JP2023540662A - 低減された活性を有するｇｌｐ－１ｒアゴニストペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）アゴニストペプチド、およびこれを含む融合分子に関する。また、本発明は、低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドをコードする核酸分子、低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを含む医薬組成物および組合せ、ならびに低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを含むキットに関する。本発明はさらに、特に、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、ＮＡＳＨ、および／またはアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬としての、低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストペプチド、これを含む組合せおよび融合分子、ならびに対応する核酸分子、医薬組成物およびキットに関する。本発明はさらに、特に肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬としてのＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドの使用に関する。

ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドの、単独または他の医薬品有効成分との組合せの使用は、欠点を有し得る。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、低い血漿レベルにおいてさえも薬学的に有効である。より高い血漿レベルにおいては、ＧＬＰ－１（主要なＧＬＰ－１Ｒアゴニスト）は、有害作用を有することが公知であり、例えば、それは、吐き気および嘔吐を誘発する。対照的に、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドと組み合わせることができる他の医薬品有効成分、例えば、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）化合物の薬理学的作用は、多くの場合、薬理学的作用を発揮するＧＬＰ－１の血漿レベルよりも高い血漿レベルにおいて観察される。まとめると、このことは、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを単独でまたは別の医薬品有効成分と組み合わせて投与する場合の、例えば、融合分子の形態のＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドの、ＧＬＰ－１媒介有害作用のリスクを示す。したがって、これらの問題を克服する新しいＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドが必要とされる。

低減されたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを提供することが本発明の目的である。そのようなＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、例えば、潜在的な有害作用（例えば、吐き気および／または嘔吐など）を回避しながら、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比の均衡を保って、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物の両方の活性薬剤の有益作用（例えば、体重、脂質および／または血糖コントロールなどの点において）を達成するために使用することができる。

一態様において、本発明は、天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約５３１分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドであって、アミノ酸配列
Ｘ_１－Ｇ－Ｅ－Ｇ－Ｔ－Ｆ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｘ_１０－Ｓ－Ｘ_１２－Ｘ_１３－Ｌ－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｆ－Ｘ_２３－Ｅ－Ｗ－Ｌ－Ｘ_２７－Ｘ_２８－Ｘ_２９－Ｇ（配列番号６３５）
を含みまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
式中Ｘ_１はＨ、ＹまたはＦであり、
Ｘ_１０はＫまたはＬであり、
Ｘ_１２はＫ、ＩまたはＱであり、
Ｘ_１３はＱまたはＬであり、
Ｘ_１５はＥ、ＡまたはＤであり、
Ｘ_１６はＥ、ＫまたはＳであり、
Ｘ_１７はＥ、ＲまたはＱであり、
Ｘ_１８はＬ、ＡまたはＲであり、
Ｘ_１９はＶ、ＡまたはＦであり、
Ｘ_２０はＲ、Ｈ、Ｑ、ＫまたはＩであり、
Ｘ_２１はＬ、Ｅ、ＨまたはＲであり、
Ｘ_２３はＩ、ＹまたはＦであり、
Ｘ_２７はＩ、Ｌ、ＫまたはＥであり、
Ｘ_２８はＡ、Ｋ、ＮまたはＥであり、
Ｘ_２９はＧ、Ｔ、ＫまたはＶであり；
場合により、アミノ酸配列は、そのＮ末端において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基をさらに含み；
場合により、アミノ酸配列は、そのＣ末端において最大で約１２、約１１または約１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長をさらに含む、
ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに関する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、アミノ酸配列
Ｈ－Ｇ－Ｅ－Ｇ－Ｔ－Ｆ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｘ_１０－Ｓ－Ｋ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｅ－Ｅ－Ｘ_１８－Ｖ－Ｘ_２０－Ｌ－Ｆ－Ｉ－Ｅ－Ｗ－Ｌ－Ｋ－Ａ－Ｘ_２９－Ｇ（配列番号６３６）
を含みまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
式中
Ｘ_１０はＫまたはＬであり、
Ｘ_１８はＡまたはＲであり、
Ｘ_２０はＲまたはＱであり、
Ｘ_２９はＧまたはＴであり；
場合により、アミノ酸配列は、そのＮ末端において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基をさらに含み；
場合により、アミノ酸配列は、そのＣ末端において最大で約１２、約１１または約１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長をさらに含む。

一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、ＧまたはＡである。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、単一のアミノ酸残基である。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、Ｇである。

一実施形態において、ペプチド延長は、配列番号５６６～６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。一実施形態において、ペプチド延長は、単一のアミノ酸残基、例えば、Ｐである。一実施形態において、ペプチド延長は、アミノ酸配列ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６０５）またはＰＫＫＩＲＹＳ（配列番号５９８）を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。

別の態様において、本発明は、天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約５３１分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドであって、最大で３個のアミノ酸残基の置換を有する、配列番号２６１～５５２および５５４～５６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２６１～５５２および５５４～５６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに関する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドがその単離された形態において存在する場合および／またはＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドが融合分子の部分である場合、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約５３１分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約４８２分の１（もしくは約９．４４９分の１～約４８２．３９６分の１）または約９分の１～約３１９分の１（もしくは約９．４４９分の１～約３１９．３１１分の１）または約９分の１～約１２１分の１（もしくは約９．４４９分の１～約１２１．１８９分の１）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約３１９分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも約９．４分の１または少なくとも約９．４５分の１または少なくとも約９．５分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも約１０分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、最大約４８２．４分の１または最大約４８２．３５分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、最大約４８２分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１０分の１～約４８２分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１０分の１～約３１９分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９０分の１～約１００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも約１８分の１（または少なくとも約１８．２６８分の１）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１８分の１～約５０１分の１（もしくは約１８．２６８分の１～約５００．６８６分の１）または約１８分の１～約４６９分の１（もしくは約１８．２６８分の１～約４６８．６７９分の１）または約１８分の１～約３１３分の１（もしくは約１８．２６８分の１～約３１３．２１４分の１）または約１８分の１～約１２３分の１（もしくは約１８．２６８分の１～約１２３．４６６分の１）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１８分の１～約３１３分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

上記の実施形態のうちの１つにおいて、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも約１８．２分の１または少なくとも約１８．３分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

上記の実施形態のうちの１つにおいて、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも約２０分の１または少なくとも約５０分の１または少なくとも約１００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１０分の１～約５００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１５分の１～約５００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約２０分の１～約５００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約５０分の１～約５００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１００分の１～約５００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、天然ＧＬＰ－１（７～３６）のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１００分の１～約３００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する。

一実施形態において、融合分子の部分としてのＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、例えばヒトＧＬＰ－１Ｒを安定に発現する細胞のｃＡＭＰ応答を測定することによって、決定されるように、約１５ｐｍｏｌ／Ｌ～約４００ｐｍｏｌ／Ｌ、または約２０ｐｍｏｌ／Ｌ～約４００ｐｍｏｌ／Ｌ、または約５０ｐｍｏｌ／Ｌ～約４００ｐｍｏｌ／Ｌ、または約１００ｐｍｏｌ／Ｌ～約４００ｐｍｏｌ／ＬのＥＣ５０によりヒトＧＬＰ－１Ｒを活性化する。一実施形態において、ヒトＧＬＰ－１Ｒの活性化は、本質的に実施例４において説明されるように決定される。

一実施形態において、単離された形態のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、例えばヒトＧＬＰ－１Ｒを安定に発現する細胞のｃＡＭＰ応答を測定することによって、決定されるように、約７．５ｐｍｏｌ／Ｌ～約２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、または約７．５ｐｍｏｌ／Ｌ～約１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、または約７．５ｐｍｏｌ／Ｌ～約１００ｐｍｏｌ／Ｌ、または約７．５ｐｍｏｌ／Ｌ～約７５ｐｍｏｌ／Ｌ、または約８ｐｍｏｌ／Ｌ～約７５ｐｍｏｌ／Ｌ、または約９ｐｍｏｌ／Ｌ～約７５ｐｍｏｌ／Ｌ、または約９ｐｍｏｌ／Ｌ～約６０ｐｍｏｌ／ＬのＥＣ５０によりヒトＧＬＰ－１Ｒを活性化する。一実施形態において、ヒトＧＬＰ－１Ｒの活性化は、本質的に実施例４において説明されるように決定される。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、配列番号２６１～５５２および５５４～５６５を含むまたはそれからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、配列番号２６１または２６２のアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。

一実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、配列番号５５３および６２２～６３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含まないまたはそのようなアミノ酸配列からならない。

別の態様において、本発明は、配列番号２６１～５５２および５５４～５６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに関する。

別の態様において、本発明は、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むもしくはそのようなアミノ酸配列からなる、または配列番号２６２のアミノ酸配列を含むもしくはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに関する。

別の態様において、本発明は、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分を含む組合せに関する。

別の態様において、本発明は、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分を含む融合分子に関する。

一実施形態において、少なくとも１種の他の医薬品有効成分は、ＦＧＦ２１化合物である。

別の態様において、本発明は、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドまたは上記において定義される融合分子をコードする核酸分子に関する。

別の態様において、本発明は、上記において定義される核酸分子を含有する宿主細胞に関する。

別の態様において、本発明は、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞を含む医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子、上記において定義される宿主細胞または上記において定義される医薬組成物を含むキットに関する。

別の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子、上記において定義される宿主細胞または上記において定義される医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、高血糖症、異常脂血症、ＮＡＳＨ、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子もしくは上記において定義される宿主細胞または上記において定義される医薬組成物に関する。

一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。

別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、ＮＡＳＨ、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療のための医薬の製造における、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子、上記において定義される宿主細胞または上記において定義される医薬組成物の使用に関する。

一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。

別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、ＮＡＳＨ、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害を治療する方法であって、上記において定義されるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、上記において定義される組合せ、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子、上記において定義される宿主細胞または上記において定義される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。

一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。

ＧＬＰ－１減衰率（１２か月のシミュレーション）に依存した有害作用（胃排出（ＧＥ）率）および薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである： ・ ９．４４９超のＧＬＰ－１減衰率（約９に四捨五入することができる）について、ＧＬＰ－１媒介性胃腸有害作用（胃排出；ＧＥ率）のＥＣ５０は、薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）のＥＣ５０よりも大きかった； ・ ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２１．１８９であり；すなわち、１２１．１８９（約１２１に四捨五入することができる）において、ＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）と平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある（図２を参照のこと）； ・ 薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、３１９．３１１であった（約３１９に四捨五入することができる）； ・ 平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４８２．３９６であった（図２を参照のこと；約４８２に四捨五入することができる）； ・ 胃排出率の最大は５３１．０であった；（全て：縦線）。 ＧＬＰ－１減衰率（１２か月のシミュレーション）に依存したＧＥ率および平均薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）についてのＥＣ５０を示すグラフである： ・ 平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４８２．３９６であった（右の縦線；約４８２に四捨五入することができる）； ・ ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２１．１８９であった（左の縦線；約１２１に四捨五入することができる）。曲線「（最大ＧＥ率）／範囲」は、ＨｂＡ１ｃとＧＥ率との間の最大距離と、ＨｂＡ１ｃと平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離との間の比を表す。「（最大ＧＥ率）／範囲」曲線の最小において（すなわち、１２１．１８９において）、ＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）とＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある。 ＧＬＰ－１減衰率（３か月のシミュレーション）に依存した有害作用（ＧＥ率）および薬力学（ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである： ・ １８．２６８超のＧＬＰ－１減衰率（約１８に四捨五入することができる）について、ＧＬＰ－１媒介性胃腸有害作用（胃排出；ＧＥ率）のＥＣ５０は、薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）のＥＣ５０よりも大きかった； ・ ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２３．４６６であり；すなわち、１２３．４６６（約１２３に四捨五入することができる）において、ＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）と平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある（図４を参照のこと）； ・ 薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、３１３．２１４であった（約３１３に四捨五入することができる）； ・ 平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４６８．６７９であった（図４を参照のこと；約４６９に四捨五入することができる）； ・ 最大ＧＥ率は５００．６８６であった（約５０１に四捨五入することができる）（全て：縦線）。 ＧＬＰ－１減衰率（３か月のシミュレーション）に依存したＧＥ率および平均薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである： ・ 平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４６８．６７９であった（右の縦線；約４６９に四捨五入することができる）； ・ ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２３．４６６であった（左の縦線；約１２３に四捨五入することができる）。曲線「（最大ＧＥ率）／範囲」は、ＨｂＡ１ｃとＧＥ率との間の最大距離と、ＨｂＡ１ｃと平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離との間の比を表す。「（最大ＧＥ率）／範囲」曲線の最小において（すなわち、１２３．４６６において）、ＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）とＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある。 （ＡおよびＢ）ＣＨＯ細胞におけるヒトＦＧＦ２１受容体有効性についてのインビトロ細胞アッセイ（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ））の結果を示すグラフである。ｐＦＧＦＲは（Ａ）において示され、ｐＥＲＫは（Ｂ）において示される。 （Ａ～Ｄ）様々なＧＬＰ－１ＲアゴニストについてのＨＥＫ２９３細胞におけるヒトグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体有効性についてのインビトロ細胞アッセイの結果を示すグラフである。配列番号２は（Ａ）において示され、配列番号７は（Ｂ）において示され、配列番号８は（Ｃ）において示され、配列番号２、７および８は（Ｄ）において示される。 （Ａ～Ｆ）３種の異なる生物分析法を使用した、雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスまたは雄のカニクイザルへの０．３ｍｇ／ｋｇの溶液の単回皮下投与後の、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質の血漿濃度を示すグラフである。（Ａ）はマウスにおける配列番号２を示し、（Ｂ）はサルにおける配列番号２を示し、（Ｃ）はマウスにおける配列番号７を示し、（Ｄ）はサルにおける配列番号７を示し、（Ｅ）はマウスにおける配列番号８を示し、（Ｆ）はサルにおける配列番号８を示す。 図７－１の続き。 完全全長タンパク質の定量のための生物分析法を使用した、雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスへの０．３ｍｇ／ｋｇの溶液の単回皮下投与後の、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質およびＧ－ＦＧＦ２１（配列番号２５２）の血漿濃度を示すグラフである。 ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回２８日間の投薬による、雌の食事性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重の進展を示すグラフである。 ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回２８日間の投薬による、雌のＤＩＯマウスにおける累積食物摂取量の進展を示すグラフである。 （ＡおよびＢ）１日目に開始するＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照による第１の治療後（Ａ）、または２２日目に開始する第４の治療後（Ｂ）のｄｂ／ｄｂマウスの２４時間血中グルコースプロファイルを示すグラフである。データは、平均値±ＳＥＭである；ｎ＝８／群。 ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回３６日間の投薬による、雌のｄｂ／ｄｂマウスにおける血漿ＨｂＡ１ｃ含有量を示すグラフである。 （ＡおよびＢ）ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回８週間の投薬後の、ＤＩＯ ＮＡＳＨマウスにおける肝臓重量および脂質含有量の進展を示すグラフである。（Ａ）は肝臓重量および脂質レベルを示し、（Ｂ）は肝臓コレステロールおよび肝臓トリグリセリドレベルを示す。 図１３－１の続き。 ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回８週間の投薬後の、ＤＩＯ ＮＡＳＨマウスにおける線維症および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）活性スコアの進展を示すグラフを示す。 ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質および対照の週１回８週間の投薬後の、ＤＩＯ ＮＡＳＨマウスにおけるより高い、同じまたはより低い線維症およびＮＡＦＬＤ活性スコアを有する動物の数を示すグラフを示す。

本発明を以下において詳細に説明するが、本明細書において説明される特定の方法、プロトコール、および試薬は変わることがあるため、本発明はそれらに限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないということも理解されるべきである。特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本発明のある特定の要素について、本明細書においてより詳細に説明する。これらの要素は、特定の実施形態により列挙される；しかしながら、各特定の実施形態は、追加の実施形態を創出するためにあらゆる様式およびあらゆる数において組み合わせることができるということは理解されるべきである。様々に説明される実施例および例示的な実施形態は、明確に説明された実施形態のみに本発明を限定すると解釈すべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態をいくつもの開示されたおよび／または例示的な要素と組み合わせる実施形態も、支持および包含すると理解されるべきである。さらに、本出願における全ての説明された要素のあらゆる順序および組合せは、文脈において明記されない限り、本出願の説明によって開示されるものと解釈すべきである。

本明細書において使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ編，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載される通りに定義される。

本発明の実施は、そうでないと明記されない限り、当技術分野における文献において説明される、化学、生化学、細胞生理学、免疫学、遺伝子組換えＤＮＡ技術における従来の方法を用いるであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

以下の本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈上必要とされない限り、言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、言明されたメンバー、整数、または工程の包含だけでなく、任意の他のメンバー、整数、もしくは工程、または、メンバー、整数、または工程の群の包含を含意するが、いくつかの実施形態では、そのような他のメンバー、整数、または工程、または、メンバー、整数、もしくは工程の群が除外される場合もある、すなわち、主題が、言明されたメンバー、整数、もしくは工程、またはメンバー、整数、または工程の群の包含からなることも理解されるべきである。本発明を説明する文脈において使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などは（特に特許請求の範囲の文脈において）、本明細書において別段の指示がないか、または文脈において明確に否定されない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるできである。本明細書における値の範囲の列挙は、単にその範囲内に属する別々の各値を個別に言及するための簡単な方法として機能する。本明細書において別段の指示がない限り、個々の各値は、それらが本明細書において個別に列挙されるかのように、本明細書に組み入れられる。本明細書において説明される全ての方法は、そうでないことが本明細書において示されていない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序において実行することができる。本明細書において提供されるありとあらゆる実施例または例示言語（例えば、「例えば、～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく解説することを意図するものであり、そうでないことが主張されない限り、発明の範囲に制限を課すものではない。明細書におけるいかなる言語も、非請求要素を発明の実施に不可欠なものと指摘していると解釈すべきではない。

いくつかの文献が、本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書において引用された各文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書などを含む）は、上記および下記に関わらず、それらを参照することによりその全体を本明細書に組み入れる。本明細書のいかなる記載も、先行発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認として、解釈されるべきではない。

用語「ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド」は、本明細書において使用される場合、ＧＬＰ－１受容体に結合し、これを活性化するペプチド、例えば、ＧＬＰ－１（主要なＧＬＰ－１Ｒアゴニストとして）を指す。また、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、本明細書において単に「ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト」と呼ばれる場合がある。

用語「ペプチド」は、本明細書において使用される場合、概して、ペプチド結合によって共有結合的に連結された、例えば、約２以上、または約３以上、または約４以上、または約６以上、または約８以上、または約９以上、または約１０以上、または約１３以上、または約１６以上、または約２１以上のアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。ペプチドは、例えば、最大約１００個のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、大きなペプチドを指す。一実施形態において、用語「ポリペプチド」は、約１００個超のアミノ酸残基を有するペプチドを指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。

用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体および／または天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸模倣物、その構造が立体異性形態を許容する場合にはそのＤまたはＬ立体異性体を指す。アミノ酸は、本明細書において、それらの名前もしくは当技術分野において公知のそれらの３文字記号のどちらかにおいて、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号によって呼ばれる。

用語「天然に存在する」は、本明細書において使用される場合、核酸分子、（ポリ）ペプチド、宿主細胞などのような生体物質に関係して使用されるとき、天然において見出され、人為的に操作されていない物質を指す。

アミノ酸に関連して使用される場合、用語「天然に存在する」は、慣習的な２０のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ））、ならびにセレノシステイン、ピロリシン（ＰＹＬ）、およびピロリン－カルボキシリシン（ＰＣＬ）を意味する。

用語「非天然アミノ酸」は、本明細書において使用される場合、自然にはコードされないかまたはどの有機体の遺伝子コードにも見出されないアミノ酸を意味することを指す。それは、例えば、純粋に合成された化合物である場合がある。非天然アミノ酸の例としては、これらに限定されるわけではないが、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタメート、Ｏ－ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ－ヒドロキシリシン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルペンチルグリシン、Ｎ－メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、Ｄ－オルニチン、Ｄ－アルギニン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンが挙げられる。

用語「アミノ酸類似体」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物を指す。アミノ酸類似体は、可逆的または非可逆的に化学的に遮断されるか、または、例えばそれらのＣ末端カルボキシ基、それらのＮ末端アミノ基、および／またはそれらの側鎖の官能基のうちの１つまたは任意の組合せにおいて、化学的に修飾された、天然および非天然アミノ酸を含む。そのような類似体としては、これらに限定されるわけではないが、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホキシド、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホン、アスパラギン酸－（ベータメチルエステル）、Ｎ－エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。

用語「アミノ酸模倣物」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。

用語「天然ＧＬＰ－１（７－３６）」は、本明細書において使用される場合、場合により、そのＣ末端にアミド基を含む配列番号２６０のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。

一実施形態において、用語「ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性」（または「ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト効力」）は、本明細書において使用される場合、ＧＬＰ－１受容体の活性を指す。一実施形態において、この用語は、インビトロにおけるアゴニスト活性／効力を指す。別の実施形態において、この用語は、インビボにおけるアゴニスト活性／効力を指す。一実施形態において、ＧＬＰ－１受容体の活性は、インビトロにおけるアゴニストと接触したときのＧＬＰ－１受容体を安定的に発現する細胞のｃＡＭＰ反応を測定することによって決定される。一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞株に由来する。一実施形態において、ＧＬＰ－１受容体は、ヒトＧＬＰ－１受容体である。一実施形態において、ＧＬＰ－１受容体の活性は、本質的に実施例４において説明されるように決定される。一実施形態において、活性／効力は、ＥＣ５０値を決定することによって定量される。

本発明は、本明細書において定義される配列番号６３５および６３６の一般式に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを提供する。

一部の実施形態において、配列番号６３５および６３６の一般式に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、それらのＮ末端において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、単一のアミノ酸残基である。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は：プロリンを除外する天然に存在するアミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸類似体；およびアミノ酸模倣物からなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、Ｇ、Ａ、ＮおよびＣからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、ＧまたはＡである。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、Ｇである。

一部の実施形態において、配列番号６３５および６３６の一般式に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、それらのＣ末端においてペプチド延長を含む。ペプチド延長は、例えば、最大約１２、約１１、約１０または約９個のアミノ酸残基（例えば、約７、約８または約９個のアミノ酸残基）からなってもよい。一実施形態において、ペプチド延長は、配列番号５６６～６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態において、ペプチド延長は、単一のアミノ酸残基、例えば、Ｐである。

また、本発明は、配列番号２６１～５５２および５５４～５６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、および１、２または３つのアミノ酸残基の置換において元の配列とは異なるこれらのアミノ酸配列の変異体を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを提供する。

また、本発明は、配列番号２６１または配列番号２６２であるアミノ酸配列、および１、２または３つのアミノ酸残基の置換において元の配列とは異なるこれらのアミノ酸配列の変異体を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドを提供する。

一実施形態において、置換されたアミノ酸残基は、ＧＬＰ－１ＲアゴニストペプチドのＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に関与しない。一実施形態において、置換は、機能的に、かつ／または表現型としてサイレントである。一実施形態において、置換は、保存的アミノ酸置換である。

本明細書において使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の、同じファミリーのアミノ酸、すなわち、それらの側鎖において関連する（例えば、電荷および／またはサイズの点で）アミノ酸のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸による置換を指す。天然に存在するアミノ酸は、一般的に、４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、ときには芳香族アミノ酸として共に分類される。

ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドは、半減期延長モジュールに融合またはコンジュゲートしてもよい。「半減期」は、本明細書において使用される場合、一般的に、例えばインビボにおいて、化合物の活性、化合物の量または分子数の半分を除去するのに必要とされる期間を指す。そのようなモジュールは、当業者に公知であり、例えば、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒアルロン酸、ポリシアル酸）、非構造性（ポリ）ペプチド鎖、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）のようなアルブミン）、血清タンパク質結合分子（例えば、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、アルブミン結合脂肪酸）、抗体、免疫グロブリン、免疫グロブリンのＦｃドメイン（Ｆｃ領域とも呼ばれる）および免疫グロブリン結合ドメインを含む。

用語「非構造性（ポリ）ペプチド鎖」は、本明細書において使用される場合、定型的なまたは規則正しい三次元構造を欠き、典型的に親水性である（ポリ）ペプチド鎖を指す。非構造性（ポリ）ペプチド鎖が融合されたペプチドおよびタンパク質の半減期（例えば、インビボ半減期）を延長する非構造性（ポリ）ペプチド鎖は、当業者に公知であり、例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｖ．ら（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（１２）：１１８６－９０）およびＰＡＳ配列（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍ．ら（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２６（８）：４８９－５０１）を含む。

用語「～に融合された」は、本明細書において使用される場合、特に、遺伝子融合、例えば、組換えＤＮＡ技術による遺伝子融合を指す。（ポリ）ペプチド半減期延長モジュールのアミノ酸配列は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドのアミノ酸配列内の任意の位置において導入してもよく、例えば、コードされるペプチド構造内においてループの形状を取ってもよく、または（ポリ）ペプチド半減期延長モジュールのアミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端に融合してもよい。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに融合された（ポリ）ペプチド半減期延長モジュールのアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドがコードしてもよい。

用語「～にコンジュゲートされた」は、本明細書において使用される場合、（ポリ）ペプチドと別の分子との間、例えば、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドと半減期延長モジュールとの間の安定な共有結合を生じる化学的および／または酵素的コンジュゲーションを指す。そのようなコンジュゲーションは、（ポリ）ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または特定の側鎖において、例えば、リジン、システイン、チロシンまたは非天然アミノ酸残基において生じてもよい。

用語「組合せ」は、本明細書において使用される場合、患者へのＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分の別々の投与によって、またはＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分が、例えば１つの医薬組成物において存在する組合せ製品の形態において、もしくは融合分子の形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分を含む組合せを適用することを可能にする手段を含むことを意味する。別々に投与される場合、投与は、同時に、または連続的に任意の順序において起こり得る。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１種の他の医薬品有効成分の量、および相対的な投与のタイミングは、所望の治療効果の合計を達成するように選択される。組合せ物の投与は、同時に、（１）全ての医薬品有効成分を含む単一の医薬組成物において；または（２）医薬品有効成分の少なくとも１つをそれぞれが含む別々の医薬組成物においてであってもよい。あるいは、組合せ物は、ある治療薬剤が最初に投与され、二番目に他の薬剤が投与されるか、またはその逆において、連続して別々に投与してもよい。そのような連続投与は、時間的に近くであっても、または時間的に離れていてもよい。一実施形態において、組合せ物は、キット、例えば、本明細書において定義されるキットの形態で提供される。

用語「融合分子」は、本明細書において使用される場合、一般的に、２つ以上の異なる分子（例えば、タンパク質および／もしくはペプチドならびに／またはそれらの組合せ）を連結し、特に共有結合し、単一の分子の形成をもたらすことによって作出される分子を指す。ある特定の例示的な実施形態において、融合分子は、元の分子の各々に由来する１つまたはそれ以上の機能特性を有する。タンパク質および／またはペプチドの場合、融合分子は、「融合タンパク質」とも呼ばれる。融合分子は、遺伝子融合によって（例えば、組換えＤＮＡ技術によって）、または例えば２つ以上のポリペプチド、タンパク質またはそれらの任意の組合せの、化学的および／または酵素的コンジュゲーションによって生成してもよい。また、２つ以上の異なる分子は、１つまたはそれ以上の好適なリンカー分子、例えば、ペプチドリンカーおよび／または非ペプチドポリマー、例えばＰＥＧによって連結してもよい。

一実施形態において、ペプチドリンカーは、約２～約１００個のアミノ酸残基、または約２～約９０個のアミノ酸残基、または約２～約８０個のアミノ酸残基、または約２～約７０個のアミノ酸残基、または約２～約６０個のアミノ酸残基、または約２～約５０個のアミノ酸残基、または約２～約４０個のアミノ酸残基、または約２～約３０個のアミノ酸残基、または約２～約２５個のアミノ酸残基、または約２～約２０個のアミノ酸残基の長さを有する。一実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも約５個のアミノ酸残基を含む。一般的に、ペプチドリンカーは、柔軟性およびプロテアーゼ抵抗性を提供するように設計される。一実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン－セリンリッチリンカーであり、例えば、アミノ酸の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％は、それぞれ、グリシンまたはセリン残基である。別の実施形態において、アミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択され、すなわち、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリンから排他的に構成される（グリシン－セリンリンカーと呼ばれる）。一実施形態において、ペプチドリンカーは、そのＣ末端においてアラニン残基をさらに含む。ペプチドリンカーは、１つまたはそれ以上の特異的プロテアーゼ切断部位をさらに含み得る。一実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号２３１～２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。

一実施形態において、融合分子は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）のＦｃドメイン（Ｆｃ領域とも呼ばれる）またはその変異体をさらに含む。一実施形態において、Ｆｃドメインの変異体は、Ｆｃドメインの野生型配列と比較して、最大約６、約５または約４個の変異を含む。一実施形態において、該変異は、アミノ酸置換、アミノ酸付加およびアミノ酸欠失、例えば、ＮまたはＣ末端欠失からなる群から選択される。一実施形態において、Ｆｃドメインまたはその変異体は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の野生型配列に、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％超の配列同一性を有してもよく、または約１００％の配列同一性を有してもよい。一実施形態において、Ｆｃドメインまたはその変異体は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の野生型配列に、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９３％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％超の配列同一性を有してもよく、または約１００％の配列同一性を有してもよい。一実施形態において、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはその変異体は、配列番号２５７、２５８および２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。

一実施形態において、融合分子は、Ｌ－Ｆｃ、Ｆｃ－Ｌ、Ｌ_１－Ｆｃ－Ｌ_２およびＦｃからなる群から選択される構造を含むリンカー分子を含み、Ｌ、Ｌ_１およびＬ_２は、単一のアミノ酸およびペプチド（例えば、本明細書において定義されるペプチドリンカー）からなる群から独立して選択され、Ｆｃは、免疫グロブリンのＦｃドメインまたはその変異体である。Ｌ_１およびＬ_２は、同じであっても、異なっていてもよい。一実施形態において、Ｌ_１およびＬ_２は、異なっている。一実施形態において、Ｌ_１は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含みもしくはそのようなアミノ酸配列からなり、Ｌ_２は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むもしくはそのようなアミノ酸配列からなるか、またはその逆の場合もある。

句「線維芽細胞増殖因子２１」または「ＦＧＦ２１」は、本明細書において使用される場合、当技術分野において公知の任意のＦＧＦ２１タンパク質を指し、特に、ヒトＦＧＦ２１を指す。一実施形態において、ヒトＦＧＦ２１は、配列番号２５０のアミノ酸配列（全長ヒト野生型ＦＧＦ２１）を有する。成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１、すなわち、配列番号２５０のアミノ酸１～２８（Ｍ１～Ａ２８）（すなわち、そのシグナル配列／ペプチド）を欠くヒト野生型ＦＧＦ２１は、配列番号２５１として示される。追加のＮ末端Ｇｌｙを有する成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１は、配列番号２５２によって表され、本明細書でＧ－ＦＧＦ２１と呼ばれる。

句「ＦＧＦ２１化合物」は、本明細書において使用される場合、概して、ＦＧＦ２１活性を有する化合物を指す。

一実施形態において、句「ＦＧＦ２１活性」（または「ＦＧＦ２１効力」）は、本明細書において使用される場合、ＦＧＦ２１受容体（ＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１ｃ）の活性化を指す。一実施形態において、ＦＧＦ２１受容体は、ヒトＦＧＦ２１受容体である。一実施形態において、ＦＧＦ２１活性とは、インビトロにおける活性および／または効力を指す。別の実施形態において、ＦＧＦ２１活性とは、インビボにおける活性および／または効力を指す。一実施形態において、ＦＧＦ２１受容体の活性化は、インビトロにおけるＦＧＦ２１化合物と接触したときのＦＧＦ２１受容体自己リン酸化および／またはＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２のリン酸化を測定することによって決定される。一実施形態において、ヒトＦＧＦＲ１ｃの自己リン酸化および／またはＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２のリン酸化は、例えば、本質的に実施例３において説明されるように、Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）を使用することによって決定される。一実施形態において、活性および／または効力は、ＥＣ５０値を決定することによって定量される。

用語「Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイ」は、本明細書において使用される場合、免疫細胞化学的アッセイ、より詳しくは、典型的にはマイクロプレート（例えば、９６ウェル形式または３８４ウェル形式）を使用して実施される、定量的免疫蛍光アッセイを指す。ＩＣＷは、ウェスタンブロッティングの特異性を、ＥＬＩＳＡの再現性および処理能力と組み合わせるものである（例えば、Ａｇｕｉｌａｒ Ｈ．Ｎ．ら（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（４）：ｅ９９６５を参照されたい）。適切なＩＣＷアッセイシステムは市販されている（例えば、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。一実施形態において、抗ｐＦＧＦＲ抗体および／または抗ｐＥＲＫ抗体は、ＩＣＷアッセイにおいて使用される。

一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、ペプチド化合物、すなわち、ペプチドまたはタンパク質である。一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体であって、天然ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有する。用語「天然ＦＧＦ２１」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するＦＧＦ２１、例えば、配列番号２５０のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＦＧＦ２１、または配列番号２５１のアミノ酸配列を有する成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１を指す。

「配列同一性」は、本明細書において使用される場合、２つのアミノ酸または核酸配列間において同一であるアミノ酸の割合を指す。比較のための配列の最適化アラインメントは、手作業により、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２、４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３の局所的相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、２４４４の類似検索方法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、生成することができる。

一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、配列番号２５０～２５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるタンパク質である。

また、本発明における使用のための好適なＦＧＦ２１変異体は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７９５５１に記載され、それらを参照することにより本明細書に組み入れられる。

一実施形態において、融合分子は、構造Ａ－Ｌ_１－Ｆｃ－Ｌ_２－Ｂを有する融合タンパク質であり、ＡはＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドであり、Ｌ_１、ＦｃおよびＬ_２は本明細書において定義される通りであり、Ｂは本明細書において定義されるＦＧＦ２１化合物である。一実施形態において、融合分子は、配列番号１～２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。

一般的に、用語「医薬品有効成分」（ＡＰＩ）は、本明細書において使用される場合、いくらかの薬理効果を提供し、本明細書において定義される状態、例えば、疾患または障害を治療または予防するために使用される、任意の薬学的に活性な化学的または生物学的化合物ならびにそれらの任意の薬学的に許容される塩およびそれらの任意の混合物を含む。

例示的な薬学的に許容される塩としては、以下の酸：塩酸（例えば、塩化物塩）、硫酸（例えば、硫酸塩）、硝酸（例えば、硝酸塩）、リン酸（例えば、リン酸塩）、臭化水素酸（例えば、臭化水素酸塩）、マレイン酸（例えば、マレイン酸塩）、リンゴ酸（例えば、リンゴ酸塩）、アスコルビン酸、クエン酸（例えば、クエン酸塩）、酒石酸（例えば、酒石酸塩）、パモ酸（例えば、パモ酸塩またはエンボン酸塩）、ラウリン酸（例えば、ラウリン酸塩）、ステアリン酸（例えば、ステアリン酸塩）、パルミチン酸（例えば、パルミチン酸塩）、オレイン酸、ミリスチン酸（例えば、ミリスチン酸塩）、ラウリル酸、ナフタレンスルホン酸、リノレン酸（例えば、リノール酸塩）などのうちの１つまたはそれ以上から作られる塩が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、用語「医薬品有効成分」、「活性剤」、「有効成分」、「活性物質」、「治療的に活性な化合物」、および「薬物」は、同義語であることが意図され、すなわち、同一の意味を有する。

本発明により、医薬品有効成分は、場合により、以下から選択される：
－ Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４において言及される全ての薬物、例えば、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ １２において言及される全ての抗糖尿病薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ ０６において言及される全ての体重減量剤もしくは食欲抑制剤、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ ５８において言及される全ての脂質低下剤、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４ ｃｈａｐｔｅｒ １７において言及される全ての抗高血圧症薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅにおいて言及される全ての腎臓保護薬（ｎｅｐｈｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、またはＲｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４ ｃｈａｐｔｅｒ ３６において言及される全ての利尿薬；
－ 本明細書において定義されるＦＧＦ２１化合物；
－ モノクローナル抗体；
－ インスリンおよびインスリン誘導体、例えば：インスリングラルギン（例えば、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬ超に濃縮されたインスリングラルギン、例えば、２７０～３３０Ｕ／ｍＬのインスリングラルギンまたは３００Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（ＥＰ２３８７９８９において開示される）、インスリングルリシン（例えば、Ａｐｉｄｒａ（登録商標））、インスリンデテミル（例えば、Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標））、インスリンリスプロ（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、Ｌｉｐｒｏｌｏｇ（登録商標））、インスリンデグルデク（例えば、ＤｅｇｌｕｄｅｃＰｌｕｓ（登録商標）、ＩｄｅｇＬｉｒａ（ＮＮ９０６８））、インスリンアスパルトおよびアスパルト製剤（例えば、ＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標））、基礎インスリンおよび類似体（例えば、ＬＹ２６０５５４１、ＬＹ２９６３０１６、ＮＮ１４３６）、ペグ化インスリンリスプロ（例えば、ＬＹ－２７５５８５）、長時間作用型インスリン（例えば、ＮＮ１４３６、Ｉｎｓｕｍｅｒａ（ＰＥ０１３９）、ＡＢ－１０１、ＡＢ－１０２、Ｓｅｎｓｕｌｉｎ ＬＬＣ）、中間時間作用型インスリン（例えば、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｎ）、速効性および短時間作用型インスリン（例えば、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｌｉｎｊｅｔａ（登録商標）（ＶＩＡｊｅｃｔ（登録商標））、ＰＨ２０インスリン、ＮＮ１２１８、ＨｉｎｓＢｅｔ（登録商標））、予備混合インスリン、ＳｕｌｉＸｅｎ（登録商標）、ＮＮ１０４５、インスリン＋Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標）、ＰＥ－０１３９、ＡＣＰ－００２ヒドロゲルインスリン、ならびに経口、吸入可能、経皮、および口腔、または舌下インスリン（例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）、Ｎａｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｆｒｅｚｚａ（登録商標）、インスリントレゴピル（ｔｒｅｇｏｐｉｌ）、ＴＰＭ－０２インスリン、Ｃａｐｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ｏｒａｌ－ｌｙｎ（登録商標）、Ｃｏｂａｌａｍｉｎ（登録商標）、経口インスリン、ＯＲＭＤ－０８０１、Ｏｓｈａｄｉ経口インスリン、ＮＮ１９５３、ＮＮ１９５４、ＮＮ１９５６、ＶＩＡｔａｂ（登録商標））。二官能性リンカーによってアルブミンまたは他のタンパク質に結合したこれらのインスリンの誘導体も好適である；
－ グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）、ＧＬＰ－１類似体、およびＧＬＰ－１受容体アゴニスト、例えば：ＧＬＰ－１（７～３７）、ＧＬＰ－１（７～３６）アミド、リキシセナチド（例えば、Ｌｙｘｕｍｉａ（登録商標））、エキセナチド（例えば、エキセンディン－４、ｒエキセンディン－４、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）、Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）、エキセナチドＮｅｘＰ）、エキセナチド－ＬＡＲ、リラグルチド（例えば、Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））、セマグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、アルブゴン、オキシントモジュリン、ゲニプロシド、ＡＣＰ－００３、ＣＪＣ－１１３１、ＣＪＣ－１１３４－ＰＣ、ＧＳＫ－２３７４６９７、ＰＢ－１０２３、ＴＴＰ－０５４、ラングレナチド（ＨＭ－１１２６０Ｃ）、ＣＭ－３、ＧＬＰ－１Ｅｌｉｇｅｎ、ＡＢ－２０１、ＯＲＭＤ－０９０１、ＮＮ９９２４、ＮＮ９９２６、ＮＮ９９２７、Ｎｏｄｅｘｅｎ、Ｖｉａｄｏｒ－ＧＬＰ－１、ＣＶＸ－０９６、ＺＹＯＧ－１、ＺＹＤ－１、ＺＰ－３０２２、ＣＡＭ－２０３６、ＤＡ－３０９１、ＤＡ－１５８６４、ＡＲＩ－２６５１、ＡＲＩ－２２５５、エキセナチド－ＸＴＥＮ（ＶＲＳ－８５９）、エキセナチド－ＸＴＥＮ＋グルカゴン－ＸＴＥＮ（ＶＲＳ－８５９＋ＡＭＸ－８０８）、ならびにポリマー結合ＧＬＰ－１およびＧＬＰ－１類似体；
－ 二重ＧＬＰ－１／ＧＩＰアゴニスト（例えば、ＲＧ－７６９７（ＭＡＲ－７０１）、ＭＡＲ－７０９、ＢＨＭ０８１、ＢＨＭ０８９、ＢＨＭ０９８）；二重ＧＬＰ－１／グルカゴン受容体アゴニスト（例えば、ＢＨＭ－０３４、ＯＡＰ－１８９（ＰＦ－０５２１２３８９、ＴＫＳ－１２２５）、ＴＴ－４０１／４０２、ＺＰ２９２９、ＬＡＰＳ－ＨＭＯＸＭ２５、ＭＯＤ－６０３０）；
－ 二重ＧＬＰ－１／ガストリンアゴニスト（例えば、ＺＰ－３０２２）；
－ 胃腸ペプチド、例えば、ペプチドＹＹ３－３６（ＰＹＹ３－３６）またはその類似体および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）またはその類似体；
－ グルカゴン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストまたはインバースアゴニスト、キセニンおよびその類似体；
－ ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－４）阻害剤、例えば：アログリプチン（例えば、Ｎｅｓｉｎａ（登録商標）、Ｋａｚａｎｏ（登録商標））、リナグリプチン（例えば、Ｏｎｄｅｒｏ（登録商標）、Ｔｒａｊｅｎｔａ（登録商標）、Ｔｒａｄｊｅｎｔａ（登録商標）、Ｔｒａｙｅｎｔａ（登録商標））、サキサグリプチン（例えば、Ｏｎｇｌｙｚａ（登録商標）、Ｋｏｍｂｏｇｌｙｚｅ ＸＲ（登録商標））、シタグリプチン（例えば、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）、Ｘｅｌｅｖｉａ（登録商標）、Ｔｅｓａｖｅｌ（登録商標）、Ｊａｎｕｍｅｔ（登録商標）、Ｖｅｌｍｅｔｉａ（登録商標）、Ｊｕｖｉｓｙｎｃ（登録商標）、Ｊａｎｕｍｅｔ ＸＲ（登録商標））、アナグリプチン、テネリグリプチン（例えば、Ｔｅｎｅｌｉａ（登録商標））、トレラグリプチン、ビルダグリプチン（例えば、Ｇａｌｖｕｓ（登録商標）、Ｇａｌｖｕｍｅｔ（登録商標））、ゲミグリプチン、オマリグリプチン、エボグリプチン、デュトグリプチン、ＤＡ－１２２９、ＭＫ－３１０２、ＫＭ－２２３、ＫＲＰ－１０４、ＰＢＬ－１４２７、ピノキサシンヒドロクロリド、およびＡｒｉ－２２４３；
－ ナトリウム依存性グルコーストランスポーター２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤、例えば：カナグリフロジン、ダパグリフロジン、レモグリフロジン、エタボン酸レモグリフロジン、セルグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、エルツグリフロジン、ＥＧＴ－０００１４４２、ＬＩＫ－０６６、ＳＢＭ－ＴＦＣ－０３９、およびＫＧＡ－３２３５（ＤＳＰ－３２３５）；
－ ＳＧＬＴ－２およびＳＧＬＴ－１の二重阻害剤（例えば、ＬＸ－４２１１、ＬＩＫ０６６）。
－ 肥満防止薬、例えば、ＳＧＬＴ－１阻害剤（例えばＬＸ－２７６１、ＫＧＡ－３２３５）または回腸型胆汁酸トランスポーター（ＩＢＡＴ）阻害剤（例えば、ＧＳＫ－１６１４２３５＋ＧＳＫ－２３３０６７２）と組み合わせたＳＧＬＴ－１阻害剤；
－ ビグアニド（例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン）；
－ チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）、グリタゾン類似体（例えば、ロベグリタゾン）；
－ ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ－アルファ、ガンマ、またはアルファ／ガンマ）アゴニストもしくはモジュレーター（例えば、サログリタザル（例えば、Ｌｉｐａｇｌｙｎ（登録商標））、ＧＦＴ－５０５）、またはＰＰＡＲガンマ部分アゴニスト（例えば、Ｉｎｔ－１３１）；
－ スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド、Ａｍａｒｙｌ（登録商標）、グリピザイド）およびメグリチニド（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド）；
－ アルファ－グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボース）；
－ アミリンおよびアミリン類似体（例えば、プラムリンチド、Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標））；
－ Ｇタンパク質結合受容体１１９（ＧＰＲ１１９）アゴニスト（例えば、ＧＳＫ－１２９２２６３、ＰＳＮ－８２１、ＭＢＸ－２９８２、ＡＰＤ－５９７、ＡＲＲＹ－９８１、ＺＹＧ－１９、ＤＳ－８５００、ＨＭ－４７０００、ＹＨ－Ｃｈｅｍ１）；
－ ＧＰＲ４０アゴニスト（例えば、ＴＵＧ－４２４、Ｐ－１７３６、Ｐ－１１１８７、ＪＴＴ－８５１、ＧＷ９５０８、ＣＮＸ－０１１－６７、ＡＭ－１６３８、ＡＭ－５２６２）；
－ ＧＰＲ１２０アゴニストおよびＧＰＲ１４２アゴニスト；
－ 全身性または低吸収性ＴＧＲ５（ＧＰＢＡＲ１＝Ｇタンパク質結合胆汁酸受容体１）アゴニスト（例えば、ＩＮＴ－７７７、ＸＬ－４７５、ＳＢ７５６０５０）；
－ 糖尿病免疫療法、例えば：経口Ｃ－Ｃケモカインレセプタータイプ２（ＣＣＲ－２）アンタゴニスト（例えば、ＣＣＸ－１４０、ＪＮＪ－４１４４３５３２）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）アンタゴニスト（例えばＡＣ－２０１）、または経口モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、メタゾラミド、ＶＶＰ８０８、ＰＡＺ－３２０、Ｐ－１７３６、ＰＦ－０５１７５１５７、ＰＦ－０４９３７３１９）；
－ メタボリック症候群および糖尿病の治療のための抗炎症剤、例えば：核内因子カッパＢ阻害剤（例えば、Ｔｒｉｏｌｅｘ（登録商標））；
－ アデノシンモノリン酸－活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）刺激剤、例えば：Ｉｍｅｇｌｉｍｉｎ（ＰＸＬ－００８）、Ｄｅｂｉｏ－０９３０（ＭＴ－６３－７８）、Ｒ－１１８；
－ １１－ベータ－ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１－ベータ－ＨＳＤ－１）の阻害剤（例えば、ＬＹ２５２３１９９、ＢＭＳ７７０７６７、ＲＧ－４９２９、ＢＭＳ８１６３３６、ＡＺＤ－８３２９、ＨＳＤ－０１６、ＢＩ－１３５５８５）；
－ グルコキナーゼの活性剤（例えば、ＰＦ－０４９９１５３２、ＴＴＰ－３９９（ＧＫ１－３９９）、ＧＫＭ－００１（ＡＤＶ－１００２４０１）、ＡＲＲＹ－４０３（ＡＭＧ－１５１）、ＴＡＫ－３２９、ＴＭＧ－１２３、ＺＹＧＫ１）；
－ ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の阻害剤（例えば、プラジガスタット（ＬＣＱ－９０８））、プロテインチロシンホスファターゼ１の阻害剤（例えば、トロズスクエミン）、グルコース－６－ホスファターゼの阻害剤、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼの阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼの阻害剤、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼの阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼの阻害剤；
－ グルコーストランスポーター－４のモジュレーター、ソマトスタチン受容体３アゴニスト（例えば、ＭＫ－４２５６）；
－ １種またはそれ以上の脂質低下剤も組合せパートナーとして好適であり、例えば：３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイム－Ａ－レダクターゼ（ＨＭＧ－ＣｏＡ－レダクターゼ）阻害剤、例えば、シンバスタチン（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｉｎｅｇｙ（登録商標）、Ｓｉｍｃｏｒ（登録商標））、アトルバスタチン（例えば、Ｓｏｒｔｉｓ（登録商標）、Ｃａｄｕｅｔ（登録商標））、ロスバスタチン（例えば、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、プラバスタチン（例えば、Ｌｉｐｏｓｔａｔ（登録商標）、Ｓｅｌｉｐｒａｎ（登録商標））、フルバスタチン（例えば、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、ピタバスタチン（例えば、Ｌｉｖａｚｏ（登録商標）、Ｌｉｖａｌｏ（登録商標））、ロバスタチン（例えば、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）、Ａｄｖｉｃｏｒ（登録商標））、メバスタチン（例えば、Ｃｏｍｐａｃｔｉｎ（登録商標））、リバスタチン、セリバスタチン（Ｌｉｐｏｂａｙ（登録商標））、フィブレート、例えば、ベザフィブレート（例えば、Ｃｅｄｕｒ（登録商標）ｒｅｔａｒｄ）、シプロフィブレート（例えば、Ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｎ（登録商標））、フェノフィブレート（例えば、Ａｎｔａｒａ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｎ（登録商標）、Ｌｉｐａｎｔｈｙｌ（登録商標））、ゲンフィブロジル（例えば、Ｌｏｐｉｄ（登録商標）、Ｇｅｖｉｌｏｎ（登録商標））、エトフィブレート、シンフィブレート、ロニフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブリド、ニコチン酸およびその誘導体（例えば、ナイアシン、例えば、ナイアシンの徐放性製剤など）、ニコチン酸受容体１アゴニスト（例えば、ＧＳＫ－２５６０７３）、ＰＰＡＲ－デルタアゴニスト、アセチル－ＣｏＡ－アセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤（例えば、アバシミベ）、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ、Ｅｚｅｔｒｏｌ（登録商標）、Ｚｅｔｉａ（登録商標）、Ｌｉｐｔｒｕｚｅｔ（登録商標）、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）、Ｓ－５５６９７１）、胆汁酸結合物質（例えば、コレスチラミン、コレセベラム）、回腸胆汁酸トランスポート（ＩＢＡＴ）阻害剤（例えば、ＧＳＫ－２３３０６７２、ＬＵＭ－００２）、ミクロソームトリグリセリド移転タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤（例えば、ロミタピド（ＡＥＧＲ－７３３）、ＳＬｘ－４０９０、グラノタピド）、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）のモジュレーター（例えば、アリロクマブ（ＲＥＧＮ７２７／ＳＡＲ２３６５５３）、ＡＭＧ－１４５、ＬＧＴ－２０９、ＰＦ－０４９５０６１５、ＭＰＳＫ３１６９Ａ、ＬＹ３０１５０１４、ＡＬＤ－３０６、ＡＬＮ－ＰＣＳ、ＢＭＳ－９６２４７６、ＳＰＣ５００１、ＩＳＩＳ－３９４８１４、１Ｂ２０、ＬＧＴ－２１０、１Ｄ０５、ＢＭＳ－ＰＣＳＫ９Ｒｘ－２、ＳＸ－ＰＣＫ９、ＲＧ７６５２）、ＬＤＬ受容体アップレギュレーター、例えば、肝臓選択性甲状腺ホルモン受容体ベータアゴニスト（例えば、エプロチローム（ＫＢ－２１１５）、ＭＢ０７８１１、ソベチロム（ＱＲＸ－４３１）、ＶＩＡ－３１９６、ＺＹＴ１）、ＨＤＬ－上昇化合物（ＨＤＬ－ｒａｉｓｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、例えば：コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤（例えば、アナセトラピブ（ＭＫ０８５９）、ダルセトラピブ、エバセトラピブ、ＪＴＴ－３０２、ＤＲＬ－１７８２２、ＴＡ－８９９５、Ｒ－１６５８、ＬＹ－２４８４５９５、ＤＳ－１４４２）、または二重ＣＥＴＰ／ＰＣＳＫ９阻害剤（例えばＫ－３１２）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ１）レギュレーター、脂質代謝モジュレーター（例えば、ＢＭＳ－８２３７７８、ＴＡＰ－３０１、ＤＲＬ－２１９９４、ＤＲＬ－２１９９５）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤（例えば、ダラプラディブ、Ｔｙｒｉｓａ（登録商標）、バレスプラジブ、リラプラジブ）、ＡｐｏＡ－Ｉエンハンサー（例えば、ＲＶＸ－２０８、ＣＥＲ－００１、ＭＤＣＯ－２１６、ＣＳＬ－１１２）、コレステロール合成阻害剤（例えば、ＥＴＣ－１００２）、脂質代謝モジュレーター（例えば、ＢＭＳ－８２３７７８、ＴＡＰ－３０１、ＤＲＬ－２１９９４、ＤＲＬ－２１９９５）、ならびにオメガ－３脂肪酸およびその誘導体（例えば、イコサペント酸エチル（ＡＭＲ１０１）、Ｅｐａｎｏｖａ（登録商標）、ＡＫＲ－０６３、ＮＫＰＬ－６６、ＰＲＣ－４０１６、ＣＡＴ－２００３）；
－ ブロモクリプチン（例えば、Ｃｙｃｌｏｓｅｔ（登録商標）、Ｐａｒｌｏｄｅｌ（登録商標））、フェンテルミンおよびフェンテルミン処方物または組合せ（例えば、Ａｄｉｐｅｘ－Ｐ、Ｉｏｎａｍｉｎ、Ｑｓｙｍｉａ（登録商標））、ベンズフェタミン（例えば、Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、ジエチルプロピオン（例えば、Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（例えば、Ａｄｉｐｏｓｔ（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ブプロピオンおよび組合せ（例えば、Ｚｙｂａｎ（登録商標）、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ ＸＬ（登録商標）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（登録商標）、Ｅｍｐａｔｉｃ（登録商標））、シブトラミン（例えば、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標）、Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標））、トピラマート（例えば、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標））、ゾニサミド（例えば、Ｚｏｎｅｇｒａｎ（登録商標））、テソフェンシン、オピオイドアンタゴニスト、例えば、ナルトレキソン（例えば、Ｎａｌｔｒｅｘｉｎ（登録商標）、ナルトレキソン＋ブプロピオン）、カンナビノイド受容体１（ＣＢ１）アンタゴニスト（例えば、ＴＭ－３８８３７）、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ－１）アンタゴニスト（例えば、ＢＭＳ－８３０２１６、ＡＬＢ－１２７１５８（ａ））、ＭＣ４受容体アゴニストおよび部分アゴニスト（例えば、ＡＺＤ－２８２０、ＲＭ－４９３）、ニューロペプチドＹ５（ＮＰＹ５）またはＮＰＹ２アンタゴニスト（例えば、ベルネペリト、Ｓ－２３４４６２）、ＮＰＹ４アゴニスト（例えば、ＰＰ－１４２０）、ベータ－３－アドレナリン受容体アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣物、５－ヒドロキシトリプタミン２ｃ（５ＨＴ２ｃ）受容体のアゴニスト（例えば、ロルカセリン、Ｂｅｌｖｉｑ（登録商標））、プラムリンチド／メトレレプチン、リパーゼ阻害剤、例えば、セチリスタット（例えば、Ｃａｍｅｔｏｒ（登録商標））、オルリスタット（例えば、Ｘｅｎｉｃａｌ（登録商標）、Ｃａｌｏｂａｌｉｎ（登録商標））、血管新生阻害剤（例えば、ＡＬＳ－Ｌ１０２３）、ベータヒスチジンおよびヒスタミンＨ３アンタゴニスト（例えば、ＨＰＰ－４０４）、ＡｇＲＰ（アグーチ関連タンパク質）阻害剤（例えば、ＴＴＰ－４３５）、セロトニン再取り込み阻害剤、例えば、フルオキセチン（例えば、Ｆｌｕｃｔｉｎｅ（登録商標））、ジュロキセチン（例えば、Ｃｙｍｂａｌｔａ（登録商標））、二重または三重モノアミン取り込み阻害剤（ドーパミン、ノルエピネフリン、およびセロトニン再取り込み）、例えば、セルトラリン（例えば、Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標））、テソフェンシン、メチオニンアミノペプチダーゼ－２（ＭｅｔＡＰ２）阻害剤（例えば、ベロラニブ）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）の産生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＩＳＩＳ－ＦＧＦＲ４Ｒｘ）またはプロヒビチン標的指向性ペプチド－１（例えば、Ａｄｉｐｏｔｉｄｅ（登録商標））；
－ 硝酸オキシド供与体、ＡＴ１アンタゴニストまたはアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ２）受容体アンタゴニスト、例えば、テルミサルタン（例えば、Ｋｉｎｚａｌ（登録商標）、Ｍｉｃａｒｄｉｓ（登録商標））、カンデサルタン（例えば、Ａｔａｃａｎｄ（登録商標）、Ｂｌｏｐｒｅｓｓ（登録商標））、バルサルタン（例えば、Ｄｉｏｖａｎ（登録商標）、Ｃｏ－Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））、ロサルタン（例えば、Ｃｏｓａａｒ（登録商標））、エプロサルタン（例えば、Ｔｅｖｅｔｅｎ（登録商標））、イルベサルタン（例えば、Ａｐｒｏｖｅｌ（登録商標）、ＣｏＡｐｒｏｖｅｌ（登録商標））、オルメサルタン（例えば、Ｖｏｔｕｍ（登録商標）、Ｏｌｍｅｔｅｃ（登録商標））、タソサルタン、アジルサルタン（例えば、Ｅｄａｒｂｉ（登録商標））、二重アンジオテンシン受容体遮断薬（二重ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＣＥ－２活性剤、レニン阻害剤、プロレニン阻害剤、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）阻害剤、エンドセリン受容体（ＥＴ１／ＥＴＡ）遮断薬、エンドセリンアンタゴニスト、利尿薬、アルドステロンアンタゴニスト、アルドステロンシンターゼ阻害剤、アルファ遮断薬、アルファ－２アドレナリン受容体のアンタゴニスト、ベータ遮断薬、混合アルファ／ベータ遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、カルシウムチャネル遮断薬ジルチアゼムの経鼻剤（例えば、ＣＰ－４０４）、二重ミネラルコルチコイド／ＣＣＢ、中枢作用性抗高血圧症薬、中性エンドペプチダーゼの阻害剤、アミノペプチダーゼＡ阻害剤、バソペプチド阻害剤、二重バソペプチド阻害剤、例えば、ネプリリシンＡＣＥ阻害剤またはネプリリシン－ＥＣＥ阻害剤、二重作用性ＡＴ受容体－ネプリリシン阻害剤、二重ＡＴ１／ＥＴＡアンタゴニスト、終末糖化産物（ＡＧＥ）分解剤、遺伝子組換えレナラーゼ、血圧ワクチン、例えば、抗ＲＡＡＳ（レニン－アンジオテンシン－アルドステロン－システム）ワクチン、ＡＴ１－またはＡＴ２－ワクチン、高血圧症ファーマコゲノミクスに基づく薬物、例えば、抗高血圧応答を有する遺伝的多型のモジュレーター、栓球凝集抑制因子、および他のものまたはこれらのうちの任意のものの組合せが好適である。

ある特定の例示的な実施形態において、「核酸分子」は、本発明により、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸分子は、本発明により、一本鎖または二本鎖の分子の形態で存在し得る。本発明による核酸分子は、直鎖状であるかまたは共有結合により閉じて環を形成し得る。

用語「ＤＮＡ」は、本明細書において使用される場合、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、ある特定の例示的な実施形態において、完全にまたは実質的にデオキシリボヌクレオチド残基で構成された分子を指す。「デオキシリボヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ベータ－Ｄ－リボフラノシル基の２’位においてヒドロキシル基を欠くヌクレオチドを指す。用語「ＤＮＡ」は、単離ＤＮＡ、例えば、部分的または完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および組換えにより生じたＤＮＡを含む。用語「ＤＮＡ」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、および／または改変によって、天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾ＤＮＡも含む。そのような改変は、ＤＮＡの末端または内部などへの、例えば、ＤＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドへの、非ヌクレオチド材料の追加を含み得る。ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドなども含むことができる。改変ＤＮＡ分子は、類似体または天然に存在するＤＮＡの類似体と呼ぶことができる。

用語「ＲＮＡ」は、本明細書において使用される場合、リボヌクレオチド残基を含み、場合により、完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基で構成された分子を指す。「リボヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ベータ－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。用語「ＲＮＡ」は、単離ＲＮＡ、例えば、部分的または完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組換えにより生じたＲＮＡを含む。用語「ＲＮＡ」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、および／または改変によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡも含む。そのような改変は、ＲＮＡの末端または内部などへの、例えば、ＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドでの、非ヌクレオチド材料の追加を含み得る。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドもしくは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなども含むことができる。改変ＲＮＡ分子は、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。本発明によれば、「ＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを指す。一実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロにおいて転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡの安定性（例えば、半減期）を増加させる１つまたはそれ以上の修飾によって、修飾することができる。そのような変更は、当業者に公知であり、そのようなものとして、例えば、５’－キャップまたは５’キャップ類似体が挙げられる。

用語「天然に存在する」は、ヌクレオチドと組み合わせて使用される場合、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）の塩基を指す。

本発明による核酸分子は、ベクターに含有させる／含ませることができる。用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター（例えば、ラムダファージ）、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクター）、または人工染色体ベクター（例えば、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ））を含む、当業者に公知の全てのベクターを含む。該ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般的に、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、哺乳動物その他）における、またはインビトロ発現系における、所望のコード配列と、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適切なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは、一般的に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を設計および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠き得る。

あるいは、本発明による核酸分子は、ゲノム、例えば、宿主細胞のゲノム、に統合させてもよい。特定の核酸分子をゲノムに統合するための手段および方法は、当業者に周知である。

用語「細胞」または「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、完全細胞、すなわち、その正常な細胞内成分、例えば、酵素、細胞小器官、または遺伝物質などを放出していない、完全膜を有する細胞を指す。ある特定の例示的な実施形態において、完全細胞は、生存細胞、すなわち、その正常な代謝機能を行うことができる生きた細胞である。ある特定の例示的な実施形態において、細胞または宿主細胞は、外因性の核酸をトランスフェクトまたは形質転換することができる任意の細胞である。ある特定の例示的な実施形態において外因性の核酸をトランスフェクトまたは形質導入させ、レシピエントに移した細胞は、レシピエントにおいてその核酸を発現することができる。

用語「細胞」は、原核細胞、例えば、細菌細胞など、および真核生物細胞、例えば、酵母細胞、真菌細胞、または哺乳動物細胞などを含む。好適な細菌細胞としては、グラム陰性細菌株、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株など、ならびにグラム陽性細菌株、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株などに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。）好適な真菌細胞としては、これらに限定されるわけではないが、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポーラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ）、およびアスペルギルス属 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に由来する細胞が挙げられる。好適な酵母細胞としては、これらに限定されるわけではないが、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））、およびハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種に由来する細胞が挙げられる。好適な哺乳動物細胞としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ－２９３などが挙げられる。一実施形態において、ＨＥＫ－２９３細胞が使用される。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質の発現のために当技術分野において使用される任意の他の細胞も、使用することができる。ある特定の例示的な実施形態において、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギまたは霊長類に由来する細胞）は、養子移入に使用される。

好適な細胞は、多くの組織型から誘導することができ、初代細胞および細胞株、例えば、免疫系の細胞など（例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞およびＴ細胞など、幹細胞、例えば、造血幹細胞および間充織幹細胞など）、ならびに他の任意の細胞型を含む。

「抗原提示細胞」は、本明細書において使用される場合、その表面上の主要組織適合遺伝子複合体との関連において抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、組織適合遺伝子複合体を認識することができる。

「細胞」または「宿主細胞」は、単離してもよく、または組織または有機体、特に「非人体」、の一部であってもよい。用語「非人体」は、本明細書において使用される場合、非ヒト霊長類または他の動物、例えば、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、もしくはげっ歯類、（例えば、マウス、ラット、モルモット、およびハムスター）を含むことを意味する。

本発明による医薬組成物は、１種もしくはそれ以上の担体および／または賦形剤を含み、それら全ては、薬学的に許容されるものである。用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用される場合、ある特定の例示的な実施形態において、医薬組成物の活性剤の作用と相互作用しない材料の非毒性を指す。

用語「担体」は、本明細書において使用される場合、適用を促進、増強、または可能にするために有効成分と組み合わされる、天然または合成の性質の有機または無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」は、対象への投与にとって好適な、１種またはそれ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、または封入物質も含む。

非経口投与のために好適な担体物質としては、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩水、静菌性生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

用語「賦形剤」は、本明細書において使用される場合、有効成分ではないが医薬組成物中に存在していてもよい全ての物質、例えば、塩、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、充填剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤物質、香味剤、または着色剤などを含むことが意図される。

薬学的に許容される塩を製造するために、薬学的に許容されない塩を使用してもよく、それらは本発明に含まれる。この種類の薬学的に許容される塩は、非限定的に以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから製造されるものを含む。薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などとして製造することもできる。塩は、医薬組成物のイオン強度または張度を調節するために加えることができる。

医薬組成物での使用のための好適な防腐剤としては、酸化防止剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、システイン、メチオニン、パラベン、チメロサール、フェノール、クレゾールおよびその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

医薬組成物での使用のための好適な緩衝物質としては、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、塩でのリン酸、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、ＴＨＡＭ、トロメタモール）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の例示的な実施形態において、本発明による医薬組成物は、無菌である。医薬組成物は、一様な剤形において提供され、当業者に公知の任意の様式において製造することができる。医薬組成物は、例えば、溶液剤または懸濁剤の形態であってもよい。

医薬組成物は、適切な希釈剤によって再構成される、安定な凍結乾燥された製品として製剤化することもでき、場合により、上記において定義されるような１種またはそれ以上の賦形剤を含む。

本発明による医薬組成物は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドに加えて、少なくとも１種の他の医薬品有効成分をさらに含んでもよい。

本明細書において使用される場合、用語「部品のキット（簡潔に：キット）」は、１つまたはそれ以上の容器と、場合によりデータ媒体とを含む製品を指す。前記１つまたはそれ以上の容器は、上記において言及した本発明の薬剤、例えば、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、融合タンパク質、医薬組成物、ならびに核酸分子および宿主細胞などの関連する薬剤の１つまたはそれ以上で満たされる。キットには、例えば、希釈剤、緩衝剤、およびさらなる試薬を収容する追加の容器を含ませてもよい。前記データ媒体は、非電子的データ媒体、例えば、グラフィックデータ媒体、例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード、または電子的データ媒体、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップ、もしくは別の半導体ベースの電子的データ媒体である。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中データベース、分散データベースなどへのアクセスの可能にする。前記データ媒体は、本発明の薬剤、例えば、本明細書において説明される、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、融合分子、医薬組成物、ならびに核酸分子および宿主細胞などの関連する薬剤の使用のための取扱説明書を含んでもよい。

本明細書において説明される薬剤および組成物は、任意の従来の経路、例えば、経口、経肺投与、吸入によって、または注射もしくは注入による非経口において投与することができる。一実施形態において、非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、または筋肉内において使用される。本明細書において説明される薬剤および組成物は、徐放性投与によって投与することもできる。

非経口投与にとって好適な医薬組成物は、通常、活性物質の滅菌水性または非水性調製物を含み、これらは、場合により、レシピエントの血液に対して等張である。適合性の担体／溶媒／希釈剤の例は、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩水、静菌性生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、ＰＢＳ、およびハンクス液である。さらに、通常、滅菌の不揮発性油も、溶液または懸濁液媒体として使用することができる。

本明細書において説明される薬剤および組成物は、通常、治療有効量において投与される。「治療有効量」は、場合により、許容できないまたは不必要な副作用を引き起こすことなくまたは最小限にのみ引き起こし、単独でまたはさらなる用量と一緒に、所望の治療反応または所望の治療効果を達成する量を指す。

ある特定の例示的な実施形態において、特定の疾患、特定の障害または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、疾患、障害または状態の経過の阻害に関係し得る。これは、疾患、障害または状態の進行を減速させること、および、特に疾患、障害または状態の進行を中断または逆転させることを含む。疾患、障害または状態の治療における所望の反応は、前記疾患、障害または状態の発生の遅延または発生の予防であってもよい。本明細書において説明される薬剤および組成物の有効量は、治療される状態、疾患、障害または状態の重篤度、対象の個々のパラメータ、例えば、年齢、生理的条件、サイズ、および体重など、治療の持続期間、付随する療法のタイプ（存在する場合）、投与の特定の経路、ならびに同様の因子に依存するであろう。したがって、本明細書において説明される薬剤の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存する。対象における反応が、初回用量において十分でない場合、より多い用量（または、別のより局所的経路の投与によって効果的に達成される、より多い用量）を使用することもできる。

本発明により、用語「疾患、障害または状態」は、任意の病理学的状態または不健康な状態、特に、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖、異常脂血症、ＮＡＳＨ、および／またはアテローム性動脈硬化症を指す。

用語「肥満」は、本明細書において使用される場合、健康に負の影響を有し得る程度にまで過剰な体脂肪が蓄積された医学的状態を指す。ヒト（成人）対象に関して、肥満は、３０ｋｇ／ｍ^２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）（ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ^２）として定義することができる。

用語「太り過ぎ」は、本明細書において使用される場合、体脂肪の量が、最適に健康である量を超えている医学的状態を指す。ヒト（成人）対象に関して、肥満は、２５ｋｇ／ｍ^２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）（例えば、２５ｋｇ／ｍ^２≦ＢＭＩ＜３０ｋｇ／ｍ^２）として定義することができる。

ＢＭＩは、成人において太り過ぎおよび肥満を分類するために一般的に使用される身長体重比の単純な指標である。それは、キログラムで表した人の体重をメートルで表したその人の身長の二乗で割ったものとして定義される（ｋｇ／ｍ^２）。

「メタボリック症候群」は、本明細書において使用される場合、以下の医学的状態のうちの少なくとも３つのクラスタリングを指す：腹部（中心性）肥満（例えば、コーカソイドの男性の場合には胴回り≧９４ｃｍおよびコーカソイドの女性の場合は≧８０ｃｍ、他の群に関しては民族的特有の値を有すると定義）、高い血圧（例えば、１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、高い空腹時血漿グルコース（例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ）、高い血清トリグリセリド（少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬＥ）、および低い高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル（例えば、男性の場合には４０ｍｇ／ｄＬ未満および女の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）。

「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」（単に「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」とも呼ばれる）は、本明細書において使用される場合、インスリン産生、インスリン作用、またはその両方における欠陥から結果として生じる血中グルコースの高濃度によって特徴付けられる代謝病の群を指す。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、緩徐発症成人自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに特定の遺伝的条件、薬物、栄養不良、感染症、および他の病気からの結果として生じる他のタイプの糖尿病からなる群から選択される。糖尿病の現在のＷＨＯ診断基準は以下の通りである：空腹時血漿グルコース≧７．０ｍｍｏｌ／ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）または２時間血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）。

「１型糖尿病」（「インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）」または「若年性糖尿病」としても知られる）は、本明細書において使用される場合、インスリンの完全な欠乏によって引き起こされる高い血中グルコース濃度によって特徴付けられる状態である。これは、体の免疫システムが、膵臓におけるインスリンを産生するベータ細胞を攻撃し、それらを破壊する場合に生じる。膵臓は、インスリンを少ししか、または全く産生しない。膵臓除去または膵疾患も、インスリンを産生するベータ細胞の欠乏を生じ得る。１型糖尿病は、糖尿病の症例の５％から１０％の間を占める。

「２型糖尿病」（「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」または「成人発症型糖尿病」としても知られる）は、本明細書において使用される場合、インスリンの可用性にかかわらない過剰なグルコース産生と、不十分なグルコースクリアランス（インスリン作用）の結果として過度に高いレベルのままにグルコースレベルが循環することによって特徴付けられる状態である。２型糖尿病は、糖尿病の全ての診断症例の約９０から９５％を占める。

「妊娠性糖尿病」は、本明細書において使用される場合、それ以前に糖尿病と診断されていない女性が、妊娠中（特に妊娠第三期）に高い血中グルコースレベルを示す状態である。妊娠性糖尿病は、調査された集団に応じて、妊娠の３～１０％に影響する。

「緩徐発症成人自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）」（「遅発性１型糖尿病」とも呼ばれる）は、本明細書において使用される場合、成人において生じる、多くの場合において発症の経過がより遅い、１型糖尿病の形態である。

「若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）」は、本明細書において使用される場合、インスリン産生を妨害する常染色体優性遺伝子における変異によって引き起こされる、糖尿病の遺伝子型を指す。

「糖尿病性網膜症」は、本明細書において使用される場合、糖尿病患者に生じる代謝の乱れによって誘発される眼疾患であり、視力の進行性喪失へ導く。

用語「高血糖」は、本明細書において使用される場合、血液中の過剰な糖（グルコース）を指す。

用語「異常脂血症」は、本明細書において使用される場合、リポタンパク質の過剰産生（高脂肪血症）または欠乏（低脂血症）を含む、リポタンパク質代謝の障害を指す。異常脂血症は、血中の総コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび／もしくはトリグリセリド濃度の上昇、ならびに／または高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の減少によって明らかにされる。

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、本明細書において使用される場合、肝細胞の炎症および変性を伴う、脂肪の蓄積（脂肪滴）によって特徴付けられる肝臓疾患を指す。一度発症すると、この疾患は、肝臓機能が変化して肝不全へと進行し得る状態である、肝硬変の高リスクを伴う。その後、ＮＡＳＨは、多くの場合、肝臓がんへと進行する。

「アテローム性動脈硬化症」は、本明細書において使用される場合、動脈内腔の狭窄を引き起こして線維症および石灰化へと進行し得る、大動脈および中動脈の血管内膜におけるプラークと呼ばれる不規則に分布する脂質沈着によって特徴付けられる血管疾患である。病巣は、通常、限局性であり、ゆっくりと断続的に進行する。時折、血流障害を生じ、その結果として、閉塞に対して末梢側の組織死を引き起こす、プラークの破裂を生じる。血流の制限は、ほとんどの臨床徴候の主要因であり、これは、閉塞の分布および重篤度によって変わる。

用語「医薬」は、本明細書において使用される場合、治療法において、すなわち、疾患および障害の治療において使用される、物質および／または組成物を指す。

用語「治療する」は、本明細書において使用される場合：対象における疾患、障害または状態を予防、改善または除去するため；対象における疾患、障害または状態を停止または鈍化させるため；対象における新たな疾患、障害または状態の発生を阻害または鈍化させるため；現在または以前に疾患、障害または状態を有している対象における症状の頻度もしくは重篤度および／または再発を減少させるため；および／または、対象の寿命を延長、すなわち増加させるための、化合物もしくは組成物または化合物もしくは組成物の組合せの、対象への投与を指す。

特に、句「疾患、障害または状態を治療すること」および「疾患、障害または状態の治療」は、疾患、障害もしくは状態またはその症状を治癒すること、その期間を短縮すること、それを改善すること、それを予防すること、その進行または悪化を鈍化または阻害すること、またはその発症を予防または遅延させることを含む。

用語「対象」は、本発明によると、治療のための対象、特に罹患した対象（「患者」とも呼ばれる）、例えば、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、または他の動物、例えば哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、もしくはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモットもしくはハムスター）などを指す。一実施形態において、対象／患者は、ヒトである。

そこで、説明をするが、本発明の範囲を限定することは意図していない以下の実施例を参照することによって本発明をさらに説明する。

システム薬理学モデリングによる最適なＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１活性比の決定
ヒトにおけるＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質の薬理学的効果への改善された機械論的洞察を使用して、最適なＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１効力比を特定した。機械論的システム薬理学モデルを開発し、ＧＬＰ－１およびＦＧＦ２１のヒトにおけるグルコース、脂質およびエネルギー代謝に対する効果を説明した（Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓら（２００９）Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｖ ５（４）：２１６－２２０；Ｄｅａｃｏｎら（２０１１）Ｒｅｖ Ｄｉａｂｅｔ Ｓｔｕｄ ８（３）：２９３－３０６；Ｋｉｍら（２００８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ６０（４）：４７０－５１２；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら（２０１４）Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ ３（３）：２２１－２２９）。

このモデルは、ＧＬＰ－１およびＦＧＦ２１の効果について関連する経路を表した。血糖コントロール（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、空腹時血漿グルコース、食後血糖値）、脂質パラメータ（すなわち、血漿トリグリセリド、脂肪酸、コレステロール）およびエネルギーバランス（すなわち、体重、食物摂取、エネルギー消費）を獲得して、模擬薬物治療（例えば、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質、リラグルチド、ＦＧＦ２１類似体ＬＹ２４０５３１９）に対する治療奏功を評価した。ＬＹ２４０５３１９については、Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ８（３）：ｅ５８５７５を参照されたい。

このモデルは、ホルモンインスリン、グルカゴンおよびある特定のインクレチン（例えば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ）によって制御されるグルコースホメオスタシスの重要な態様を網羅した。血糖コントロールに関する主要モデルのエンドポイントは、ＨｂＡ１ｃであった。ＨｂＡ１ｃは、先の数か月にわたる平均血漿グルコース濃度を推定するために使用された共通の臨床エンドポイントである。ＨｂＡ１ｃは、Ｎａｔｈａｎら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ３１（８）：１４７３－１４７８によって報告されたように、平均血漿グルコースとＨｂＡ１ｃとの間位の線形的相関を使用してモデルにおいて推定した。

このモデルは、コレステロールの提示を含む基本的脂質代謝を扱うのに適したレベルで、トリグリセリドおよび脂肪酸代謝を組み入れた。ＨＤＬおよび非ＨＤＬ、すなわち、ＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールは、循環しているリポタンパク質である。脂質代謝の提示は、ＦＧＦ２１化合物の、脂質およびスタチンとの相互作用に与える影響をシミュレートすることを可能にした。ＦＧＦ２１化合物は、脂質濃度に著しい効果を有した（Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ１８（３）：３３３－３４０；Ｆｉｓｈｅｒら（２０１１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１５２（８）：２９９６－３００４）。

このモデルにおける体重減少または体重増加は、体脂肪量の変化として測定した。脂肪量と体重との間に直接的な関係性があった（Ｂｒｏｙｌｅｓら（２０１１）Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ １０５（８）：１２７２－１２７６）。食物摂取は、基礎および安静時代謝率に基づいた（Ａｍｉｒｋａｌａｌｉら（２００８）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ６２（７）：２８３－２９０）。エネルギー消費がカロリー摂取と等しい場合、体脂肪量は、一定を維持した。食物摂取に対する治療効果は、Ｇｏｂｅｌら（２０１４）（Ｏｂｅｓｉｔｙ（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ）２２（１０）：２１０５－２１０８）の式を使用して、モデルに実行した。

食物は、炭水化物（グルコース等価物）、脂肪（脂肪酸等価物）およびタンパク質（アミノ酸等価物）であると考えた。全ての栄養が胃に入り、遅延ノードを通過し、その後、３区画の消化管に入った。消化管の設計は、食物消化および吸収についてのＢａｓｔｉａｎｅｌｌｉら（１９９６）（Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ７４（８）：１８７３－１８８７）およびＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（１９９７）（Ｍｅｄ Ｉｎｆｏｒｍ（Ｌｏｎｄ）２２（１）：３５－４５）によってなされた仕事に基づいた。

栄養、ホルモン、薬物および疾患状態は、胃排出の遅延を生じさせる可能性がある。健康状態下で、胃排出率は、食事の量、そのエネルギー密度および胃における栄養量に依存する（Ａｃｈｏｕｒら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ５５（９）：７６９－７７２；Ｆｏｕｉｌｌｅｔら（２００９）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ２９７（６）：Ｒ１６９１－１７０５）。糖尿病を有する個体は、経口ブドウ糖負荷試験または食事試験で観察されるグルコース吸収の遅延を有することが多い（Ｂｈａｒｕｃｈａら（２００９）Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ）７０（３）：４１５－４２０；Ｃｈａｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ３５（１２）：２５９４－２５９６）。この遅延は胃排出の減速に起因する。胃と小腸との間の移動における遅延をこの実施例のモデルに加えて、糖尿病対象における胃排出の遅延を説明した。薬物およびホルモン（例えば、ＧＬＰ－１）は、胃の迷走神経緊張に影響し得、これは機械的混合および／または蠕動を減少し、胃排出も遅延させる（Ｊｅｌｓｉｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ １４（６）：５３１－５３８；Ｌｉｔｔｌｅら（２００６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ９１（５）：１９１６－１９２３；Ｎａｕｃｋら（２０１１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ６０（５）：１５６１－１５６５；ｖａｎ Ｃａｎら（２０１３）Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（６）：７８４－９３）。

この調査の１つの目的は、ＧＬＰ－１関連有害作用、すなわち、吐き気および嘔吐（Ｌｅａｎら（２０１４）Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（５）：６８９－６９７）を予防することであった。胃排出測定値は、胃排出率の低さに相関する吐き気および嘔吐といった有害事象の推定を提供した。したがって、モデルにおける胃有害事象についてのマーカーは、胃排出率の和であった。

健常者および疾患の異なるステージの２型糖尿病患者を表す異なる仮想患者がモデルプラットフォームに実装された。さらに、仮想患者は、異なる程度の肥満および異常脂血症を網羅した。仮想患者は、疾患重症度の可変性ならびにクリニックにおいて観察された病態生理学的および表現型の可変性を表した。

いくつかの治療薬、すなわち、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質、リラグルチド、ＦＧＦ２１類似体ＬＹ２４０５３１９、メトホルミン、アトルバスタチン、シタグリプチン、およびヒトインスリンがモデルにおいて実施された。これらの治療薬は、シミュレーションにおいてオンオフ切り換えすることができた。仮想患者は、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質を投与される場合、メトホルミンおよびアトルバスタチンのバックグラウンドにあると想定された。

仮想ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質がこの実施例で説明されるモデルにおいて実施された。融合タンパク質は、ＦＧＦ２１アゴニスト活性とＧＬＰ－１アゴニスト活性の両方を含み、ＦＧＦ２１受容体アゴニストとＧＬＰ－１受容体アゴニストの両方と同じ効果を有した。仮想融合タンパク質の薬物動態特性は、デュラグルチドと同様であると想定した（Ｇｅｉｓｅｒら（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ５５（５）：６２５－３４）。

多くのデータセットと比較することによってモデルを検証した。シミュレーション結果は、関連データおよび知識、例えば、Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎら（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（５）：１３０５－１３１９；Ｍｕｓｃｅｌｌｉら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５７（５）：１３４０－１３４８と定量的に一致した。モデルは、関連の定量的試験データ、例えば、Ａｓｃｈｎｅｒら（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ２９（１２）：２６３２－２６３７；Ｄａｌｌａ Ｍａｎ、Ｃａｕｍｏら（２００５）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ２８９（５）：Ｅ９０９－９１４；Ｄａｌｌａ Ｍａｎら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５４（１１）：３２６５－３２７３；Ｆｉａｌｌｏ－Ｓｃｈａｒｅｒ（２００５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９０（６）：３３８７－３３９１；Ｈａｈｎら（２０１１）Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ Ｍｏｄｅｌ８：１２；Ｈｅｒｍａｎら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ７８（６）：６７５－６８８；Ｈｅｒｍａｎら（２００６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ４６（８）：８７６－８８６およびＪ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ９１（１１）：４６１２－４６１９；Ｈｏｊｌｕｎｄら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８０（１）：Ｅ５０－５８；Ｍｏｎａｕｎｉら（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９（６）：９２６－９３５；Ｎａｕｃｋら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ３２（１）：８４－９０；Ｎａｕｃｋら（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ９１（１）：３０１－３０７；Ｎａｕｃｋら（２００４）Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ１２２（３）：２０９－２１７；Ｔｚａｍａｌｏｕｋａｓら（１９８９）Ｗｅｓｔ Ｊ Ｍｅｄ１５０（４）：４１５－４１９；Ｓｉｋａｒｉｓ（２００９）Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ３（３）：４２９－４３８；ＶｉｃｉｎｉおよびＣｏｂｅｌｌｉ（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ２８０（１）：Ｅ１７９－１８６；Ｖｏｌｌｍｅｒら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５７（３）：６７８－６８７に適合した。

ＦＧＦ２１類似体およびＧＬＰ－１受容体アゴニストを含む既存の治療薬が直接的比較についてモデルにおいて実施された。ＦＧＦ２１類似体の効果は臨床データ、例えば、Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １８（３）： ３３３－３４０で検証された。ＧＬＰ－１受容体アゴニストリラグルチドは、標的について直接的な競合相手であり、その実行を様々な臨床データ、例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎら（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ６８（６）：８９８－９０５；Ｅｌｂｒｏｎｄら（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ２５（８）：１３９８－１４０４；Ｃｈａｎｇら（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５２（７）：１７８６－１７９１；Ｋｏｌｔｅｒｍａｎら（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ８８（７）：３０８２－３０８９；Ｄｅｇｎら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３（５）：１１８７－１１９４；Ｋｏｌｔｅｒｍａｎら（２００５）Ａｍ Ｊ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ Ｐｈａｒｍ６２（２）：１７３－１８１；Ｖｉｌｓｂｏｌｌら（２００８）Ｄｉａｂｅｔ Ｍｅｄ２５（２）：１５２－１５６；Ｂｕｓｅら（２００９）Ｌａｎｃｅｔ３７４（９６８３）：３９－４７；Ｊｅｌｓｉｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ１４（６）：５３１－５３８；Ｈｅｒｍａｎｓｅｎら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ１５（１１）：１０４０－１０４８；Ｓｕｚｕｋｉら（２０１３）Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ５２（１０）：１０２９－１０３４；ｖａｎ Ｃａｎら（２０１３）Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（６）：７８４－９３；Ｚｉｎｍａｎら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ３２（７）：１２２４－１２３０；Ｒｕｓｓｅｌｌ－Ｊｏｎｅｓら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ５２（１０）：２０４６－２０５５；Ｐｒａｔｌｅｙら（２０１１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ６５（４）：３９７－４０７；Ｎａｕｃｋら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ１５（３）：２０４－２１２；Ｆｌｉｎｔら（２０１１）Ａｄｖ Ｔｈｅｒ２８（３）：２１３－２２６；Ｋａｐｉｔｚａら（２０１１）Ａｄｖ Ｔｈｅｒ２８（８）：６５０－６６０；およびＡｓｔｒｕｐら（２０１２）Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３６（６）：８４３－８５４において説明されるようなデータと比較した。

モデルプラットフォームは、活性比を変化させて、仮想ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質の利益的および有害作用のシミュレーションを可能にした。有効ＦＧＦ２１媒介性ＥＣ５０値は、Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ１８（３）：３３３－３４０に由来する値と一定に設定した。有効ＧＬＰ－１媒介性ＥＣ５０値は、内在ＧＬＰ－１（表１）に関して、１つ増加の２～６００の因子によって減少した。

仮想融合タンパク質のそれぞれについて、関連の薬力学的エンドポイント、すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬコレステロールおよび脂肪量について、暴露－奏功の関係をシミュレートした。ＧＬＰ－１媒介性有害事象についてのマーカーとして、胃排出率を使用した。平均的な肥満異常脂血症の２型糖尿病の仮想患者に対するＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質による５２週間の治療を幅の広い用量範囲でシミュレートした。５２週間の治療後、全ての関連の薬力学的エンドポイントが定常状態に到達することを予想した。各エンドポイントについて、最大半量効果濃度（ＥＣ５０値）を暴露－奏効曲線から決定した。ＥＣ５０値は、特に主にＧＬＰ－１媒介性エンドポイントであるＨｂＡ１ｃおよび胃排出率について、活性比で変化した。図１は、ＧＬＰ－１減衰率に依存するＥＣ５０値を記載する。ＧＬＰ－１減衰率の増加は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の減少を示した。

この手順は、関連の活性比の特定を可能にし、この比について、薬力学的作用を媒介する血漿レベルに比べて、より高い血漿レベルで有害作用が観察された。９より高いＧＬＰ－１減衰率について、ＧＬＰ－１媒介性消化管有害作用のＥＣ５０のほうが薬力学的作用のＥＣ５０より高かった。したがって、胃の有害作用は、薬力学的作用を達成するのに必要とされるレベルよりも高い血漿レベルで発生した。ＧＬＰ－１媒介性消化管有害作用を回避しながら、全ての望ましい薬力学的作用を提供する用量を解明することは可能であった。

胃排出率についての最大ＥＣ５０値は、減衰率５３１で到達した。有害作用と平均薬力学的作用との間の最大距離は、減衰率４８２で到達した（図２）。したがって、１：４８２以上の活性比は、関係しなかった。薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、３１９であった。ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、１２１であった。

１：１０～１：４８２の間の効力比を有するＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質は、脂質特性、体重およびグルコース代謝を改善するのに最も有益であると予測され、胃排出反応に基づく著しい有害事象を発生する見込みはなかった。より低い効力比は、それらの予想される胃排出の強力な抑制および有害事象の潜在性に基づいて、良好な候補ではない可能性があった。より高い効力比は、充分に効果的ではなく、したがって競合的ではない可能性があると考えられた。

ＨｂＡ１ｃレベルの主としてＧＬＰ－１媒介性のパラメータが、当該技術分野において公知のＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびＦＧＦ２１剤による１２週間の治療後に定常状態に臨床的に到達するため、平均的な肥満異常脂血症の２型糖尿病の仮想患者に対するＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質による１２週間の治療を幅の広い用量範囲でシミュレートした。

図３は、１２週間のシミュレーション期間にわたるＧＬＰ－１減衰率に対して得られたＥＣ５０値を記載する。１８より高いＧＬＰ－１減衰率について、ＧＬＰ－１媒介性消化管有害作用のＥＣ５０のほうが薬力学的作用のＥＣ５０より高かった。胃排出率についての最大ＥＣ５０値は、減衰率５０１で到達した。有害作用と平均の薬力学的作用との間の最大距離は、減衰率４６９で到達した（図４）。薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、３１３であった。ＦＧＦ２１－（脂質）およびＧＬＰ－１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、１２３であった。

異なる活性比を有するＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質についての有害事象の効能および潜在能を記載のシステム薬理学アプローチによって調査した。おそらく計算された理想的な効力比を有する融合タンパク質が、同定され、胃排出反応に基づく著しく有害なＧＬＰ－１ＲＡ関連作用を発生しない可能性のある状態で、脂質特性、体重および血糖コントロールを改善するのに有益であると予測された。選択したモデルが知らせる効力比を有する化合物がリスク特性に対する良好な効能を提供することを予測した。

ＨＥＫ２９３、ＣＨＯおよび大腸菌細胞におけるホモダイマーＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質の発現、および単離されたＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドの化学合成
ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションによって産生した。融合タンパク質のＤＮＡ配列を、Ｎ末端においてＩＬ２シグナル配列（配列番号２４６）に融合させ、続いて、ヒスチジンリッチな配列（Ｈｉｓタグ）およびＴＥＶプロテアーゼ切断部位（配列番号２４７または２４８）に融合させた。シグナル配列は、培養培地への所望のタンパク質の分泌に必要であった。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）（ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、培養上清からタンパク質を精製した。ＩＭＡＣカラムからの溶出後、場合により、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼの添加によってＮ末端Ｈｉｓタグを切断した。Ｈｉｓタグ切断後、切断反応溶液をＩＭＡＣカラム（ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）の２回目の通過をさせ、フロースルー画分（Ｈｉｓタグを有さない）を収集した。このタンパク質をさらに、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および泳動用緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を用いたゲルろ過カラムを使用して精製した。所望のタンパク質を含有する画分を収集し、プールし、濃縮して、さらなる使用まで－８０℃で貯蔵した。

配列番号２５２のＦＧＦ２１タンパク質（追加のＮ末端Ｇｌｙを有する成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１；本明細書においてＧ－ＦＧＦ２１と呼ばれる）を、大腸菌において発現した。ＦＧＦ２１タンパク質のＤＮＡ配列をＮ末端においてヒスチジンリッチな配列（Ｈｉｓタグ）およびＴＥＶまたはＳＵＭＯプロテアーゼ切断部位（配列番号２４８または２４９）に融合させた。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して所望のタンパク質を精製し、続いてＴＥＶまたはＳＵＭＯプロテアーゼの添加によってＮ末端Ｈｉｓタグを切断した。Ｈｉｓタグ切断後、切断反応溶液を、イオン交換カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いて泳動用緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を用いたゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。所望のタンパク質を含有する画分を収集し、プールし、濃縮して、さらなる使用まで－８０℃で貯蔵した。

代替の手法において、大腸菌封入体の発現、および続いて、Ｔｒｉｓ緩衝塩化グアニジウム溶液中において封入体をアンフォールディングし、カオトロピック塩を伴わない緩衝液中での希釈によりリフォールディングすることによってフォールディングされた融合タンパク質が得られるリフォールディング工程によって融合タンパク質を産生した。タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して融合タンパク質を精製し、続いてＴＥＶプロテアーゼの添加によってＮ末端プレ配列を切断した。切断反応溶液を、陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。所望のタンパク質を含有する画分を収集し、プールした。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を使用する超音波／ダイアフィルトレーション工程によって、最終的な緩衝液条件およびタンパク質濃度を確立した。試料をさらなる使用まで－８０℃で貯蔵した。

融合タンパク質は組換え法（上記を参照されたい）によって産生したが、単離されたペプチドＧＬＰ－１Ｒアゴニストは化学合成した。

より詳細には、ペプチドは以下の手動の合成手順を使用して合成した：

乾燥ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂０．３ｇ（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器内に置いた。樹脂はＤＣＭ（１５ｍｌ）にて１時間、ＤＭＦ（１５ｍｌ）にて１時間膨張させた。樹脂のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６回）。固形支持体からのＦｍｏｃ除去の確認に、Ｋａｉｓｅｒ試験（定量的方法）を使用した。乾燥ＤＭＦ中のＣ末端Ｆｍｏｃアミノ酸（樹脂負荷に対応する５等量の余剰）を脱保護された樹脂に添加し、次のＦｍｏｃアミノ酸のカップリングをＤＭＦ中のＤＩＣおよびＨＯＢＴの５等量の余剰で開始させた。反応混合物における各反応物の濃度は約０．４Ｍであった。混合物は、室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（各６：６：６回）で洗浄した。カップリング完了時のペプチド樹脂アリコートについて実施したＫａｉｓｅｒ試験は陰性であった（樹脂に色がなかった）。第１のアミノ酸の付着後、無反応のアミノ基は、存在する場合、樹脂の中で、無水酢酸／ピリジン／ＤＣＭ（１：８：８）を使用して、２０分間キャップして、配列の任意の欠失を回避した。キャッピング後、ＤＣＭ／ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで樹脂を洗浄した（各６／６／６／６回）。Ｃ末端のアミノ酸付着ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦ（各６：６：６回）で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートについて実施したＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。

ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上の標的配列における残りのアミノ酸は、ＤＭＦ中の樹脂負荷に対応する５等量の余剰を使用して、Ｆｍｏｃ ＡＡ／ＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法を使用して、順次結合させた。反応混合物における各反応物の濃度は約０．４Ｍであった。混合物は、室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６回）。各カップリングステップおよびＦｍｏｃ脱保護ステップの後、Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、反応の完全性を確認した。

線形配列の完成後、リジンのε－アミノ基は分枝点または修飾点として使用され、ＤＭＦ中の２．５％のヒドラジン水和物を使用することによって、１５分間を２回、脱保護し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６回）。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法（樹脂負荷に対して、５等量の余剰を使用して）によるＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕを使用して、グルタミン酸のγ－カルボキシル端をＬｙｓのε－アミノ基に付着させた。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６×３０ｍＬ）。グルタミン酸のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間（各２５ｍＬ）、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６回）。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。

側鎖分枝が１つ以上のγ－グルタミン酸も含んだ場合、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法（樹脂負荷に対して、５等量の余剰で）を使用してγ－グルタミン酸の遊離アミノ基に付着させるために、第２のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕを使用した。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６×３０ｍＬ）。γ－グルタミン酸のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間（２５ｍｌ）、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６回）。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。

樹脂からのペプチドの最終切断：
手動の合成によって合成したペプチジル樹脂をＤＣＭ（６×１０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（６×１０ｍＬ）およびエーテル（６×１０ｍＬ）で洗浄し、減圧デシケーターで一晩乾燥させた。固体支持体からのペプチドの切断は、ペプチド－樹脂を試薬カクテル（８０％のＴＦＡ／５％のチオアニソール／５％のフェノール／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＤＭＳ／５％のＤＣＭ）で、室温で３時間処理することによって達成した。切断混合物はろ過によって回収し、樹脂はＴＦＡ（２ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５ｍＬ）で洗浄した。余剰ＴＦＡおよびＤＣＭを窒素下で少量に濃縮し、少量のＤＣＭ（５～１０ｍＬ）を残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。この工程を３～４回繰り返して、揮発性不純物の多くを除去した。残留物を０℃に冷却し、無水エーテルを添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離にかけ、上清エーテルを除去し、新鮮なエーテルをペプチドに添加し、再び遠心分離にかけた。粗試料は分取ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。ペプチドの同一性をＬＣＭＳによって確認した。

ＣＨＯ細胞におけるヒトＦＧＦ２１受容体の有効性についてのインビトロ細胞アッセイ（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ）
Ｇ－ＦＧＦ２１（配列番号２５２）および本発明の融合タンパク質の細胞インビトロ有効性を、特異的な高感度のＩｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して測定した。ＩＣＷアッセイは、通常、マイクロプレート形式を使用して実施される、免疫細胞化学的アッセイである。ＦＧＦ２１受容体自己リン酸化ＩＣＷアッセイ（Ａｇｕｉｌａｒら（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（４）：ｅ９９６５）のために、ヒトベータ－Ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）と共にヒトＦＧＦＲ１ｃを安定して発現するＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用した。ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２の受容体自己リン酸化レベルまたは下流活性を決定するために、２×１０^４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに播種し、４８時間増殖させた。細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ダルムシュタット、ドイツ）を伴う無血清培地ハムＦ－１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘによって３～４時間、血清飢餓させた。続いて、細胞を、増加する濃度の、Ｇ－ＦＧＦ２１（配列番号２５２）または示される融合タンパク質のいずれかによって、３７℃で５時間処理した。インキュベーション後、培地を捨て、細胞を、３．７％の新たに調製したパラ－ホルムアルデヒドにおいて２０分間固定させた。細胞に、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を２０分間浸透させた。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）により、室温で２時間、ブロッキングを実施した。一次抗体として、抗ｐＦＧＦＲ Ｔｙｒ６５３／６５４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、ドイツ）または抗ｐＥＲＫホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を加えて、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。その後、細胞を、二次抗マウス８００ＣＷ抗体（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）と室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で再び洗浄した。Ｏｄｙｓｓｅｙ画像表示装置（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）により、赤外色素シグナルを定量した。結果を、ＴＯ－ＰＲＯ３染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）によるＤＮＡの定量化によって正規化した。任意単位（ＡＵ）としてデータを得て、用量－応答曲線からＥＣ５０値を得た（表２および３にまとめる）。図５は、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＋ＫＬＢを過剰発現するＣＨＯ細胞によるＩＣＷの結果を示している。

ヒトグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体有効性についてのインビトロ細胞アッセイ
ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体についての化合物のアゴニズムを、ヒトＧＬＰ－１受容体を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞株においてｃＡＭＰ反応を測定する機能的アッセイによって決定した。

組換えＨＥＫ２９３細胞を、３７℃に置いたＴ１７５培養フラスコにおいて培地（１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中にてコンフルエンス近くまで増殖させ、２ｍＬのバイアルの１０％のＤＭＳＯを含有する細胞培養培地中に１～５×１０^７細胞／ｍＬの濃度で収集した。各バイアルは、細胞懸濁液１．８ｍＬを含有した。バイアルをイソプロパノールチャンバー内で－８０℃までゆっくりと凍結させ、その後、長期貯蔵のために液体窒素へ移した。

凍結細胞を、それらの使用前に、３７℃において迅速に融解し、細胞バッファ２０ｍＬ（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＢＳＡ）により洗浄し、９００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。細胞をアッセイバッファ（細胞バッファ＋２ｍＭのＩＢＭＸ）中に再懸濁し、１×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度に調節した。測定のために、細胞懸濁液５μＬ（最終５×１０^３細胞／ウェル）および試験化合物５μＬを、３８４ウェルプレートのウェルへ添加し、続いて、室温において３０分間インキュベートした。Ｂａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス、Ｈ－６７９５）のヒトＧＬＰ－１（７～３６）アミド（配列番号２６０）を対照として使用した。Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）に基づくＣｉｓｂｉｏ Ｃｏｒｐ．（カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）のキットを使用して、細胞のｃＡＭＰ含有量を決定した。溶解バッファ（キットの成分）中に希釈したＨＴＲＦ試薬の添加後、プレートを１時間インキュベートし、続いて、６６５／６２０ｎｍの蛍光比を測定した。最大反応の５０％活性化をもたらした濃度（ＥＣ５０）を決定することによって、アゴニストのインビトロ効力を定量した。

結果を表４にまとめ、用量－応答曲線を図６に示す。

ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質のコンフォメーション安定性および熱安定性の解析
ＵＮｉｔ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、ＣＡ、米国）を使用して、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質についてコンフォメーション安定性および凝集する性質を同時に決定した。ＵＮｉｔは、タンパク質またはポリペプチドのアンフォールディングを検出するタンパク質またはポリペプチドの自家蛍光解析と、Ｓｔａｔｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＳＬＳ）測定とを組み合わせて凝集挙動を調査する。

ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に処方した５ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質についてデータを取得した。９μＬの体積の各試料をＵＮｉｔキャピラリーホルダーにロードし、ＵＮｉｔにおいて三組ずつ解析した。温度を０．３℃／分の一定線形速度で２０℃から９５℃まで増大させた。２６６ｎｍのレーザーにより検出される自家蛍光およびＳＬＳシグナルを示すＢａｒｙＣｅｎｔｒｉｃ Ｍｅａｎ（ＢＣＭ）を、適用した温度に対してプロットして、融点（Ｔｍ）および凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を得た。ＵＮｉｔ解析ソフトウェアｖ．２．１を使用してデータを解析し、表５にまとめる。

加えて、一部のタンパク質について、熱シフトアッセイを適用して、示差走査蛍光定量（ＤＳＦまたはＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ（商標））アッセイ（Ａｈｍａｄ Ｓ．ら（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１：４３３－４４６；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ ６：４２９－４４０；Ｎｉｅｓｅｎら（２００７）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． ２：２２１２－２１）を模倣して熱安定性を解析した。このアッセイは、Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ６６５１）のような疎水性蛍光色素は、それらがタンパク質上の疎水性の区画へ結合した場合、それらの蛍光が増加するという観察に基づく。そのような疎水性の区画は、タンパク質が加熱に際してアンフォールディングした場合にタンパク質において曝露されるので、蛍光における増大は、アンフォールディングの程度についての、およびそれゆえ、タンパク質の熱安定性についての測定値として使用することができる。

ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中の各タンパク質の溶液を、Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅの１６０倍溶液（販売者によって提供される５０００倍ＤＭＳＯストックから水中に希釈する）と混合することによって、タンパク質を試験した。試料体積をＰＢＳにより２０μＬに調節した。典型的な条件は、最終混合物中に０．８ｍｇ／ｍＬのタンパク質および８倍のＳｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅを含有したが、タンパク質濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬ～１．２ｍｇ／ｍＬの間で変動させた。試料を、９６ウェルＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ Ｓｅｍｉ－Ｓｋｉｒｔ ９６ 白色）中に分配し、気泡を除去するために短時間遠心分離した。プレートを、ＢｉｏＲａｄ ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ器具に挿入し、１℃／分の傾斜スピードにおいて１０～９０℃の熱勾配にかけた。蛍光の励起および定量のために、４８５ｎｍおよび５７５ｎｍの波長のフィルターを選択した。ＢｉｏＲａｄ ｉＱ５ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎソフトウェア（ｖ．２．０．１４８．６０６２３）を使用してデータを加工した。温度に対する蛍光強度の曲線において、変曲点を、融点（Ｔｍ）についての測定値として選択した。

マウスおよび非ヒト霊長類における薬物動態
雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスまたは雄カニクイザルへの、溶液中の０．３ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与後、３つの異なる方法を使用して、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質の血漿濃度および薬物動態パラメータを決定した。投薬後３０分～１６８時間の時点において、血液試料を得た。

ａ．）ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質の完全ＦＧＦ２１部分の定量のための生物分析スクリーニング法
血漿試料をＥＬＩＳＡキット（Ｆ１２３１－Ｋ０１、Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）により、融合タンパク質の完全ＦＧＦ２１部分について分析した。アッセイは、ヒト完全ＦＧＦ２１の異なるエピトープに結合する２つの選択された抗体による２部位サンドイッチ技法を利用した。抗体のうちの１つは、ヒトＦＧＦ２１のＮ末端アミノ酸（ａａ）２９～３５に特異的に結合し、他の抗体は、ヒトＦＧＦ２１のＣ末端（ａａ２０３～２０９）に特異的に結合した。抗ヒトＦＧＦ２１（ａａ２９～３５）特異的抗体により被覆したマイクロプレートのウェルに、アッセイ標準、対照および未知の試料を直接的に添加した。同時に、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ヒトＦＧＦ２１（ａａ２０３～２０９）特異的抗体を、各ウェルに添加した。第１のインキュベーション期間後、マイクロタイターウェルの壁上の抗体は、試料中のヒトＦＧＦ２１を捕獲し、各マイクロタイターウェル中の非結合タンパク質は洗い流された。「抗ＦＧＦ２１抗体－ヒト完全ＦＧＦ２１－ＨＲＰコンジュゲートトレーサー抗体」の「サンドイッチ」が形成された。非結合トレーサー抗体を、次の洗浄工程において除去した。この免疫複合体の検出のために、その後、ウェルを、定時反応において基質溶液とインキュベートし、その後、分光光度法マイクロプレートリーダーにおいて測定した。マイクロタイターウェルの壁上のヒト完全ＦＧＦ２１に結合した免疫複合体の酵素活性は、試料中の完全ＦＧＦ２１の量に直接的に比例した。

ｂ．）完全全長融合タンパク質の定量のための生物分析スクリーニング法
血漿中の全長ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ法を利用して決定した。融合タンパク質のＮ末端を、マウスモノクローナル抗ＧＬＰ１抗体（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＳＤ）によって捕獲した。プレートをＢｌｏｃｋｅｒ Ａ（ＭＳＤ）１５０μＬにより室温（ＲＴ）において穏やかに振盪しながら１時間ブロッキングし、洗浄バッファ３００μＬにより３回洗浄した後、希釈した血漿試料（標準試料およびＰＫ研究用試料）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートをＲＴにおいて穏やかに振盪しながら１時間インキュベートした。洗浄バッファ３００μＬにより３回洗浄した後、プライマー検出抗体（Ｃ末端ウサギ抗ＦＧＦ２１抗体、Ｐｉｎｅｄａ Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒ－Ｓｅｒｖｉｃｅ、ベルリン、ドイツ）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートをＲＴにおいて１時間インキュベートした。洗浄バッファ３００μＬにより３回洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）中に希釈したヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇ標識化、ＭＳＤ）２５μＬを各ウェルに添加し、プレートをＲＴにおいて１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬにより３回洗浄した後、リードバッファ１５０μＬをウェルに添加した。

ｃ．）ＧＬＰ－１ ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質の完全ＧＬＰ－１部分の定量のための生物分析スクリーニング法
血漿試料をＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ法により、融合タンパク質の完全ＧＬＰ－１部分について分析した。ＥＬＩＳＡプレートをマウスモノクローナル抗ＧＬＰ－１抗体（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＳＤ）により被覆した。Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ（ＭＳＤ）１５０μＬにより室温（ＲＴ）において穏やかに振盪しながら１時間ブロッキングし、ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬにより３回洗浄した後、希釈した血漿試料（標準試料およびＰＫ研究用試料）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートをＲＴにおいて穏やかに振盪しながら１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬにより３回洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔ中に希釈した（１／３，３３３）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇ標識化、ＭＳＤ）２５μＬを各ウェルに添加し、プレートをＲＴにおいて１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬにより３回洗浄した後、リードバッファ１５０μＬをウェルに添加した。

プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４によって、ノンコンパートメントモデルおよび線形台形補間（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）計算を使用して、薬物動態パラメータを計算した。結果を、図７および８ならびに表６において示す。結果は、新規ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質は、ｎｇ／ｍＬの範囲内にそれらの血漿レベルを維持し、半減期は最大２０～４０時間であったことを示す。

マウスモデルにおけるインビボ有効性
ａ．）多用量食事性肥満（ＤＩＯ）マウス
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｎ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒマウスを、特定病原体感染防止壁施設において１２時間明／１２時間暗周期にて群で飼育し、水および標準食または高脂肪食（ｓｓｎｉｆｆ 調節済みＦａｔ Ｄｉｅｔ Ｅ１５７９７）を自由に摂らせた。２０週間の高脂肪食での事前飼育後、マウスを体重について階級化して、各処置群（ｎ＝８）が同様の平均体重を有するように処置群に分けた。標準固形飼料（ｓｓｎｉｆｆ Ｒ／Ｍ－Ｈ、Ｖ１５３４－０）を自由に摂らせた週齢が適合する群を、標準対照群として含めた。また、デュラグルチド処置群を、比較群として含めた。処置の開始前に、マウスに、３日間媒体溶液を皮下（ｓ．ｃ．）注射し、計量して、マウスを手順に慣らした。

１）飼育した雌ＤＩＯマウスにおける血中グルコースに対する急性効果：媒体（リン酸緩衝液）の第１の投与（ｓ．ｃ．）またはＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質（リン酸緩衝液中に溶解した）の第１の投与それぞれの直前に、初回血液試料を採取した。投与体積は、ストック液の濃度によって、５または１０ｍＬ／ｋｇであった。実験中、動物に、水およびそれらの対応する食餌を摂らせた。血中グルコースレベルを、ｔ＝０時間、ｔ＝１時間、ｔ＝２時間、ｔ＝３時間、ｔ＝４時間、ｔ＝６時間およびｔ＝２４時間において測定した（方法：Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｃｋ血糖計）。血液採取は、麻酔なしで尾部切開によって実施した。

２）雌のＤＩＯマウスにおける体重に対する慢性効果：マウスを毎週１回、８日目毎に明相の開始時の朝に、媒体または試験化合物により４週間処置した。体重および摂食量を毎日記録した。処置開始２日前および２６日目に、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により全体脂肪量を測定した。

体重および摂食量に対する融合タンパク質の効果を、それぞれ図９および図１０に示す。配列番号８または配列番号７の融合タンパク質により処置した動物は、研究の終わりまでに媒体またはデュラグルチド処置動物よりも多くの食餌を累積的に消費したが、それらは、媒体またはデュラグルチド処置動物よりも有意に体重が減少した。このことは、体重減少に対する配列番号７および配列番号８の両方の分子の効果が実現するために摂食量の抑制を必要としなかったので、配列番号７および配列番号８の両方の分子のＦＧＦ２１模倣活性に対するＧＬＰ－１受容体活性の均衡が保たれていることを明らかに実証している。

ｂ．）飼育した雌の糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける多数の皮下用量の血中グルコース低下効果
動物、研究設計（投薬前相、投薬相）、薬理学的介入
雌の健康な痩せたマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ－（痩せ）／ＯｌａＨｓｄまたはＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７（ｍ）＋／＋ Ｌｅｐｒ（ｄｂ）Ｊ）および糖尿病傾向のある肥満ｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ＯｌａＨｓｄまたはＢＫＳ．ＣＧ－ｍ ＋／＋ Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／Ｊ）を、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ Ｉｎｃ．またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに注文した。全ての動物を木材チップ床敷を有する靴箱型ケージにおいて群で飼育し、投薬相の前におよそ２～３週間の間慣らした。

１２時間明／１２時間暗周期（明相０４：００ＡＭ～４：００ＰＭ）、２０～２６℃の室温、および３０～７０％の相対湿度の動物飼養条件下においてマウスを飼育した。全ての動物は、グリーンフィールド市の水およびＰｕｒｉｎａ Ｆｏｍｕｌａｂ Ｄｉｅｔ ５００８を自由に摂取した。研究開始時に、マウスはおよそ１０～１２週齢であった。

投薬前相（１５日間）
９日目に尾部クリップにより、ＨｂＡ１ｃおよび血中グルコース測定のために血液を収集した。範囲を延長したＡｌｐｈａＴＲＡＫ血糖計（コード２９ストリップ）を使用して血中グルコース濃度を測定した。血糖計測定は、任意の他の生活活動より前に取り、二重に実施した。これらの値（計算された血糖計の値）が２０ｍｇ／ｄＬを超えて異なった場合は、第３の値を記録した。９および１５日目に体質量測定を収集した。ＨｂＡ１ｃおよび体質量値を、ブロックランダム化に使用した。ブロックランダム化結果に従って、１５日目に動物を処置群（ｎ＝８／群）、ならびに新しいケージおよびケージの仲間（ｎ＝４動物／ケージ）に割り当てた。週齢が適合した健康な参照群として痩せの群を研究に含めた。

用量製剤および投薬
動物を、５ｍｇ／ｋｇの体積の媒体（滅菌ＰＢＳ）、デュラグルチド、配列番号８または配列番号７のいずれかの皮下注射により、投薬相の１、８、１５、２２および２７日目に１回処置した。投薬は１０：００～１２：００ＡＭの間に完了し、各個体の極めて最近の体質量記録に調節した。Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ Ｐｅｎ）を含む注射液を、ストック液またはＰｅｎ製剤への滅菌ＰＢＳの添加により調製して、適切な濃度を達成した。

投薬相（３６日間）
１）午前給餌動物における血中グルコース濃度：実験中、動物は水および食餌を無制限に摂取した。１、２、８、９、１５、１６、２２、２３、２７および２８日目の１０：００～１２：００ＡＭの間の任意の他の生活活動より前、ならびに２、９、１６、２３および２８日目の投薬２４時間後に血中グルコースを測定した。加えて、１および２２日目の、投薬１、２、３、４、６および２４時間後に血液を収集した（図１１）。血液およそ５μＬを尾部クリップから収集し、範囲を延長したＡｌｐｈａＴＲＡＫ血糖計（コード２９ストリップ）を使用して血中グルコース測定を二重で実施した。これらの値（計算されたグルコース値）が２０ｍｇ／ｄＬを超えて異なった場合は、第３の値を記録した。各個体および示される期間について台形法（ｔｒａｐｅｚｏｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）により曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。

２）ＨｂＡ１ｃ分析：投薬前相の９日目および投薬相の３６日目に、血液を尾部クリップから収集した。血液を５μＬの無添加マイクロキャピラリー管に収集し、即座に溶血液を含有する遠心分離管に入れた。管を激しく振盪して溶血液と血液とを混合し、揺り子上に置いて血液と試薬とが完全に混合することを確実にした。研究開始時および研究終了後の血漿ＨｂＡ１ｃレベルを図１２に示す。

統計解析：データは平均値±ＳＥＭとして記載する。統計解析のために、糖尿病肥満ｄｂ／ｄｂ媒体マウス（ｎ＝８）の群を、糖尿病肥満ｄｂ／ｄｂ被験物質処置マウス（ｎ＝８）の群と比較して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）および多重比較（ダネット法）を実施した。２つの群の平均値における差が０．０５超であった場合、それらは統計的に有意に異なるとみなされた。非糖尿病痩せ媒体群データを図１１および１２に記載し、非肥満非糖尿病状態についての参照データセットとして使用した。

配列番号８または配列番号７の融合タンパク質により処置した動物において、血中グルコースレベルに対する低下効果は、媒体またはデュラグルチド処置動物における効果より有意に大きかった（図１１）。配列番号８の融合タンパク質の最も高い用量は、処置の２２日目に測定した２４時間血中グルコースプロファイルのほぼ全体にわたり、血中グルコースレベルの、正常非糖尿病動物レベルまでの低下さえももたらした。加えて、図１２に示されるように、配列番号８または配列番号７の融合タンパク質により処置した動物は、研究の終わりまでに媒体またはデュラグルチド処置動物よりも明白な、ＨｂＡ１ｃ増大の抑制を示した。

ｃ．）ＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスモデル
動物および実験設定
全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する国際基準の原理に従った。

ＪａｎＶｉｅｒ（ＪａｎＶｉｅｒ ｌａｂｓ、フランス）から雄の５週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを得、各群、１ケージ当たり５匹の動物を１２時間暗／１２時間明周期下において飼育した。室温は２２℃±１℃に制御し、５０％±１０％湿度であった。動物は、以前にＡＭＬＮ食餌（Ｃｌａｐｐｅｒら（２０１３）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０５：Ｇ４８３－Ｇ４９５）として記載されている高脂肪食（４０％、これらのうち１８％はトランス脂肪）、４０％炭水化物（２０％フルクトース）および２％コレステロール（Ｄ０９１００３０１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、米国）、または普通のげっ歯類固形飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、デンマーク）および水道水（低脂肪食、ｎ＝１０～１２）を自由に摂取した。２６週間後、基線の段階の個体の線維症および脂肪肝の組織学的評価のために肝生検を実施した。

生検の１日前に、マウスをエンロフロキサシン（Ｂａｙｅｒ、ドイツ）（５ｍｇ／ｍＬ ／ １ｍＬ／ｋｇ）により事前処置した。生検前に、マウスを１００％酸素中のイソフルラン（２％～３％）により麻酔した。正中線における腹部の小切開を行い、肝臓の外側左葉を曝露した。組織学的検査のために、４％パラホルムアルデヒド中に固定した葉の遠位部分から、肝組織の円錐形楔形部分（５０～１００ｍｇ）を切除した。以前にＣｌａｐｐｅｒらによって説明される生検手順を、ＥＲＢＥ ＶＩＯ １００Ｃ電気外科用ユニット（ＥＲＢＥ、米国）を使用するバイポーラ凝固による肝臓の切断面の電気凝固法を使用して改良した。肝臓を腹腔に戻し、腹壁を縫合し、皮膚をステープラー処置した。手術時ならびに手術後１および２日目に、術後疼痛緩和および感染を制御するために、それぞれ、カルプロフェン（Ｐｆｉｚｅｒ、米国）（５ｍｇ／ｍＬ－０．０１ｍＬ／１０ｇ）およびエンロフロキサシン（５ｍｇ／ｍＬ－１ｍＬ／ｋｇ）を、腹腔内に投与した。生検手順後、動物を単独で飼育し、ＡＭＬＮ食餌で３週間維持して回復させた。基線肝生検によって評価された個体の疾患段階に基づいて階層化し、１０～１２匹の動物の研究群へランダム化した。

その後、動物を、ＡＭＬＮ食餌または固形飼料食餌のいずれかでのさらなる８週間の間、ＧＬＰ－１ＲＡ／ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質５０ｍｇ／ｋｇ、デュラグルチド０．６ｍｇ／ｋｇ、または媒体（ＰＢＳ）の毎週１回の皮下注射により処置した。次に、動物を安楽死させ、肝臓重量を決定し、組織学分析および生化学分析のために肝組織を収集した（図１３を参照されたい）。

組織学的評価およびデジタル画像解析
基線肝生検および最終試料を外側左葉から収集し（約１００ｍｇ）、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。肝組織をパラフィン包埋し、薄片にした（３μｍの厚さ）。肝臓の形態および線維症を評価するために、薄片を、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシンならびにシリウスレッドにより染色し、Ｖｉｓｉｏｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、デンマーク）により解析した。病理学者が盲検により組織学的評価およびスコア付けを実施した。Ｋｌｅｉｎｅｒら（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１： １３１３－１３２１によって概略される臨床基準を使用して、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）（脂肪肝、炎症、気球状変性）および線維症段階を実施した。データは、図１４および図１５において２つの異なる形式で示される。

配列番号８の融合タンパク質は、肝臓重量、肝臓の全脂質含有量、肝臓コレステロールおよびトリグリセリド含有量、ならびにＮＡＦＬＤ活性スコアに対する効果を明らかに示し、これらは、デュラグルチドの効果によって例示されるＧＬＰ－１アゴニズム単独の肝臓重量、肝臓の全脂質含有量、肝臓コレステロールおよびトリグリセリド含有量、ならびにＮＡＦＬＤ活性スコアよりも優れている。

Claims (17)

1. 天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）のＧＬＰ－１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニスト活性に比べて、約９分の１～約５３１分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドであって、アミノ酸配列
   Ｘ_１－Ｇ－Ｅ－Ｇ－Ｔ－Ｆ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｘ_１０－Ｓ－Ｘ_１２－Ｘ_１３－Ｌ－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｆ－Ｘ_２３－Ｅ－Ｗ－Ｌ－Ｘ_２７－Ｘ_２８－Ｘ_２９－Ｇ（配列番号６３５）
   を含みまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
   式中
   Ｘ_１はＨ、ＹまたはＦであり、
   Ｘ_１０はＫまたはＬであり、
   Ｘ_１２はＫ、ＩまたはＱであり、
   Ｘ_１３はＱまたはＬであり、
   Ｘ_１５はＥ、ＡまたはＤであり、
   Ｘ_１６はＥ、ＫまたはＳであり、
   Ｘ_１７はＥ、ＲまたはＱであり、
   Ｘ_１８はＬ、ＡまたはＲであり、
   Ｘ_１９はＶ、ＡまたはＦであり、
   Ｘ_２０はＲ、Ｈ、Ｑ、ＫまたはＩであり、
   Ｘ_２１はＬ、Ｅ、ＨまたはＲであり、
   Ｘ_２３はＩ、ＹまたはＦであり、
   Ｘ_２７はＩ、Ｌ、ＫまたはＥであり、
   Ｘ_２８はＡ、Ｋ、ＮまたはＥであり、
   Ｘ_２９はＧ、Ｔ、ＫまたはＶであり；
   場合により、前記アミノ酸配列は、そのＮ末端において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基をさらに含み；
   場合により、前記アミノ酸配列は、そのＣ末端において最大で約１２、約１１または約１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長をさらに含む、
   ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
2. アミノ酸配列
   Ｈ－Ｇ－Ｅ－Ｇ－Ｔ－Ｆ－Ｔ－Ｓ－Ｄ－Ｘ_１０－Ｓ－Ｋ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｅ－Ｅ－Ｘ_１８－Ｖ－Ｘ_２０－Ｌ－Ｆ－Ｉ－Ｅ－Ｗ－Ｌ－Ｋ－Ａ－Ｘ_２９－Ｇ（配列番号６３６）
   を含みまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
   式中
   Ｘ_１０はＫまたはＬであり、
   Ｘ_１８はＡまたはＲであり、
   Ｘ_２０はＲまたはＱであり、
   Ｘ_２９はＧまたはＴであり；
   場合により、前記アミノ酸配列は、そのＮ末端において少なくとも１つの追加のアミノ酸残基をさらに含み；
   場合により、前記アミノ酸配列は、そのＣ末端において最大で約１２、約１１または約１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長をさらに含む、
   請求項１に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
3. 少なくとも１つの追加の前記アミノ酸残基は、ＧまたはＡである、請求項１または２に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
4. 前記ペプチド延長は、配列番号５６６～６２１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
5. 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドがその単離された形態において存在する場合および／または前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドが融合分子の部分である場合、前記天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）の前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約９分の１～約５３１分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
6. 前記天然ＧＬＰ－１（７～３６）（配列番号２６０）の前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性に比べて、約１０分の１～約５００分の１、または約１５分の１～約５００分の１、または約２０分の１～約５００分の１、または約５０分の１～約５００分の１、または約１００分の１～約５００分の１、または約１００分の１～約３００分の１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
7. 配列番号２６１～５５２および５５４～５６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
8. 配列番号２６１のアミノ酸配列を含むもしくはそのようなアミノ酸配列からなる、または配列番号２６２のアミノ酸配列を含むもしくはそのようなアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１つの他の医薬品有効成分を含む組合せ。
10. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドおよび少なくとも１つの他の医薬品有効成分を含む融合分子。
11. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチドまたは請求項１０に記載の融合分子をコードする核酸分子。
12. 請求項１１に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
13. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、請求項９に記載の組合せ、請求項１０に記載の融合分子、請求項１１に記載の核酸分子または請求項１２に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
14. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、請求項９に記載の組合せ、請求項１０に記載の融合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載の宿主細胞または請求項１３に記載の医薬組成物を含むキット。
15. 医薬としての使用のための、請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、請求項９に記載の組合せ、請求項１０に記載の融合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載の宿主細胞または請求項１３に記載の医薬組成物。
16. 肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための、請求項１～８のいずれか１項に記載のＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、請求項９に記載の組合せ、請求項１０に記載の融合分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載の宿主細胞または請求項１３に記載の医薬組成物。
17. 前記糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である、請求項１６に記載の使用のための、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストペプチド、組合せ、融合分子、核酸分子、宿主細胞または医薬組成物。

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