CN116098913A - 车叶草苷在成骨细胞系mc3t3-e1增殖与分化的应用 - Google Patents

车叶草苷在成骨细胞系mc3t3-e1增殖与分化的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及车叶草苷的新用途，具体是车叶草苷在成骨细胞系MC3T3‑E1增殖与分化中的应用。本发明通过体外实验和分子生物学实验证明了车叶草苷可以促进MC3T3‑E1细胞增殖与分化，使ALP活性增高，上调OPG/RANKL的比值，促进骨的形成以及矿化结节的生成，探索并提供了车叶草苷促进成骨细胞增殖与分化的机制。本发明为车叶草苷在骨质疏松症的治疗与预防提供了理论依据。

Description

车叶草苷在成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化的应用
技术领域
本发明涉及车叶草苷的新用途，具体是车叶草苷在成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化中的应用。
背景技术
骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨质减少、骨组织细微结构破坏、骨脆性增加、骨折危险性增大为特征的全身性的慢性代谢性骨病，被世界卫生组织列为仅次于心血管系统疾病的第二大危害人类健康的疾病。根据国际骨质疏松基金会的数据显示，在全球范围内超过50岁的人群中有三分之一的女性和五分之一的男性会发生骨质疏松性骨折。鉴于许多国家人口老龄化正在迅速增加，骨质疏松症患者逐渐增多，骨质疏松症己成为全球范围内广泛存在的严重社会公众健康问题。因此，如何预防以及治疗质疏松症将成为一项重要课题。
骨质疏松症的主要原因是骨形成和骨吸收失衡。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨组织不断地进行着重建，骨重建过程包括成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨。正常情况下成骨细胞和破骨细胞所介导的骨形成和骨吸收处于平衡状态，在病理条件下平衡打破即可引起骨代谢异常而引发相关疾病，如骨质疏松症。因此，破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。目前，骨质疏松症治疗药物主要分为两类：抑制骨吸收和促进骨形成，其中甲状旁腺激素是美国食品药品监督管理局唯一批准的促进骨形成的药物，但是甲状旁腺激素可以引发骨肉瘤，导致其在临床上大规模应用受到限制。
车叶草苷(Asperuloside,Asp)是一种环烯醚萜类化合物，目前，国内外的研究发现，车叶草苷具有抗炎、镇痛、降血压、抗肿瘤等广泛天然药理作用。车叶草苷作为一种已经有的物质，尽管有确切的分子式和结构式，但其研究的活性不高，作为单体在促进成骨细胞增殖、治疗骨质疏松症中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供车叶草苷在成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了车叶草苷在制备成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化药物中的应用。
车叶草苷的结构式如下：
Figure BDA0004125121650000021
上述技术方案中，进一步地，所述药物为治疗或预防骨质疏松的药物。
本发明还提供了车叶草苷在制备预防骨质疏松保健食品中的应用。
上述技术方案中，进一步地，所述车叶草苷的浓度为5～20μM；优选地，所述车叶草苷的浓度为10～20μM。
本发明提供了一种预防或治疗骨质疏松的药物，所述药物以车叶草苷为活性成分。
上述技术方案中，进一步地，所述药物以车叶草苷为唯一活性成分。
上述技术方案中，进一步地，所述药物为口服制剂或注射制剂。
本发明提供了一种预防骨质疏松的保健食品，所述保健食品包含车叶草苷。
本申请采用的实验验证方法如下：
(1)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3-E1细胞24、48、72h，并采用CCK-8试剂盒检测MC3T3-E1细胞活力、ALP试剂盒检测ALP活性；
(2)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3-E1细胞72h后，用real timePCR法检测细胞中OPG和RANKL mRNA表达水平；骨保护素(OPG)是由成骨细胞合成的一种参与骨重建的糖蛋白，其通过阻断RANK与RANKL之间的相互作用抑制破骨细胞的活性，阻碍骨吸收。所以，OPG/RANKL表达比值是骨量的主要决定因素，是评价骨形成的重要标志，并且在大多数骨溶解疾病的诊断治疗中有着重要的意义。
(3)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3-E1细胞72h后，继续用条件培养液培养17d，然后用Von Kossa染色法检测MC3T3-E1细胞产生矿化结节情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明通过体外实验和分子生物学实验证明了车叶草苷可以促进MC3T3-E1细胞增殖与分化，使ALP活性增高，上调OPG/RANKL的比值，促进骨的形成以及矿化结节的生成，探索并提供了车叶草苷促进成骨细胞增殖与分化的机制。本发明为车叶草苷在骨质疏松症的治疗与预防提供了理论依据。
附图说明
图1不同浓度Asp促进MC3T3-E1细胞增殖结果图；
图2不同浓度Asp对MC3T3-E1细胞中ALP活性的影响结果图；
图3不同浓度Asp对MC3T3-E1细胞中OPG/RANKL mRNA表达情况的影响结果图；
图4不同浓度Asp对MC3T3-E1的细胞矿化结节形成影响结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
以下实施例中所用细胞、试剂、器材均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
1、实验方案：
①细胞增殖能力的检测
MC3T3-E1细胞以1×105/ml个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl细胞悬液。待细胞贴壁后，弃去原细胞培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)，每孔100μl。细胞继续在体积分数为5％ CO2、37℃的细胞培养箱中继续培养24h、48h和72h，然后每孔加入10μl的CCK-8溶液，继续培养0.5h。用酶标仪测定450nm的OD值。
②碱性磷酸酶(ALP)活性检测
MC3T3-E1细胞以2×105/ml个细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔300μl细胞悬液。待细胞贴壁后，弃去原细胞培养液，加入条件培养液(含有50μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠的DMEM细胞培养液)，每孔300μl，在体积分数为5％ CO2、37℃的细胞培养箱中继续培养7d，每天换液一次。然后弃去原细胞培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)药液，每孔300μl。培养24h、48h和72h后，按照ALP试剂盒说明书测定ALP含量，BCA试剂盒测定蛋白总含量，并且按照ALP试剂盒说明中提供的公式计算ALP含量。
③Real-time PCR检测OPG/RANKL mRNA表达情况
将MC3T3-E1细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔1ml细胞悬液。待细胞长到约有90％汇合度时，弃去原培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)药液，每孔各1ml。培养72h后，提取总RNA，检测OPG、RANKL的mRNA的表达情况，以β-actin作为内参对照。
④Von Kossa矿化结节
将MC3T3-E1细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔1ml细胞悬液。待细胞长成细胞单层后，弃去原培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)，每孔1ml。培养72h后，弃去原培养液，加入条件培养液(含有50μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠的DMEM细胞培养液)，每孔3ml。继续培养17d，期间2～3d换液一次。弃去原培养液，用PBS洗两次，然后进行染色。在显微镜下观察矿化结节产生的情况并进行拍照。
2、实验结果：
①细胞增殖功能检测
CCK-8测定结果表明Asp可以剂量、时间依赖性地促进MC3T3-E1细胞增殖，与空白组相比有明显的统计学差异(图1，P<0.01或P<0.05)。Asp作用24h与空白组比较，各浓度均无明显的促增殖作用(图1，P>0.05)；但是作用48h、72h后，Asp(5μM、10μM和20μM)对MC3T3-E1细胞有明显的促增殖作用(图1，P<0.01或P<0.05)。
②ALP活性检测
经条件培养7d后，再用不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)作用于MC3T3-E1细胞24h、48h、72h，提取总蛋白检测ALP活性。实验结果表明：不同浓度Asp作用细胞24h后，ALP活性没有明显变化；作用48h后，与空白组比较，只有20μM的Asp可以显著增加ALP活性(图2，P<0.05)；作用72h后，5μM、10μM和20μM的Asp可以剂量依赖性的增加ALP活性，与空白组比较有明显的统计学差异(图2，P<0.01或P<0.05)。
③OPG/RANKL mRNA表达的检测
MC3T3-E1细胞，经过Asp作用72h后，提取总RNA，通过Real time RT-PCR检测OPG和RANKL mRNA的表达情况，并计算OPG/RANKL的比值。实验结果表明：Asp(5μM、10μM和20μM)不仅可以剂量依赖性的下调RANKL mRNA的表达水平(图3b，P<0.01或P<0.05)，同时还能够剂量依赖性的上调OPG mRNA的表达水平(图3a，P<0.01或P<0.05)。与空白相比较，10μM和20μM的Asp可以显著地增加OPG/RANKL的比值(图3c，P<0.01)。
④Asp对MC3T3-E1细胞矿化情况的影响
Von Kossa染色后，可以在镜下观察到黑色的矿化结节(图4)。MC3T3-E1细胞经过Asp处理后，矿化结节的数量及面积与空白组相比都有增加的趋势，与对照组相比10μM和20μM的Asp可以显著地促进矿化结节的产生。表明：10μM和20μM的Asp能够促进钙盐的沉积，使MC3T3-E1细胞的矿化能力增强，从而使矿化结节产生的数量及面积增加。
综上所述，车叶草苷可以促进MC3T3-E1细胞增殖与分化，使ALP活性增高，上调OPG/RANKL的比值，促进骨的形成以及矿化结节的生成。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.车叶草苷在制备成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗或预防骨质疏松的药物。
3.车叶草苷在制备预防骨质疏松保健食品中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述车叶草苷的浓度为5～20μM。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述车叶草苷的浓度为10～20μM。
6.一种预防或治疗骨质疏松的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以车叶草苷为活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以车叶草苷为唯一活性成分。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射制剂。
9.一种预防骨质疏松的保健食品，其特征在于，所述保健食品包含车叶草苷。
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