CN116103209B - 一株肠杆菌clh-46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、产品和方法 - Google Patents

一株肠杆菌clh-46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、产品和方法 Download PDF

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Abstract

本发明一株肠杆菌CLH‑46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、产品和方法，属于微生物与生物技术领域。本发明的肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH‑46的保藏编号为CGMCC No.26535。本发明还提供基于所述菌株CLH‑46的制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途，菌剂产品和制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。用本发明的菌株CLH‑46发酵生产18α‑GAMG和18β‑GAMG的产率分别为97.1%和96.2%，发酵罐发酵中制备得到18α‑GAMG终浓度达到39.31g/L，18β‑GAMG终浓度达到29.47g/L。

Description

一株肠杆菌CLH-46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、 产品和方法
技术领域
本发明属于微生物与生物技术领域，具体涉及一株肠杆菌CLH-46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、产品和方法。
背景技术
甘草（Glycyrrhiza）是作为我国重要的传统药用植物，具有清热解毒、补脾益气、调和诸药、润肺止咳等诸多功效，主要含有三萜皂苷类、黄酮类和酚类成分，而含量较高且最常见的活性化合物为甘草酸(Glycyrrhizic acid，GL)和甘草次酸(Glycyrrhetinicacid，GA)。其中，GL为齐墩果烷型五环三萜类化合物，由苷元结构及其C3位上两个分别以β-1,2糖苷键和β-1,3糖苷键相连的葡萄糖醛酸基组成，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、抗衰老和保肝护肝等药理活性，但由于GL结构上两个葡萄糖醛酸基的极性较强，不易透过细胞膜发挥药理作用，口服利用率低，因而 GL分子不是发挥药效的最佳形式。
单葡萄糖醛酸甘草次酸（Glycyrrhetic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide，GAMG）作为甘草中含量极少（＜0.1mg/g）的高生物活性五环三萜成分，主要以18β-GAMG的形式存在，几乎不含有18α-GAMG。GAMG可由GL水解外侧的一分子葡萄糖醛酸基制备获得，其极性介于GL和GA之间，是五环三萜苷元和葡萄糖醛酸基作为疏水基团和亲水基团的两亲性化合物，在体内兼具了跨膜转运和易溶解的双重优势。
研究表明，GAMG与GL和GA具有类似的药理活性，但GAMG在抗炎、抗肿瘤和抗病毒等方面具有更显著的疗效，同时GAMG的半数致死量（LD50）为5000mg/kg，远大于GL的LD50(805mg mg/kg)，显示出明显的生物安全性优势，因而在新药开发方面具有极大的应用前景。18α-GAMG和18β-GAMG是单葡萄糖醛酸甘草次酸的差向异构体，18α-GAMG的生物学活性大大优于18β-GAMG构型，如在抗肝肿瘤方面，18α-GAMG比18α-GL、18β-GL和18β-GAMG具有更强的抑癌作用，并能够显著改善肝脏病理损伤；在抗炎活性方面，18α-GAMG也表现出最强的活性，浓度为40 μM时NO抑制率即超过70%。此外，在皮肤治疗方面，18α-GAMG具有比18β-GAMG更强的抗菌和抗过敏活性。
在食品工业领域，GAMG还可作为一种独特的新型高倍甜味剂，具有高甜度、低热量的特点，其甜度约为GL的5.5倍，蔗糖的941倍，可用于配置低热量或零热量的产品，被认为是一种极具发展前景的天然食品添加剂，为喜爱甜食的肥胖症、糖尿病患者带来了福音。另外，GAMG还可作为各种化妆品的乳化剂或助溶剂等。
目前，GAMG的常用生产方式主要有化学法和生物转化法，主要集中在18β-GAMG的生产，极少有18α-GAMG的生产报道。尽管，化学法在低收率情况下，能够实现克级的18β-GAMG到18α-GAMG的转化。但往往存在工艺条件苛刻，常涉及强酸、强碱和大量有机溶剂的使用，容易对环境造成严重污染等问题；且由于化学法的反应选择性差，容易造成转化不彻底或大量GA副产物的产生，不利于高纯度GAMG的产生；另外，所涉及工艺的工段收率低，造成工艺成本较高等问题，大大限制了GAMG的批量生产。与化学法相比，生物转化法具有优异的底物选择性、温和的反应条件、生态友好性、工艺成本低、能够制备大量的药用前体等优点，具有更大的潜力和优势，成为了极具发展前景的GAMG生产方式。其中，通过生物转化法由GL制备18α-GAMG或18β-GAMG的转化形式如图1所示。
在生物转化法方面，本领域的报道主要集中在真菌生产18β-GAMG，如：CN103352062B公开了一种利用产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum) Li-3产酶转化的方法，该方法首先通过添加促进剂来诱导产紫青霉Li-3菌株产酶，然后使用产酶后的菌体来制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，进一步对甘草提取物中成分进行水解来产生18β-GAMG，反应时间长，转化步骤较繁琐。CN103992953B公开了一株能够转化GL为GAMG的东乡野生稻内生菌黄曲霉(Aspergillus flavus) DX-SEL2，培养时间长，转化效率低。CN106636290B公开了一株篮状真菌(Talaromyces sp.)发酵生产GAMG的方法，但在5-10%接种量下仍需发酵120-144h，耗时长且效率较低。CN111485012A公开了一种利用球毛壳霉(Chaetomiumglobosum) THS3进行固态发酵甘草来制备GAMG的方法，但菌株发酵周期耗时长(30天)，形成GAMG和GL的非单一构型混合物。另外，CN115044520B公开了一株交替单胞菌转化甘草提取物中的18β-GL为18β-GAMG，但其培养基成分复杂，18β-GAMG的产量只有3.67g/L，且发酵过程会产生18β-GA副产物。此外，在已有文献或专利报道中，无论是真菌还是细菌转化方法，均为对甘草提取物所含18β-GL或提纯后的18β-GL进行转化，未见可特异性转化18α-GL为18α-GAMG的菌株报道。
发明内容
出于解决填补本领域现有技术存在的未见相关菌株报道的空白这一技术问题，本发明提供一株细菌来源的肠杆菌Enterobacter sp.CLH-46，经16S rRNA测序、序列比对和菌体形态学鉴定，确定该菌株为肠杆菌属(Enterobacter sp.)，其被命名为肠杆菌Enterobacter sp.CLH-46。该菌株可用于制备高纯度的18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸，具有特异性强，得率高，无副产物等优点，为两种构型的单葡萄糖醛酸甘草次酸的工业化生产奠定了基础。
本发明的技术方案如下：
一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.26535。
保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途。
所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸。
制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到39.31g/L，纯度为84.19%-98.78%，转化率大于95%，产率为97.1%；
优选地，制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到29.47g/L，所述制备产物的产率为96.2%。
一种菌剂，包括活性成分，所述活性成分包括：保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46。
所述的一种菌剂，还包括：辅料。
一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括：采用保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46进行制备。
所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸；
优选地，所述制备指用菌株CLH-46催化底物；
优选地，所述底物选自甘草酸及其盐；
优选地，所述甘草酸选自：18α-甘草酸和/或18β-甘草酸；
优选地，所述催化的pH值为5-9优选6；
优选地，所述底物的浓度为2g/L-10g/L优选4g/L；
制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18α-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵；
优选地，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃200rpm培养24-36h；
优选地，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18α-甘草酸；
优选地，所述发酵还包括：培养28-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18α-甘草酸，发酵74h；
优选地，所述发酵培养基包含：18α-甘草酸二铵盐；
优选地，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18β-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵；
优选地，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃200rpm培养24-36h；
优选地，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18β-甘草酸；
优选地，所述发酵还包括：培养34-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18β-甘草酸，发酵82h；
优选地，所述发酵培养基包含：18β-甘草酸单铵盐；
优选地，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
本发明从甘草根际土壤中分离筛选出的，细菌来源的，能够定向转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸甘草次酸的肠杆菌Enterobacter sp.CLH-46，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，菌株的保藏编号为CGMCC No.26535。该菌不仅能够高效的、特异性转化18α-GL为18α-GAMG,而且也能特异性转化18β-GL为18β-GAMG,转化效率高，培养成分简单，转化工艺绿色环保，这为后续18α-GAMG和18β-GAMG工业化生产奠定基础。
本发明提供一株肠杆菌Enterobacter sp.CLH-46菌株及其在生产18α和18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸中的应用。本发明所述菌株的保藏编号为：CGMCC No.26535，为首次报道的能够高效水解18α-甘草酸生产18α-GAMG的肠杆菌属细菌。本发明基于菌株CLH-46提供一种用于制备18α-GAMG和18β-GAMG的方法，利用上述菌株和方法制备18α-GAMG或18β-GAMG时，具有菌株培养条件简单，底物转化效率高，特异性强，无副产物生成和工艺环保的特点。基于本发明提供的菌株CLH-46，在常规条件下制备GAMG的产率高达97.1%。经5L发酵罐放大，18α-GAMG终浓度高达39.31g/L，18β-GAMG终浓度大于29.47g/L，产品经纯化后的纯度可达98.7%以上。因此，本发明为制备18α-GAMG和18β-GAMG提供了一种简单有效且可工业放大的方法。
本发明对上述肠杆菌属Enterobacter sp.CLH-46在制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸（18α-GAMG）和18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸（18β-GAMG）的效果方面进行了摇瓶和5L发酵罐的验证，该菌株可高效地转化甘草酸或其盐生产GAMG，且转化过程中无副产物产生。其中，在摇瓶条件下18α-GAMG和18β-GAMG的产率分别为97.1%和96.2%。在5L发酵罐分批补料放大过程中，18α-GAMG终浓度达到39.31g/L，18β-GAMG终浓度达到29.47g/L，展现出其良好的工业应用潜力。
本发明提供的肠杆菌属（Enterobacter sp.）CLH-46菌株具有培养条件简单，底物转化效率高，特异性强，无副产物生成和工艺环保的特点。另外，由于本发明提供的CLH-46菌株为细菌，繁殖比真菌更快，且培养条件简单，培养基成分易获得，因而还具有成本低而盈利性强等优势。由此可见，本发明为本领域提供了一种简单高效的18α-GAMG和18β-GAMG制备方法。
本发明保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46的保藏信息如下：
菌株名称：CLH-46；
保藏号：CGMCC No.26535；
分类命名：肠杆菌Enterobacter sp.；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2023年2月10日。
附图说明
图1是肠杆菌属CLH-46菌株转化甘草酸的示意图，其中，A：18α-GL制备18α-GAMG；B：18β-GL制备18β-GAMG。
图2是本发明实验例2中CLH-46菌株的最适初始底物浓度和最适生长pH值探究，其中，A：最适初始底物浓度；B：最适生长pH值。
图3是本发明实验例3中CLH-46菌株转化18α-GL生成18α-GAMG的高效液相色谱分析图，其中，A：18α-甘草酸（转化前）；B：转化后。
图4 是本发明实验例4中经半制备液相纯化后的18α-GAMG的高效液相色谱分析图。
图5 是本发明实验例5中CLH-46菌株转化18α-GL生成18α-GAMG的液相色谱-质谱联用分析图。
图6是本发明实验例6和7中CLH-46菌株在5L发酵罐放大试验中。其中，A：转化18α-GL生成18α-GAMG；B：转化18β-GL生成18β-GAMG。
具体实施方式
以下通过具体实施例和实验例对本发明作进一步说明。应理解，所述实施例和实验例仅作为对本发明的解释和说明，而不能作为限制本发明的保护范围。如无特殊说明，下述实施例和实验例中所使用的实验方法均为常规方法；所使用试剂或材料等，均可从商业途径获得。
应注意，本发明在实验例中所使用的培养基，可根据具体实施方案对主要成分甘草酸进行构型替换或使用其成盐组分，以优选获得不同需求的18α或18β型培养基。在如下实验例中，主要以18α-GL底物作介绍。
以下为实验例中使用到的培养基：
筛选培养基：2g/L 18α-甘草酸二铵盐，3g/L NaNO3，3g/L K2HPO4, 0.5g/LMgSO4·7H2O，1g/L KCl，10mg/L FeSO4·7H2O，自然pH，于115℃灭菌20min；若配置固体培养基，即筛选平板，则在上述成分基础上，添加20 g/L琼脂粉。
扩繁培养基：2g/L 18α-甘草酸二铵盐，3g/L NaNO3，3g/L K2HPO4，2g/L Tryptone，1g/L Yeast extract，2g/L NaCl，0.5g/L MgSO4·7H2O，1g/L KCl，20mg/L FeSO4·7H2O，自然pH，于115℃灭菌20min。
发酵培养基：4g/L 18α-甘草酸二铵盐，3g/L NaNO3，3g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，1g/L KCl，20mg/L FeSO4·7H2O，调pH至6.0，于115℃灭菌20min。
制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸的发酵培养基与上述培养基的区别只是将18α-甘草酸二铵盐替换成18β-甘草酸单铵盐，其余成分是一样的。本领域技术人员可基于本发明记载的培养基成分，根据化学领域的公知常识和常规技术手段，基于物质结构相似性质相似的原理，对上述培养基中的18α-甘草酸二铵盐或18β-甘草酸单铵盐替换成其他结构近似、性质相似的18α-甘草酸盐类物质或18β-甘草酸盐类物质或18α-甘草酸或18β-甘草酸作为培养基中的发酵底物，并获得与本发明下述实验例3-7提供的数据图表类似的发酵效果，不存在技术障碍。为节约篇幅，本发明不再一一列明不同底物对应的实验过程和实验数据。
LB固体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g 氯化钠，20g琼脂粉，去离子水定容至1L，自然pH，于121℃灭菌15min。
本文中的CLH-46菌株、菌株CLH-46、肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46、肠杆菌CLH-46、CLH-46均指代保藏编号为CGMCC NO.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46。本文中的“以上”、“以下”均包含本数。
第1组实施例、本发明的菌株CLH-46
本组实施例提供一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46，其保藏编号为CGMCC No.26535。
任何培养、扩繁、发酵、富集、生产、制备、使用、接种、扩增、转化、修饰、改造、进口、出口、销售、许诺销售保藏编号为CGMCC NO.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46的行为，和/或，将保藏编号为CGMCC NO.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46与其他菌联用的行为，和/或，用保藏编号为CGMCC NO.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46催化底物/发酵/制备/生产的行为均落在本发明的保护范围。
所述其他菌包括但不限于：沙门氏菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、耶尔森菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、肠杆菌属的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、坂崎肠杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌（即，长双歧杆菌婴儿亚种）、乳双歧杆菌（即，动物双歧乳脂亚种）、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌等。
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《制剂技术百科全书》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），对辅料进行常规选择或调整，进而将保藏编号为CGMCC NO.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制成不同剂型、不同存储条件、不同保质期的产品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
第2组实施例、本发明的菌株CLH-46的用途
本组实施例提供保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途。
在具体的实施例中，所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸。
在一些实施例中，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到39.31g/L，纯度为84.19%-98.78%，转化率大于95%，产率为97.1%；
在另一些实施例中，制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到29.47g/L，所述制备产物的产率为96.2%。
第3组实施例、本发明的菌剂
本组实施例提供一种菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述菌剂包括活性成分，所述活性成分包括：保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46。
在进一步的实施例中，所述的一种菌剂还包括：辅料。
在更具体的实施例中，所述辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合制剂制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述药用辅料进行选择和调配，并将CGMCC NO.26535的肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、喷雾剂、滴剂、胶囊剂、丸剂等。
第4组实施例、本发明的制备方法
本组实施例提供一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述方法包括：采用保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46进行制备。
在具体的实施例中，所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸；
优选地，所述制备指用菌株CLH-46催化底物；
优选地，所述底物选自甘草酸及其盐；
优选地，所述甘草酸选自：18α-甘草酸和/或18β-甘草酸；
优选地，所述催化的pH值为5-9优选6；
优选地，所述底物的浓度为2g/L-10g/L优选4g/L；
在一些实施例中，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18α-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵；
优选地，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃200rpm培养24-36h；
优选地，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18α-甘草酸；
优选地，所述发酵还包括：培养28-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18α-甘草酸，发酵74h；
优选地，所述发酵培养基包含：18α-甘草酸二铵盐；
优选地，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
在另一些实施例中，制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18β-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵；
优选地，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃200rpm培养24-36h；
优选地，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18β-甘草酸；
优选地，所述发酵还包括：培养34-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18β-甘草酸，发酵82h；
优选地，所述发酵培养基包含：18β-甘草酸单铵盐；
优选地，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
实验例1、本发明CLH-46菌株的分离、纯化与筛选
从新疆塔城地区的甘草根际土壤中采集待分离土样，称取土样5-10g，放入50mL无菌水中，充分振荡10min后，再自然沉降20min。于超净工作台中吸取1mL沉降后的上清液，再用无菌水进行梯度稀释，分别制成10-3、10-4、10-5和10-6倍浓度的稀释液。分别取200μL不同浓度的稀释液，均匀涂布于筛选平板，于30℃恒温培养箱培养。将新生长的菌落，经多轮筛选平板划线或梯度稀释，以分离获得纯种菌株。
将各纯种菌株分别接种于筛选培养基中，并置于30℃ 200rpm的恒温振荡培养箱中进行培养2-4d。取发酵培养液100μL，加入900μL甲醇中，涡旋振荡2min使其充分混匀，混合样液经0.22μm有机滤膜过滤处理，再通过分析型高效液相色谱进行分析，初步筛选具有特异性水解18α-GL为18α-GAMG的菌株，从中获得一株细菌，并命名为CLH-46。
对菌株CLH-46进行LB固体培养基培养，观察其生长形态，发现其菌落形态呈圆形，黄色，光滑湿润，且经革兰氏染色呈阴性，为革兰氏阴性菌。通过显微镜观察发现，CLH-46为杆状细菌，宽0.6-1.0μm×1.2-3.0μm。对菌株CLH-46的16S rRNA序列测序后进行BLAST序列比对，其16S rRNA序列长度1421 bp，与肠杆属（Enterobacter）有98%-100%同源性。结合其菌落形态学分析，鉴定为肠杆菌属（Enterobacter sp.），并命名为CLH-46。将CLH-46菌株送至菌种保藏中心，对该菌株进行菌种保藏，其保藏信息如下：
菌株名称：CLH-46；
保藏号：CGMCC No.26535；
分类命名：肠杆菌Enterobacter sp.；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2023年2月10日。
实验例2、CLH-46菌株的最适初始底物浓度和最适生长pH值
选取适宜的初始底物浓度是菌株培养和促进转化的关键因素之一。本实验例对肠杆菌属CLH-46菌株的最适初始底物浓度进行探究，以确定发酵培养基优选的初始底物浓度培养条件。基于发酵培养基组分，仅改变底物18α-GL的浓度，分别设置发酵培养基中初始底物浓度为2g/L、4g/L、6g/L、8g/L和10g/L。在相同条件下，对肠杆菌属CLH-46菌株进行培养，通过分析型高效液相色谱进行分析，结果如图2A所示。结果表明，肠杆菌属CLH-46菌株在所选浓度范围均具有催化活性，可作为培养CLH-46菌株的优选初始底物浓度范围，并在4g/L的18α-GL初始底物浓度下表现出最优的转化能力。
另外，对肠杆菌属CLH-46菌株的最适生长pH值进行探究，以确定发酵培养基优选的pH值培养条件。基于发酵培养基组分，分别设置发酵培养基的pH梯度为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9。在相同条件下，对肠杆菌属CLH-46菌株进行培养，通过分析型高效液相色谱进行分析，结果如图2B所示。结果表明，肠杆菌属CLH-46菌株在pH值为5-9之间均具有催化活性，能够特异性转化18α-GL为18α-GAMG；在pH值5.5-7.0之间表现出较高的催化活性，可作为培养CLH-46菌株的优选pH值范围，并在pH为6.0时，表现出最高的催化活力；但在pH低于4.5时几乎不具有催化活性。另外，由于发酵培养基的自然pH在6.0左右，进一步表明本发明的CLH-46菌株可在更温和的pH值范围内进行有效生产，几乎无需对pH值进行调节，大大减少了酸碱调节剂的使用，符合绿色生产要求。
实验例3、肠杆菌Enterobacter sp.CLH-46菌株的培养与底物转化
肠杆菌属CLH-46种子液的活化形式可采用从保藏有CLH-46菌株的甘油管或其筛选平板上挑取单菌落等形式，所选用的活化培养基采用筛选培养基。
将肠杆菌属CLH-46接种于筛选培养基时，可作为一级种子液，并将一级种子液置于30℃ 200rpm恒温振荡培养箱中培养48h。以体积比1%的接种量，转接一级种子液至扩繁培养基，作为二级种子液，并置于30℃ 200rpm恒温振荡培养箱中培养24h。以体积比1%的接种量，转接二级种子液至发酵培养基，并置于30℃ 200rpm恒温振荡培养箱中培养，每隔12h取样。采用分析型高效液相色谱检测18α-GL的消耗量和18α-GAMG的生成量，检测方法：流动相采用甲醇:冰醋酸水溶液（6‰）= 84:16，色谱柱为Kromasil 100-3.5-C18，流速为0.8mL/min，进样量5μL，检测波长为254nm，结果如图3所示。其中，底物18α-GL的出峰时间为2.971min，产物18α-GAMG的出峰时间为6.070min。结果表明，发酵24h后能够检测到18α-GAMG的产生；36h后，18α-GL转化完毕，18α-GAMG无明显增加。经计算，产物18α-GAMG的产率为97.1%。另外，转化18β-GL的摇瓶实验中，产物18β-GAMG的产率为96.2%。
实验例4、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸产品的制备
结合本发明实验例2所述菌株培养方法，将活化好的CLH-46菌株接种于发酵培养基中进行培养。培养36h后，进行分批补料发酵，即每隔12h分别补料6g/L、8g/L和10g/L的18α-GL，并通过分析型高效液相色谱检测转化过程的效果。
对转化完毕后的发酵液，进行8000rpm离心25min，并向沉淀部分加1L乙醇，置于45℃恒温水浴锅中，同时搅拌30min，使其充分溶解后，进行过滤操作。将滤液迅速置于冰中，搅拌20min后，立即抽滤获得滤饼部分。然后，采用真空旋蒸仪进行干燥，挥发残留乙醇后，获得18α-GAMG粗产品。接着，将18α-GAMG粗产品进行干燥以获得18α-GAMG一次纯化产品。采用高效液相色谱检测18α-GAMG一次纯化产品的纯度。经计算，一次纯化产品中的18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸的纯度为84.19%。
进一步，采用岛津半制备液相对一次纯化产品进行提纯，方法如下：
称量200mg的18α-GAMG一次纯化产品，使用甲醇和0.6%乙酸混合溶剂进行溶解，溶剂配比为21:4，进行15min的温和搅拌，使其充分溶解。然后，通过半制备液相色谱对待纯化样液进行纯化。其中，流动相采用A：甲醇和B：0.6%冰醋酸水溶液，A∶B=84∶16；且流动相需经过0.22μm有机滤膜过滤，并进行20min超声脱气处理。采用色谱柱为5μm的岛津C18液相色谱柱，10×250mm；检测波长为254nm，流速为5mL/min，进样量2mL，进样方式采用注射进样。对收集到的纯化样液，采用分析型高效液相色谱进行检测以判断其保留时间和纯度。纯化样液收集完毕后，通过干燥、纯化产品获得18α-GAMG纯化产品粉末。采用分析型高效液相色谱检测纯化产品的纯度，结果如图4所示。经计算，所得二次纯化的18α-GAMG的纯度为98.78%。
实验例5、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸产品的鉴定
采用AGILENT液相色谱-质谱联用仪进行结构分子量鉴定，方法如下：
对实验例4中获得高纯度的18α-GAMG二次纯化产品进行液相色谱-质谱联用分析，结果如图5所示。质谱结果显示，被检测化合物实测的(M-H)-为645.3627，而预测18α-GAMG的(M-H)-为645.3644，即被检测化合物分子量与18α-GAMG的预测分子量相符，确定18α-GAMG二次纯化产品的分子量和18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸一致。
实验例6、5L发酵罐放大制备18α-GAMG
为进一步验证CLH-46菌株在生产18α-GAMG中的效果，对CLH-46菌株以18α-GL作为主要碳源（参见发酵培养基），发酵温度30℃，pH6.0，进行5L发酵罐的分批补料发酵，初始底物18α-GL的浓度为15g/L左右，通过分析型高效液相色谱监测18α-GL的消耗量和18α-GAMG的生成量，本实验例中发酵罐发酵的第一次补料时间为第28h，共完成５次18α-GL的补料，结果如图6A所示。结果表明，在5L发酵罐分批补料过程中，在74h转化过程中，18α-GAMG终浓度达到39.31g/L，18α-GL的转化率大于95%，展现出其良好的工业应用潜力。
实验例7、5L发酵罐放大制备18β-GAMG
为进一步验证CLH-46菌株在18β-GAMG中的效果，对CLH-46菌株以18β-GL作为主要碳源，发酵温度30℃，pH6.0，进行5L发酵罐的分批补料发酵，初始底物18β-GL的浓度为15g/L左右，通过分析型高效液相色谱监测18β-GL的消耗量和18β-GAMG的生成量，本实验例中发酵罐发酵的第一次补料时间为第34h，共完成4次18β-GL的补料，结果如图6B所示。结果表明，在5L发酵罐分批补料实验中，在82h转化过程中，18β-GAMG终浓度达到29.47g/L，18β-GL的转化率大于95%，为18β-GAMG的工业化生产奠定了良好的基础。本实验例中的发酵罐培养初始0h即已包含一定浓度的底物在发酵罐中，在发酵过程中边生长边转化底物18β-GL，同时从18β-GL水解下的一分子葡萄糖醛酸基可作为菌体生长的主要碳源，体现了整个过程中对底物的生长利用，也更有利于后期产品的分离。

Claims (28)

1.一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.26535。
2.保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途，其特征在于，所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸。
4.根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途，其特征在于，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到39.31g/L，纯度为84.19%-98.78%，转化率大于95%，产率为97.1%。
5.根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC No.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途，其特征在于，制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸的终浓度达到29.47g/L，所述制备产物的产率为96.2%。
6.一种菌剂，包括活性成分，其特征在于，所述活性成分包括：保藏编号为CGMCCNo.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46。
7.根据权利要求6所述的一种菌剂，其特征在于，还包括：辅料。
8.一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，包括：采用保藏编号为CGMCCNo.26535的一株肠杆菌（Enterobacter sp.）菌株CLH-46进行制备。
9.根据权利要求8所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述单葡萄糖醛酸甘草次酸选自：18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和/或18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸。
10.根据权利要求8所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述制备指用菌株CLH-46催化底物。
11.根据权利要求10所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述底物选自甘草酸及其盐。
12.根据权利要求11所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述甘草酸选自：18α-甘草酸和/或18β-甘草酸。
13.根据权利要求10所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述催化的pH值为5-9。
14.根据权利要求13所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述催化的pH值为6。
15.根据权利要求10或11所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述底物的浓度为2g/L-10g/L。
16.根据权利要求15所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述底物的浓度为4g/L。
17.根据权利要求9所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18α-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵。
18.根据权利要求17所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃ 200rpm培养24-36h。
19.根据权利要求18所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18α-甘草酸。
20.根据权利要求17-19任一所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵还包括：培养28-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18α-甘草酸，发酵74h。
21.根据权利要求18所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：18α-甘草酸二铵盐。
22.根据权利要求17所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
23.根据权利要求9所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，制备18β-单葡萄糖醛酸甘草次酸包括：以18β-甘草酸或其盐类物质为底物进行发酵。
24.根据权利要求23所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵包括：将菌株CLH-46以1%的接种量接种于发酵培养基并于30℃ 200rpm培养24-36h。
25.根据权利要求24所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵还包括：摇瓶培养36h后每隔12h依次补料6g/L、8g/L和10g/L的18β-甘草酸。
26.根据权利要求23-25任一所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵还包括：培养34-36h后用5L发酵罐在温度30℃，pH6.0下每隔3-16h依次补料4-20g/L的18β-甘草酸，发酵82h。
27.根据权利要求24所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：18β-甘草酸单铵盐。
28.根据权利要求23所述的一种制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于，制备18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸还包括：对发酵产物提纯。
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