列的变体，所述变体与原始序列的区别在于一个、两个或三个氨基酸残基的取代。

本发明还提供了GLP-1R激动肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:261或SEQ ID NO:262以及这些氨基酸序列的变体，所述变体与原始序列的区别在于一个、两个或三个氨基酸残基的取代。

在一个实施方案中，一个或多个被取代的氨基酸残基不参与GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性。在一个实施方案中，一个或多个取代是功能上和/或表型上沉默的。在一个实施方案中，一个或多个取代是一个或多个保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸被相同氨基酸家族的一个或多个氨基酸(即，在其侧链上(例如，在电荷和/或大小方面)相关的氨基酸)取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同归类为芳族氨基酸。

GLP-1R激动肽可以融合或缀合至半衰期延长模块。如本文所用，“半衰期”通常是指例如在体内消除化合物的活性、化合物的量或分子数量的一半所需的时间段。此类模块是本领域技术人员已知的，并且包括例如聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、透明质酸、多唾液酸)、非结构化(多)肽链、弹性蛋白样多肽(ELP)、血清蛋白(例如，白蛋白，诸如人血清白蛋白(HAS))、血清蛋白结合分子(例如，白蛋白结合结构域(ABD)、白蛋白结合脂肪酸)、抗体、免疫球蛋白、免疫球蛋白的Fc结构域(也称为Fc区)和免疫球蛋白结合结构域。

如本文所用，术语“非结构化(多)肽链”是指缺乏固定或有序的三维结构并且典型地是亲水的(多)肽链。延长与其融合的肽和蛋白质的半衰期(例如，体内半衰期)的非结构化(多)肽链是本领域技术人员已知的，并且包括例如XTEN(Schellenberger V.等人(2009)Nat Biotechnol.27(12):1186-90)和PAS序列(Schlapschy M.等人(2013)Protein EngDes Sel.26(8):489-501)。

如本文所用，术语“融合至”特别地是指遗传融合，例如通过重组DNA技术融合。(多)肽半衰期延长模块的氨基酸序列可以在GLP-1R激动肽的氨基酸序列内的任何位置引入，并且可以例如在所编码的肽结构内呈环形形状，或者它可以是N末端或C末端融合的。融合至GLP-1R激动肽的(多)肽半衰期延长模块的氨基酸序列可以由多核苷酸编码。

如本文所用，术语“缀合至”是指化学和/或酶促缀合，其导致(多)肽与另一种分子(例如，GLP-1R激动肽与半衰期延长模块)之间的稳定共价连接。这种缀合可以发生在(多)肽的N末端或C末端处或特定侧链处，例如在赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸或非天然氨基酸残基处。

如本文所用，术语“组合”意在包括以下方式：允许通过向患者单独施用GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分或以存在GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分的组合产品的形式(例如，在一种药物组合物中)或以融合分子的形式来应用包含GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分的组合。在单独施用时，施用可以同时或以任何顺序依序进行。将选择GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分的量和施用的相对时间安排，以便获得所需的组合治疗效果。组合的施用能以以下形式并行进行：(1)单一药物组合物，其包含所有活性药物成分；或(2)单独的药物组合物，各自包含活性药物成分中的至少一种。可替代地，组合可以以依序方式单独施用，其中首先施用一种治疗剂，其次施用另一种治疗剂，或反之亦然。这种依序施用可以在时间上接近或在时间上久远。在一个实施方案中，组合是以试剂盒(例如，如本文所定义的试剂盒)的形式提供的。

如本文所用，术语“融合分子”通常是指通过以下方式产生的分子：连接(特别是共价连接)两个或更多个不同的分子(例如，蛋白质和/或肽和/或其组合)，导致形成单一分子。在某些示例性实施方案中，融合分子将具有一种或多种源自每种原始分子的功能特性。在蛋白质和/或肽的情形中，融合分子也被称为“融合蛋白”。融合分子可以通过遗传融合(例如，通过重组DNA技术)或通过化学和/或酶促缀合例如两种或更多种多肽、蛋白质或其任何组合而产生。两个或更多个不同的分子也可以通过一个或多个合适的接头分子(例如，肽接头或非肽聚合物，诸如PEG)来连接。

在一个实施方案中，肽接头的长度为约2至约100个氨基酸残基、或约2至约90个氨基酸残基、或约2至约80个氨基酸残基、或约2至约70个氨基酸残基、或约2至约60个氨基酸残基、或约2至约50个氨基酸残基、或约2至约40个氨基酸残基、或约2至约30个氨基酸残基、或约2至约25个氨基酸残基、或约2至约20个氨基酸残基。在一个实施方案中，肽接头包含至少约5个氨基酸残基。通常，肽接头被设计成提供柔性和蛋白酶抗性。在一个实施方案中，肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸的接头，其中例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％的氨基酸分别是甘氨酸或丝氨酸残基。在另一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸和丝氨酸，即，肽接头仅由甘氨酸和丝氨酸构成(称为甘氨酸-丝氨酸接头)。在一个实施方案中，肽接头在其C末端进一步包含丙氨酸残基。肽接头可以进一步包含一个或多个特异性蛋白酶裂解位点。在一个实施方案中，肽接头包含选自SEQ ID NO:231至245的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含免疫球蛋白(例如，IgG1或IgG4)的Fc结构域(也称为Fc区)或其变体。在一个实施方案中，与Fc结构域的野生型序列相比，Fc结构域的变体包含多达约6个、约5个或约4个突变。在一个实施方案中，所述突变选自氨基酸取代、氨基酸添加和氨基酸缺失，例如N末端或C末端缺失。在一个实施方案中，Fc结构域或其变体可以与IgG1 Fc区(例如，人IgG1 Fc区)的野生型序列具有大于约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性或者可以与其具有约100％的序列同一性。在一个实施方案中，Fc结构域或其变体可以与IgG4 Fc区(例如，人IgG4 Fc区)的野生型序列具有大于约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性或者可以与其具有约100％的序列同一性。在一个实施方案中，免疫球蛋白的Fc结构域或其变体包含选自SEQ ID NO:257、258和259的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，融合分子包含接头分子，其包含选自L-Fc、Fc-L、L₁-Fc-L₂和Fc的结构，其中L、L₁和L₂独立地选自单个氨基酸和肽(例如，如本文所定义的肽接头)，并且Fc是免疫球蛋白的Fc结构域或其变体。L₁和L₂可以相同或不同。在一个实施方案中，L₁和L₂不同。在一个实施方案中，L₁包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，并且L₂包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或反之亦然。

如本文所用，短语“成纤维细胞生长因子21”或“FGF21”是指本领域已知的任何FGF21蛋白，并且特别地是指人FGF21。在一个实施方案中，人FGF21具有SEQ ID NO:250的氨基酸序列(全长人野生型FGF21)。成熟人野生型FGF21(即，缺少SEQ ID NO:250的氨基酸1-28(M1至A28)(即，其信号序列/肽)的人野生型FGF21)如SEQ ID NO:251所示。具有另外的N末端Gly的成熟人野生型FGF21由SEQ ID NO:252表示，并且在本文中被称为G-FGF21。

如本文所用，短语“FGF21化合物”通常是指具有FGF21活性的化合物。

在一个实施方案中，如本文所用，短语“FGF21活性”(或“FGF21效力”)是指FGF21受体(FGFR，例如FGFR1c)的激活。在一个实施方案中，FGF21受体是人FGF21受体。在一个实施方案中，FGF21活性是指体外活性和/或效力。在另一个实施方案中，FGF21活性是指体内活性和/或效力。在一个实施方案中，FGF21受体的激活是通过测量在体外与FGF21化合物接触时FGF21受体自身磷酸化和/或MAPK ERK1/2的磷酸化来确定的。在一个实施方案中，人FGFR1c的自身磷酸化和/或MAPK ERK1/2的磷酸化是例如基本上如实施例3中所述通过使用In-Cell Western(ICW)来确定的。在一个实施方案中，活性和/或效力是通过确定EC50值来量化的。

如本文所用，术语“In-Cell Western(ICW)测定”是指免疫细胞化学测定，更特别地定量免疫荧光测定，其典型地使用微孔板(例如，呈96孔或384孔形式)进行。ICW组合蛋白质印迹法的特异性与ELISA的再现性和通量(参见例如，Aguilar H.N.等人(2010)PLoS ONE5(4):e9965)。适当的ICW测定系统是可商购的(例如，购自LI-COR Biosciences，美国)。在一个实施方案中，在ICW测定中使用抗pFGFR抗体和/或抗pERK抗体。

在一个实施方案中，FGF21化合物是肽化合物，即肽或蛋白质。在一个实施方案中，FGF21化合物是天然FGF21或FGF21变体，所述变体与天然FGF21的氨基酸序列具有至少约80％或至少约90％或至少约91％或至少约92％或至少约93％或至少约94％或至少约95％或至少约96％或至少约97％或至少约98％的氨基酸序列同一性。如本文所用，术语“天然FGF21”是指天然存在的FGF21，例如具有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的人野生型FGF21或具有SEQ ID NO:251的氨基酸序列的成熟人野生型FGF21。

如本文所用，“序列同一性”是指两个氨基酸或核酸序列之间相同的氨基酸的百分比。用于比较的序列的最佳比对可以手动，借助Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，借助Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的类似性搜索方法，或借助使用这些算法的计算机程序(在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，GeneticsComputer Group，威斯康星州麦迪逊科学大道575号)进行。

在一个实施方案中，FGF21化合物是蛋白质，其包含选自SEQ ID NO:250至256的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

用于本发明的合适FGF21变体还描述于例如PCT/EP2016/079551中，将其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，融合分子是具有结构A-L₁-Fc-L₂-B的融合蛋白，其中A是GLP-1R激动肽，L₁、Fc和L₂如本文所定义，并且B是如本文所定义的FGF21化合物。在一个实施方案中，融合分子是融合蛋白，其包含选自SEQ ID NO:1至230的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

通常，如本文所用，术语“活性药物成分”(API)包括任何药物活性化学或生物化合物及其任何药学上可接受的盐及其任何混合物，其提供一些药理作用并且用于治疗或预防病症，例如如本文所定义的疾病或障碍。

示例性的药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸中的一种或多种制备的盐：盐酸(例如，氯化盐)、硫酸(例如，硫酸盐)、硝酸(例如，硝酸盐)、磷酸(例如，磷酸盐)、氢溴酸(例如，氢溴酸盐)、马来酸(例如，马来酸盐)、苹果酸(例如，苹果酸盐)、抗坏血酸、柠檬酸(例如，柠檬酸盐)、酒石酸(例如，酒石酸盐)、双羟萘酸(例如，双羟萘酸盐(pamoate)或双羟萘酸盐(embonate))、月桂酸(lauric acid)(例如，月桂酸盐)、硬脂酸(例如，硬脂酸盐)、棕榈酸(例如，棕榈酸盐)、油酸、肉豆蔻酸(例如，肉豆蔻酸盐)、月桂酸(lauryl acid)、萘磺酸、亚麻酸(例如，亚油酸盐)等。

如本文所用，术语“活性药物成分”、“活性剂”、“活性成分”、“活性物质”、“治疗活性化合物”和“药物”意在为同义词，即具有相同的含义。

根据本发明，活性药物成分任选地选自：

-Rote Liste 2014中提到的所有药物，例如Rote Liste 2014第12章中提到的所有抗糖尿病药、Rote Liste 2014第6章中提到的所有减肥药或食欲抑制剂、Rote Liste2014第58章中提到的所有降脂药、Rote Liste 2014第17章中提到的所有抗高血压药、RoteListe中提到的所有保肾药或Rote Liste 2014第36章中提到的所有利尿剂；

-如本文所定义的FGF21化合物；

-单克隆抗体；

-胰岛素和胰岛素衍生物，例如：甘精胰岛素(例如，

)、浓度高于100U/mL的甘精胰岛素(例如，270-330U/mL的甘精胰岛素或300U/mL的甘精胰岛素(如EP2387989中所披露))、谷赖胰岛素(例如，

)、地特胰岛素(例如，

)、赖脯胰岛素(例如，

)、德谷胰岛素(例如，

IdegLira(NN9068))、门冬胰岛素和门冬胰岛素配制品(例如，

)、基础胰岛素和类似物(例如，LY2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化赖脯胰岛素(例如，LY-275585)、长效胰岛素(例如，NN1436、Insumera(PE0139)、AB-101、AB-102、Sensulin LLC)、中效胰岛素(例如，

)、速效和短效胰岛素(例如，

PH20胰岛素、NN1218、

)、预混胰岛素、

NN1045、胰岛素加

PE-0139、ACP-002水凝胶胰岛素以及口服、可吸入、经皮和经颊或舌下胰岛素(例如，

特果匹胰岛素(insulin tregopil)、TPM-02胰岛素、

口服胰岛素、ORMD-0801、Oshadi口服胰岛素、NN1953、NN1954、NN1956、

)。那些通过双功能接头键合至白蛋白或另一种蛋白质的胰岛素衍生物也是合适的；

-胰高血糖素样肽1(GLP-1)、GLP-1类似物和GLP-1受体拮抗剂，例如：GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、利西拉肽(例如，

)、艾塞那肽(例如，激动肽-4、rExendin-4、

艾塞那肽NexP)、艾塞那肽-LAR、利拉鲁肽(例如，

)、索马鲁肽(semaglutide)、他司鲁肽(taspoglutide)、阿必鲁肽、杜拉鲁肽(dulaglutide)、奥布根(albugon)、胃泌酸调节素、京尼平苷、ACP-003、CJC-1131、CJC-1134-PC、GSK-2374697、PB-1023、TTP-054、兰勒那肽(langlenatide)(HM-11260C)、CM-3、GLP-1 Eligen、AB-201、ORMD-0901、NN9924、NN9926、NN9927、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、ZP-3022、CAM-2036、DA-3091、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、艾塞那肽-XTEN(VRS-859)、艾塞那肽-XTEN+胰高血糖素-XTEN(VRS-859+AMX-808)以及聚合物结合的GLP-1和GLP-1类似物；

-双重GLP-1/GIP激动剂(例如，RG-7697(MAR-701)、MAR-709、BHM081、BHM089、BHM098)；双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂(例如，BHM-034、OAP-189(PF-05212389、TKS-1225)、TT-401/402、ZP2929、LAPS-HMOXM25、MOD-6030)；

-双重GLP-1/胃泌素激动剂(例如，ZP-3022)；

-胃肠肽，诸如肽YY 3-36(PYY3-36)或其类似物和胰腺多肽(PP)或其类似物；

-胰高血糖素受体激动剂或拮抗剂、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体激动剂或拮抗剂、食欲刺激素拮抗剂或反向激动剂、类爪蟾肽(xenin)及其类似物；

-二肽基肽酶-IV(DPP-4)抑制剂，例如：阿格列汀(例如，

)、利格列汀(例如，

)、沙格列汀(例如，

)、西格列汀(例如，

、

)、阿拉格列汀、替格列汀(例如，

)、曲格列汀、维格列汀(例如，

)、吉格列汀、奥格列汀、依格列汀(evogliptin)、杜拓格利普汀、DA-1229、MK-3102、KM-223、KRP-104、PBL-1427、盐酸哌诺沙星(Pinoxacinhydrochloride)和Ari-2243；

-钠依赖性葡萄糖转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂，例如：卡格列净、达格列净、瑞格列净(remogliflozin)、依碳酸瑞格列净、舍格列净、恩格列净、伊格列净、托格列净、鲁格列净、埃格列净、EGT-0001442、LIK-066、SBM-TFC-039和KGA-3235(DSP-3235)；-SGLT-2和SGLT-1双重抑制剂(例如，LX-4211、LIK066)。

-SGLT-1抑制剂(例如，LX-2761、KGA-3235)或SGLT-1抑制剂与抗肥胖症药物的组合，所述抗肥胖症药物诸如回肠胆汁酸转运(IBAT)抑制剂(例如，GSK-1614235+GSK-2330672)；

-双胍(例如，二甲双胍、丁双胍、苯乙双胍)；

-噻唑烷二酮(例如，吡格列酮、罗格列酮)、格列酮类似物(例如，洛贝格列酮(lobeglitazone))；

-过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-α、-γ或-α/γ)激动剂或调节剂(例如，沙罗格列扎(saroglitazar)(例如，

)、GFT-505)或PPARγ部分激动剂(例如，Int-131)；

-磺酰脲(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、

格列吡嗪)和氯茴苯酸(例如，那格列奈、瑞格列奈、米格列奈)；

-α-葡糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖)；

-胰淀素和胰淀素类似物(例如，普兰林肽、

)；

-G蛋白偶联受体119(GPR119)激动剂(例如，GSK-1292263、PSN-821、MBX-2982、APD-597、ARRY-981、ZYG-19、DS-8500、HM-47000、YH-Chem1)；

-GPR40激动剂(例如，TUG-424、P-1736、P-11187、JTT-851、GW9508、CNX-011-67、AM-1638、AM-5262)；

-GPR120激动剂和GPR142激动剂；

-全身性或低可吸收性TGR5(GPBAR1＝G蛋白偶联胆汁酸受体1)激动剂(例如，INT-777、XL-475、SB756050)；

-糖尿病免疫治疗剂，例如：口服2型C-C趋化因子受体(CCR-2)拮抗剂(例如，CCX-140、JNJ-41443532)、白细胞介素1β(IL-1β)拮抗剂(例如，AC-201)或口服单克隆抗体(mAb)(例如，醋甲唑胺(methalozamide)、VVP808、PAZ-320、P-1736、PF-05175157、PF-04937319)；

-用于治疗代谢综合征和糖尿病的抗炎药，例如：核因子κB抑制剂(例如，

)；

-腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)刺激剂，例如：伊美格列明(Imeglimin)(PXL-008)、Debio-0930(MT-63-78)、R-118；

-11-β-羟基类固醇脱氢酶1(11-β-HSD-1)抑制剂(例如，LY2523199、BMS770767、RG-4929、BMS816336、AZD-8329、HSD-016、BI-135585)；

-葡糖激酶激活剂(例如，PF-04991532、TTP-399(GK1-399)、GKM-001(ADV-1002401)、ARRY-403(AMG-151)、TAK-329、TMG-123、ZYGK1)；

-二酰甘油O-酰基转移酶(DGAT)抑制剂(例如，普加司他(pradigastat)(LCQ-908))、蛋白质酪氨酸磷酸酶1抑制剂(例如，曲度奎明(trodusquemine))、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶抑制剂、糖原合酶激酶抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂；

-葡萄糖转运蛋白-4调节剂、生长抑素受体3激动剂(例如，MK-4256)；

-一种或多种降脂药也适合作为组合配偶体，例如：3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶-A-还原酶(HMG-CoA-还原酶)抑制剂诸如辛伐他汀(例如，

)、阿托伐他汀(例如，

)、瑞舒伐他汀(例如，

)、普伐他汀(例如，

)、氟伐他汀(例如，

)、匹伐他汀(例如，

)、洛伐他汀(例如，

)、美伐他汀(例如，

)、立伐他汀(rivastatin)、西立伐他汀

贝特类诸如苯扎贝特(例如，

延迟剂)、环丙贝特(例如，

)、非诺贝特(例如，

)、吉非贝齐(例如，

)、依托贝特、双贝特、氯烟贝特、克利贝特、氯贝胺、烟酸及其衍生物(例如，尼克酸(niacin)，包括尼克酸的缓释配制品)、烟酸受体1激动剂(例如，GSK-256073)、PPAR-δ激动剂、乙酰基-CoA-乙酰基转移酶(ACAT)抑制剂(例如，阿伐麦布)、胆固醇吸收抑制剂(例如，依折麦布、

S-556971)、胆汁酸结合物质(例如，考来烯胺、考来维仑)、回肠胆汁酸转运(IBAT)抑制剂(例如，GSK-2330672、LUM-002)、微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)抑制剂(例如，洛美他派(AEGR-733)、SLx-4090、格兰他派(granotapide))、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)调节剂(例如，阿利库单抗(REGN727/SAR236553)、AMG-145、LGT-209、PF-04950615、MPSK3169A、LY3015014、ALD-306、ALN-PCS、BMS-962476、SPC5001、ISIS-394814、1B20、LGT-210、1D05、BMS-PCSK9Rx-2、SX-PCK9、RG7652)、LDL受体上调剂例如肝脏选择性甲状腺激素受体β激动剂(例如，伊罗替罗(KB-2115)、MB07811、索布替罗(sobetirome)(QRX-431)、VIA-3196、ZYT1)、HDL升高化合物诸如：胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂(例如，安塞曲匹(MK0859)、达塞曲匹、依塞曲匹(evacetrapib)、JTT-302、DRL-17822、TA-8995、R-1658、LY-2484595、DS-1442)、或双重CETP/PCSK9抑制剂(例如，K-312)、ATP结合盒(ABC1)调节剂、脂质代谢调节剂(例如，BMS-823778、TAP-301、DRL-21994、DRL-21995)、磷脂酶A2(PLA2)抑制剂(例如，达拉地(darapladib)、

伐瑞拉地(varespladib)、瑞拉帕地)、ApoA-I增强剂(例如，RVX-208、CER-001、MDCO-216、CSL-112)、胆固醇合成抑制剂(例如，ETC-1002)、脂质代谢调节剂(例如，BMS-823778、TAP-301、DRL-21994、DRL-21995)和ω-3脂肪酸及其衍生物(例如，二十碳五烯酸乙酯(AMR101)、

AKR-063、NKPL-66、PRC-4016、CAT-2003)；

-溴隐亭(例如，

)、芬特明和芬特明配制品或组合(例如，Adipex-P、苯丁胺(lonamin)、

)、苄非他明(例如，

)、安非拉酮(例如，

)、苯甲曲秦(例如，

)、安非他酮和组合(例如，

)、西布曲明(例如，

)、托吡酯(例如，

)、唑尼沙胺(例如，

)、特索芬辛、阿片类物质拮抗剂(诸如纳曲酮(例如，

纳曲酮+安非他酮))、大麻素受体1(CB1)拮抗剂(例如，TM-38837)、黑色素浓集激素(MCH-1)拮抗剂(例如，BMS-830216、ALB-127158(a))、MC4受体激动剂和部分激动剂(例如，AZD-2820、RM-493)、神经肽Y5(NPY5)或NPY2拮抗剂(例如，韦利贝特、S-234462)、NPY4激动剂(例如，PP-1420)、β-3-肾上腺素能受体激动剂、瘦素或瘦素模拟物、5-羟色胺2c(5HT2c)受体激动剂(例如，氯卡色林、

)、普兰林肽/美曲普汀、脂肪酶抑制剂(诸如新利司他(例如，

)、奥利司他(例如，

))、血管生成抑制剂(例如，ALS-L1023)、β组氨酸和组胺H3拮抗剂(例如，HPP-404)、AgRP(刺鼠相关蛋白)抑制剂(例如，TTP-435)、血清素再摄取抑制剂(诸如氟西汀(例如，

)、度洛西汀(例如，

))、双重或三重单胺摄取抑制剂(多巴胺、去甲肾上腺素和血清素再摄取)(诸如舍曲林(例如，

)、特索芬辛)、甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)抑制剂(例如，贝洛拉尼(beloranib))和针对成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)产生的反义寡核苷酸(例如，ISIS-FGFR4Rx)或抗增殖蛋白靶向肽-1(例如，

)；

-一氧化氮供体、AT1拮抗剂或血管紧张素II(AT2)受体拮抗剂(诸如替米沙坦(例如，

)、坎地沙坦(例如，

)、缬沙坦(例如，

)、氯沙坦(例如，

)、依普罗沙坦(例如，

)、厄贝沙坦(例如，

)、奥美沙坦(例如，

)、他索沙坦、阿齐沙坦(例如，

))、双重血管紧张素受体阻断剂(双重ARB)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、ACE-2激活剂、肾素抑制剂、肾素原抑制剂、内皮素转化酶(ECE)抑制剂、内皮素受体(ET1/ETA)阻断剂、内皮素拮抗剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、醛固酮合酶抑制剂、α-阻断剂、α-2肾上腺素能受体拮抗剂、β-阻断剂、混合α-/β-阻断剂、钙拮抗剂、钙通道阻断剂(CCB)、钙通道阻断剂地尔硫卓的鼻用配制品(例如，CP-404)、双重盐皮质激素/CCB、中枢作用性抗高血压药、中性内肽酶抑制剂、氨肽酶-A抑制剂、血管肽抑制剂、双重血管肽抑制剂(诸如脑啡肽酶-ACE抑制剂或脑啡肽酶-ECE抑制剂、双效AT受体-脑啡肽酶抑制剂、双重AT1/ETA拮抗剂)、晚期糖基化终末产物(AGE)分解剂、重组肾酶、血压疫苗(诸如抗RAAS(肾素-血管紧张素-醛固酮-系统)疫苗、AT1疫苗或AT2疫苗)、基于高血压药物基因组学的药物(诸如具有抗高血压反应的遗传多态性的调节剂、血小板聚集抑制剂和其他)或任何这些的组合是合适的。

在某些示例性实施方案中，根据本发明，“核酸分子”是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根据本发明，核酸分子可以呈分子的形式，所述分子是单链或双链的。根据本发明的核酸分子可以是线性的，或共价闭合以形成环。

如本文所用，术语“DNA”是指包含脱氧核糖核苷酸残基并且在某些示例性实施方案中完全或基本上由脱氧核糖核苷酸残基构成的分子。如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'位缺少羟基的核苷酸。术语“DNA”包括分离的DNA，诸如部分或完全纯化的DNA、基本上纯的DNA、合成的DNA和重组产生的DNA。术语“DNA”还包括经修饰的DNA，其与天然存在的DNA的区别在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，诸如添加到DNA的一个或多个末端或添加到内部，例如在DNA的一个或多个核苷酸处添加。DNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸。经改变的DNA分子可以被称为类似物或天然存在的DNA的类似物。

如本文所用，术语“RNA”是指包含核糖核苷酸残基并且任选地完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括分离的RNA，诸如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA。术语“RNA”还包括经修饰的RNA，其与天然存在的RNA的区别在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，诸如添加到RNA的一个或多个末端或添加到内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加。RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。经改变的RNA分子可以被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。根据本发明，“RNA”是指单链RNA或双链RNA。在一个实施方案中，RNA是mRNA，例如体外转录的RNA(IVTRNA)或合成RNA。RNA也可以被修饰，例如具有增加RNA的稳定性(例如，半衰期)的一个或多个修饰。此类修饰是本领域技术人员已知的，并且包括例如5'-帽或5'帽类似物。

在结合核苷酸使用时，术语“天然存在的”是指碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。

根据本发明的核酸分子可以含在/包含在载体中。如本文所用，术语“载体”包括技术人员已知的所有载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(例如，λ噬菌体)、病毒载体(例如，腺病毒或杆状病毒载体)或人工染色体载体(例如，细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常含有所需编码序列和在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物等)中或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所需的适当DNA序列。克隆载体通常用于工程化和扩增某个所需DNA片段，并且可能缺少表达所需DNA片段所需的功能序列。

可替代地，可以将根据本发明的核酸分子整合到基因组(例如，宿主细胞的基因组)中。将特定核酸分子整合到基因组中的手段和方法是本领域技术人员熟知的。

如本文所用，术语“细胞”或“宿主细胞”是指完整细胞，即具有完整膜并且尚未释放其正常细胞内组分(诸如酶、细胞器或遗传材料)的细胞。在某些示例性实施方案中，完整细胞是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。在某些示例性实施方案中，细胞或宿主细胞是可以用外源核酸转染或转化的任何细胞。在某些示例性实施方案中，在用外源核酸转染或转化并转移至接受者时，细胞可以在接受者体内表达所述核酸。

术语“细胞”包括原核细胞，诸如细菌细胞；以及真核细胞，诸如酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括但不限于来自以下菌株的细胞：革兰氏阴性细菌菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株；以及革兰氏阳性细菌菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和乳球菌属(Lactococcus)的菌株。合适的真菌细胞包括但不限于来自以下属的物种的细胞：木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属(Aspergillus)。合适的酵母细胞包括但不限于来自以下属的物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))和汉逊酵母属(Hansenula)。合适的哺乳动物细胞包括但不限于例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、HEK-293等。在一个实施方案中，使用HEK-293细胞。然而，也可以使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和在本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。在某些示例性实施方案中，使用哺乳动物细胞(例如，来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞)进行过继转移。

合适的细胞可以源自很多种组织类型，并且包括原代细胞和细胞系，诸如免疫系统的细胞(例如，抗原呈递细胞，诸如树突细胞和T细胞；干细胞，诸如造血干细胞和间充质干细胞)以及任何其他细胞类型。

如本文所用，“抗原呈递细胞”是在其表面上展示在主要组织相容性复合物的背景下的抗原的细胞。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别组织相容性复合物。

细胞或宿主细胞可以是分离的或者组织或生物体(特别是“非人生物体”)的一部分。如本文所用，术语“非人生物体”意在包括非人灵长类动物或其他动物，例如哺乳动物，诸如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔或啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠)。

根据本发明的药物组合物包含一种或多种载体和/或赋形剂，所有所述载体和/或赋形剂都是药学上可接受的。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指材料无毒性，在某些示例性实施方案中，所述材料不与药物组合物的活性剂的作用相互作用。

如本文所用，术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中组合活性组分以便促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括一种或多种适合施用于受试者的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质。

用于肠胃外施用的合适载体物质包括但不限于无菌水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、生理盐水、抑菌盐水(例如，含有0.9％苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘和特别地生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。

如本文所用，术语“赋形剂”旨在包括可以存于药物组合物中并且并非活性成分的所有物质，诸如盐、粘合剂(例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇)、填充剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、调味剂或着色剂。

并非药学上可接受的盐可以用于制备药学上可接受的盐，并且被包括在本发明中。这种药学上可接受的盐以非限制性方式包括由以下酸制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，诸如钠盐、钾盐或钙盐。可以添加盐以调节药物组合物的离子强度或张力。

用于药物组合物的合适防腐剂包括但不限于抗氧化剂、柠檬酸、柠檬酸钠、苯扎氯铵、氯丁醇、半胱氨酸、甲硫氨酸、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯酚、甲酚及其混合物。

用于药物组合物的合适缓冲物质包括但不限于乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、磷酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris、THAM、氨丁三醇)。

在某些示例性实施方案中，根据本发明的药物组合物是无菌的。药物组合物可以以一致剂型提供，并且可以以本领域技术人员已知的任何方式来制备。药物组合物可以例如呈溶液或悬浮液的形式。

也可以将药物组合物配制为用适当稀释剂重构的稳定冻干产品，其任选地包含一种或多种如上文所定义的赋形剂。

除了GLP-1R激动肽外，根据本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种其他活性药物成分。

如本文所用，术语“部件试剂盒(kit of parts)(简写：试剂盒)”是指包含一个或多个容器以及任选地数据载体的制品。所述一个或多个容器可以装有本发明的上述药剂中的一种或多种，例如GLP-1R激动肽、融合蛋白、药物组合物以及相关药剂，诸如核酸分子和宿主细胞。在试剂盒中可以包含另外的容器，其含有例如稀释剂、缓冲剂和其他试剂。所述数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体，诸如信息传单、信息表、条码或存取码；或电子数据载体，诸如光盘(CD)、数字多功能光盘(DVD)、微芯片或另一种基于半导体的电子数据载体。存取码可以允许访问数据库，例如互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库。所述数据载体可以包含使用本发明的药剂的指导，所述药剂例如如本文所述的GLP-1R激动肽、融合分子、药物组合物以及相关药剂，诸如核酸分子和宿主细胞。

本文所述的药剂和组合物可以经由任何常规途径来施用，例如口服、经肺施用、通过吸入或肠胃外，包括通过注射或输注。在一个实施方案中，使用肠胃外施用，例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内。本文所述的药剂和组合物也可以通过持续释放施用来施用。

适合肠胃外施用的药物组合物典型地包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其任选地与接受者的血液是等渗的。相容性载体/溶剂/稀释剂的例子是无菌水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、生理盐水、抑菌盐水(例如，含有0.9％苯甲醇的盐水)、PBS和汉克氏溶液。此外，通常可以将无菌非挥发油用作溶液或悬浮液介质。

本文所述的药剂和组合物通常是以治疗有效量来施用的。“治疗有效量”是指单独或与其他剂量一起实现所需治疗反应或所需治疗效应、任选地不引起或最低程度地引起不可接受或不想要的副作用的量。

在某些示例性实施方案中，在治疗特定疾病、特定障碍或特定病症的情形中，所需反应可以与抑制疾病、障碍或病症的病程相关。这包括减慢疾病、障碍或病症的进展，并且特别是中断或逆转疾病、障碍或病症的进展。在疾病、障碍或病症的治疗中的所需反应也可以是延迟所述疾病、障碍或病症的发作或者预防所述疾病、障碍或病症的发作。本文所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症，疾病、障碍或病症的严重程度，受试者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型和体重)，治疗持续时间，伴随疗法(如果存在)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文所述的药剂的施用剂量可以取决于多个此类参数。在初始剂量引起的受试者反应不足的情形中，可以使用较高剂量(或通过不同的更局部性的施用途径实现的有效较高的剂量)。

根据本发明，术语“疾病、障碍或病症”是指任何病理或不健康状态，特别是肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、糖尿病性视网膜病变、高血糖症、血脂异常、NASH和/或动脉粥样硬化。

如本文所用，术语“肥胖症”是指已积累过多体脂达到可以对健康造成负面影响的程度的医学病症。对于人类(成年)受试者，肥胖症可以定义为体重指数(BMI)大于或等于30kg/m²(BMI≥30kg/m²)。

如本文所用，短语“超重”是指体脂的量高于最佳健康状态的医学病症。对于人类(成年)受试者，肥胖症可以定义为体重指数(BMI)大于或等于25kg/m²(例如，25kg/m²≤BMI＜30kg/m²)。

BMI是体重对身高的简单指数，其常用于归类成人的超重和肥胖症。它被定义为个人体重(以公斤计)除以其身高(以米计)的平方(kg/m²)。

如本文所用，“代谢综合征”是指以下医学状况中的至少三种的聚集：腹部(向心性)肥胖症(例如，定义为对于欧洲男性腰围≥94cm，以及对于欧洲女性腰围≥80cm，对于其他族群具有种族特异性值)、血压升高(例如，130/85mmHg或更高)、空腹血浆葡萄糖升高(例如，至少100mg/dL)、高血清甘油三酯(例如，至少150mg/dL)和低高密度脂蛋白(HDL)水平(例如，对于男性低于40mg/dL，以及对于女性低于50mg/dL)。

如本文所用，“糖尿病(diabetes mellitus)”(也简称为“糖尿病(diabetes)”)是指一组代谢疾病，其特征为由于胰岛素产生、胰岛素作用或两者的缺陷所致的高血糖水平。在一个实施方案中，糖尿病选自1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、成人迟发型自身免疫性糖尿病(LADA)、青少年发病的成年型糖尿病(MODY)以及由于特殊遗传病症、药物、营养不良、感染和其他疾病所致的其他类型的糖尿病。糖尿病的当前WHO诊断标准如下：空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/l(126mg/dL)或2小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/l(200mg/dL)。

如本文所用，“1型糖尿病”(也称为“胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)”或“青少年糖尿病”)是特征为由完全缺乏胰岛素引起的高血糖水平的病症。这在身体的免疫系统攻击胰腺中产生胰岛素的β细胞并破坏所述细胞时发生。然后，胰腺产生极少胰岛素或不产生胰岛素。胰腺切除或疾病也可以导致产生胰岛素的β细胞的损失。1型糖尿病占糖尿病病例的5％与10％之间。

如本文所用，“2型糖尿病”(也称为“非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)”或“成年发作型糖尿病”)是特征如下的病症：虽然胰岛素可用，但仍产生过多葡萄糖，并且由于葡萄糖清除(胰岛素作用)不足，循环葡萄糖水平保持过高。2型糖尿病可以占所有经诊断的糖尿病病例的约90％至95％。

如本文所用，“妊娠糖尿病”是先前未诊断出糖尿病的女性在妊娠期间(尤其是在孕晚期期间)展现高血糖水平的病症。妊娠糖尿病影响3％-10％的妊娠，取决于所研究的群体。

如本文所用，“成人迟发型自身免疫性糖尿病(LADA)”(也称为“缓发型1型糖尿病”)是在成人中发生的1型糖尿病形式，通常具有较慢发作过程。

如本文所用，“青少年发病的成年型糖尿病(MODY)”是指由常染色体显性基因中破坏胰岛素产生的突变引起的遗传性糖尿病形式。

如本文所用，“糖尿病性视网膜病变”是由糖尿病患者体内发生的代谢紊乱诱导的眼部疾病，并且导致视力的进行性下降。

如本文所用，术语“高血糖症”是指血液中的糖(葡萄糖)过多。

如本文所用，术语“血脂异常”是指脂蛋白代谢障碍，包括脂蛋白过度产生(“高脂血症”)或缺乏(“低脂血症”)。血脂异常可以表现为血液中的总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和/或甘油三酯浓度升高，和/或高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度降低。

如本文所用，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指特征为脂肪(脂滴)积累以及炎症和肝细胞降解的肝病。一旦开始，所述疾病就伴随着高硬化风险，硬化是一种肝脏功能改变并且可能进展为肝脏功能不全的状态。此后，NASH通常进展为肝癌。

如本文所用，“动脉粥样硬化”是指特征如下的血管疾病：称为斑块的脂质沉积物不规则分布于大型和中型动脉的内膜中，其可以引起动脉管腔狭窄并且进展为纤维化和钙化。病灶通常是局部的，并且缓慢且间歇性进展。有时发生斑块破裂，导致血流阻塞，从而引起远离阻塞处的组织死亡。血流受限解释大多数临床表现，其随阻塞的分布和严重程度而变。

如本文所用，术语“药剂”是指用于疗法(即，用于治疗疾病或障碍)的物质和/或组合物。

如本文所用，术语“治疗”是指向受试者施用化合物或组合物或者化合物或组合物的组合，以便：预防、改善或消除受试者的疾病、障碍或病症；阻止或减慢受试者的疾病、障碍或病症；抑制或减慢受试者的新生疾病、障碍或病症的发展；降低目前患有或先前曾患有疾病、障碍或病症的受试者的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即，增加)受试者的寿命。

具体地，短语“治疗疾病、障碍或病症”和“疾病、障碍或病症的治疗”包括治愈疾病、障碍或病症或其症状，缩短疾病、障碍或病症或其症状的持续时间，改善、预防、减慢或抑制疾病、障碍或病症或其症状的进展或恶化，或者预防或延迟疾病、障碍或病症或其症状的发作。

根据本发明，术语“受试者”是指用于治疗的受试者，特别是患病受试者(也称为“患者”)，包括但不限于人、非人灵长类动物或其他动物，例如哺乳动物，诸如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔或啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠)。在一个实施方案中，受试者/患者是人。

现在通过参考以下实施例进一步描述本发明，所述实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。

实施例

实施例1：通过系统药理学建模确定最佳GLP-1RA/FGF21活性比

使用改进的对GLP-1RA/FGF21融合蛋白在人中的药理学效应的机理了解来鉴别最佳GLP-1RA/FGF21效力比。开发了一种机理系统药理学模型，其描述了GLP-1和FGF21对人的葡萄糖、脂质和能量代谢的影响(Cuevas-Ramos等人(2009)Curr Diabetes Rev 5(4):216-220；Deacon等人(2011)Rev Diabet Stud 8(3):293-306；Kim等人(2008)Pharmacol Rev60(4):470-512；Kharitonenkov等人(2014)Mol Metab 3(3):221-229)。

所述模型代表GLP-1和FGF21效应的相关路径。捕捉血糖控制(即，HbA1c、空腹血浆葡萄糖、餐后血糖)、脂质参数(即，血浆甘油三酯、脂肪酸、胆固醇)和能量平衡(即，体重、食物摄入、能量消耗)以评估对模拟的药物治疗(例如，GLP-1RA/FGF21融合蛋白、利拉鲁肽、FGF21类似物LY2405319)的治疗反应。对于LY2405319，参见Kharitonenkov等人(2013)PLoSONE 8(3):e58575。

所述模型覆盖受激素胰岛素、胰高血糖素和某些肠降血糖素(例如，GLP-1、GIP)控制的葡萄糖稳态的关键方面。关于血糖控制的主要模型终点是HbA1c。HbA1c是用于估计在先前数月内的平均血浆葡萄糖浓度的常见临床终点。HbA1c是在模型内使用平均血浆葡萄糖与HbA1c之间的线性相关性来估计的，如Nathan等人(2008)Diabetes Care 31(8):1473-1478所报道。

所述模型以适于操作基础脂质代谢(包括胆固醇的代表)的水平并入甘油三酯和脂肪酸代谢。HDL和非HDL(即，LDL加VLDL胆固醇)是循环脂蛋白。脂质代谢的代表允许模拟FGF21化合物对脂质的影响和与他汀类的相互作用。FGF21化合物对脂质浓度具有显著的影响(Gaich等人(2013)Cell Metab 18(3):333-340；Fisher等人(2011)Endocrinology152(8):2996-3004)。

测量模型中的体重减轻或增加作为身体脂肪量的变化。脂肪量与体重之间存在直接关系(Broyles等人(2011)Br J Nutr 105(8):1272-1276)。食物摄入是基于基础和静止代谢率(Amirkalali等人(2008)Indian J Med Sci 62(7):283-290)。在能量消耗等于热量摄入时，身体脂肪量保持恒定。在模型中使用Gobel等人(2014)(Obesity(Silver Spring)22(10):2105-2108)的配制品实施对食物摄入的疗法效应。

将食物视为碳水化合物(葡萄糖当量)、脂肪(脂肪酸当量)和蛋白质(氨基酸当量)。所有营养物都进入胃，穿过延迟结，然后进入三室胃肠道。胃肠道设计是基于Bastianelli等人(1996)(J Anim Sci 74(8):1873-1887)和Worthington(1997)(MedInform(Lond)22(1):35-45)关于食物消化和吸收进行的工作。

营养物、激素、药物和疾病状况可以引起胃排空的延迟。在健康状况下，胃排空率取决于膳食的量、其能量密度和胃中营养物的量(Achour等人(2001)Eur J Clin Nutr 55(9):769-772；Fouillet等人(2009)Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 297(6):R1691-1705)。患有糖尿病的个体通常具有通过口服葡萄糖耐量试验或膳食试验观察到的葡萄糖吸收延迟(Bharucha等人(2009)Clin Endocrinol(Oxf)70(3):415-420；Chang等人(2012)Diabetes Care 35(12):2594-2596)。此延迟归因于胃排空的减慢。在此实施例的模型中增加胃与小肠之间的行程延迟以解释糖尿病受试者体内延迟的胃排空。药物和激素(例如，GLP-1)可以影响胃的迷走张力，这降低了机械混合和/或蠕动，并且还减慢了胃排空(Jelsing等人(2012)Diabetes Obes Metab 14(6):531-538；Little等人(2006)J ClinEndocrinol Metab 91(5):1916-1923；Nauck等人(2011)Diabetes 60(5):1561-1565；vanCan等人(2013)Int J Obes(Lond)38(6):784-93)。

此研究的一个目标是预防GLP-1相关的不良效应，即恶心和呕吐(Lean等人(2014)Int J Obes(Lond)38(5):689-697)。胃排空测量提供对诸如恶心和呕吐的不良事件的估计，所述不良事件与低胃排空率相关。因此，模型中胃不良事件的标志是胃排空率之和。

在模型平台中实施代表健康的和不同疾病阶段的2型糖尿病患者的不同虚拟患者。此外，虚拟患者覆盖不同程度的肥胖症和血脂异常。虚拟患者代表在临床上观察到的疾病严重程度和病理生理学变异性以及表型变异性。

在模型中实施若干疗法，即GLP-1RA/FGF21融合蛋白、利拉鲁肽、FGF21类似物LY2405319、二甲双胍、阿托伐他汀、西格列汀和人胰岛素。可以在模拟中开启或关闭这些疗法。假定虚拟患者在施用GLP-1RA/FGF21融合蛋白时具有二甲双胍和阿托伐他汀的背景。

在此实施例中描述的模型中实施虚拟GLP-1RA/FGF21融合蛋白。融合蛋白含有FGF21和GLP-1激动活性两者，并且它具有与FGF21和GLP-1受体激动剂两者相同的效应。假定虚拟融合蛋白的药代动力学谱与杜拉鲁肽类似(Geiser等人(2016)Clin Pharmacokinet55(5):625-34)。

通过与多个数据集比较来验证所述模型。模拟结果定性地与相关数据和知识一致，所述数据和知识例如Hellerstein等人(1997)J Clin Invest 100(5):1305-1319；Muscelli等人(2008)Diabetes 57(5):1340-1348。所述模型匹配相关的定量测试数据，例如Aschner等人(2006)Diabetes Care 29(12):2632-2637；Dalla Man,Caumo等人(2005)AmJ Physiol Endocrinol Metab 289(5):E909-914；Dalla Man等人(2005)Diabetes 54(11):3265-3273；Fiallo-Scharer(2005)J Clin Endocrinol Metab 90(6):3387-3391；Hahn等人(2011)Theor Biol Med Model 8:12；Herman等人(2005)Clin Pharmacol Ther78(6):675-688；Herman等人(2006)J Clin Pharmacol 46(8):876-886和J ClinEndocrinol Metab 91(11):4612-4619；Hojlund等人(2001)Am J Physiol EndocrinolMetab 280(1):E50-58；Monauni等人(2000)Diabetes 49(6):926-935；Nauck等人(2009)Diabetes Care 32(1):84-90；Nauck等人(1993)J Clin Invest 91(1):301-307；Nauck等人(2004)Regul Pept 122(3):209-217；Tzamaloukas等人(1989)West J Med 150(4):415-419；Sikaris(2009)J Diabetes Sci Technol 3(3):429-438；Vicini和Cobelli(2001)AmJ Physiol Endocrinol Metab 280(1):E179-186；Vollmer等人(2008)Diabetes 57(3):678-687。

在模型中实施现有疗法以供直接比较，所述现有疗法包括FGF21类似物和GLP-1受体激动剂。用临床数据验证FGF21类似物的效应，所述临床数据例如Gaich等人(2013)CellMetab 18(3):333-340。GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是靶标的直接竞争者，并且将其实施与各种临床数据进行比较，所述临床数据例如以下文献中描述的数据：Jacobsen等人(2009)Br J Clin Pharmacol 68(6):898-905；Elbrond等人(2002)Diabetes Care 25(8):1398-1404；Chang等人(2003)Diabetes 52(7):1786-1791；Kolterman等人(2003)J ClinEndocrinol Metab 88(7):3082-3089；Degn等人(2004)Diabetes 53(5):1187-1194；Kolterman等人(2005)Am J Health Syst Pharm 62(2):173-181；Vilsboll等人(2008)Diabet Med 25(2):152-156；Buse等人(2009)Lancet 374(9683):39-47；Jelsing等人(2012)Diabetes Obes Metab 14(6):531-538；Hermansen等人(2013)Diabetes ObesMetab 15(11):1040-1048；Suzuki等人(2013)Intern Med 52(10):1029-1034；van Can等人(2013)Int J Obes(Lond)38(6):784-93)；Zinman等人(2009)Diabetes Care 32(7):1224-1230；Russell-Jones等人(2009)Diabetologia 52(10):2046-2055；Pratley等人(2011)Int J Clin Pract 65(4):397-407；Nauck等人(2013)Diabetes Obes Metab 15(3):204-212；Flint等人(2011)Adv Ther 28(3):213-226；Kapitza等人(2011)Adv Ther28(8):650-660；以及Astrup等人(2012)Int J Obes(Lond)36(6):843-854。

所述模型平台允许以变化的活性比模拟虚拟GLP-1RA/FGF21融合蛋白的有益和不良效应。有效的FGF21介导的EC50值相对于源自Gaich等人(2013)Cell Metab 18(3):333-340的那些设定为常数。相对于内源GLP-1，有效的GLP-1介导的EC50值减小2至600倍，增量为1(表1)。

表1：GLP-1R激动剂/FGF21融合蛋白药效学(EC50值)。

^*相对于内源GLP-1

^**FGF21 EC50值是根据Gaich等人(2013)Cell Metab 18(3):333-340，假定半最大效应来设定的对于每种虚拟融合蛋白，针对相关药效学终点，即HbA1c、甘油三酯、脂肪酸、非HDL胆固醇和脂肪量，模拟暴露-反应关系。使用胃排空率作为GLP-1介导的不良事件的标志。针对宽剂量范围模拟用GLP-1RA/FGF21融合蛋白对普通肥胖型血脂异常2型糖尿病虚拟患者进行的52周治疗。在治疗52周后，预期所有相关药效学终点都达到稳态。对于每个终点，根据暴露-反应曲线确定半最大有效浓度(EC50值)。尤其对于主要GLP-1介导的终点HbA1c和胃排空率，EC50值随活性比而变。图1描绘了取决于GLP-1衰减因子的EC50值。增加的GLP-1衰减因子指示GLP-1R激动活性降低。

此程序允许鉴别相关活性比，对于所述活性比，与介导药效学效应的血浆水平相比，在更高的血浆水平下观察到不良效应。对于大于9的GLP-1衰减因子，GLP-1介导的胃肠不良效应的EC50大于药效学效应的EC50。因此，胃不良效应在比实现药效学效应所需的水平高的血浆水平下发生。可以说明提供所有所需药效学效应同时避免GLP-1介导的胃肠不良效应的剂量。

在衰减因子531处达到胃排空率的最大EC50值。在衰减因子482处达到不良效应与平均药效学效应之间的最大距离(图2)。因此，超出1:482的活性比是不相关的。药效学(HbA1c)的最大值与不良效应之间的最大距离为319。通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应之间的最大距离为121。

预测效力比在1:10与1:482之间的GLP-1RA/FGF21融合蛋白在改进脂质分布、体重和葡萄糖代谢方面最有益，并且基于胃排空反应，可能不引起严重的不良事件。基于所预测的对胃排空的强抑制以及不良事件的可能性，较低效力比可能并非良好的候选者。认为较高的效力比可能不够有效，因此不具有竞争性。

针对宽剂量范围模拟用GLP-1RA/FGF21融合蛋白对普通肥胖型血脂异常2型糖尿病虚拟患者进行的12周治疗，因为主要GLP-1介导的参数HbA1c水平在用本领域已知的GLP-1受体激动剂和FGF21药剂进行的12周治疗后在临床上达到稳态。

图3描绘了相对于12周模拟期内的GLP-1衰减因子获得的EC50值。对于大于18的GLP-1衰减因子，GLP-1介导的胃肠不良效应的EC50大于药效学效应的EC50。在衰减因子501处达到胃排空率的最大EC50值。在衰减因子469处达到不良效应与平均药效学效应之间的最大距离(图4)。药效学(HbA1c)的最大值与不良效应之间的最大距离为313。通过扩展FGF21介导的效应(脂质)和GLP-1介导的效应(HbA1c)归一化的药效学(HbA1c)的最大值与不良效应之间的最大距离为123。

借助所描述的系统药理学方法研究具有不同活性比的GLP-1RA/FGF21融合蛋白的功效和不良事件的可能性。鉴别具有推测计算的理想效力比的融合蛋白，预测其在改进脂质分布、体重和血糖控制方面是有益的，同时基于胃排空反应，可能不会引起严重的不良GLP-1RA相关效应。预测具有所选的模型告知效力比的化合物提供良好的功效对风险特征。

实施例2：同二聚体GLP-1RA/FGF21融合蛋白在HEK-293、CHO和大肠杆菌细胞中的表达以及分离的GLP-1R激动肽的化学合成

通过在HEK-293或CHO细胞中瞬时转染产生GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白。融合蛋白的DNA序列在N末端融合至IL2信号序列(SEQ ID NO:246)，随后是富含组氨酸的序列(His标签)和TEV蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO:247或248)。将所需蛋白分泌至培养基中需要信号序列。使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)(cOmplete His-Tag Purification Column^TM，Roche)从培养上清液中纯化蛋白质。在从IMAC柱洗脱后，任选地通过添加烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶来裂解N末端His标签。在His标签裂解后，使裂解反应溶液第二次经过IMAC柱(cOmplete His-Tag Purification Column^TM，Roche)，收集(无His标签)流过物级分。使用蛋白A亲和色谱(rProtein A Sepharose，GE Healthcare)和以磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)作为运行缓冲液的凝胶过滤柱进一步纯化蛋白质。将含有所需蛋白质的级分收集，合并，浓缩并储存于-80℃下直至进一步使用。

在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:252的FGF21蛋白(具有另外的N末端Gly的成熟人野生型FGF21；在本文中称为G-FGF21)。FGF21蛋白的DNA序列在N末端融合至富含组氨酸的序列(His标签)和TEV或SUMO蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO:248或249)。使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)(HisTrap HP，GE Healthcare)纯化所需蛋白质，随后通过添加TEV或SUMO蛋白酶裂解N末端His标签。在His标签裂解后，使用离子交换柱(Source 15，GE Healthcare)，随后是使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)作为运行缓冲液的凝胶过滤柱(Superdex 75，GEHealthcare)来纯化裂解反应溶液。将含有所需蛋白质的级分收集，合并，浓缩并储存于-80℃下直至进一步使用。

在替代方法中，通过在大肠杆菌包涵体中表达，随后进行重折叠步骤来产生融合蛋白，在所述重折叠步骤中，通过在Tris缓冲的盐酸胍溶液中解折叠包涵体，并通过在不含离液盐的缓冲液中稀释重折叠来获得折叠的融合蛋白。使用蛋白A亲和色谱(MabSelectSuRe，GE Healthcare)纯化融合蛋白，随后通过添加TEV蛋白酶裂解N末端前序列。使用阴离子交换柱(POROS 50HQ，ThermoFisher)纯化裂解反应溶液。将含有所需蛋白质的级分收集并合并。通过使用PBS(Gibco)的超滤/渗滤步骤建立最终的缓冲液条件和蛋白质浓度。将样品储存在-80℃下直至进一步使用。

通过重组方法产生融合蛋白(参见上文)，但是化学合成分离的肽GLP-1R激动剂。

更具体地，使用以下人工合成程序合成肽：

将0.3g烘干的Rink酰胺MBHA树脂(0.66mmol/g)置于配备有聚丙烯过滤器的聚乙烯容器中。将树脂在DCM(15ml)中溶胀1小时并且在DMF(15mL)中溶胀1小时。通过将其用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次(5分钟和15分钟)，使树脂上的Fmoc基团去保护。用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤树脂。使用Kaiser测试(定量方法)确认从固体载体上去除了Fmoc。将在无水DMF中的C末端Fmoc-氨基酸(5当量过量，对应于树脂载量)添加到去保护的树脂中，并且用在DMF中的5当量过量的DIC和HOBT引发下一Fmoc-氨基酸的偶联。反应混合物中每种反应物的浓度都为大约0.4M。将混合物在旋转器上在室温下旋转2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤。在偶联完成后对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阴性(树脂上无颜色)。在第一个氨基酸附接后，使用乙酸酐/吡啶/DCM(1:8:8)对树脂中的未反应氨基(如果存在)加帽20分钟，以避免序列的任何缺失。在加帽后，用DCM/DMF/DCM/DMF(各自6/6/6/6倍)洗涤树脂。通过将其用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次(5分钟和15分钟)，使C末端氨基酸附接的肽基树脂上的Fmoc基团去保护。用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤树脂。在Fmoc去保护完成后对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阳性。

使用Fmoc AA/DIC/HOBt方法，使用在DMF中的5当量过量(对应于树脂载量)，依序偶联Rink酰胺MBHA树脂上靶序列中的其余氨基酸。反应混合物中每种反应物的浓度都为大约0.4M。将混合物在旋转器上在室温下旋转2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤。在每个偶联步骤和Fmoc去保护步骤后，实施Kaiser测试以确认反应完成。

在线性序列完成后，将赖氨酸的ε氨基用作分支点或修饰点，并且通过使用DMF中的2.5％水合肼两次去保护，每次15分钟，并且用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤。使用在DMF中的Fmoc-Glu(OH)-OtBu与DIC/HOBt方法(相对于树脂载量，使用5当量过量)将谷氨酸的γ羧基端附接至Lys的ε氨基。将混合物在旋转器上在室温下旋转2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各自6x 30mL)洗涤。通过将其用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次(5分钟和15分钟，各自25mL)，使谷氨酸上的Fmoc基团去保护。用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤树脂。在Fmoc去保护完成后对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阳性。

如果侧链分支还含有另一个γ-谷氨酸，则使用在DMF中的DIC/HOBt方法(相对于树脂载量，用5当量过量)使用第二个Fmoc-Glu(OH)-OtBu附接至γ-谷氨酸的游离氨基。将混合物在旋转器上在室温下旋转2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各自6x 30mL)洗涤。通过将其用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次(5分钟和15分钟，25mL)，使γ-谷氨酸上的Fmoc基团去保护。用DMF/DCM/DMF(各自6:6:6次)洗涤树脂。在Fmoc去保护完成后对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阳性。

从树脂上最终裂解肽：

将通过人工合成而合成的肽基树脂用DCM(6x 10mL)、MeOH(6x 10mL)和醚(6x10mL)洗涤，并且在真空干燥器中干燥过夜。通过用试剂混合物(80％ TFA/5％茴香硫醚/5％苯酚/2.5％ EDT/2.5％ DMS/5％ DCM)将肽-树脂在室温下处理3小时将肽从固体载体上裂解下来。通过过滤收集裂解混合物，并且用TFA(2mL)和DCM(2x 5mL)洗涤树脂。在氮气下将过量的TFA和DCM浓缩至小体积，并且将少量DCM(5-10mL)添加到残余物中并在氮气下蒸发。重复所述过程3-4次，以去除大部分的挥发性杂质。将残余物冷却至0℃，并且添加无水醚以沉淀肽。离心沉淀的肽并去除上清液中的醚，并且将新鲜的醚添加到肽中并再次离心。对粗制样品进行制备型HPLC纯化并冻干。通过LCMS确认肽的身份。

实施例3：对CHO细胞中的人FGF21受体功效的体外细胞测定(In-Cell Western)

使用特异性和高灵敏度的In-Cell Western(ICW)测定来测量本发明的G-FGF21(SEQ IDNO:252)或融合蛋白的细胞体外功效。ICW测定是免疫细胞化学测定，其通常使用微孔板形式来进行。使用稳定表达人FGFR1c以及人β-Klotho(KLB)的CHO Flp-In细胞(Invitrogen，德国达姆施塔特)进行FGF21受体自身磷酸化ICW测定(Aguilar等人(2010)PLoS ONE 5(4):e9965)。为了确定受体自磷酸化水平或MAP激酶ERK1/2的下游激活，将2×10⁴个细胞/孔接种到96孔板中，并且使其生长48h。用含GlutaMAX的无血清培养基汉姆氏F-12营养混合物(Gibco，德国达姆施塔特)使细胞血清饥饿3-4小时。随后用递增浓度的G-FGF21(SEQ ID NO:252)或所指示的融合蛋白在37℃下将细胞处理5分钟。在孵育后，弃去培养基，并且将细胞在3.7％新鲜制备的多聚甲醛中固定20分钟。用在PBS中的0.1％ Triton-X-100将细胞透化20分钟。用Odyssey封闭缓冲液(LICOR，德国巴特洪堡)在室温下进行2小时封闭。作为一抗，添加抗pFGFR Tyr653/654(New England Biolabs，德国法兰克福)或抗pERK磷酸-p44/42MAP激酶Thr202/Tyr204(Cell Signaling)，并且在4℃下孵育过夜。在孵育一抗后，用PBS加0.1％ Tween20洗涤细胞。然后将细胞与抗小鼠800CW二抗(LICOR，德国巴特洪堡)一起在室温下孵育1小时。随后，再次用PBS加0.1％ Tween20洗涤细胞。用Odyssey成像仪(LICOR，德国巴特洪堡)量化红外染料信号。通过用TO-PRO3染料(Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄)量化DNA来归一化结果。以任意单位(AU)获得数据，并且根据剂量-反应曲线获得EC50值(汇总在表2和表3中)。图5显示了来自用过表达人FGFR1c加KLB的CHO细胞进行的ICW的结果。

表2：在CHO细胞中经由ICW pFGFR测量的G-FGF21(SEQ ID NO:252)和GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的EC50值。

表3：在CHO细胞中经由ICW pERK测量的G-FGF21(SEQ ID NO:252)和GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的EC50值。

实施例4：对人胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体功效的体外细胞测定

通过测量稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞系中的cAMP反应的功能测定来确定化合物对人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的激动。

使重组HEK-293细胞在置于37℃的T175培养瓶中的培养基(含10％ FBS的DMEM)中生长至接近汇合，并且以1-5×10⁷个细胞/mL的浓度收集在2mL小瓶中的含有10％ DMSO的细胞培养基中。每个小瓶含有1.8mL细胞悬浮液。将小瓶在异丙醇室中缓慢冷冻至-80℃，然后转移至液氮中以便长期储存。

在使用前，将冷冻的细胞在37℃下快速解冻，用20mL细胞缓冲液(1×HBSS；20mMHEPES，0.1％ BSA)洗涤，并且以900rpm离心5分钟。将细胞重悬浮于测定缓冲液(细胞缓冲液加2mM IBMX)中，并且调节至1×10⁶个细胞/mL的细胞密度。为了测量，将5μL细胞悬浮液(最终5×10³个细胞/孔)和5μL测试化合物添加到384孔板的孔中，随后在室温下孵育30分钟。将来自Bachem(瑞士布本多夫，H-6795)的人GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO:260)视为对照。使用来自Cisbio Corp.的试剂盒(目录号62AM4PEC)基于均相时间分辨荧光(HTRF)来确定细胞的cAMP含量。在添加稀释于溶解缓冲液中的HTRF试剂(试剂盒组分)后，将板孵育1h，随后测量在665/620nm下的荧光比。通过确定引起最大反应的50％激活的浓度(EC50)来量化激动剂的体外效力。

结果汇总在表4中，并且剂量-反应曲线示于图6中。

表4：在HEK-293细胞中经由HTRF cAMP测定测量的人GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)、GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和若干单一GLP-1R激动肽的EC50值。

n.d.：未确定

实施例5：分析GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的构象和热稳定性

使用UNit(Unchained Labs，美国加利福尼亚州)同时确定GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的构象稳定性和聚集倾向。UNit将检测蛋白质或多肽的解折叠的蛋白质或多肽的固有荧光的分析与研究聚集行为的静态光散射(SLS)测量相结合。

获得了在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中配制的浓度为5mg/mL的融合蛋白的数据。将体积为9μL的每个样品装载到UNit毛细管固定器中，并且在UNit上一式三份地进行分析。以0.3℃/分钟的恒定线性速率将温度从20℃升高到95℃。将指示用266nm激光检测的固有荧光和SLS信号的重心平均值(BaryCentric Mean，BCM)对所施加的温度绘图，以便获得解链温度(Tm)和聚集开始温度(Tagg)。数据使用UNit分析软件v.2.1进行分析并且汇总在表5中。

此外，对于一些蛋白质，在差示扫描荧光法(DSF或ThermoFluor^TM)测定的模拟中应用热位移测定分析热稳定性(Ahmad S.等人(2012)Protein Science 21:433-446；Pantoliano等人(2001)J.Biomol.Screen 6:429-440；Niesen等人(2007)Nat.Protoc.2:2212-21)。此测定是基于以下观察结果：疏水性荧光染料(诸如Sypro^TM Orange(LifeTechnologies，目录号S6651))在它们结合到蛋白质上的疏水补丁时增加它们的荧光。此类疏水补丁在蛋白质加热后解折叠时暴露于蛋白质中，因此可以将荧光的增加用作解折叠程度的量度，因此用作蛋白质热稳定性的量度。

通过将每种蛋白质在PBS(Gibco)中的溶液与160x Sypro^TM Orange溶液(由如供应商提供的5000X DMSO原液在水中稀释)混合来测试蛋白质。将样品体积用PBS调节至20μL。典型的条件包括在最终混合物中的0.8mg/mL蛋白质和8x Sypro^TM Orange，但是蛋白质浓度可以在0.4mg/mL与1.2mg/mL之间变化。将样品分配在96孔PCR板(BioRad Semi-Skirt96白色)中，并且短暂离心以去除气泡。将板插入BioRad iQ5实时PCR仪器中，并且经历以1℃/分钟的升温速度从10℃至90℃的热梯度。为了激发和量化荧光，选择波长为485nm和575nm的滤光片。使用BioRad iQ5标准版软件(v.2.0.148.60623)进行数据处理。在荧光强度对温度的曲线中，选择拐点作为解链温度(Tm)的量度。

表5：G-FGF21(SEQ ID NO:252)和所选的GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的解链温度和聚集温度。

^*经由DSF生成的数据；n.d.：未确定

实施例6：在小鼠和非人灵长类动物中的药代动力学

在对雌性C57Bl/6小鼠或雄性食蟹猴单次皮下施用0.3mg/kg溶液后使用三种不同的方法确定GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的血浆浓度和药代动力学参数。在给药后30分钟至168小时的时间点获得血液样品。

a.)用于量化GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的完整FGF21部分的生物分析筛选方法

用ELISA试剂盒(F1231-K01，Eagle Biosciences，美国)分析血浆样品中融合蛋白的完整FGF21部分。所述测定利用采用两种所选抗体的双位点夹心技术，所述抗体结合至人完整FGF21的不同表位。一种抗体特异性结合至人FGF21的N末端氨基酸(aa)29-35，并且另一种抗体特异性结合至人FGF21的C末端(aa 203-209)。将测定标准品、对照和未知样品直接添加到用抗人FGF21(aa 29-35)特异性抗体包被的微孔板的孔中。同时，将辣根过氧化物酶缀合的抗人FGF21(aa 203-209)特异性抗体添加到每个孔中。在第一个孵育期后，微量滴定孔的壁上的抗体捕获样品中的人FGF21，并且洗去每个微量滴定孔中未结合的蛋白质。形成“抗FGF21抗体-人完整FGF21-HRP缀合的示踪抗体”的“夹心”。在随后的洗涤步骤中去除未结合的示踪抗体。为了检测此免疫复合物，然后在定时反应中将孔与底物溶液一起孵育，然后在分光光度酶标仪中进行测量。结合至微量滴定孔的壁上的人完整FGF21的免疫复合物的酶活性与样品中完整FGF21的量成正比。

b.)用于量化完整全长融合蛋白的生物分析筛选方法

利用ELISA方法确定血浆中全长GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白的浓度。融合蛋白的N末端被小鼠单克隆抗GLP1抗体(Mesoscale Discovery，MSD)捕获。在室温(RT)下伴随轻轻振荡用150μL Blocker A(MSD)将板封闭1小时并且用300μL洗涤缓冲液洗涤3次后，将50μL稀释的血浆样品(标准品和PK研究样品)添加到每个孔中，并且将板在室温下伴随轻轻振荡孵育1小时。在用300μL洗涤缓冲液洗涤3次后，将50μL引物检测抗体(C末端兔抗FGF21抗体，Pineda 

rper-Service，德国柏林)添加到每个孔中，并且将板在室温下孵育1小时。在用300μL洗涤缓冲液洗涤3次后，将25μL在PBS-Tween 0.05％(PBS-T)中稀释的山羊抗兔抗体(Sulfo标签标记的，MSD)，并且将板在室温下孵育1小时。在用300μL PBS-T洗涤3次后，将150μL读取缓冲液添加到孔中。

c.)用于量化GLP-1FGF21 Fc融合蛋白的完整GLP-1部分的生物分析筛选方法

用GLP-1ELISA方法分析血浆样品中融合蛋白的完整GLP-1部分。将ELISA板用小鼠单克隆抗GLP-1抗体(Mesoscale Discovery，MSD)包被。在室温(RT)下伴随轻轻振荡用150μL Blocker A(MSD)封闭1小时并且用300μL PBS-T洗涤3次后，将50μL稀释的血浆样品(标准品和PK研究样品)添加到每个孔中，并且将板在室温下伴随轻轻振荡孵育1小时。在用300μLPBS-T洗涤3次后，将25μL在PBS-T中稀释(1/3,333)的山羊抗人IgG(Sulfo标签标记的，MSD)添加到每个孔中，并且将板在室温下孵育1小时。在用300μLPBS-T洗涤3次后，将150μL读取缓冲液添加到孔中。

通过WinNonlin 6.4程序使用非隔室模型和线性梯形插值计算来计算药代动力学参数。结果呈现在图7和图8以及表6中。结果显示新型GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白保持其血浆水平在ng/mL范围内，半衰期长达20-40小时。

表6：在小鼠和非人灵长类动物中皮下注射0.3mg/kg后，所选的GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白和G-FGF21(SEQ ID NO:252)的终末半衰期。

n.d.：未确定

实施例7：在鼠类模型中的体内功效

a.)多剂量饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠

将雌性C57BL/6N Charles River小鼠以12小时光照/12小时黑暗周期分组圈养在特定的无病原体的屏障设施中，自由获取水和标准或高脂肪饮食(ssniff调节的脂肪饮食E15797)。在以高脂肪饮食预饲喂20周后，将小鼠按体重分层至治疗组(n＝8)，使得每个组具有类似的平均体重。包括可随意获取标准食物(ssniff R/M-H，V1534-0)的年龄匹配组作为标准对照组。还包括杜拉鲁肽治疗组作为比较组。在开始治疗前，向小鼠皮下(s.c.)注射媒介物溶液并称重3天以使它们适应程序。

1)对饲喂的雌性DIO小鼠的血糖的急性效应：分别就在首次施用(s.c.)媒介物(磷酸盐缓冲溶液)或首次施用GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白(溶解在磷酸盐缓冲液中)之前，采集初始血液样品。施用量为5或10mL/kg，取决于储备溶液的浓度。在实验期间，动物可获取水和它们相应的饮食。在t＝0小时、t＝1小时、t＝2小时、t＝3小时、t＝4小时、t＝6小时和t＝24小时测量血糖水平(方法：Accu-Check血糖仪)。通过在不进行麻醉的情况下切开尾部进行血液取样。

2)对雌性DIO小鼠的体重的慢性效应：每第8天在光照阶段开始的上午，用媒介物或测试化合物每周对小鼠进行一次治疗，持续4周。每天记录体重和摄食量。在治疗开始前两天和在第26天，通过核磁共振(NMR)测量总脂肪量。

融合蛋白对体重和摄食量的影响分别示于图9和图10中。尽管到研究结束时，用SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:7的融合蛋白治疗的动物比媒介物或杜拉鲁肽治疗的动物累积消耗更多的食物，但它们比媒介物或杜拉鲁肽治疗的动物显著减轻更多的体重。这明确证明了SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的两种分子的GLP-1受体活性相对FGF21模拟物活性的平衡，因为它们对体重减轻的效应不需要抑制摄食量来实现。

b.)多次皮下剂量对饲喂的雌性糖尿病db/db小鼠的降血糖效应

动物、研究设计(给药前阶段、给药阶段)、药理学干预

雌性、健康、瘦(BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd或BKS.Cg-Dock7(m)+/+Lepr(db)J)小鼠和易患糖尿病、肥胖db/db(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd或BKS.CG-m+/+Lepr(db)/J)小鼠从Envigo RMS Inc.或Charles River Laboratories订购。所有动物都分组圈养在具有木屑垫料的鞋盒笼中，并且在给药阶段前适应大约2至3周。

将小鼠圈养在动物饲养所条件下，所述条件包括12小时光照/12小时黑暗周期(光照阶段凌晨04:00-下午4:00)、在20℃-26℃之间的室温和在30％-70％之间的相对湿度。所有动物都可自由获取格林菲尔德(Greenfield)城市给水和Purina Fomulab饮食5008。在研究开始时，小鼠为大约10-12周龄。

给药前阶段(15天)

在第9天经由尾夹收集血液用于HbA1c和血糖测量。使用扩展范围的AlphaTRAK血糖仪(代码29条试纸)测量血糖浓度。在任何其他生命活动前进行血糖仪测量，并且一式两份地进行。如果值相差超过20mg/dL(所计算的血糖仪值)，则记录第三个值。在第9天和第15天收集体重测量值。使用HbA1c和体重值进行区组随机化。根据区组随机化结果，在第15天将动物分配至治疗组(n＝8只/组)且分配至新的笼和配对笼(n＝4只动物/笼)。瘦组作为年龄匹配的健康参考组包括在研究中。

剂量配制和给药

在给药阶段的第1天、第8天、第15天、第22天和第27天，通过皮下注射量为5ml/kg的媒介物(无菌PBS)、杜拉鲁肽、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7对动物进行一次治疗。在上午10:00与12:00之间完成给药，并且调节至每个个体的最近体重记录。为了达到适当的浓度，通过向储备溶液或Pen配制品中添加无菌PBS来制备包含度易达(Trulicity)(杜拉鲁肽Pen)的注射溶液。

给药阶段(36天)

1)上午饲喂动物的血糖浓度：在实验期间动物无限制地获取水和饲料。在第1天、第2天、第8天、第9天、第15天、第16天、第22天、第23天、第27天和第28天在上午10:00至12:00之间在任何其他生命活动前以及在第2天、第9天、第16天、第23天和第28天在给药后24小时测量血糖。此外，在第1天和第22天，在给药后1、2、3、4、6和24小时收集血液(图11)。经由尾夹收集大约5μL血液，并且使用范围扩展的AlphaTRAK血糖仪(代码29条试纸)一式两份地进行血糖测量。如果值相差超过20mg/dL(所计算的血糖值)，则记录第三个值。通过梯形法计算所指示的每个个体和时间段的曲线下面积(AUC)。

2)HbA1c分析：在给药前阶段的第9天和给药阶段的第36天经由尾夹收集血液。将血液收集到5μL无添加剂的微毛细管中，并且立即置于含有溶血产物的离心管中。剧烈振荡管以混合溶血产物和血液，并且将其置于摇床上以确保血液和试剂完全混合。研究开始时和研究终止后的血浆HbA1c水平示于图12中。

统计学分析：数据描绘为平均值±SEM。对于统计学分析，进行单因素方差分析(ANOVA)和多重比较(邓尼特方法)，比较糖尿病肥胖db/db媒介物小鼠组(n＝8)与糖尿病肥胖db/db试验品治疗的小鼠组(n＝8)。在两组的平均值的差异大于0.05时，认为它们是统计学上显著不同的。非糖尿病、瘦-媒介物组的数据描绘于图11和图12中，并且用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

在用SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7的融合蛋白治疗的动物中，对血糖水平的降低效应显著大于媒介物或杜拉鲁肽治疗的动物中的效应(图11)。最高剂量的SEQ ID NO:8的融合蛋白甚至导致在治疗第22天测量的几乎整个24小时血糖谱内血糖水平降低至正常非糖尿病动物水平。此外，如图12中所示，到研究结束时，与媒介物或杜拉鲁肽治疗的动物相比，用SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7的融合蛋白治疗的动物显示出更显著的对HbA1c增加的抑制。

c.)DIO-NASH小鼠模型

动物和实验装置

所有动物实验都符合实验动物的护理和使用的国际公认原则。

从JanVier(JanVier Labs，法国)获得5周龄的雄性C57Bl/6J小鼠，并且将每个组在12小时黑暗/12小时光照周期下每笼圈养5只动物。将室温控制在22℃±1℃，湿度为50％±10％。动物可随意获取高脂肪(40％，其中18％为反式脂肪)、40％碳水化合物(20％果糖)和2％胆固醇的饮食(D09100301，Research Diet，美国)(先前描述为AMLN饮食(Clapper等人(2013)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 305:G483-G495))或常规啮齿类动物食物(Altromin 1324，Brogaarden，丹麦)和自来水(脂肪少的食物(lean chow)，n＝10-12)。在26周后，进行肝脏活检以对基线时的个体纤维化和脂肪变性分期进行组织学评估。

在活检前一天，用恩诺沙星(Bayer，德国)(5mg/mL/1mL/kg)对小鼠进行预治疗。在活检前，用在100％氧气中的异氟醚(2％-3％)麻醉小鼠。在中线上作出小的腹部切口，并且暴露出肝左外叶。从肝叶的远端部分切下锥形楔的肝脏组织(50-100mg)，将其固定在4％多聚甲醛中用于组织学。使用肝脏切割表面的电凝法借助使用ERBE VIO 100C电刀(ERBE，美国)的双极电凝来改进先前由Clapper等人描述的活检程序。将肝脏放回腹腔，缝合腹壁并钉合皮肤。在手术时以及手术后第一天和第二天腹膜内施用卡洛芬(Pfizer，美国)(5mg/mL-0.01mL/10g)和恩诺沙星(5mg/mL-1mL/kg)，以分别控制术后疼痛缓解和感染。在活检程序后，将动物单独圈养并保持喂食AMLN饮食持续3周以恢复。分层且随机化至10-12只动物的研究组是基于如通过基线肝脏活检评估的个体疾病分期。

然后通过每周一次皮下注射50mg/kg GLP-1RA/FGF21 Fc融合蛋白、0.6mg/kg杜拉鲁肽或媒介物(PBS)对动物进行治疗，持续另外8周，喂食AMLN或食物饮食。随后，对动物实施安乐死，测定肝脏重量，并且收集脏肝组织用于组织学和生物化学分析(参见图13)。

组织学评估和数字图像分析

从左外叶收集基线肝脏活检和末端样品(约100mg)，并且将其在4％多聚甲醛中固定过夜。将肝脏组织石蜡包埋并切片(3μm厚)。为了评估肝形态和纤维化，分别用苏木精和曙红以及天狼星红对切片染色，随后用Visiomorph软件(Visiopharm，丹麦)进行分析。由对研究不知情的病理学家进行组织学评估和评分。使用Kleiner等人(2005)Hepatology 41:1313-1321概述的临床标准进行NAFLD活动评分(NAS)(脂肪变性、炎症、气球样变性)和纤维化分期。数据以两种不同的形成呈现在图14和图15中。

SEQ ID NO:8的融合蛋白明确显示出对肝脏重量、肝脏总脂质含量、肝脏胆固醇和甘油三酯含量以及NAFLD活动得分的效应，其优于单独的GLP-1激动的那些效应，后者由杜拉鲁肽的效应来例证。

Claims (17)

1.一种GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动肽，其GLP-1R激动活性与天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约531倍，其中所述GLP-1R激动肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

X₁-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-X₁₂-X₁₃-L-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-F-X₂₃-E-W-L-X₂₇-X₂₈-X₂₉-G(SEQ ID NO:635)，

其中

X₁是H、Y或F，

X₁₀是K或L，

X₁₂是K、I或Q，

X₁₃是Q或L，

X₁₅是E、A或D，

X₁₆是E、K或S，

X₁₇是E、R或Q，

X₁₈是L、A或R，

X₁₉是V、A或F，

X₂₀是R、H、Q、K或I，

X₂₁是L、E、H或R，

X₂₃是I、Y或F，

X₂₇是I、L、K或E，

X₂₈是A、K、N或E，并且

X₂₉是G、T、K或V；

其中，任选地，所述氨基酸序列在其N末端进一步包含至少一个另外的氨基酸残基；并且

其中，任选地，所述氨基酸序列在其C末端进一步包含由多达约12个、约11个或约10个氨基酸残基组成的肽延伸部分。

2.根据权利要求1所述的GLP-1R激动肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

H-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-K-Q-L-E-E-E-X₁₈-V-X₂₀-L-F-I-E-W-L-K-A-X₂₉-G(SEQIDNO:636)，

其中

X₁₀是K或L，

X₁₈是A或R，

X₂₀是R或Q，并且

X₂₉是G或T；

其中，任选地，所述氨基酸序列在其N末端进一步包含至少一个另外的氨基酸残基；并且

其中，任选地，所述氨基酸序列在其C末端进一步包含由多达约12个、约11个或约10个氨基酸残基组成的肽延伸部分。

3.根据权利要求1或2所述的GLP-1R激动肽，其中所述至少一个另外的氨基酸残基是G或A。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的GLP-1R激动肽，其中所述肽延伸部分由选自SEQID NO:566至621的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的GLP-1R激动肽，其中在所述GLP-1R激动肽呈其分离形式时和/或在所述GLP-1R激动肽是融合分子的一部分时，所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与所述天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约9至约531倍。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的GLP-1R激动肽，其中所述GLP-1R激动肽的GLP-1R激动活性与所述天然GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:260)的GLP-1R激动活性相比降低约10至约500倍或约15至约500倍或约20至约500倍或约50至约500倍或约100至约500倍或约100至约300倍。

7.一种GLP-1R激动肽，其包含选自SEQ ID NO:261至552和554至565的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

8.一种GLP-1R激动肽，其包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

9.一种组合，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分。

10.一种融合分子，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽和至少一种其他活性药物成分。

11.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽或根据权利要求10所述的融合分子。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸分子。

13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽、根据权利要求9所述的组合、根据权利要求10所述的融合分子、根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的宿主细胞。

14.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽、根据权利要求9所述的组合、根据权利要求10所述的融合分子、根据权利要求11所述的核酸分子、根据权利要求12所述的宿主细胞或根据权利要求13所述的药物组合物。

15.根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽、根据权利要求9所述的组合、根据权利要求10所述的融合分子、根据权利要求11所述的核酸分子、根据权利要求12所述的宿主细胞或根据权利要求13所述的药物组合物，其用作药剂。

16.根据权利要求1至8中任一项所述的GLP-1R激动肽、根据权利要求9所述的组合、根据权利要求10所述的融合分子、根据权利要求11所述的核酸分子、根据权利要求12所述的宿主细胞或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗选自以下的疾病或障碍：肥胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、高血糖症、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和动脉粥样硬化。

17.根据权利要求16所述的用于所述用途的GLP-1R激动肽、组合、融合分子、核酸分子、宿主细胞或药物组合物，其中所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。

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