CN116096871A - 外膜囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及奈瑟疫苗组合物(特别是淋球菌疫苗组合物)领域以及这种组合物在医药上的用途。更具体地说，本发明涉及菌株FA1090的基因修饰的淋球菌和由此获得的外膜囊泡。本发明还提供了一种制备本发明的基因修饰的淋球菌以及包含本发明的外膜囊泡的免疫组合物和疫苗的方法。

Description

外膜囊泡
技术领域
本发明涉及基因修饰的淋球奈瑟菌和由此获得的外膜囊泡。该外膜囊泡在免疫组合物和疫苗中特别有用，例如，用于医药的疫苗。
背景技术
淋球奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是一种引起性传播感染(STI)的人类专属性病原体，淋球菌属。淋球菌疾病通常表现为生殖道、直肠、咽部或眼部的粘膜感染。
淋球奈瑟菌感染是一个相当大的全球健康问题，估计全世界每年的发病率超过1.06亿例(WHO，2018)。淋球菌是美国报告的第二大传染病(CDC 2019)，其在世界范围内的流行率似乎正在增加。例如，在过去5年中，澳大利亚的流行率增加了63％(KirbyInstitute.HIV,viral hepatitis and sexually transmissible infections inAustralia:Annual Surveillance Report 2017)，在美国，2014年至2018年期间增加了63％(CDC.Sexually Transmitted Disease Surveillance 2018)。然而，由于无症状感染很常见(发生在高达80％的受感染女性和40％的受感染男性身上)，所以对淋球菌的真正流行率并不完全了解。
如果不进行治疗，或者不进行诊断，淋球菌感染可能导致严重后果。这些后果包括子宫内膜炎、盆腔炎、泌尿生殖道脓肿、不良妊娠结局、新生儿并发症(包括失明)和不孕症。此外，感染淋球菌会增加获得和传播人类免疫缺陷病毒(HIV)的风险(Hayes R,Watson-Jones D,Celum C,van de Wijgert J,Wasserheit J.Treatment of sexuallytransmitted infections for HIV prevention:end of the road or new beginning？AIDS 2010；24:S15–26)。
淋球奈瑟菌的控制主要是基于抗生素治疗。然而，这种方法由于抗菌素抗性性(AMR)的快速和持续出现而受到影响。淋球菌已经对许多以前成功治疗感染的抗生素产生了抗性。这使得头孢类药物成为治疗淋球的最后一道防线。然而，现在已经从世界各地分离出对扩大谱系的头孢菌素(即头孢曲松和头孢克肟)具有高度抗性性的菌株(Unemo M,Jensen JS.Antimicrobial-resistant sexually transmitted infections:gonorrhoeaand Mycoplasma genitalium.Nat Rev Urol 2017；14:139–152)。
为了努力结束性传播感染流行病这一主要的公共卫生问题，世卫组织最近发布了一项全球卫生战略草案，其全球目标是到2030年将淋球菌的发病率减少90％(WHO,GlobalHealth Sector Strategy on sexually transmitted infections,2016–2021,20December 2017)。鉴于淋球菌具有发展AMR的能力，淋球菌疫苗将是长期控制淋球的关键(Edwards JL,Jennings MP,Seib KL Neisseria gonorrhoeae vaccine development:hope on the horizon？Current Opinion in Infectious Diseases:June 2018-Volume31-Issue 3-p 246-250),(Gottlieb SL,Jerse AE,et al.Advancing vaccinedevelopment for gonorrhoea and the Global STI Vaccine Roadmap.SexHealth.2019；16(5):426-432.doi:10.1071/SH19060)。
然而，迄今为止，淋球菌疫苗的开发一直具有挑战性，没有任何淋球菌特异性候选疫苗显示出临床保护。然而，最近的一项回顾性病例对照研究发现，性健康诊所的病人(15-30岁)在接种了针对脑膜炎奈瑟菌血清B组的外膜囊泡(OMV)疫苗后，淋球发病率有所下降(即交叉保护)。然而，MeNZB对淋球奈瑟菌的疗效相对较低(估计为31％)(Petousis-HarrisH,Paynter J,Morgan J,et al.Effectiveness of a Group B OMV meningococcalvaccine against gonorrhoea in New Zealand–a case control study.Lancet 2017；390:1603–1610)。
OMVs是一种复杂的外膜成分组合，由革兰氏阴性菌，如脑膜炎奈瑟菌和淋球奈瑟菌自然释放(Van Der Pol L,Stork M,Van Der Ley P.Outer membrane vesicles asplatform vaccine technology.Biotechnol J 2015；10:1689–1706)。对基于MeNZB的OMV疫苗的交叉保护的观察首次提供了证据，表明基于OMV的疫苗方法可能有效地保护受试者免受淋球菌之害。在这方面，Liu及其同事表明，用微囊白细胞介素-12加淋球菌OMV的阴道内接种可以赋予小鼠对淋球菌感染的保护(Liu Y,Hammer LA,Liu W,et al.Experimentalvaccine induces Th1-driven immune responses and resistance to Neisseriagonorrhoeae infection in a murine model.Mucosal Immunol 2017；10:1594–1608)。然而，将淋球菌OMVs作为疫苗候选物的其他尝试给出了不确定的结果。例如，一种基于淋球菌OMV的候选疫苗在诱导血清和粘膜抗体方面具有免疫原性，但在小鼠挑战研究中失败了(Freixeiro et al,A genetically modified native outer membrane vesicle vaccineadministered by a subcutaneous/intranasal route failed to accelerateclearance of gonococcus in a heterologous mouse challenge study.21stInternational Pathogenic Neisseria Conference September 23–28,2018,OralPoster Presentation Abstract OP174)。
目前仍然需要一种有效的淋球菌疫苗。本申请的发明人惊奇地发现，在背景菌株FA1090中专门生产的基因修饰淋球菌，导致了在作为疫苗菌株的效用方面具有改进的特性的淋球菌。特别是，该基因修饰淋球菌a)能够在液体培养中生长，b)与其他具有相同基因修饰的淋球菌菌株相比，能够产生高产水平的OMVs。此外，所述的基因修饰FA1090淋球菌获得的OMVs具有更好的免疫原性，例如其诱导显著的交叉杀菌抗体滴度的能力。这本身就很令人惊讶。鉴于基因组分析表明FA1090菌株的淋球奈瑟菌与超过4000个比较对象的淋球菌的基因组相比，具有基因组多样性(即外围性)，这一点尤其令人惊讶。
发明内容
本申请的发明人发现，通过生成基因修饰淋球菌，特别是在背景菌株FA1090中，他们能够生产出具有惊人特性的疫苗菌株。特别是，发明人发现，FA1090菌株的基因修饰淋球菌与其他具有相同基因修饰的淋球菌菌株相比既能转入液体培养，又能产生生产水平的OMVs。此外，从所述基因修饰FA1090淋球菌中获得的OMVs具有高度免疫原性，并能诱导出显著的交叉杀菌抗体滴度。鉴于这些临床前数据，基于本文公开的外膜囊泡的疫苗能够在预防人类的淋球菌感染和疾病方面显示出临床疗效。
因此，在第一方面，提供了一种菌株FA1090的基因修饰淋球菌，包括以下基因修饰：
a)减少或消除脂质A生物合成月桂酰基转移酶(lpxl1)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除还原修饰蛋白(rmp)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
在另一个方面，提供了一种产生淋球菌的方法，该方法包括：
a)减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌；或
b)减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌。
在另一个方面，提供了淋球菌在生产外膜囊泡中的用途。
在另一个方面，提供了一种从FA1090菌株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含降低水平或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽两者。
在另一个方面，提供了一种来自基因修饰的FA1090菌株淋球菌的外膜囊泡(OMV)，所述基因修饰的FA1090菌株淋球菌包含以下基因修饰：a)减少或消除lpxl1基因、lpxl1mRNA、和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及b)减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能，所述OMV包含：i)与来自缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，降低水平的Rmp多肽；和ii)与来自所述比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，降低水平的六乙酰化脂质A。
在另一个方面，提供了一种从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡。
在另一个方面，提供了一种包含本发明的外膜囊泡的免疫原性组合物。
在另一个方面，提供了一种疫苗，其包含本发明的外膜囊泡或本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在医药上的用途。
在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗，用于免疫受试者对抗奈瑟菌感染，例如淋球奈瑟菌感染。
在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗，用于治疗或预防由奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)引起的疾病。
在另一个方面，提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防由奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在另一个方面，提供了一种对有需要的受试者对奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)进行免疫的方法，其包括向受试者施用免疫学上有效量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在另一个方面，提供了一种提高受试者免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的免疫原性成分或本发明的疫苗。
在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制造治疗或预防奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。
在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制造治疗或预防由淋球奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。
在另一个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗的用途，本发明的方法或用途，其中至少有2个剂量的组合物被施用于受试者。
在另一个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗的用途，本发明的方法或用途，其中受试者是青少年和/或成年人。
在另一个方面，提供了用于免疫原性组合物或疫苗的用途，本发明的方法或用途，其中受试者相对于一般人群的平均风险而言，感染淋球奈瑟菌的风险增加。
在另一个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗的用途，本发明的方法或用途，其中受试者对一种或多种进一步的感染性病原体进行共同免疫。
在另一个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗的用途，本发明的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗通过肌肉注射或腹膜内施用途径施用。
附图说明
图1:按原产国划分的用于基因组分析的淋球菌分离物的频率(如实施例1所述)(*＝频率<0.5％)。有4058个淋球奈瑟菌全基因组可用于分析。
图2:淋球菌基因组的核心和非核心单核苷酸多态性(snps)系统发育，包括存在于内部集合的菌株的基因组(用符号标记)。分支长度与遗传距离成正比。确定了六个紧凑的集群，用黑色箭头突出显示。
图3:4058个淋球菌基因组的系统发育重建和群体结构，包括内部集合的菌株(NM_cgMLST_v1.0模式)。对4058个菌株的集群是由全基因组的分型来定义的。
图4:用Silhouette参数优化来确定淋球菌群体的最佳分区数。全基因组的变异性表明，分离物分为24个不同的集群。
图5:根据全基因组分析，中心性定义为每个菌株与其他菌株的平均距离。根据1605个基因座的NM_cgMLST_v1.0等位基因变异，每个菌株与其他所有菌株的系统发育平均距离('中心性')。
图6A、图6B和图6C：突变体一代的对照示意图。为了检查双同源重组的发生和突变体克隆的产生，设计了一对位于缺失区外的引物，如图所示(图6A)。用专门与野生型基因组配对而不是与突变体配对的引物(图6C)研究了混合在突变体总群体中的野生型细胞(图6B)。
图7：FA1090Δlpxl1克隆的PCR外部检查的琼脂糖凝胶。用重组事件外部引物进行PCR，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离。水被用来作为PCR反应的阴性对照。1kb加梯子被用作标志物。箭头表示基因敲除(KO)突变体和野生型(WT)菌株的预期条带。
图8:FA1090ΔlpxL1克隆的PCR内部检查的琼脂糖凝胶。用野生型群体的特异引物进行PCR，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离。一个条带的存在与群体中残留的野生型细胞相关。水被用来作为PCR反应的阴性对照。1kb加梯子被用作标志物。
图9A：使用MALDI-TOF，从参考批次FA1090中纯化的脂质A的结构和其质谱图。记录的光谱显示未修饰的六乙酰化脂质A：最高峰对应于MPLA形式，第二峰对应于BPLA形式。脂质的MALDI-TOF图谱。
图9B：对应于从基因修饰FA1090Δlpxl1中纯化的五乙酰化形式的脂质A的结构和其使用MALDI-TOF的质谱图。当与图9A的光谱相比，每个相应的峰(MPLA和BPLA)之间的质量差异为182Da，这是月桂酸链的质量。两个光谱中都有一个m/z 1572的信号，对应于一个未识别的脂质。
图10：FA1090Δlpxl1,Δrmp克隆的PCR外部检查的琼脂糖凝胶。用重组事件外部引物进行PCR，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离。野生型菌株的DNA裂解液和基因组DNA(gDNA)都被用作PCR反应的阳性对照，并作为与突变体克隆的比较。水被用来作为PCR反应的阴性对照。1kb加梯子被用作标志物。箭头表示基因敲除(KO)突变体和野生型(WT)菌株的预期条带。
图11：FA1090ΔlpxL1Δrmp克隆的PCR内部检查的琼脂糖凝胶。用原始群体的特异性引物进行PCR(在这种情况下，FA1090ΔlpxL1产生2KO突变体的细胞)，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分离。一个条带的存在与群体中残留的原始细胞的存在相关。1kb加梯子被用作标志物。
图12：从未经修饰的FA1090分离物中提取的lpxL1的基因座。
图13：从FA1090Δlpxl1,Δrmp菌株中提取的lpxL1基因座。
图14：从未经修饰的FA1090分离物中提取的rmp基因座。
图15：从FA1090Δlpxl1,Δrmp菌株中提取的rmp基因座。
图16：从野生型FA1090、Δlpxl1 FA1090(1KO)和ΔLpxl1,Δrmp(2KO)FA1090获得的OMVs的SDS-PAGE模式。鉴定了迁移的表观分子量为～28kDa的条带的蛋白质含量。
图17：中心性定义为各菌株相互间的平均距离。根据59个蛋白基因座的等位基因变化，每个菌株与其他所有菌株的系统发育平均距离("中心性")。
图18：WT和突变体FA1090的OMV对TLR4的激活。用来自野生型(WT)FA1090的OMV或来自FA1090Δlpxl1(或1KO)突变体(#GMMA2)和FA1090Δlpxl1,Δrmp(或2KO)突变体(#GMMA3)的OMV的不同浓度(基于蛋白质)体外刺激HEK293-NF-kBluc/hTLR4细胞。然后裂解细胞，并对TLR4介导的NF-kB激活进行量化，测量荧光素酶的诱导发光。细胞激活以相对于培养基处理的细胞的诱导倍数表示。
图19：六个双突变体淋球菌(Δlpxl1,Δrmp)在两种测试的培养基制剂中的生长概况。在16小时内监测生长情况，并根据在600nm处测量的光密度(OD)进行测量。
图20A:显示在两种生长培养基中的六个2KO淋球菌(Δlpxl1,Δrmp)的OMV体积生产力。对于每个样品，荧光都是在添加和不添加染料的情况下记录的，不添加染料的上清液的背景荧光从染料处理的样品值中被减去。也减去了只有培养基的空白。显示培养上清液中的OMV浓度(单位：mg/L)，通过标准曲线的数值推断进行评估。数据被报告为每个菌株和生长条件的两个生物重复的平均值。
图20B：图20A的结果归一化为每个菌株在每个条件下达到的600nm波长的不同光密度(OD600nm)，以比较特定的生产力。
图21：从双突变体FA1090(Δlpxl1,Δrmp)和双突变体F62(Δlpxl1,Δrmp)中获得的OMVs(此处称为GMMA)的免疫原性。7周大的CD1雌性小鼠用FA1090 2KO或F62 2KO的OMVs配制于明矾或只用明矾进行两次IP免疫，间隔时间为4周。在第二次免疫后两周收集的血清中，用人血清作为补体来源，通过hSBA测定针对所述菌株的功能抗体。
图22A、图22B和图22C：显示了血清稀释液的FA1090(图22A)、SK920679(图22B)和WHO-M(图22C)菌株的细菌粘附抑制(BAI)结果，这些血清来自7周大的CD1雌性小鼠，这些小鼠在两次单独的实验中用从FA1090双突变体(Δlpxl1,Δrmp，图中标记为"dd")获得的OMV(其中称为GMMA)进行两次IP免疫，间隔4周。OMV是在明矾中配制的，仅有明矾的对照也作为阴性对照进行了测试。通过BAI对指定菌株(FA1090(图22A)、SK92-679(图22B)和WHO-M(图22C))的功能抗体进行测定。"dd"＝delta,delta即FA1090ΔΔ(指双突变体Δlpxl1,Δrmp)。
图23：FA1090Δlpxl1,Δrmp(2KO)的OMV(在此称为GMMA)不诱发抗rmp抗体。用在明矾中配制的FA1090Δlpxl1(单突变体)或FA1090Δlpxl1,Δrmp(双突变体)的OMVs对7周大的CD1雌性小鼠进行两次IP免疫，每次间隔4周，在第二次免疫之后，用基于Luminex的免疫测定法对汇集的血清进行抗rmp IgG测定。
图24：用Alum、Bexsero或7个FA1090 2KO OMV疫苗批次(TRD4-TRD10)免疫的CD1小鼠的4wp2和2wp3血清上测得的针对FA1090同源株的hSBA滴度。条形图代表两个独立实验的平均滴度。圆点代表单个滴度。
图25A：用明矾、Bexsero或FA1090 2KO OMV疫苗批次TRD4、TRD5和TRD9免疫的CD1小鼠的个别血清中，测量针对所述淋球菌菌株的个体hSBA滴度。数据与GMT(95％CI)一起报告。
图25B和图25C：hSBA GMR(95％CI)显示FA1090 2KO OMV疫苗批次TRD4、TRD5和TRD9的滴度比明矾(图25B)和Bexsero(图25C)在11个测试菌株中至少有9个具有优势。
图26：用Luminex测定来自指定免疫小鼠组的血清中的抗OMV IgG。报告了所有7批FA1090 2KO OMV疫苗的IgG滴度和Bexsero滴度。虚线表示定量的下限，LLOQ＝329。
图27A：用Luminex测定来自指定免疫的个体小鼠血清中的抗OMV IgG。报告了单个滴度和GMT以及95％CI。
图27B：用Luminex测定了来自指定免疫的个体小鼠血清中的抗OMV IgG。报告了来自不同FA1090 2KO OMV批次的滴度和Bexsero滴度的GMR与95％的上限和下限。
图28A：用Luminex测定了来自指定免疫的个体小鼠阴道洗液中的抗OMV IgG。报告了单个滴度和GMT以及95％CI。
图28B：用Luminex测定了来自指定免疫的个体小鼠阴道洗液中的抗OMV IgG。报告了来自不同批次FA1090 2KO OMV疫苗和Bexsero滴度或Alum滴度的GMR及95％CI的上限和下限。
图29A：用Luminex测定了来自指定免疫的个体小鼠的阴道洗液中的抗OMV IgA。报告了个体滴度和GMT以及95％CI。
图29B：用Luminex测定指定免疫的个体小鼠阴道洗液中的抗OMV IgA。报告了来自不同FA1090 2KO OMV疫苗批次的滴度和Bexsero滴度或Alum滴度的GMR及95％CI的上限和下限。
图30：淋球菌的全球PorB系统发育情况。
图31：FA1090 2KO和GC_0817560PorB的比对与胞外环(1-8)的识别和多样性。
图32：不同菌株中呈现相变ON opaB基因序列的细菌比例。报告了在一个(FA1090WT和GC_0817560菌株)或多个(FA1090 2KO和其他菌株)样品中预测为相变ON的细菌的比例。
具体实施方式
术语
为了便于审查本公开的各种实施方式，提供了以下术语的解释。其他术语和解释将在本公开内容的范围内提供。
除非本文另有解释或定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属行业的普通技术人员通常理解的含义相同。例如，分子生物学中常用术语的定义可以在Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),TheEncyclopaedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；and Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
所有参考文献，包括在本专利说明书中引用的专利和或专利申请的出版物都通过引用并入本文。
如本文所用，用斜体字表示的基因标识符指的是基因或其mRNA(例如，lpxl1指的是lpxl1基因)。在此，非斜体的基因标识符指的是蛋白质或多肽(例如，lpxl1指的是lpxl1蛋白)。如本文所用，"lpxl1基因mRNA和/或多肽"是指"lpxl1基因mRNA和/或lpxl1多肽"。如本文所用，"rmp基因mRNA和/或多肽"是指"lpxl1基因mRNA和/或rmp多肽"。缩写WT对应于"野生型"。
提到"脂寡糖"(或LOS)也可称为"脂多糖"(或LPS)。
氨基酸是指选自以下的氨基酸：丙氨酸(ala，A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，蛋氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)，缬氨酸(val，V)。
本文所用的"受试者"是动物，最好是哺乳动物，包括人类、非人类灵长类动物和非灵长类哺乳动物，如啮齿动物属(包括但不限于小鼠和大鼠)、Cavia属(包括但不限于豚鼠)和Lagomorpha目(包括但不限于兔子)的成员。如本文所用，受试者最优选为人类。
如本文所用，"免疫应答“是指在分子、细胞或组织水平(即在生物组织的任何水平)上发生的对抗原的反应事件序列。在本公开的背景下，"免疫应答"可以是对抗原(如细菌、病毒、真菌等表面的抗原)或对存在于OMV表面的抗原或以免疫原片段、免疫原组合物或疫苗形式存在的抗原所发生的细胞(细胞介导)和/或体液(抗体介导)事件的序列。如本文所用，"免疫原性"是指抗原引起免疫应答的能力。
如本文所用，"佐剂"是指一种化合物或物质(或化合物或物质的组合)，当与抗原或多个抗原一起施用受试者时，例如作为免疫原性组合物或疫苗的一部分，增加或增强受试者对所施用抗原或多个抗原的免疫应答(与没有佐剂时得到的免疫应答相比)。就本公开内容而言，与外膜囊泡一起施用受试者的佐剂增加或增强了受试者对存在于OMV表面的抗原或抗原的免疫应答。
本文所用的术语"保护"在奈瑟菌(尤其是淋球奈瑟菌)引起的感染、疾病或病症方面是指通过预防进行保护。例如，保护可涉及减少由奈瑟菌引起的感染、疾病或病症的发生率(在有症状和无症状状态下)，从而控制疾病和/或控制由奈瑟菌引起的相关生殖健康不良后果。保护可能会导致临床就诊次数的减少。术语保护(protect/protection)在此可用于防止奈瑟菌的初级感染，即预防急性疾病(宫颈炎和尿道炎)、减少抗微生物的影响、与淋球菌有关的HIV感染和由于所述感染而发生的长期生殖并发症。可以实现对不同解剖部位(泌尿生殖器、肛门、口咽)的致病淋球菌感染的保护。如本文所使用的术语"预防"是指，由于加强了保护，由淋球奈瑟菌引起的疾病或病症基本上被避免了，从而改善了人口健康状况。
如本文所使用的术语"治疗"在由奈瑟菌(特别是淋球奈瑟菌)引起的感染、疾病或病症的背景下，是指在感染后通过施用治疗任何淋球菌引起的症状、效应或表型。治疗可以是指降低受试者的病情或疾病症状的严重程度或频率，减缓或消除病情的发展和/或完全或部分消除受试者的疾病或病情的症状。淋球奈瑟菌引起的感染、疾病或病症的治疗包括改善、稳定、减少或消除淋球奈瑟菌对人类造成的症状、影响或表型。淋球奈瑟菌引起的感染、疾病或病症的治疗也可包括清除或杀死细菌。
本文所用的术语"基因修饰"是指对细胞中遗传物质的构成、结构或操作的任何改变，以提供特定的效果(如减少或消除表达)。技术人员知道有许多方法可以减少或消除基因和/或蛋白质的表达，与未修改的(如自然发生的细菌)或包含感兴趣的野生型基因的细菌相比。细胞内的遗传物质与DNA或RNA有关。因此，本文所用的基因修饰一词是指对淋球菌DNA或RNA的构成、结构或操作的任何人为改变，从而减少和/或消除特定基因的表达和/或功能。在此，"基因修饰"在淋球菌方面指的是人工改变其遗传物质的淋球菌。基因修饰淋球菌不包括野生型淋球菌。基因修饰淋球菌包括例如被引入外源多核苷酸的淋球菌。基因修饰淋球菌还指经过基因操作的细菌，其内源性核苷酸被改变以包括突变，如缺失、插入、替换或其组合。例如，一个内源性的编码和/或非编码区域可以被缺失或替换。这种基因修饰可能导致多肽的表达减少和/或消除，和/或可能导致多肽具有与内源多核苷酸编码不同的氨基酸序列。基因修饰淋球菌的另一个实例是具有改变的调控序列，如启动子，以导致可操作连接的内源性编码区的表达增加或减少。
如本文所使用的术语"基因缺失"或"基因敲除"是指有可能使特定基因无法操作或不活跃的遗传技术组合。在一些实施方式中，基因缺失会减少或消除来自该基因的多肽的表达。在一些实施方式中，mRNA和蛋白质都被减少或消除了。在某些实施方式中，基因的表达大大减少或消除。大幅减少是指与基因的内源表达水平相比，基因的表达至少减少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。在一个特定的实施方式中，一个基因的表达被消除了。消除的意思是，使用技术监测从基因转录的mRNA的表达，或从特定mRNA翻译的蛋白质的表达，没有观察到检测水平。基因的表达可以通过合适的技术来确定(例如，通过RT/Q-PCR测量转录物水平或通过免疫测定如Western Blot测量表达蛋白水平)。这种技术是本领域技术人员已知的。基因缺失或基因敲除，不仅可以包括基因元件的缺失，还可以包括添加、替换或修改，从而使基因无法操作或不活跃，即插入基因序列可能导致基因的错误翻译，例如，通过加入早期停止密码子，或导致错义翻译。例如，基因可以通过同源重组等方式用不同的异源基因(如抗生素抗性基因)替换基因或所述基因的片段而被缺失。
在此使用的"Δ"符号指的是细菌菌株，其中"Δ"符号后的基因序列已被缺失/敲除，符合"基因缺失"或"基因敲除"的定义。
本文所用的术语"外膜囊泡"或"OMV"是指通过破坏革兰氏阴性菌的外膜或从外膜上剥离而获得的蛋白脂质囊泡，从而形成保留外膜抗原的囊泡。革兰氏阴性细菌自然脱落的OMVs被释放到生长培养基中。异源抗原在革兰氏阴性菌中表达，使其在膜中聚集，然后释放到培养上清液中。来自这种细菌的OMV是外膜和周质细菌区间的代表，并允许以其自然组成和结构呈现膜蛋白。在最广泛的意义上，OMVs涉及到任何这样的蛋白脂质体囊泡。然而，术语OMVs包括"原生OMVs"(nOMVs)、微囊泡(MVs)、去污剂提取的OMVs(DOMVs)和blebs，其是在作为MVs释放之前仍然附着于细菌外膜突起。所有这些构成了本发明的一部分，在此统称为OMVs，除非另有特别提及。在本发明的一个优选实施方式中，OMVs是nOMVs。如本文所用，术语外膜囊泡或OMVs也可称为GMMA。
如本文所使用的术语"同源"是指具有基本相同基因组的两个单独的生物体。在一个实施方式中，同源性是指具有相同基因组的两个单独的生物体。在本公开的背景下，两个生物体可以是同源的，但特定的基因修饰除外。
如本文所使用的术语"异源基因序列"是指与参考生物体有关的非自然发生的核苷酸序列(例如基因序列或基因序列的一部分)。在本发明的背景下，异源基因序列是指在淋球菌FA1090菌株的基因组中不自然存在的序列。
在这里，术语"基因组重组"是指两个多核苷酸之间的遗传信息交换过程。对于基因缺失/敲除的目的，同源重组涉及创建一个含有抗生素抗性标志物的DNA构建体，以取代所需的敲除基因。该构建体还包含一个与目标序列同源的基因序列。这种方法依赖于细胞的修复机制，将DNA构建体重组到现有的DNA中。这导致内源性基因的序列被改变。
如本文所使用的术语"免疫原性组合物"是指适合给人类或动物受试者(如在实验或临床环境中)服用的物质组合物，它能够引起特定的免疫应答，如针对病原体，如奈瑟菌。因此，一种免疫原性组合物包括一个或多个抗原(例如多肽抗原)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包括一种或多种能够激发或增强免疫应答的额外成分，如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，免疫原性组合物被施用以引起免疫应答，从而完全或部分地保护受试者免受病原体诱发的症状或状况的影响。在本公开内容中，术语免疫原性组合物将被理解为包括用于向受试者或受试者群体施用的组合物，其目的是引起对奈瑟菌的保护性暴露前免疫应答或对奈瑟菌的缓解性暴露后免疫应答。
所谓"免疫学上的有效量"，是指对一个人施用该量，无论是单剂量还是作为系列的一部分，对治疗、保护或预防是有效的。施用免疫学上有效的剂量可引起免疫应答，包括保护性免疫应答。这一剂量可根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(如非人类灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配方、治疗医生对医疗情况的评估以及其他相关因素而有所不同。预计该量将落在一个相对宽泛的范围内。
如本文所使用的术语"药学上可接受的"是指参考物适合于给受试者(例如，人类或动物受试者)服用。Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition 25(1975),描述了适合于治疗和/或预防组合物的药物输送的组合物和配方(包括稀释剂)，包括免疫性组合物。
如本文所使用的术语"抗体"在最广泛的意义上是指具有免疫球蛋白样结构域(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的分子，包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人类、人源化、多特异性抗体，包括双特异性抗体和异构抗体；单一可变域(例如，VH，VHH，VL，结构域抗体(dAbTM))，抗原结合抗体片段，Fab，F(ab')2，Fv，二硫化物连接的Fv，单链Fv，二硫化物连接的scFv，diabodies，TANDABSTM等，以及上述任何形式的改良版本(关于其他"抗体"形式的概述，见[Holliger P,Hudson PJ.Engineered antibody fragments and the rise ofsingle domains.Nat Biotechnol.2005；23(9):1126-36])。替代性抗体形式包括替代性支架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以被安排在一个合适的非免疫球蛋白支架或骨架上，如affibody、SpA支架、LDL受体A类结构域、avimer或EGF结构域。
"序列同一性"可以通过MPSRCH程序(Oxford Molecular)中实现的SmithWaterman同源搜索算法来确定，使用参数空缺开放惩罚＝12和空缺扩展惩罚＝1的仿生空缺搜索，但最好是通过Needleman-Wunsch全局排列算法来确定(见例如Rubin(2000)Pediatric.Clin.North Am.47:269-285)，使用默认参数(例如，使用EBLOSUM62计分矩阵，空缺开放惩罚＝10.0，空缺扩展惩罚＝0.5)。这种算法在EMBOSS软件包的针状工具中得到了方便的实现。在应用中提到与某一特定SEQ ID的序列同一性时，该同一性是指对该SEQID的整个长度进行计算。
淋球菌
在第一方面，本发明提供了一种菌株FA1090的基因修饰淋球菌，包括基因修饰，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除脂质A生物合成月桂酰基转移酶(lpxl1)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除还原修饰蛋白(rmp)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
在一个实施方式中，然后引入基因修饰的起始生物体是基本上或完全未修饰的FA1090菌株的淋球菌。因此，本发明提供了一种基因修饰的淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，其中未修饰的淋球菌是FA1090菌株淋球菌。
在一个实施方式中，然后引入本发明的基因修饰的起始生物体是FA1090菌株的淋球菌，它不包括对其lpxl1和/或rmp基因的基因修饰。因此，本发明提供了一种基因修饰淋球菌，它包括以下的基因修饰。
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，其中未修饰的淋球菌是包含野生型lpxl1和rmp基因的FA1090菌株淋球菌。
在一个实施方式中，提供了一种包含修饰的淋球菌菌株FA1090，与缺乏所述修饰的淋球菌菌株FA1090中的功能性Lpxl1和功能性Rmp相比，其至少：降低脂质A生物合成月桂酰基转移酶(Lpxl1)的总活性和降低功能性还原修饰蛋白(Rmp)。
FA1090菌株的淋球菌在本领域中是已知的。淋球菌的FA1090菌株(porin血清型PIB-3菌株)最初是从一个可能有播散性淋球菌感染的病人的宫颈内口分离出来的[Nachamkin I,Cannon JG,Mittler RS.Infect Immun.1981May；32(2):641-8].FA1090淋球菌可从American Type Culture Collection(ATCC，例如，见保存号#700825，1081University Blvd,Manassas,Virginia 20110,US)获得，FA1090基因组序列可从GenBank公开获得(登录号：AE004969.1)。
虽然在本领域可以理解，由于自然变异，FA1090菌株可能略有不同(例如在不同的实验室之间)，但技术人员将了解确定一个给定的淋球菌是否是FA1090菌株的方法。例如，本领域的技术人员知道对淋球菌基因组进行测序的方法(例如使用实施例9中描述的方法)，并将基因组与已知的FA1090菌株的基因组进行比对，例如GenBank登录号AE004969.1中列出的FA1090的基因组。所述比对，将为技术人员提供与GenBank登录号AE004969.1中规定的基因组相比的序列同一性水平。如果所示序列同一性水平高于95％，高于97％或高于99％，技术人员可以推断所述淋球菌是FA1090菌株淋球菌。
在一个实施方式中，引入基因修饰的FA1090淋球菌是一种与GenBank登录AE004969.1(日期为2015年7月1日)中所示的FA1090淋球菌基因组至少有80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的淋球菌。在一个实施方式中，引入基因修饰的FA1090淋球菌是一种淋球菌与GenBank登录AE004969.1(日期为2015年7月1日)所示的FA1090淋球菌基因组有99.97％的同一性，如使用在[Lee I,Ouk Kim Y,Park SC,Chun J.OrthoANI:Animproved algorithm and software for calculating average nucleotideidentity.Int J Syst Evol Microbiol.2016；66(2):1100-1103]中描述的OrthoANI算法计算。在一个实施方式中，未修饰的淋球菌是FA1090菌株淋球菌，其与GenBank登录AE004969.1(日期为2015年7月1日)中所示的FA1090淋球菌基因组至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一个实施方式中，未修饰的淋球菌是FA1090菌株淋球菌，它与GenBank登录AE004969.1(日期为2015年7月1日)中所示的FA1090淋球菌基因组有99.97％的同一性，使用[Lee I,Ouk Kim Y,Park SC,Chun J.OrthoANI:An improvedalgorithm and software for calculating average nucleotide identity.Int J SystEvol Microbiol.2016；66(2):1100-1103.]描述的OrthoANI算法计算。
在一个实施方式中，引入基因修饰的FA1090淋球菌(即未修饰的淋球菌)是FA1090菌株淋球菌，包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的序列。在所述实施方式中，包括与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的序列的FA1090淋球菌保留了功能性Lpxl1和Rmp蛋白。在一个实施方式中，引入基因修饰的FA1090淋球菌(即未修饰的淋球菌)是包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的FA1090菌株淋球菌。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种菌株FA1090的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，其中减少或消除的表达和/或功能是与包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株FA1090的淋球菌相比。
在一个实施方式中，包括野生型lpxl1和rmp的FA1090菌株的淋球菌是未修饰的FA1090菌株淋球菌。这种菌株的一个实例可以是可从ATCC(#700825)获得的FA1090菌株淋球菌。
在一个实施方式中，lpxl1基因包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少80％相同的序列，rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少80％相同的序列。
在一个实施方式中，lpxl1基因包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。lpxl1基因(也称为msbB)编码多肽脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶(Lpxl1)。Lpxl1在脂质A的生物合成中起作用。基因修饰以提供降低或不可检测的功能性lpxl1编码的蛋白的奈瑟微生物产生内毒素减少的OMV。这是因为脂质A酰化的数量和酰化的性质是影响LOS毒性的主要因素[Makda Fisseha et al.Infection andImmunityJun 2005,73(7)4070-4080]。Lpxl1(多肽)也可被称为Lpxl1酶。
在一个实施方式中，rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。rmp基因编码多肽还原可修饰蛋白(Rmp)。
在一个实施方式中，lpxl1基因包含与SEQ ID NO:3中所示序列至少90％相同的序列，rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％相同的序列。在一个实施方式中，lpxl1基因包含SEQ ID NO3，rmp基因包含SEQ ID NO:1。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除Rmp多肽的表达和/或功能。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)减少或消除Lpxl1多肽的表达；和
b)减少或消除Rmp多肽的表达。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a)消除Lpxl1多肽的表达；和
b)消除Rmp多肽的表达。
在一个实施方式中，Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，Rmp多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4中所示序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，Rmp多肽包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列，Rmp多肽包含与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，Lpxl1多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，Rmp多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与未修饰的(如野生型)淋球菌中的Lpxl1多肽的表达相比，本发明的淋球菌表达的Lpxl1多肽低于10％、低于5％或低于1％，以及与未修饰(如野生型)淋球菌FA1090菌株中的Rmp多肽的表达相比，本发明的淋球菌表达的Rmp多肽低于10％、低于5％或低于1％。在一个实施方式中，与包含野生型lpxl1基因的淋球菌FA1090菌株中Lpxl1多肽的表达相比，本发明的淋球菌细菌表达的Lpxl1多肽低于10％，低于5％或低于1％，与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株中Rmp多肽的表达相比，本发明的淋球菌细菌表达的Rmp多肽低于10％，低于5％或低于1％。
在一个实施方式中，与未修饰的(野生型)淋球菌FA1090菌株中的Lpxl1多肽的水平相比，本发明的淋球菌表达最小水平的Lpxl1多肽；与未修饰的(野生型)淋球菌FA1090菌株中的Rmp多肽的水平相比，本发明的淋球菌表达最小水平的Rmp多肽。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌不表达Lpxl1多肽或Rmp多肽。在一个实施方式中，本发明的淋球菌不能以例如通过免疫测定的可检测水平表达Lpxl1和/或Rmp多肽。在一个实施方式中，本发明的淋球菌不能以如通过Western Blot或ELISA测定可检测水平表达Lpxl1和/或Rmp多肽。
在本公开内容的背景下，"表达减少"是指与未修饰的(野生型)淋球菌FA1090菌株或包含野生型lpxl1/rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比，本发明的淋球菌细菌表达较少的lpxl1和rmp mRNA和/或Lpxl1和Rmp蛋白。当与未修饰的(野生型)淋球菌FA1090菌株或包含野生型lpxl1/rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比，观察到mRNA和/或蛋白质表达的任何减少时，可认为表达量下降。当与未修饰的(野生型)淋球菌FA1090菌株或包含野生型lpxl1/rmp基因的淋球菌FA1090菌株中的mRNA和/或蛋白表达相比，观察到mRNA和/或蛋白表达分别减少5％以上、10％以上、25％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上时，可认为表达量下降。在本公开内容的背景下，"消除表达"是指在本发明的淋球菌中，使用技术人员用于测量表达的技术，不能检测到Lpxl1 mRNA和/或蛋白以及Rmp mRNA和/或蛋白。
lpxl1和rmp基因的表达水平可以使用技术人员熟知的技术来测量，例如使用基于聚合酶链反应(PCR)的技术(例如使用Q/RT-PCR)。Lpxl1和Rmp多肽的表达水平可以用技术人员熟知的技术来测量。例如，Lpxl1和Rmp多肽的表达水平可以用Western Blotting或ELISA来测量。Rmp多肽的表达水平可以用SDS-PAGE和LC/MS-MS测量，例如使用基本如实施例11中所述的技术。
基因修饰可以减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。因此，所述基因修饰可导致Lpxl1多肽的保留表达，但其中多肽是无功能的。Lpxl1的功能可以通过检查外膜囊泡脂寡糖的脂质A成分的五乙酰化程度(例如使用实施例6所述的方法)而不是六乙酰化来确定。如果基因修饰淋球菌包括减少或消除Lpxl1蛋白功能的基因修饰，则脂质A将是五乙酰化的(例如它将至少80％，至少90％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％；或100％五乙酰化)，尽管有证据表明存在Lpxl1 mRNA和/或蛋白质。
在一个实施方式中，Lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除导致FA1090菌株淋球菌包含五乙酰化脂质A与六乙酰化脂质A的比率为50:50至99:1(其中与总脂质A相比，五乙酰化脂质A的百分比为50％至100％)。
在一个实施方式中，Lpxl1多肽的表达和/或功能的降低或消除导致脂质A的五乙酰化，任选地，其中脂质A的酰化是通过基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF)光谱法测定的。在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌包含具有五乙酰化脂质A的脂寡糖(LOS)。脂质A的酰化可以例如通过提取脂质A然后通过MADI-TOF光谱分析来确定，例如基本上如实施例6中所述。具体而言，Lpxl1多肽的表达减少或消除，导致脂质低聚糖(LOS)包含缺乏月桂酸的脂质A，如果LpxL1有功能表达的话，它就会加入月桂酸。减少或消除Lpxl1多肽的表达和/或功能会导致LOS包含自脂质A的GlcN二糖的非还原端缺乏次级月桂酰基链的脂质A。Lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除导致LOS包含缺乏C12酰氧基酰基链的脂质A(从非还原端)。减少或消除Lpxl1多肽的表达和/或功能会导致LOS包含在β-(1->6)D-葡糖胺二聚体的远端非还原端葡糖胺的二级2'-O-位上缺乏月桂酸的脂质A(因此，在脂质A的远端葡糖胺上存在单独的3-羟基肉豆蔻酰分子的酰胺连接)。
在一个实施方式中，lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除导致脂质A的五乙酰化超过50％，例如超过60％，超过70％，超过80％，超过90％，超过95％或超过99％。在一个实施方式中，减少或消除Lpxl1多肽的表达和/或功能导致脂质A的100％五乙酰化。在一个实施方式中，与包含野生型lpxl1基因的FA1090菌株淋球菌相比，本发明的基因修饰的淋球菌具有降低的激活Toll样受体4(TLR4)的能力。
类似地，所述基因修饰可减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。因此，所述基因修饰可导致保留Rmp多肽的表达，但其中的多肽是无功能的。Rmp的功能可以通过检查淋球菌出泡(bleb)的程度来确定。如果基因修饰淋球菌包含减少或消除Rmp蛋白功能的基因修饰，尽管有证据表明rmp mRNA和/或Rmp蛋白的存在，与包含野生型rmp基因的淋球菌相比，淋球菌可能是"高度出泡"。因此，在一些实施方式中，可以测试基因修饰FA1090与来自包含野生型rmp基因的淋球菌的相同量度相比，是否产生更多的OMV(例如，菌株是否高度出泡)，即通过比较从一个菌株获得的OMV产量与另一个菌株的OMV产量(使用相同的OMV出泡方案)。例如，这种方法例如以下公开[Maharjan et al.(2016).Dissection ofthe function of the RmpM periplasmic protein from Neisseriameningtidis.Microbiology,162(),364-375]。这样一个实验的实例可以在实施例18中找到。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰FA1090淋球菌(FA1090双突变体ΔLpxl1，Δrmp)与对比者菌株例如GC_0817560相比，显示出改进的OMV生产力(就OMV生产力相对于单突变体ΔLpxl1的增加而言)。
在一个实施方式中，Rmp多肽的表达和/或功能的降低或消除导致淋球菌与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株的出泡相比是高度出泡的。因此，相对于其相应的野生型菌株(或包含野生型rmp基因的菌株)，本公开的淋球菌是高度出泡的，即它们向其培养基中释放的出泡量比野生型菌株或包含野生型rmp基因的菌株大。在一个实施方式中，Rmp多肽的表达和/或功能的减少或消除导致淋球菌与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比多出泡10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的OMVs。在一个实施方式中，Rmp多肽的表达和/或功能的减少或消除导致淋球菌与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比多出泡80％至120％的OMV。在一个实施方式中，包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株包含与SEQ ID NO:1至少90％、95％或100％相同的序列。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌细菌包含基因修饰，其中基因修饰由以下组成或包含：
a)破坏或确实内源性的lpxl1和rmp基因；或
b)在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中抑制lpxl1和rmp多肽的表达。
在一个实施方式中，本发明的基因修饰的淋球菌是通过a)破坏或确实内源性lpxl1和rmp基因；或b)在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中抑制Lpxl1和Rmp多肽的表达而产生的。
在一个实施方式中，基因修饰(即减少或消除lpxl1和rmp的表达和/或功能)是通过抑制包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中Lpxl1和Rmp多肽的表达而实现的。在所述实施方式中，FA1090淋球菌菌株包含野生型(即未修饰的)lpxl1和rmp基因序列，对该细菌进行的所述基因修饰导致Lpxl1和Rmp蛋白的表达减少或消除。在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中抑制Lpxl1和Rmp蛋白表达的技术包括例如反义抑制和抑制性RNA(即小干扰RNA[siRNA]、微RNA[miRNA]、短发夹RNA[shRNA]等)，尽管这些技术更通常用于真核生物宿主。在获得的细菌中，编码被抑制的蛋白质的mRNA将基本不存在和/或其翻译将被基本抑制(例如，在没有抑制的情况下会看到表达水平的低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于25％、低于15％、低于10％、低于5％或低于1％)。在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中，对Lpxl1和Rmp蛋白表达的抑制是与未被修饰以抑制Lpxl1和Rmp蛋白表达的菌株相比较而测量的。
然而，最好是破坏或缺失内源性的lpxl1和rmp基因。因此，在一个实施方式中，基因修饰包括或包括破坏和/或缺失内源性lpxl1和rmp基因。
当基因修饰涉及破坏内源性lpxl1和rmp基因时，这可能导致Lpxl1和/或Rmp蛋白的表达减少或消除，例如如果所述破坏是对启动子区域的破坏。然而，内源性lpxl1和/或rmp基因的破坏可能导致突变体Lpxl1和/或Rmp蛋白的表达，例如具有与野生型Lpxl1和/或Rmp蛋白不同氨基酸序列的Lpxl1和/或Rmp蛋白。在一个实施方式中，对内源性Lpxl1和/或Rmp的破坏导致表达无功能的Lpxl1和/或Rmp多肽。
在一个实施方式中，对内源性lpxl1和/或rmp基因的破坏包括对内源性lpxl1和/或rmp基因序列的添加、缺失或替换。“添加"是指在基因序列中插入一个或多个非天然核苷酸。可以在编码区或非编码区(包括上游启动子区)进行添加，可以在末端和/或非末端残基进行添加。在一些实施方式中，添加到启动子区，使编码区没有转录或转录减少，或添加到编码区，使其有一个密码子转移或早期终止密码子。”替换"是指用一个核苷酸碱基交换另一个核苷酸。替换能够将一个密码子改为编码不同氨基酸的密码子，从而使产生的蛋白质发生微小的(但具有功能性)变化。或者，替换能够将一个氨基酸编码密码子改为"终止"密码子，从而产生一个不完整(无功能)的蛋白质。在破坏内源性基因的背景下，"缺失"是指从多核苷酸基因序列中去除一个或多个核苷酸。在一些实施方式中，缺失包括启动子区域(或其部分)的缺失，从而使编码区域没有转录或转录减少，或者缺失在编码区域内，从而出现密码子转移或早期终止密码子。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌包含基因修饰，其中基因修饰包括缺失内源性的lpxl1和rmp基因。在一个实施方式中，本发明的淋球菌包含基因修饰，其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1,Δrmp)。在一个实施方式中，本发明的基因修饰淋球菌是双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1,Δrmp)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种FA1090菌株的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：
a.减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；和
b.减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，
其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1，Δrmp)。
在一个实施方式中，提供了一种FA1090菌株的基因修饰淋球菌，包含以下基因修饰：减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达；和减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达，其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1，Δrmp)。
在一个实施方式中，提供了一种FA1090菌株的基因修饰淋球菌，包含以下基因修饰：减少或消除Lpxl1多肽的表达；和减少或消除rmp多肽的表达，其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1，Δrmp)。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌包含基因修饰，其中基因修饰是基因缺失。
在一个实施方式中，提供了一种FA1090菌株的基因修饰淋球菌，包含以下基因修饰：减少或消除的lpxl1基因、mRNA和/或Lpxl1多肽的表达，和减少或消除的rmp基因、mRNA和/或Rmp多肽的表达，其中所述基因修饰是基因缺失。在一个实施方式中，基因缺失是lpxl1和rmp基因座内序列增加、替换或缺失修饰的结果。基因缺失可以是所述修饰的结果，也可以通过所述修饰实现。
在一个实施方式中，提供了FA1090菌株的基因修饰的淋球菌，包含以下基因修饰：减少或消除lpxl1基因、mRNA和/或Lpxl1多肽的表达，和减少或消除rmp基因的表达，mRNA和/或Rmp多肽，其中基因修饰是基因缺失，其中基因缺失是用异源序列替换lpxl1和rmp基因的一部分(或几部分)的结果，任选地，其中所述异源序列编码抗生素抗性基因。在一个实施方式中，提供了一种FA1090菌株的基因修饰淋球菌，其包含以下基因修饰：减少或消除lpxl1基因、mRNA和/或Lpxl1多肽的表达，减少或消除rmp基因，mRNA和/或Rmp多肽的表达，其中所述基因修饰是基因缺失，其中基因缺失是将异源基因序列加入lpxl1和rmp编码区的结果，任选地，其中所述异源序列编码抗生素抗性基因。
在一个实施方式中，提供了一种FA1090菌株的基因修饰的淋球菌，其包含以下基因修饰：减少或消除Lpxl1多肽的表达，和减少或消除rmp多肽的表达，其中基因修饰是基因缺失，导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1，Δrmp)。
任何合适的技术都可以用来缺失内源性lpxl1和rmp基因(即产生基因敲除)。例如，淋球菌的基因敲除可以通过转座子诱变、体外基因工程来修饰质粒或细菌人工染色体(BACs)上的基因，并将修饰后的构建体转移到感兴趣的生物体中，以及体内同源重组来实现。在一个实施方式中，通过禁用对基因的转录或翻译至关重要的内源启动子、操作子或调控元件来敲除基因。在一个实施方式中，使用CRISPR-Cas9技术缺失这些基因。
在一个实施方式中，内源性的lpxl1和rmp基因通过同源重组被缺失。同源重组例如可按WO01/09350A2所述进行，或使用以下描述的技术[Dillard J.P.(2011).GeneticManipulation of Neisseria gonorrhoeae.Current protocols in microbiology,Chapter 4,Unit4A.2]。在同源重组过程中，通过在lpxl1和rmp基因的编码序列中加入不同的基因，或通过重组用不同的基因(如异源基因，或非功能基因)取代该基因或其片段，从而缺失内源性lpxl1和rmp基因。在一个实施方式中，该异源基因是抗生素抗性基因。
在一个实施方式中，基因修饰可以是对编码和/或非编码区的修饰。编码区是一个基因的DNA序列中编码蛋白质的部分。非编码区(如内含子DNA)是生物体(即淋球菌)DNA中不编码蛋白质序列的部分。在一个实施方式中，基因修饰是对lpxl1基因的编码区、非编码区或其组合，以及对rmp基因的编码区、非编码区或其组合。识别特定DNA序列中的编码区和非编码区属于技术人员的范畴。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌与野生型淋球菌FA1090菌株具有同源性，除了具有以下的基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
如本文所使用的术语"同源"是指基本上相同的基因组。因此，在一个实施方式中，本发明的淋球菌与野生型(即基本上未修饰的)淋球菌FA1090菌株是同源的，除了特定的遗传修饰。在一个实施方式中，本发明的淋球菌与包含野生型lpxl1和rmp基因的淋球菌FA1090菌株同源，除了特定的基因修饰。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌与野生型淋球菌FA1090菌株相同，除了以下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌与野生型(即基本上未经修饰的)淋球菌FA1090菌株相同，除了特定的基因修饰。在一个实施方式中，本发明的淋球菌与包含野生型lpxl1和rmp基因的淋球菌FA1090菌株是同源的，除了特定的基因修饰。
野生型淋球菌FA1090菌株(或包含野生型lpxl1和rmp基因的淋球菌FA1090菌株)的一个实例是可从ATCC(#700825)获得的淋球菌FA1090菌株。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌还包含另外的基因修饰，导致最多3个、最多5个、最多10个或最多20个另外的奈瑟抗原过表达和/或减少或消除表达。所谓"另外的"奈瑟抗原，是指在Lpxl1和Rmp的修饰之外(即不包括)的"另外"。在一个实施方式中，本发明的淋球菌包含另外的基因修饰，导致1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的奈瑟抗原的过表达和/或减少或消除表达，即除了如下基因修饰：a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；和b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述另外的基因修饰导致另外的奈瑟抗原的过表达和/或减少或消除表达，其中所述过表达和/或减少表达是与未被基因修饰的FA1090株淋球菌或含有相应野生型基因的FA1090株淋球菌相比。在另外的基因修饰导致另外的奈瑟抗原过表达的情况下，所述抗原优选存在于细菌外膜中，以便它们在从基因修饰淋球菌获得或可获得的OMV上表面暴露。在这样的实施方式中，另外的奈瑟抗原可以是独立多肽的形式，也可以作为融合蛋白存在于同一多肽中。
技术人员知道过表达抗原的技术，特别是过表达抗原的技术，从而使OMVs表面的抗原含量增加(例如，见WO2012/032498A2中总结的方法)。OMVs可以从经过基因修饰以过度表达特定抗原的细菌获得。该细菌可能已经表达了抗原，但可包含与没有所述修饰的细菌相比增加抗原表达的一种基因修饰。这种修饰通常是通过重组技术引入的，例如定点突变或定向同源重组。作为过表达的结果，从修饰过的细菌制备的外膜囊泡含有更高水平的过表达的抗原。
所述奈瑟抗原可以是来自奈瑟氏菌属的任何成员的抗原，例如N.animalis,N.animaloris,N.bacilliformis,N.canis,N.cinerea,N.dentiae,N.elongata,N.flava,N.flavescens,N.gonorrhoeae,N.iguanae,N.lactamica,N.macacae,N.meningitidis,N.mucosa,N.oralis,N.perflava,N.pharyngis,N.polysaccharea,N.shayeganii,N.sicca,N.subflava,N.wadsworthii,N.weaveri or N.zoodegmatis。在一个实施方式中，所述奈瑟抗原是来自Neisseria meningitidis的抗原。在一个实施方式中，所述奈瑟抗原是来源于Neisseria gonorrhoea的抗原。
在一个实施方式中，本发明的淋球菌包括另外的基因修饰，导致过量表达最多3个、最多5个、最多10个或最多20个另外的奈瑟抗原。
产生基因修饰细菌的方法
在另一个方面，本发明提供了一种产生本发明的淋球菌的方法，该方法包括
a)减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌；或
b)减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌。
在a)所述的方法中，第一淋球菌FA1090细菌是单突变体(Δlpxl1)，第二淋球菌FA1090细菌是双突变体(Δlpxl1，Δrmp)。在b)所述的方法中，第一淋球菌FA1090细菌是单突变体(Δrmp)，第二淋球菌FA1090细菌是双突变体(Δlpxl1,Δrmp)。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，并减少或消除第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌。在所述优选实施方式中，第一淋球菌FA1090细菌是单突变体(Δlpxl1)。单突变体((Δlpxl1)是一种FA1090菌株的淋球菌，其已被基因修饰使得其lpxl1基因已被缺失。在一个实施方式中，第二淋球菌FA1090细菌是双突变体(ΔlpxL1,Δrmp)。
在一个实施方式中，本发明的方法包含以下步骤：减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达，以产生第一淋球菌FA1090细菌；减少或消除第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达，以产生第二淋球菌FA1090细菌。在一个实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：减少或消除Lpxl1多肽在淋球菌FA1090细菌中的表达，以产生第一淋球菌FA1090细菌；以及减少或消除来自第一淋球菌FA1090细菌的Rmp多肽的表达，以产生第二淋球菌FA1090细菌。
在一个实施方式中，所述用于减少或消除lpxl1和rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能的基因修饰可由以下组成或包含以下：
a)破坏或缺失内源性lpxl1和rmp基因；或
b)在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中减少或消除lpxl1和rmp的表达。
然而，优选的是，基因修饰涉及破坏或缺失内源性lpxl1和rmp基因。特别优选的是缺失内源性的lpxl1和rmp基因。在一个优选的实施方式中，基因修饰是基因缺失。
本领域技术人员知道传统的基因敲除技术，用它来产生"第二淋球菌FA1090细菌"(即双突变体ΔlpxL1,Δrmp菌株)。基因敲除的技术是众所周知的，以前已经报道过奈瑟的敲除突变体[例如，Makda Fisseha et al.Infection and Immunity Jun2005,73(7)4070-4080]。例如，可以通过缺失编码区的至少一部分来实现敲除，但也可以使用任何其他合适的技术，例如启动子的缺失或突变，起始密码子的缺失或突变等。该细菌可以包含一个标志物基因来代替被敲除的基因，例如抗生素抗性标志物。无论选择哪种技术(或技术组合)，得到的细菌将基本上不含Lpxl1和Rmp。
在一个优选的实施方式中，减少或消除Lpxl1基因和Rmp基因的表达是通过基因组重组进行的。在一个实施方式中，基因组重组是同源重组，其中lpxl1和rmp基因或其一部分被替换。在一个实施方式中，减少或消除lpxl1基因和rmp基因的表达是通过用异源基因序列替换lpxl1和rmp的编码序列或其一部分来进行的。然而，在一个优选的实施方式中，减少或消除lpxl1基因和rmp基因的表达是通过用抗生素抗性盒或抗生素抗性基因替换lpxl1和rmp编码序列或其一部分来进行的。
在一个实施方式中，减少或消除lpxl1基因和rmp基因的表达是基因缺失，任选地，其中所述基因缺失是lpxl1和rmp基因座内序列添加、替换或缺失修饰的结果。在一个实施方式中，减少或消除lpxl1基因和rmp基因的表达是通过在lpxl1和rmp编码序列内添加或插入异源基因序列(或异源序列)和/或用异源基因序列替换lpxl1和rmp基因序列或其一部分来进行的。在一个实施方式中，异源基因序列是携带在盒内的抗生素抗性基因，所述盒还包含一个重组位点。
在一个实施方式中，减少或消除lpxl1基因和rmp基因的表达是通过在lpxl1和rmp编码序列中加入抗生素抗性盒和/或用抗生素抗性盒替换lpxl1和rmp编码序列或其一部分来实现的。抗生素抗性盒是一种携带重组位点和抗生素抗性基因的基因盒，例如，赋予细菌卡那霉素抗性的KanMX。
在lpxl1和/或rmp基因中加入赋予抗生素抗性的基因，或用赋予抗生素抗性的基因替换lpxl1和/或rmp基因的序列(如编码区)或其一部分，可以选择携带插入的抗生素抗性基因的转化体(而不是缺失基因)。因此，成功的转化体(即成功产生的突变体)在所述抗生素存在的平板上划线或或在其存在下生长时是敏感的。任何没有成功转化的细菌将无法存活。然而，应随后对转化体进行测试，以a)确保已实现所述基因的表达和/或功能的减少或消除，以及b)确保没有残留的野生型(即非转化型)细菌存在。
如果需要，可以使用无标志物的突变构建体进行后续转化，以取代抗生素盒。因此，在一个实施方式中，抗生素抗性盒随后被替换。
外膜囊泡
在本发明的另一个方面，提供了本发明的淋球菌(即FA1090菌株的基因修饰淋球菌，其中基因修饰在OMV产生中a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；和b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能)。
Lpxl1在外膜囊泡中表达的程度：
在本发明的另一个方面，提供了一种从FA1090菌株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含水平降低或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽。在一个实施方式中，提供了一种从FA1090菌株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含水平降低或消除的Lpxl1和Rmp。在一个实施方式中，与来自野生型FA1090细菌的OMVs相比，Lpxl1和Rmp多肽的水平降低或没有可检测的水平被测量。在一个实施方式中，与来自包含野生型(即未修饰的)lpxl1和rmp基因的FA1090菌株的淋球菌的OMVs相比，Lpxl1和Rmp多肽的水平降低或不可检测到水平。在一个实施方式中，通过免疫测定(例如通过Western Blot或ELISA测定)测量Lpxl1和Rmp多肽的降低水平或没有可检测的水平。
在本发明的另一个方面，提供了一种从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡。因此，提供了一种从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中基因修饰a)减少或消除了lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；和b)减少或消除了rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡是从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的，其中基因修饰a)减少或消除了lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达；和b)减少或消除了rmp基因mRNA和/或多肽的表达。对淋球菌基因组进行的基因修饰导致来自所述FA1090菌株的基因修饰的淋球菌的OMV与比较者OMV中Lpxl1和Rmp多肽的表达和/或功能水平相比，Lpxl1多肽的表达和/或功能减少或消除和Rmp多肽的表达和/或功能减少或消除，所述比较者OMV是来自缺乏基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090(或包含野生型lpxl1和rmp基因)。
在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡包括Lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除，以及Rmp多肽的表达和/或功能的减少或消除。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡包括Lpxl1多肽的表达减少或消除，以及Rmp多肽的表达减少或消除。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡包含在OMV表面上Lpxl1多肽的表达减少或消除，以及Rmp多肽表达减少或消除。所述减少或消除的表达和/或功能是与来自包含野生型lpxl1和rmp基因的FA1090株淋球菌的OMVs相比。
在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡不表达Lpxl1或Rmp。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡在OMV表面不表达Lpxl1或Rmp。
在一个实施方式中，提供了一种从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中基因修饰减少或消除了Lpxl1多肽的表达；以及减少或消除了rmp多肽的表达，其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因。在一个实施方式中，提供了一种从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中基因修饰减少或消除了Lpxl1多肽的表达；并减少或消除了rmp多肽的表达，其中基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，导致双突变体FA1090淋球菌(ΔlpxL1，Δrmp)。
在一个实施方式中，提供了一种从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中基因修饰减少或消除了Lpxl1多肽的表达和减少或消除了Rmp多肽的表达。其中，所述基因修饰是基因缺失，其中所述基因缺失是lpxl1和rmp基因座内序列添加、替换或缺失修饰的结果，任选地，其中所述基因缺失是用异源序列替换lpxl1和rmp基因的一部分或几部分的结果，任选地，其中所述异源序列编码抗生素抗性基因。.
Lpxl1不在外膜囊泡中表达的程度
在本发明的另一个方面，提供了一种来自基因修饰FA1090菌株淋球菌的外膜囊泡(OMV)，所述基因修饰FA1090菌株淋球菌包含如下基因修饰a)减少或消除lpxl1基因、lpxl1mRNA和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；和b)减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能。
所述OMV包含
I.与比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，Rmp多肽的水平降低，其中所述比较者OMV来自缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090；和
II.与来自比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，六乙酰化脂质A的水平降低。
在一个实施方式中，所述OMV包含具有降低的六酰化脂质A水平的脂寡糖(LOS)。在一个实施方式中，所述OMV包含具有脂质A成分的脂寡糖(LOS)，所述脂质A成分与来自比较者OMV的六酰化脂质A水平相比具有降低的六酰化脂质A水平(其中比较者OMV来自缺乏以下修饰的e淋球奈瑟菌菌株FA1090：a)减少或消除lpxl1基因、lpxl1 mRNA和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及b)减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能)。
在一个实施方式中，所述OMV还包含
iii.与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平相比，缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平增加。
在一个实施方式中，OMV还包含具有缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A增加的水平的寡糖(LOS)。在一个实施方式中，OMV还包含具有脂质A成分的寡糖(LOS)，所述脂质A成分与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平相比，具有增加的五乙酰化脂质A的水平。在一个实施方式中，所述缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A缺乏来自GlcN二糖非还原端的次级月桂酰链。
还提供了来自基因修饰淋球奈瑟菌菌株FA1090的外膜囊泡(OMV)，该OMV包含：
I.与来自缺乏所述基因修饰的淋球菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，Rmp多肽的水平降低；以及
II.与来自比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，六乙酰化脂质A的水平降低。
III.与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五酰化脂质A的水平相比，缺乏月桂酸的五酰化脂质A的水平增加。
六/五酰化脂质A的水平可以按照以前的描述进行测定，实施例6中提供了这种方法的一个实例。
从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡包含PorB，所述PorB蛋白包括八个环状结构域(环状结构域1-8)。所述环状结构域在本文中提供为SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32和33(即来自FA1090 2KOΔlpxL1，Δrmp菌株的PorB环状结构)。在一个实施方式中，从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡包含PorB蛋白，所述PorB蛋白包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31.SEQ IDNO:32and SEQ ID NO:33。在一个实施方式中，从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡包含PorB蛋白，所述PorB蛋白包含八个环状结构域，每个环状结构域与SEQ ID NO:26,SEQID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31.SEQ ID NO:32andSEQ ID NO:33分别具有至少有90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。换而言之，环1结构域可包含与SEQ ID NO:26至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，环2结构域可包含与SEQ ID NO:27至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，等。
在一个实施方式中，从本发明的淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡包含与SEQ IDNO:25具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的PorB蛋白序列。在一个实施方式中，从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡包含SEQ ID NO:25的PorB蛋白序列。
在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡与来自缺乏基因修饰的淋球菌FA1090菌株的比较者OMV的激活相比，表现出减少的toll样受体4(TLR4)的激活。用于确定TLR4激活的方法在实施例13中公开。
在本发明的另一个方面，提供了一种从本发明的淋球菌获得或可获得的外膜囊泡。因此，提供了一种从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中基因修饰a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡是从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的，其中基因修饰a)减少或消除了lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达；和b)减少或消除了rmp基因mRNA和/或多肽的表达。对淋球菌基因组进行的基因修饰导致来自所述FA1090菌株的基因修饰淋球菌细菌的OMV包含与来自缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比降低的Rmp多肽水平和与来自比较者OMV的六乙酰化脂质A水平相比降低的六乙酰化脂质A水平。
因此，本发明提供了淋球菌外膜囊泡。外膜囊泡包括任何通过破坏淋球菌外膜或从淋球菌外膜渗出以形成保留外膜抗原的囊泡而获得的蛋白脂质体囊泡。OMVs可以通过本领域技术人员已知的各种方法制备。例如，OMVs可以从细菌中人工制备，可以使用去污剂处理(例如用脱氧胆酸)，或通过非去污剂手段制备。一种优选的OMV制备方法是，例如，通过离心，然后过滤培养上清液，并使用切向流过滤(TFF)对其进行浓缩(例如，如实施例10中所述)。
在一个优选的实施方式中，本发明的外膜囊泡是原生外膜囊泡，即没有经过去污剂抽提。在一个优选的实施方式中，本发明的外膜囊泡是通过非去污剂抽提获得的。本发明的外膜囊泡是通过漂白得到的，或者是通过破坏外膜得到的，其中所述破坏基本上不包括去污剂抽提来自外膜的OMV。因此，获得本发明的外膜囊泡的优选方法基本上是在没有去污剂的情况下使用超声、均质化、微流控、空化、渗透震荡、研磨、法压、混合等技术进行的。不使用或少使用去污剂的方法可以保留有用的抗原，如[W02004/019977]所述。
在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡在给受试者服用时具有交叉杀菌作用。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡，当给受试者施用时，能够诱发交叉杀菌的抗体滴度。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡，当施用给受试者时，对淋球奈瑟菌的异源和同源菌株具有交叉杀菌作用，其中同源菌株是FA1090菌株淋球菌，异源菌株是淋球菌的非FA1090株，例如WHO-M、F62、MS11、WHO-N、BG27、BG8、WHO-F、WHO-G和GC14。
本发明的外膜囊泡在电子显微镜下的直径在40-nm和120-nm之间(例如在电子显微镜下为60-nm和80-nm之间)。此外，本发明的OMVs基本上不受细胞质的污染。
OMVs在细菌生长过程中自发释放，可以从培养基中纯化。纯化最好包括将OMVs从活的和/或完整的淋球奈瑟菌中分离出来，例如通过使用低速离心法将细胞沉淀，同时留下泡在悬浮液中和/或通过使用过滤器(例如0.22μm的过滤器)进行基于尺寸的过滤，这允许泡通过但不允许完整的细菌通过。因此，与培养基不同，含有本公开的组合物的OMV通常基本上不含完整的细菌，无论是活的还是死的。泡的大小意味着它们可以很容易地通过过滤从整个细菌中分离出来，例如通常用于过滤消毒。尽管泡可以通过标准的0.22μm的过滤器，但这些过滤器会很快被其他物质堵塞，因此在使用0.22μm的过滤器之前，通过一系列孔径越来越小的过滤器进行连续的过滤消毒可能是有用的。前面的过滤器的例子是那些孔径为0.8μm、0.45μm的过滤器等等。在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡是通过孔径小于0.5、0.4或0.3μm的无菌过滤器过滤纯化的。
[W02005/004908]中描述了一种有用的OMV制备方法，涉及对粗制的OMV进行超滤，而不是高速离心。该方法可能涉及在超滤发生后的超速离心步骤。
获得的囊泡可能完全缺乏LOS，或者它们可能缺乏六乙酰化的LOS，例如，囊泡中的LOS可具有每个LOS分子减少的二级酰基链的数量。例如，从本发明的基因修饰淋球菌(即具有lpxl1缺失或突变的菌株)获得的OMVs会产生五乙酰化的LOS[Koeberling et al.(2008)J Infect Dis 198:262-70and Zollinger et al.(2010)Vaccine28:5057-67]。获得的OMVs可包含LOS，其包含缺乏自脂质A的GlcN二糖非还原端的次级月桂酰链的脂质A。获得的OMVs包括减少的内毒素活性。
在一个实施方式中，本发明的外膜囊泡包含双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱，其中所述双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱是通过质谱分析(例如如实施例12中公开的)测量的。在一个实施方式中，所述双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱包括PorB、Opa、PilQ、BamA、BamD和Ton-B依赖性受体蛋白(NGO0952)。在一个实施方式中，双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱包含PorB 1B、PilQ、BamA和BamD。
免疫原性组合物和疫苗
在本发明的另一个方面，提供了一种包含本发明的外膜囊泡的免疫原性组合物。
本发明的这一方面因此提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含水平降低或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽。
因此，本发明的这一方面提供了一种免疫原性组合物，其包含来自基因修饰FA1090菌株淋球菌的外膜囊泡(OMVs)，所述基因修饰FA1090菌株淋球菌包含以下基因修饰a)减少或消除lpxl1基因、lpxl1 mRNA和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；和b)减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能，所述OMV包含：
I.与比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，Rmp多肽的水平降低，其中所述比较者OMV来自缺乏所述基因修饰的淋球菌株FA1090；和
II.与来自比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，六乙酰化脂质A的水平降低。
在一个实施方式中，所述OMV还包含III.与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平相比，缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平增加。
本发明的这一方面还提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述细菌包含如下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
在一个实施方式中，提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述菌株包含如下基因修饰：
a)减少或消除lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达；以及
b)减少或消除rmp基因mRNA和/或多肽的表达。
在一个实施方式中，提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述菌株包含如下基因修饰：
a)减少或消除Lpxl1多肽的表达；和
b)减少或消除Rmp多肽的表达。
在一个实施方式中，提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述菌株包含如下基因修饰
a)消除Lpxl1多肽的表达；和
b)消除Rmp多肽的表达。
在一个实施方式中，提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述细菌包含以下基因修饰：减少或消除Lpxl1多肽的表达和减少或消除Rmp多肽的表达，其中基因修饰包含缺失内源性Lpxl1和Rmp基因。在一个实施方式中，提供了一种免疫原性组合物，其包含从FA1090菌株的基因修饰淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡，其中所述细菌包含以下修饰：减少或消除Lpxl1多肽的表达和减少或消除Rmp多肽的表达，其中所述基因修饰是基因缺失，其中所述基因缺失是lpxl1和rmp基因座内序列添加、替换或缺失修饰的结果，任选地，其中所述基因缺失是用异源序列替换lpxl1和rmp基因的一部分或几部分的结果，任选地，其中所述异源序列编码抗生素抗性基因。
在包含OMVs的组合物中，术语"免疫原性"是指存在于表面(或基本暴露于表面)的抗原能够引起免疫应答，如细胞介导的和/或抗体反应，例如当用于免疫受试者时。本发明的免疫原性组合物可用于疫苗。因此，免疫原性组合物和疫苗可以是药学上可接受的。术语"获得的或可获得的"是指从本发明的基因修饰淋球菌中分离出的OMVs，所述分离导致OMVs的富集群体。所述OMVs也可以被纯化以去除污染，例如去除细胞质蛋白污染。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物不包含任何活的和/或整个细菌。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物是药学上可接受的。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含佐剂。本发明的组合物可进一步包含佐剂，以便当与本发明的外膜囊泡一起施用给受试者时，观察到对存在于OMVs表面的抗原或抗原的免疫应答增加或增强。本发明的组合物可进一步包含佐剂，以便当与本发明的外膜囊泡一起给予受试者时，观察到反应性的降低。
本发明的组合物可包括铝盐佐剂。适合的铝盐佐剂包括氢氧化物、磷酸盐或其混合物。该盐可以采取任何合适的形式(如凝胶、结晶、无定形等)，优选抗原对盐的吸附作用。在一个实施方式中，佐剂是一种铝盐佐剂，例如氢氧化铝。在一个实施方式中，佐剂是氢氧化铝。在一个实施方式中，本发明的OMVs被吸附在氢氧化铝上。在一个实施方式中，佐剂不是凝胶基。在一个实施方式中，佐剂不是ALHYDROGEL。
被称为"氢氧化铝"的佐剂通常是氢氧化铝盐，它通常至少是部分结晶的。氢氧化铝可以用公式AlO(OH)表示，通过红外线(IR)光谱，特别是通过在1070cm-1处的吸附带和3090-3100cm-1处的强肩可以与其他铝化合物如氢氧化铝Al(OH)3区分开来[Chapter 9ofVaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell&Newman)PlenumPress 1995第9章]。氢氧化铝佐剂的结晶程度由半高处的衍射带宽度(WHH)反映出来，由于结晶度较小，结晶度低的颗粒显示出更大的线宽。表面积随着WHH的增加而增加，WHH值较高的佐剂被认为具有更大的抗原吸附能力。氢氧化铝佐剂的典型形态是纤维状(例如在透射电子显微照片中看到的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约为11，即佐剂本身在生理pH值下有一个正的表面电荷。据报道，氢氧化铝佐剂在pH7.4时，每毫克Al+++的吸附能力在1.8-2.6毫克蛋白质之间。
本发明的组合物可以以各种形式制备。组合物通常以水溶液形式给受试者(如哺乳动物)施用，然而，在施用之前，组合物可能已经处于非水溶液形式(如干燥或冻干)。本发明的组合物可以制备成液体形式的注射剂(作为溶液或悬浮液)。本发明的组合物可包括防腐剂，例如硫柳汞和/或2-苯氧乙醇。然而，优选该组合物基本上不含汞物质。不含汞的疫苗是更可取的。
本发明的组合物或疫苗可进一步包含赋形剂。本发明的组合物可包含钠盐(如氯化钠)以提供补液。可能存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。本发明的组合物可进一步包含去污剂，例如吐温(聚山梨醇)。
组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是带有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物在给受试者施用时，引起针对淋球奈瑟菌同源和/或异源菌株的抗体，例如对淋球奈瑟菌同源和/或异源菌株具有杀菌作用的抗体。一般来说，本发明的组合物在施用给受试者后能够诱导血清中的杀菌抗体反应。这些反应通常是在对小鼠施用后测量的，是疫苗效力的标准指标。血清杀菌活性(SBA)测量由补体介导的细菌杀伤力，可以用人或兔的补体进行测定(测量SBA的示例方法可以在本文实施例16中找到)。如本文所用，术语"异源菌株"是指与用于免疫受试者的OMVs所来自的淋球菌株不同的淋球菌株。由于用于免疫受试者的OMVs在此来自FA1090株淋球菌，异源菌株是指非FA1090株淋球菌。如本文所用，术语"同源菌株"是指淋球奈瑟菌的FA1090菌株。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗能够引起交叉杀菌的滴度。
在本发明的另一方面，提供了包含本发明的外膜囊泡或本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常是预防性的。本发明的疫苗包含免疫有效量的抗原，其中所述抗原存在于本发明的OMV的表面上。
治疗
本公开为我们提供了作为药物的免疫原性组合物和疫苗。它还提供了本发明的外膜囊泡以本发明的免疫原性组合物和疫苗的形式作为药物的用途。因此，另一方面，提供了用于药物的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗，用于免疫受试者以抵抗奈瑟菌感染，例如淋球奈瑟菌感染。因此，本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗可用于免疫受试者以对抗奈瑟菌属的其他细菌，最特别是脑膜炎奈瑟球菌(N.meninigitidis)和淋球奈瑟球菌(N.gonorrhoea)。
在另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗用于治疗或预防由奈瑟菌例如淋球奈瑟菌引起的疾病。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗用于治疗或预防泌尿生殖道、肛门直肠和/或口咽部位的淋球感染。在另一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗用于治疗或预防淋球菌相关的盆腔炎、播散性淋球菌感染、异位妊娠和/或不孕症。
可以通过在施用本发明的免疫原性组合物或疫苗后监测淋球奈瑟菌感染来测试预防性和治疗性治疗的功效。世界卫生组织(WHO)建议通过诊断测试来衡量感染的预防，将其作为疗效的临床终点而非疾病终点；这将确保在无症状状态下也能控制传播[GottliebSL etal.Gonococcal vaccines:Public health value and preferred productcharacteristics；report of a WHO global stakeholder consultation,January2019.Vaccine 2020Jun 9；38(28):4362-4373]。可以通过在施用组合物或疫苗后监测针对外膜囊泡中的免疫原性蛋白或其他抗原的免疫应答来测试疫苗接种的保护作用。本公开的组合物的免疫原性可以通过将它们施用给测试受试者然后确定标准血清学参数(例如抗OMV IgG的水平/浓度和功能性抗体的存在)来确定。这些免疫应答通常在施用组合物后测定，并与施用组合物前测定的值进行比较。当施用多于一剂的组合物时，可进行多于一次的施用后测定。如果与施用对照/安慰剂疫苗的受试者相比，接受本发明的免疫原性组合物或疫苗的受试者在特定解剖部位的淋球菌感染减少/较低，则本发明的免疫原性组合物或疫苗也被认为是有效的。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％对淋球奈瑟菌感染具有保护作用。
在另一方面，提供了在有需要的受试者中治疗或预防由奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在另一方面，提供了一种使有需要的受试者针对奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)进行免疫的方法，其包括向受试者施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在另一方面，提供了在受试者中引起免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。在另一方面，提供了在受试者中引起针对奈瑟菌感染(例如淋球奈瑟菌感染)的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于治疗或预防由奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于治疗或预防由淋球奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。在另一个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗、方法或用途，其中将至少2剂组合物施用于受试者。多剂量可用于初次免疫程序和/或加强免疫程序。初级剂量方案之后可以是加强剂量方案。因此，在进一步的实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗、方法或用途，其中将至少2个剂量的组合物施用于受试者，其中至少一个剂量是加强剂量。
在另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者是青少年和/或成人(例如年轻成人)。世界卫生组织(WHO)建议在第一次性接触之前接种疫苗，同时在发病率最高的时期(通常在青春期后期和成年早期)提供最大程度的保护。WHO将青少年定义为10至19岁之间的人[Rosen JE.Adolescent health and development(AHD):a resource guide for World Bank operations staff and governmentcounterparts.Washington,D.C.,The World Bank,2004]。因此，如本文所用，术语“青少年”是指年龄在10至19岁之间的受试者。如本文所用，“成人”是指20岁或以上的受试者(例如20-25岁、20-45岁、20-55岁等)。
为了根据本文公开的方法或用途鉴定用于预防或治疗的受试者，可以采用筛选方法来确定与目标或疑似疾病或病症相关的风险因素或确定受试者中现有疾病或病症的状态。这些筛选方法包括例如确定可能与淋球菌感染或淋球菌相关疾病相关的环境、家族、职业和其他此类风险因素，以及诊断方法(例如细菌培养或免疫测定方法)。这些和其他常规方法允许临床医生选择需要治疗的患者。在另一方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者感染淋球奈瑟菌的风险相对于一般人群的平均风险增加。与一般人群的平均风险相比，淋球奈瑟菌感染风险增加的受试者实例可包括(但不限于)性工作者、男男性接触者(MSM)、暴露前预防(PreP)使用者、当前或过去有STI诊断的个人、从事护理的HIV+个人以及正在寻求或已经寻求STI筛查或医疗中心其他STI服务的个人。
在另一方面，提供了用于本发明的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者针对一种或多种其他传染原进行联合免疫。联合免疫可包括针对本发明疫苗内的一种或多种另外感染剂的免疫(即其中本发明的疫苗还包含针对一种或多种其他感染剂的抗原)。然而，联合免疫还可以包括针对一种或多种其他传染原的免疫，其中其他疫苗与本发明的疫苗基本上同时施用(例如在相同的临床预约)。例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗可以与包含针对一种或多种其他传染原的抗原的其他免疫原性组合物或疫苗一起施用于受试者。在一个实施方式中，一种或多种另外的传染原是引起性传播感染的传染原。
在进一步的方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗的用途、本发明的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗通过肌内或腹膜内施用途径施用。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗通过肌肉内施用途径施用。在一个实施方式中，施用途径在第一次免疫和任何后续免疫之间保持不变。在一个实施方式中，施用途径不包括鼻内途径。
本发明的实施方式在随后编号的段落中进一步描述。
1.一种菌株FA1090的基因修饰的淋球菌，其包含以下基因修饰：
a.减少或消除脂质A生物合成月桂酰基转移酶(lpxl1)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b.减少或消除还原修饰蛋白(rmp)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
2.段落1的淋球菌，其中减少或消除的表达和/或功能是与包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株FA1090的淋球菌相比。
3.段落1或段落2的淋球菌，其中所述lpxl1基因包含与SEQ IDNO:3所示序列至少80％相同的序列，并且其中所述rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少80％相同的序列。
4.段落1-3的淋球菌，其中所述lpxl1基因包含与SEQ ID NO:3所示序列至少90％相同的序列，并且其中所述rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少90％相同的序列。
5.段落1-4的淋球菌，其中所述lpxl1基因包含SEQ ID NO:3，并且其中所述rmp基因包含SEQ ID NO:1。
6.前述任一段落的淋球菌，其中所述基因修饰：
a.减少或消除Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及
b.减少或消除Rmp多肽的表达和/或功能。
7.段落1-6的淋球菌，其中所述Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，并且所述Rmp多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列。
8.段落1-7的淋球菌，其中所述Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列，并且所述Rmp多肽包含与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。
9.段落1-8的淋球菌，其中所述Lpxl1多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述Rmp多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
10.前述任一段落的淋球菌，其中与包含野生型Lpxl1基因的淋球菌FA1090菌株相比，所述菌表达少于10％，少于5％或少于1％的Lpxl1多肽，与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比，所述菌表达少于10％，少于5％或少于1％的Rmp基因。
11.段落1-10段的淋球菌，其中所述菌不表达Lpxl1多肽和/或Rmp多肽。
12.段落1-11的淋球菌，其中Lpxl1多肽表达和/或功能的减少或消除导致脂质A的五乙酰化，任选地，其中脂质A的酰化是通过MALDI-TOF光谱法确定。
13.段落12的淋球菌，其中Lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除导致脂质A的五乙酰化超过50％，例如超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过95％或超过99％。
14.段落12或段落13的淋球菌，其中Lpxl1多肽的表达和/或功能的减少或消除导致脂质A的100％五乙酰化。
15.段落1-14的淋球菌，其中Rmp多肽的表达和/或功能的减少或消除导致淋球菌与包含野生型rmp基因的淋球菌FA1090菌株相比具有高度出泡性(hyper-blebbing)。
16.段落1-15所述的淋球菌，其中所述基因修饰由以下组成或包含以下：
a)破坏或缺失内源性lpxl1和rmp基因；或
b)在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中抑制Lpxl1和Rmp多肽的表达。
17.段落1-16的淋球菌，其中所述基因修饰由以下组成或包含以下：内源性lpxl1和rmp基因的破坏或缺失。
18.段落17的淋球菌，其中对内源性lpxl1和/或rmp的破坏导致表达无功能的Lpxl1和/或Rmp多肽。
19.段落17或段落18的淋球菌，其中破坏包括对内源性lpxl1和/或rmp基因序列的添加、缺失或替换。
20.前述任一段落的淋球菌，其中所述基因修饰包含缺失内源性lpxl1和rmp基因，即基因缺失。
21.段落20的淋球菌，其中所述内源性lpxl1和rmp基因的缺失导致双突变体FA1090淋球菌(Δlpxl1，Δrmp)。
22.段落20或段落21的淋球菌，其中所述内源性lpxl1和rmp基因通过同源重组被缺失。
23.前述任一段落的淋球菌，其中所述基因修饰可以是对编码和/或非编码区的修饰。
24.前述任一段落的淋球菌，其中所述细菌与野生型淋球菌FA1090菌株具有同源性，除了段落1-23的基因修饰外。
25.前述任一段落的淋球菌，其还包含另外的基因修饰，这些修饰导致至多3个、至多5个、至多10个或至多20个其他奈瑟抗原的过度表达和/或减少或消除表达。
26.一种产生段落1-25的淋球菌的方法，所述方法包括以下任何一项：
a)减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌；或
b)减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌。
27.段落26的方法，其中a)第一淋球菌FA1090细菌是单突变体(Δlpxl1)，第二淋球菌FA1090细菌是双突变体(Δlpxl1，Δrmp)，并且其中b)第一淋球菌FA1090细菌是单突变体(Δrmp)，第二淋球菌FA1090细菌是双突变体(Δlpxl1，Δrmp)。
28.段落26或段落27的方法，其中减少或消除lpxl1基因和rmp基因两者的表达是通过基因组重组进行。
29.段落26-28的方法，其中减少或消除lpxl1基因和rmp基因两者的表达是基因缺失，任选地，其中所述基因缺失是lpxl1和rmp基因座内序列添加、替换或缺失修饰的结果。
30.段落26-29的方法，其中减少或消除lpxl1基因和rmp基因两或者的表达是通过在lpxl1和rmp编码序列内添加异源基因序列和/或用异源基因序列替换lpxl1和rmp编码序列或其一部分来进行。
31.段落26-30的方法，其中减少或消除lpxl1基因和rmp基因两者的表达是通过在lpxl1和rmp编码序列内加入抗生素抗性盒和/或用抗生素抗性盒替换lpxl1和rmp编码序列或其一部分来进行。
32.段落1-25中任一段落的淋球菌在生产外膜囊泡中的用途。
33.从FA1090株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含降低水平或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽两者。测的水平。
34.段落33所述的外膜囊泡，其中所述降低水平或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽两者是与来自野生型FA1090细菌或包含野生型Lpxl1和Rmp基因的FA1090细菌的OMV相比测量的。
35.一种来自基因修饰的FA1090菌株淋球菌的外膜囊泡(OMV)，所述基因修饰的FA1090菌株淋球菌包含以下基因修饰：
a.减少或消除lpxl1基因、lpxl1 mRNA、和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及b.减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能，
所述OMV包含：
I.与来自缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，降低水平的Rmp多肽；和
II.与来自所述比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，降低水平的六乙酰化脂质A。
36.段落35所述的外膜囊泡(OMV)，其中所述OMV还包含：
III.与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平相比，缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平增加。
37.段落1-25段中任一段落的从淋球菌中获得或可获得的外膜囊泡。
38.段落37的外膜囊泡，其包含减少或消除表达的所述Lpxl1多肽和减少或消除表达的所述Rmp多肽。
39.段落37或段落38的外膜囊泡，其不表达Lpxl1或Rmp。
40.段落37的外膜囊泡，其包含与缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比降低水平的Rmp多肽，和与来自比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比降低水平的六乙酰化脂质A。
41.段落40的外膜囊泡，其还包含与来自比较者OMV的缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平相比，缺乏月桂酸的五乙酰化脂质A的水平增加。
42.段落33-41中任一段落的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡是原生外膜囊泡，即未经去污剂抽提。
43.段落33-42中任一段落的外膜囊泡，其通过孔径小于0.5、0.4或0.3μm的无菌过滤器过滤而纯化。
44.段落33-43中任一段落的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱，其中所述蛋白谱通过质谱分析测量。
45.段落44段的外膜囊泡，其中所述双突变体FA1090(ΔlpxL1,Δrmp)蛋白谱包含PorB 1B、PilQ、BamA和BamD。
46.一种包含段落33-45中任一段落的外膜囊泡的免疫原性组合物。
47.段落46的免疫原性组合物还包含佐剂。
48.段落47的免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐佐剂，例如氢氧化铝。
49.段落46-48的免疫原性组合物，当给受试者施用时，引起针对淋球奈瑟菌同源和/或异源菌株的抗体，例如针对淋球奈瑟菌同源和/或异源菌株具有杀菌作用的抗体。
50.一种疫苗，其包含段落33-45段中任一段落的外膜囊泡或段落46-49的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
51.段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗，其用于医药。
52.段落46-49的免疫组合物或段落50的疫苗，其用于免疫受试者对抗奈瑟菌感染，例如淋球奈瑟菌感染。
53.段落46-49段的免疫原性组合物或段落50的疫苗，其用于治疗或预防由奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)引起的疾病。
54.一种治疗或预防由奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗。
55.一种使有需要的受试者对奈瑟菌(例如淋球奈瑟菌)进行免疫的方法，包括向受试者施用免疫有效量的段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗。
56.一种在受试者中提高免疫应答的方法，其包括向受试者施用段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗。
57.段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗在制备治疗或预防奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。
58.段落46-49的免疫原性组合物或段落50的疫苗在制备治疗或预防由淋球奈瑟菌引起的疾病的药物中的用途。
59.段落51-58中任一段落的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中至少有2个剂量的组合物被施用于受试者。
60.段落51-58中任一段落的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者为青少年和/或成年人。
61.段落51-58中任一段落的免疫原性组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者相对于一般人群的平均风险而言，感染淋球奈瑟菌的风险增加。
62.段落51-58中任一段落的免疫组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中受试者对一种或多种另外的感染性病原体进行共同免疫。
63.段落51-58中任一段落的免疫组合物或疫苗的用途、方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗通过肌肉注射或腹膜内施用途径施用。
下面的实施例只是为了说明问题，并不打算以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：FA1090与淋球菌的全球变异性的基因组比较选择两个FA1090全基因组进行比较基因组分析，具体如下。
(1)FA1090-GenBank(见GenBank登录号：AE004969.1)
(2)FA1090--FA1090菌株淋球菌，从波士顿大学医学院的Lee Wetzler教授处获得。
FA1090菌株(1)的基因组从GenBank下载(登录号：AE004969.1)。用IlluminaMiseq技术对FA1090菌株(2)的基因组进行了测序(如实施例9所述)。对测序的基因组进行组装以确定整个染色体序列。
使用Lee I,Ouk Kim Y,Park SC,Chun J.OrthoANI:An improved algorithm andsoftware for calculating average nucleotide identity.Int JSyst EvolMicrobiol.2016；66(2):1100-1103.]中描述的方法计算FA1090基因组(1)和(2)的同一性。基因组为99.97％相同。
将这两个FA1090菌株的基因组与其他大量的淋球菌基因组进行了比较，包括。
-14个世界卫生组织的菌株(存在于内部集合中)，
-从ATCC获得的12个菌株(存在于内部集合中)，
-形成内部淋球菌库一部分的30个淋球菌菌株，和
-4000个公开获得的淋球奈瑟菌菌株的基因组，代表了该物种的全球集合。
因此，总共有4058个基因组可供分析。总的来说，本分析所考虑的菌株在不同的国家都有代表性，并与相关的淋球菌循环菌株集合相对应(见图1)。
材料和方法
数据来源：淋球菌基因组的全球集合(4000个公开获得的基因组)从PubMLST数据库下载(2019年3月访问)。FA1090 GenBank菌株(登录号AE004969.1)基因组和WHO基因组(登录号PRJEB14020)分别从GenBank和欧洲核苷酸档案(ENA)数据库下载。FA1090(2)、ATCC集合(12个菌株)和内部淋球菌库(30个菌株)的基因组是通过下一代测序获得的。
组装：用spades(v.3.6.2)组装软件对测序菌株进行组装。
单核苷酸多态性(snps)的检测和比较。基因组序列用kSNP3软件(v.021版)进行比较。kSNP3可以检测作为输入的基因组序列中的核心和非核心snp。分析的原始结果是一个比对snps的multifasta文件，包括插入和缺失。这个mfasta文件可以作为系统发育和种群结构重建的任何软件管线的输入。对于这些系统发育分析，我们用R编程语言(基于ape、phangorn、clValid和cluster R软件包)开发了一个ad hoc管线，或者直接用splitstree软件(4.14版)进行。
扩展的多焦点序列分型(MLST)：基因组序列也用Bigsdb软件(v.1.20)进行定性，将等位基因和蛋白质标识符分配到奈瑟菌属公共核心基因组MLST模式(NM_cgMLST_v1.0)定义的基因座列表中。在所有情况下，这些扩展的MLST分型资料被用来计算菌株之间的遗传距离(以不同等位基因的数量为基础)，并重建种群系统发育。
基因组注释：编码序列的检测和注释是用prokka软件管线(v.1.13.3)进行的。对于基因组(1)，使用了最初发表的基因组注释，但也重新进行了注释。对于基因组(2)，通过mauve管线，重叠群(contig)在(1)基因组支架上被重新排序，然后与一个6框的停止接头基序融合，以形成一个虚拟的单一重叠群(标记为r1c)。表1中报告了组装的总体情况。
表1：FA1090组装的总体概况。(a)如果用prokka管线对已发表的基因组AE004969进行重新注释，则该数字为2201。(b)这些数字指的是单一的虚拟重叠群FA1090_r1c注释。
全基因组比较：使用两种技术进行基因组比较，基于核心和非核心单核苷酸多态性(snps)检测和扩展的多基因座等位基因分配(PubMLST数据库的cgMLST_v1.0方案)。
单核苷酸多态性的系统发育
基于snps的系统发育重建是一项计算要求很高的任务，为了方便基因组之间的比较和它们的可视化，分析是在选定的基因组的子集上进行的。总共有369个基因组被包括在分析中，并从4058个基因组中随机选择。核心和非核心Snps被确定，并与kSNP管线比对。
图2表示了菌株相似性的系统发育网络。FA1090的基因组与F62菌株的基因组有一定程度的相似性，但总的来说，它似乎与该集合的所有基因组都有很大距离。总的来说，该网络显示了一个星形结构，存在大约6个紧凑的集群(图2中的黑色箭头)。
cgMLST系统发育
通过脑膜炎奈瑟菌分型模式(NM cgMLST v1.0)的特点，对所有4058株菌株进行了全面的基因组分析。该模式为每个基因组中的1605个基因座的序列分配了数字标识符。这个扩展的多焦点图谱(数字标识符的列表)被用来相互比较基因组并定义遗传距离(以便重建菌株的系统发育)。
准备了一个遗传对称矩阵(如图3所示)，显示了菌株对之间计算的遗传矩阵距离。与图2所示的重建一致，种群结构的特点是有明确的集群，相互分离。矩阵的两边都表示了基于配对距离的层次关系。在这棵树上，集群被很好地分离和定义。
然后通过剪影优化技术确定最佳的集群数量(图4)。这个程序确定了树中的分区，使集群之间的平均距离最大化。使得分最大化的分区数量为24个。
在图3中表示的一对菌株之间的遗传距离矩阵的基础上，每个菌株与所有其他菌株的平均距离也被计算出来。这一分析代表了该菌株相对于整个种群的"中心性"，图5表示了所有被分析的菌株。
中心性得分衡量每一个菌株在淋球菌群体中的中心或外围的遗传距离的大小。更中心的菌株平均来说与群体中的其他菌株更相似。根据这个分数，我们可以推断出，一般来说，外围的菌株不适合作为群体平均特征的代表。这些菌株倾向于在群体中具有特殊性和独特性(即与其他菌株不同)。下文表2显示了一个菌株子集的中心性得分。
表2
菌株 中心性得分
FA1090(1)Genbank 965
FA1090(2) 941
F62 944
SK92-679 803
GC_0817560 692
如图5所示，这些菌株(圈出的)位于图中最"中心"的区域。参考菌株FA1090在图的右角，属于最外围的菌株。这个位置表明，FA1090菌株在遗传上与该集合的其他菌株有差异。
结论：FA1090全基因组相比于其他淋球菌菌株的现有基因组的分析表明该菌株与所有其他淋球菌菌株的平均遗传距离要比其他菌株高得多。基于这些分析，基于OMV的疫苗(其中OMV是从FA1090菌株中漂白出来的)可能不会因为基因组的相似性而具有广泛的交叉保护性。
实施例2：细菌菌株和培养条件
与Genbank Accession ID AE004969.1)中公开的FA1090菌株有99.97％同一性的淋球菌FA1090菌株用于下述实验(即实施例1的FA1090菌株(2))。菌株在加入1％的Isovitalex的Gonococcus(GC)琼脂培养基(Difco)在37℃，5％的CO2氛围中常规培养18-24小时。
实施例3：质粒的构建和转化
按照标准的实验室方法[Sambrook J FE,Maniatis T.Molecular cloning:alaboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory.2012；4th ed]所描述的常规地进行DNA操作。
Lpxl1：包含卡那霉素抗性基因和用于同源重组的上游和下游区域的质粒pBS-ΔlpxL1 kanR[见Oliver Koeberling,Anja Seubert,Dan M.Granoff.BactericidalAntibody Responses Elicited by aMeningococcal Outer Membrane Vesicle Vaccinewith Overexpressed Factor H–Binding Protein and Genetically AttenuatedEndotoxin,The Journal of Infectious Diseases,Volume 198,Issue 2,15July 2008,Pages 262–270]被用作模板，用于扩增转化所需DNA。使用引物lpxl1_UP FW(GGCATTTGTATTTTGCCGTCTG，SEQ ID NO:9)和lpxl1_DO REV(GCGAAATGTACGCCATTTTCTACGC，SEQ ID NO:10)以及KAPA Hifi 2X mastermix(Roche)进行PCR，反应条件如下：94℃5分钟，40个循环，94℃30秒，60℃30秒，72℃3分钟，最后一步72℃5分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)按照制造商的方案进行DNA纯化。
Rmp：使用引物组合UpIII-FOR/REV和DpIII-FOR/REV，以50ng FA1090菌株的基因组DNA为模板，对Rmp基因的上游和下游区域进行扩增。同时，红霉素抗性基因(eryR)的扩增是用引物对EryR_gono_SmaI-Fw/Rev进行的，模板为10ng携带该基因的质粒(Serruto等，2010)。见下文表3。纯化的PCR产物以XbaI-SmaI(UP rmp)、SmaI(eryR)和SmaI-XhoI(DOWNrmp)的形式克隆到用XbaI-XhoI(NEB)消化的pBluescript KS+(Agilent，#212207)。通过双重消化和电泳，确认了克隆的正确性。
表3
转化：PCR产物(用于Lpxl1缺失)或XbaI线性化质粒(用于Rmp缺失)均用于转化。野生型FA1090用上述PCR产物转化，生成FA1090(1KO)ΔlpxL1菌株。然后用XbaI线性化质粒转化这个1KO菌株，生成FA1090(2KO)Δlpxl1,Δrmp。转化是按照以前的描述进行的(DillardJP.Genetic Manipulation of Neisseria gonorrhoeae.Curr Protoc Microbiol.2011；Chapter 4:Unit4A.2)，并将转化体选入+1％Isovitalex，以及卡那霉素40μg/ml(Δlpxl1)或红霉素2μg/ml(Δrmp)GC琼脂平板。
用Accuprime Taq聚合酶(Thermo Scientific)和外部引物(引物对lpxl1 estFW/REV和UP_CHECK_NGO1577-Fw/DW_CHECK_NGO1577-Rev分别用于ΔlpxL1和Δrmp)通过PCR分析测试所有转化体以检查双重组的正确事件(见下文实施例4和7)。
实施例4：FA1090单突变体的产生(ΔlpxL1)
主要是由于脂质A的作用，脂多糖(LPS)具有内毒素活性。其毒性可导致显著的致反应性。因此，为了降低基于OMV的疫苗对淋球奈瑟菌的反应原性，缺失了lpxl1基因(NGO0154)。
含有PorB IB等位基因的FA1090菌株被用来作为缺失的背景菌株。
FA1090ΔlpxL1是通过双同源重组得到的，其中lpxL1基因的编码序列的一个区域被抗生素抗性盒(卡那霉素)取代。
选择并扩增对卡那霉素有抗性的突变体ΔlpxL1克隆，并检测其DNA是否存在正确突变(图6)。
将2号克隆在含卡那霉素的平板上划线，从衍生的克隆(2.1号)中制备甘油原液，并生成DNA裂解液。通过使用重组事件的外部引物(图6A)，筛选选择的克隆是否缺失lpxl1基因并获得卡那霉素抗性基因。
使用Accuprime Taq聚合酶(Thermo Scientific)和外部引物(引物对lpxl1 estFW(CCGCCAAACTCAATCCTTCG，SEQ ID NO:17)和lpxl1 est REV(GCAAACTTTTGTTTCACCGTTTCCG，SEQ ID NO:18)通过PCR分析测试所有转化体，以检查双重组的正确事件。
野生型菌株中扩增子的预期长度(1703bp)比缺失突变体中的扩增子(2344bp)短。如图7所示，2号克隆的DNA的PCR产物有两条条带，一条较短，代表野生型，一条较长，是缺失突变体的预期长度。所有其他克隆都有较长的条带，包括2.1号亚克隆，表明在所有这些克隆中都发生了重组，这些克隆的lpxl1基因是缺失的。
实施例5：研究FA1090单突变体(ΔlpxL1)中残留的FA1090 WT淋球菌的存在
在转化过程中，一些细菌获得了对所使用的抗生素的天然抗性，而没有获得重组后的抗性盒。
为了研究残留的FA1090(即WT)细胞的存在(图6C)，用野生型基因组的特异引物进行了PCR(图6B)。由于引物对亲代菌株基因组具有特异性，因此产物的存在表明在总群体中存在野生型细胞。相反，如果没有产物，则表明有一个均一的突变体群体。
使用Accuprime Taq聚合酶(Thermo Scientific)和内部引物进行PCR筛选，这些引物对野生型DNA具有特异性(NGO_lpxL1wtcheck-Fw(CCGCGTTCGAGATGG，SEQ ID NO:19)和NGO_lpxL1wtcheck-Rev(GCGGAACTGTTTGACGAG，SEQ ID NO:20)。
对于lpxl1缺失突变体的产生，野生型特异性扩增子的预期长度为176bp。因此，在FA1090ΔlpxL1克隆#4和#2.1中没有观察到条带(图8)，突变体群体是没有野生型细胞污染的。因此，选择了使用外部引物也有适当的扩增曲线的FA1090ΔlpxL1#2.1用于进一步的实验。
实施例6：LOS的五乙酰化
已知lpxl1的缺失会导致脂质A的五乙酰化形式的脂肪寡糖含量。因此，使用MALDI-TOF光谱法评估脂质A的酰化状态，以确认从FA1090单突变体(Δlpxl1)获得的OMV中Lpxl1功能的丧失。
方法
脂质A的提取。从100μg的OMVs中沉淀出脂质A，并分别从淋球菌FA1090野生型和Δlpxl1(单突变体)菌株中纯化出来，使用1％(vol/vol)乙酸在100℃下温和水解3小时。将样品在14,000×g下离心15分钟；将颗粒重新悬浮在水中，并用水冲洗两次。然后用SpeedVac将沉淀干燥过夜，重悬于20μL的氯仿/甲醇(4:1的比率)中，并与等体积的超级DHB溶液(Sigma)混合，如之前[Rossi et al.Modulation of endotoxicity of Shigellageneralized modules for membrane antigens(GMMA)by genetic lipid Amodifications:relative activation of TLR4 and TLR2 pathways in differentmutants.J Biol Chem.2014,289(36):24922-35]报道的。
MALDI TOF分析：2μl的脂质A提取物被加载到靶板上(MTP384靶板研磨钢BC，Bruker Daltonics)，并通过Ultraflex MALDI-TOF(Bruker Daltonics)在反射离子阴性模式下进行分析(见Rossi等-上面提供的文献)。每次分析都包括与Super DHB溶液混合的肽校准标准品(Bruker Daltonics)。对于脂质A的MS/MS分析，线性模式分析的主要峰被选为碰撞诱导解离，产生的片段被MALDI TOF-TOF以离子负模式检测。图谱代表了在20个不同斑点区域的50次单一激光射击的整合。
结果：脂质A的MS分析。通过MS分析评估了来自野生型OMVs(即从没有基因修饰的野生型FA1090获得的OMVs)和ΔLpxl1OMV的脂质A结构。
观察到野生型OMVs的脂质A的主要分子离子在m/z 1,632.03，这与脂质A(MPLA)的六酰基、单磷酸结构的理论质量一致。除了这种主要形式外，还确定了一个二磷酰物种(BPLA)，m/z为1,711.97(图9A)。
从ΔLpxl1 OMV脂质A获得的MALDI光谱中观察到一个主要成分，其m/z为1,449.84(图9B)。与野生型脂质A的MPLA形式观察到的182Da的质量差异与缺乏单一月桂酸链相一致(计算质量：182.3Da)。此外，ΔLpxl1 OMV的光谱还显示了m/z 1,529.79的信号，相当于也缺乏月桂酸链的脂质A的二磷酸形式。没有观察到可归因于野生型脂质A形式的MS信号。
因此，由FA1090Δlpxl1产生的OMVs被MALDI TOF-分析证实具有100％的五乙酰化形式的单磷酸和二磷酸物质的LOS含量(图9)。
实施例7：双突变体FA1090(ΔlpxL1，Δrmp)的产生
还原可修饰蛋白(Rmp)，以前称为PIII，已被证明可以诱导阻断抗体，从而抑制其他杀菌抗体的作用[Gulati S,et al.Antibody to reduction modifiable proteinincreases the bacterial burden and the duration of gonococcal infection in amouse model.J Infect Dis.2015；212(2):311-315][Joiner KA,Scales R,Warren KA,Frank MM,RicePA.Mechanism of action of blocking immunoglobulin G forNeisseria gonorrhoeae.J Clin Invest.1985；76(5):1765-1772]。
为了从Δlpxl1单突变体FA1090菌株中去除Rmp(从而产生双突变体FA1090Δlpxl1,Δrmp)，将FA1090Δlpxl1#2.1菌株用pBSΔrmp eryR线性化构建体转化。
FA1090Δlpxl1,Δrmp是通过双同源重组得到的，其中rmp基因的编码序列的区域被抗生素抗性盒(红霉素)取代。
选择并扩增对红霉素有抗性的突变体Δlpxl1,Δrmp克隆，并检测其DNA是否存在正确突变(图10)。使用重组事件的外部引物，选择失去rmp基因并获得红霉素抗性基因的克隆。
使用Accuprime Taq聚合酶(Thermo Scientific)和外部引物(UP_CHECK_NGO1577-Fw(GTGTCCAGTCGTAGCAGG，SEQ ID NO:21)DW_CHECK_NGO1577-Rev(AGGGATGATGATAAAACCATATCC，SEQ ID NO:22)通过PCR分析测试所有转化体，以检查双重组的正确事件。
野生型菌株中扩增子的预期长度为2089bp，缺失突变体中扩增子的预期长度为2590bp。如图10所示，所有克隆的PCR产物都具有缺失突变体的预期长度，而野生型对照中的条带具有较短的表观尺寸，从而表明重组发生在所有克隆中，这些克隆被缺失了rmp基因。
实施例8：研究残留的单突变体FA1090(Δlpxl1)淋球菌的存在
将1号克隆(来自实施例7)在含红霉素的平板上化线，从衍生的克隆(#1.1)中生成甘油原液，并制备DNA裂解液。
为了研究生成的双突变体中是否存在残留的FA1090Δlpxl1细胞，用原始基因组的特异引物进行了PCR(见图11)。使用Accuprime Taq聚合酶(Thermo Scientific)和对野生型DNA特异的内部引物(INTwt_NGO1577-Fw(TCGTACGCAACAACTATGGAG，SEQ ID NO:23)和INTwt_NGO1577-Rev(CATCAACATATTGAGGAGCCTG，SEQ ID NO:24))进行PCR筛选。
野生型特异性扩增子的预期长度为150bp。用原始的FA1090ΔlpxL1#2.1作为模板，观察到一条条带。
从琼脂糖凝胶中可以观察到克隆FA1090ΔlpxL1Δrmp#1的DNA有一条微弱的条带，而在克隆FA1090ΔlpxL1Δrmp#1.1中没有观察到条带，这说明突变体群体没有受到原始细胞的污染。
选择FA1090ΔlpxL1Δrmp#1.1进行进一步的实验。
实施例9：通过下一代测序确认lpxl1和rmp的缺失
方法：将一环冷冻的FA1090野生型(野生型)、Δlpxl1(单突变体，1KO)和Δlpxl1,Δrmp(双突变体，2KO)原液在GC+1％Isovitalex琼脂平板上进行划线，在37℃和5％ CO2下培养24h。将细菌重新悬浮在5ml的PBS中至600nm处的光密度为0.6(Ultrospec10细胞密度仪GE Healthcare)。将两毫升的细菌悬浮液在4℃下以13000rpm离心5分钟，弃去上清液，根据用于革兰氏阴性菌的制造商的说明，使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒(SigmaAldrich Cat#NA2110)对得到的沉淀进行DNA纯化。用100μl预热的(70℃)无核酸酶水(ThermoFisher cat#10977-035)进行洗脱。纯化的DNA浓度用NanoDrop 1000UV-Vis分光光度计测定，DNA的完整性用0.8％ TAE琼脂糖凝胶电泳检查。
按照制造商的说明(文件#15031942v02 2017年4月,Illumina)，使用Nextera XTDNA Library Prep制备下一代测序文库。时间标记为8分钟，文库用测序接头标记(NexteraXT Index kit 24indexes-96样本；REF 15055294；LOT 10026832)。文库被归一化并稀释到1:25。其他文库使用Nextera DNA Flex Library Prep kit，按照制造商的说明(文件#1000000025416v07；2019年5月；Illumina，USA)构建。300ng的DNA被标记，用磁珠清理，并使用Illumina增强型PCR混合物和双指数接头进行5个循环的PCR扩增。按照Index AdapterPooling guide,Nextera DNA CD Indexes,Illumina(Document#1000000041074v09)选择索引。对扩增的DNA进行清理，并对平均500-600个碱基对的片段进行大小选择。最终的文库在Agilent 2100生物分析仪上用高灵敏度DNA试剂盒进行检测。文库被汇集并稀释到4nM浓度。按照MiSeq系统(Denature and Dilute Libraries Guide Document#15039740v10,Illumina)，对文库进行变性并加入1％的非索引PhiX对照文库。变性的文库以12pM的浓度加载。所有文库在Illumina MiSeq测序仪上运行以使用500周期的MiSeq试剂盒v2(Illumina，Cat.No.MS-103-1003)进行测序，配对端读取为250个碱基对(2x 250)。
结果：分离了FA1090Δlpxl1,Δrmp#1.1菌株的基因组DNA，并组装了完整的基因组。从中提取了两个被缺失的基因座的序列。
下一代测序法被用来确认：
a)lpxl1基因座在野生型FA1090(2)分离株中的存在(图12)，
b)FA1090Δlpxl1Δrmp突变体中预期的lpxl1缺失(图13)，
c)野生型FA1090(2)分离株中rmp基因座的存在(图14)；以及
d)FA1090Δlpxl1Δrmp突变体中预期的rmp缺失(图15)。
实施例10：OMV的制备
OMVs是在没有去污剂的情况下制备的，因此是原生的OMVs(nOMVs)。
为了产生用于本文分析的OMVs，将500mL的细菌生长物在12,000xg下离心30分钟。弃去沉淀。
将500mL上清液与100μl苯宗酶(1000U/mL)在4℃下培养24-72小时。用0.22微米的过滤器过滤接种液，然后用切向流过滤(TFF)进行一系列的浓缩和洗涤步骤，截止点为300kDa。第一次浓缩到250ml，然后用5升PBS(20CV)进行缓冲液交换。第二次浓缩到50ml，然后用2升PBS(40CV)进行第二次清洗。然后进行最后一次浓缩到5-15ml的步骤。
然后用0.22微米的注射器过滤器再次过滤，得到PBS中纯化的OMVs。
实施例11：确认Rmp蛋白的缺失
SDS-PAGE和多肽质量指纹法。分离自野生型FA1090淋球菌、FA1090ΔlpxL1(单突变体)和FA1090ΔlpxL1,Δrmp(双突变体)的OMVs分别在含有2％SDS终液的SDS样品缓冲液中95℃变性5分钟。随后，将每种制剂的10μg装入4-12％的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。凝胶用考马斯蓝染色，将感兴趣的条带从凝胶上切除，用50mM碳酸氢铵和乙腈(50:50，体积/体积)洗涤洗一次，用纯乙腈洗涤一次，然后晾干。将50μl 0.012μg/μl的测序级改良胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)加入到干燥的条带中，消化在37℃下进行过夜。将含有多肽混合物的溶液装入C18反相柱Acquity UPLC peptide CSH C181.7μm 1×150mm，用28-85％的缓冲液B(0.1％(v/v)甲酸，ACN)线性梯度分离，流速50μl/min，温度50℃。质谱数据在Q-Exactive biopharma plus质谱仪上以正向模式获得，使用数据依赖采集模式(DDA)，动态地从调查扫描(300-1600m/z)中选择五个最丰富的前体离子进行HCD碎裂。自动增益控制(AGC)被设置为3×106。对于MS/MS的获取，前体的分离以3m/z的窗口进行，MS/MS扫描以200m/z的17,500分辨率获取，归一化碰撞能量为26eV。
使用包含从已测序的淋球奈瑟菌FA1090基因组推断出的蛋白质序列的数据库使用Peaks X软件(Bioinphormatics解决方案)对MS光谱进行分析，以进行蛋白质鉴定。
结果：通过SDS-PAGE分析了从野生型、Δlpxl1(单突变体)和Δlpxl1,Δrmp(双突变体)FA1090淋球菌获得的OMVs。在对凝胶进行考马斯染色后，确定了迁移的表观分子量为～28kDa的条带的蛋白质含量。蛋白质在凝胶中被胰蛋白酶消化，通过LC-MS/MS分析生成的肽。从野生型OMV和Δlpxl1(单突变体)OMV观察到的条带中鉴定了Rmp和不透明蛋白B和D。只有不透明蛋白B和D从ΔLpxl1、Δrmp(双突变体)OMVs观察到的条带中被鉴定出来(见图16)。
实施例12：根据FA1090双突变体产生的OMV中存在的蛋白成分，比较全球各淋球菌菌株的基因变异性。
基本上进行了相同的基因组比较(如实施例1所述)，只考虑从FA1090双突变体淋球菌Δlpxl1,Δrmp获得的外膜囊泡的蛋白质成分。
OMV的蛋白成分列表是通过OMV产物的质谱表征得出的，具体如下。
考虑对FA1090ΔLpxl1,Δrmp双突变体(2KO)菌株的四种不同的OMV产物进行质谱(MS)分析。这四种产物中的三种用两种不同的消化方案分析了两次。总共有7个制剂进行了质谱分析。对每个样品的质谱数据进行独立分析，以确定蛋白质和它们的相对丰度。对比FA1090公共基因组注释和PSORTb软件对蛋白质进行了注释，以预测细胞定位。每个独立的质谱分析的蛋白质列表都经过过滤，去除预测为细胞质的和相对丰度低于0.05％的蛋白质。最后，通过连接每个MS实验所显示的七个过滤列表，确定了59个蛋白质的最终列表。
在通过质谱鉴定的59种蛋白质中，一些蛋白质在所有OMV产品中都被鉴定出来(如下表4所概述)，并在OMV蛋白质总量的0.6％(w/w)以上的浓度中被观察到。
表4
表4：报告了每个批次中平均丰度≥0.6％w/w且在所有7个批次中普遍鉴定的已知蛋白质。(a)由于主要的序列冗余，Opa蛋白的数量在该家族中具有代表性。(b)由PSORTb3.0.2版预测的细胞定位和人工修改的前脂蛋白预测
使用MS特征鉴定的59个蛋白被用来定义一个多焦点分型模式(在蛋白序列水平)。对收集到的所有4058个菌株进行分型，为每个菌株分配蛋白质等位基因标识符。
如实施例1所述，这些扩展的特征被用来测量菌株之间的变化，并测量遗传距离。从剪影分数分析中得出的最佳集群数是22个集群。
如前所述，中心性分数衡量每个菌株在淋球菌群体中的中心或外围的遗传距离有多大。基于遗传距离，FA1090双突变体OMV组成的中心性在图17中报告)。一子集菌株的中心性分数显示在下面的表5中。
表5
菌株 中心性分数
FA1090(1)Genbank 33.9
FA1090(2) 32.2
F62 31
SK92-679 28.3
GC_0817560 25.1
这一分析与之前在全基因组水平上进行的分析一致(见实施例1)。此外，该分析还证实，对于FA1090 OMVs的蛋白质成分，FA1090在基因组上与该集合的其他菌株有一定的距离。
实施例13：测试FA1090突变体的OMVs激活TLR-4的能力
缺失lpxl1基因导致细菌只产生五乙酰化脂质A，并表现出减少的toll样受体4(TLR4)信号[Zhou X,Gao X,Broglie PM,et al.Hexa-acylated lipid A is requiredfor host inflammatory response to Neisseria gonorrhoeae in experimentalgonorrhoea.Infection and Immunity.2014Jan；82(1):184-192]。
为了评估FA1090Δlpxl1突变体和FA1090Δlpxl1,Δrmp突变体表达的五乙酰化形式的脂质A激活TLR4的能力，在稳定转染了人类TLR4和在NF-kB控制下表达荧光素酶的报告质粒的HEK293细胞上测试由这些突变体制备的OMV(图18中称为GMMA)以及野生型FA1090菌株的OMV。
这些数据证实，FA1090Δlpxl1(单突变体或1KO)和FA1090ΔlpxL1,Δrmp(双突变体或2KO)突变体都表达一种突变形式的脂质A，与野生型FA1090菌株表达的脂质A相比，突变形式的脂质A激活TLR4的能力高度下降(见图18)。
实施例14：FA1090双突变体(Δlpxl1,Δrmp)的液体生长与其他淋球菌菌株中制备的双突变体(ΔlpxL1,Δrmp)的液体生长的比较
本实验的目的是直接比较一些来自平板(不适应液体生长)的Δlpxl1,Δrmp菌株在液体培养物中的生长情况。双突变体菌株在液体培养物中的生长能力是评估所选疫苗菌株的放大潜力的一个重要考虑。
如实施例3-4和7所述，在FA1090、F62、SK92-679、BG13、BG17和BG27菌株中产生双突变体(Δlpxl1,Δrmp)。
在GC+isovitalex 1％平板上用冷冻甘油原液对下列菌株进行划线。
1.FA1090Δlpxl1,Δrmp(FA1090ΔΔ)
2.F62Δlpxl1,Δrmp(F62ΔΔ)
3.SK92-679Δlpxl1,Δrmp(SK92-679ΔΔ)
4.BG13Δlpxl1,Δrmp(BG13ΔΔ)
5.BG17Δlpxl1,Δrmp(BG17ΔΔ)
6.BG27Δlpxl1,Δrmp(BG27ΔΔ)
对甘油原液的一环细菌进行划线，以获得单个菌落。每个菌株准备4个平板。将平板在37℃和5％的CO2条件下培养30小时。
为这个实验准备了两种不同的培养基。
1.GC+isovitalex 1％+乳酸盐7.5g/L(或GC+乳酸盐)：将3克乳酸钠(DL)(SigmaAldrich)溶于400mL GC+isovitalex 1％培养基中，并用500mL 0.22μm过滤瓶(Millipore)进行过滤消毒。
2.MCDMI-mod(或MCDMI-5g/L乳酸盐)。根据以下配方制备1L培养基(表6)：用NaOH将PH值调至7，然后用1L 0.22μm的过滤瓶(Millipore)对培养基进行过滤消毒。
表6
所有的菌株都从琼脂平板上重新悬浮在6mL的GC+乳酸盐中。只使用单个菌落。
然后将悬浮液在50mL GC+乳酸盐和MCDMI-mod培养基中稀释到250mL带通风杯(Corning)的一次性挡板摇瓶中，使OD600nm(600nnm处的光密度)达到约0.3。记录开始的OD600nm，并将烧瓶在37℃和160rpm摇动下培养。
监测OD600nm直到达到静止期。
在两种不同的培养基中观察到不同的生长表现(数据见图19)。
-在补充了乳酸盐的GC中，只有F62ΔΔ和SK92-679ΔΔ观察到生长不良。其他菌株的生长是成功的。在MCDMI中，F62ΔΔ是表现最好的。总的来说，MCDMI培养基似乎适合F62和FA1090双突变株("ΔΔ"表示双突变株)的生长，而BG13ΔΔ和BG27ΔΔ能够生长，但在生长速度和生物质产量方面受到限制。对于BG17ΔΔ，MCDMI-mod培养基似乎不适合液体生长。SK92-679ΔΔ在两种测试的培养基中都显示了生长缺陷。
综上所述，
-BG13ΔΔ和BG27ΔΔ可以在两种培养基中培养，但强烈优选基于GC的培养基。F62ΔΔ的情况正好相反(强烈优选MCDMI培养基)。
-BG17ΔΔ可以完全在基于GC的培养基中培养。
-SK92-672ΔΔ在两种测试的培养基中都显示出生长缺陷，只有在基于GC的培养基中观察到轻微的生长。
-FA1090ΔΔ可以在两种培养基中培养，这使得它成为一个灵活的菌株，可以在未来扩大规模。它在两种测试的培养基中都显示出相当的生长速度。然而，根据不同的培养基，其他双突变体菌株显示出可比的生长(F62ΔΔ在MCDMI-mod中，BG13ΔΔ、BG17ΔΔ和BG27ΔΔ在GC+乳酸盐中)。
实施例15：通过直接量化培养上清液中的OMV来评价OMV的生产力
使用六个Δlpxl1,Δrmp菌株(如在实施例14中使用的)评估OMV生产力。
培养物在4000rpm下沉淀30分钟，上清液用0.22μm的立体过滤器过滤。
使用荧光染料FM4-64估计每个菌株在两种生长条件下(在实施例14中描述)的OMV生产力。该染料在膜双层的夹层中会发出荧光。荧光强度与培养上清液(OMVs)中的膜量成正比，其线性范围用标准曲线确定。对于每个样品，染料被1:100直接稀释到样品上清液中。标准曲线是通过在用于生长的相同培养基中连续稀释来自FA1090的纯化OMV，并使用1:100稀释的FM4-64染料来制备。
对含染料添加或不含染料添加的每个样品的荧光进行记录，并从染料处理的样品值中减去未加染料的上清液的背景荧光。还减去了只有培养基的空白。培养上清液中的OMV浓度通过标准曲线的数值外推进行评估，并在图20中报告为每个菌株和生长条件的两个生物重复的平均值。
如图20A所示，除了F62ΔΔ菌株外，OMV体积生产力在基于GC的培养基中更高，这反映了不同菌株在两种培养基中达到的不同生物量。令人惊讶的是，尽管在MCDMI培养基中观察到生长非常差，但SK92-679ΔΔ菌株也获得了高值。FA1090ΔΔ在基于GC的培养基中达到了最高的生产率。
计算值也根据每个菌株在每个条件下达到的不同OD600nm进行归一化，以比较具体的生产力(见图20B)。就具体生产力而言，考虑到在两种培养基中达到的低OD600nm和登记的OMVs相对较高的体积生产力，SK92-679ΔΔ菌株如预期显示出非常高的数值。然而，目前还不清楚这些生产力值是由于实际的OMV释放还是仅仅由于培养上清液中非特异性释放的细胞碎片。
关于在基于GC的培养基中的其他菌株，FA1090ΔΔ、BG13ΔΔ和BG17ΔΔ的生产力范围是20-30mg/L/OD，而F62ΔΔ略高，BG27ΔΔ则较低。在MCDMI-mod培养基中也观察到类似的情况，大多数菌株的生产力范围为10-20mg/L/OD，BG27ΔΔ的生产力略低。
由于FA1090和F62的双突变体都表现出良好的生长性能，并被认为是在OMV生产方面产量最高的菌株，(不包括SK92-679的异常发现，它是由低生物量引起的)，所以选择这两个菌株的OMV进行免疫原性分析。
实施例16：评估FA1090突变体的OMV的免疫原性
从FA1090Δlpxl1,Δrmp双突变体(2KO)和淋球奈瑟菌F62菌株的类似ΔlpxL1,Δrmp双突变体中制备OMVs。
这些OMVs的免疫原性在CD1小鼠体内进行了测试。
7周大的CD1雌性小鼠在第1天和第29天通过腹腔注射(IP)途径施用在明矾(3mg/ml)中配制的这些OMV制剂(10μg)或单独的明矾进行了两次免疫。在第一剂疫苗之前(免疫前血清)和第二剂疫苗之后(血清后2)收集血清。
通过人血清杀菌试验(hSBA)和细菌粘附抑制(BAI)测量功能抗体。
hSBA方法
在GC+1％ Isovitalex琼脂平板上对从冷冻的等分试样的细菌进行划线，并在37℃和5％的CO2下培养16(±2)小时。
培养结束后，用10μl无菌菌环挑出菌落，接种到10ml含1％Isovitalex的GC培养基中(37℃预热)，使光密度(OD，600nm)达到0.1的起始水平。然后将细菌悬浮液在37℃下温和摇动(180rpm)，直到培养物达到OD600nm约为0.3-0.4。然后将细菌在SBA缓冲液(DPBS，1％BSA，0.1％葡萄糖)中1:10.000稀释。
然后将热灭活的小鼠血清在SBA缓冲液中稀释，使平板的最终体积为25微升/孔。然后加入17微升/孔的稀释细菌和8微升/孔的正常人血清。反应混合物在37℃下温和摇动孵育一小时。反应结束后，将每孔7微升涂在方形GC+1％ Isovitalex板上，在37℃5％CO2下培养过夜。
孵育后，手工计数并记录平板上每个点的菌落数量(菌落形成单位，CFU)。平板由MACROLAB仪器采集。
阴性对照是在热灭活补体和血清样本存在的情况下测试细菌，以检测潜在的血清毒性；以及在存在活性人补体但不存在血清样本的情况下测试细菌，以检测潜在的补体毒性。
与不含血清的对照相比，杀菌滴度被计算为给予50％杀伤力的血清稀释度的倒数。
BAI方法
第4天：SV-HUC-1细胞在F-12Nut混合培养基+10％ FBS的96孔板中接种(35000细胞/孔)。
第1天：在GC+1％的Isovitalex琼脂圆板上从冷冻的等分试样中划线细菌，并在37℃下培养过夜。
第0天：
步骤1)细菌制备：细菌在GC 1％isovitalex培养基中生长至A600nm＝0.5。然后用俄勒冈绿对细菌进行染色，最终达到A600＝0.05。
为了进行染色，将细菌以8000rpm离心5分钟，然后重新悬浮在1mg/ml在PBS中1:200稀释的俄勒冈绿。然后将被染色的细菌在37℃下培养15分钟，用PBS清洗并重新悬浮在1ml PBS/BSA 2％中。
步骤2)血清稀释：在96个圆孔板中，血清被稀释为1:100，然后被连续稀释(取决于同源或异源菌株)为10个稀释点(1:100至1:51200或1:100至1:1968300)。
步骤3)中和：60微升血清+60微升细菌，然后在室温下孵育15分钟。
在加入血清+细菌(100微升/孔)之前，用PBS清洗细胞3次，然后在37℃下孵育1小时。第二次洗涤(PBS中3次)后，将细胞重悬于4％的甲醛中，在室温下黑暗中20分钟。在另一次洗涤(PBS中1次)后，将其重新悬浮在每孔100μl H2O中。
在Opera Phenix上读取平板(或在黑暗中储存在+4℃)。BAI被计算为相比于没有血清存在的细菌，每个稀释的血清样品诱导的细菌粘附抑制的百分比，计算方法如下。
细菌粘附抑制率％在每个稀释度i下的每个样品j的计算方法为：
0％细菌体积等于观察到的明矾免疫的血清观察到的平均细菌体积。
100％细菌体积等于0-没有观察到粘附。
结果：
在使用人血清作为补体源在两次免疫后收集的汇合血清中，对FA1090、WHO-M、F62、MS11、WHO-N和SK92-679菌株进行了hSBA测定(图21)。
结果显示，对于六个测试菌株中的五个，来自FA1090双突变体的OMVs(在图21中称为GMMA)令人惊讶地能够诱导SBA滴度高于由F62菌株的类似Δlpxl1,Δrmp双突变体产生的OMVs诱导的滴度。来自FA1090和F62双突变体(Δlpxl1,Δrmp)的OMVs都不能诱导对SK92-679菌株的杀菌滴度。
在两次免疫后收集的汇合血清中，对FA1090(图22A)、SK-92-679(图22B)和WHO-M(图22C)菌株进行了BAI测试。
结果表明，对于所有测试的菌株，FA1090 2KO的OMVs(在图22中称为GMMA)诱导出能够抑制细菌粘附在细胞上的功能性抗体。
实施例17：评估通过FA1090突变体的OMVs诱导rmp抗体7周大的CD1雌性小鼠在第1天和第29天用在明矾中配制的来自FA1090ΔlpxL1突变体(或1KO)的1批OMVs和来自FA1090Δlpxl1,Δrmp双突变体(或2KO)的2批OMVs进行两次IP免疫。
用Luminex测定法对汇集的血清进行抗rmp IgG测定。
图23中的结果显示，虽然FA1090ΔlpxL1单突变体(1KO)的OMVs(图23中称为GMMA)能够诱导产生针对rmp的抗体，但FA1090双突变体(2KO)的OMVs不能诱导产生抗rmp IgG，进一步证明了FA1090 2KO中没有这种蛋白。
实施例18：Rmp缺失导致淋球菌高度出泡(hyperblebbing)
进行了10个2L规模的发酵。三次使用FA1090Δlpxl1(运行#1至3)，七次使用FA1090Δlpxl1,Δrmp(2KO)菌株(运行#4至10)。OMVs的产量是在浓缩体(CB)点计算的，这相当于最后过滤步骤后获得的OMV级分(在实施例10中概述的过程中)。数据列于表7。
表7
与Δlpxl1,Δrmp(双突变体)相比，Δlpxl1(单突变体)在收获时达到较高的最终OD590，即6.8±0.3vs 4.3±0.8。然而，对于Δlpxl1,Δrmp(双突变体)，在浓缩体时确定的OMV产量是两倍以上(49±11vs 15±1毫克蛋白质/L过滤上清液)。
因此，双突变体的生产力(每OD)是5.28(2dp)倍。
实施例19：CD1小鼠的后续免疫原性研究
研究设计:将7至8周龄的雌性CD1小鼠(10只/组)在第1、29和57天用7个不同批次(标记为TRD4至TRD10)的2KO(Δlpxl1,Δrmp)FA1090 OMVs(10μg，200μL)吸附在明矾(3mg/mL)上，或单独的明矾(200μL)或对比疫苗Bexsero(200μL)进行腹膜内免疫。
由于观察到Bexsero的脑膜炎球菌B群外膜囊泡成分能够对淋球菌感染产生交叉保护，所以使用Bexsero作为对比疫苗(Petousis-Harris H et al.Lancet 2017；390:1603–1610)。
OMV批次的制备与先前描述的一样(见实施例10)，不同的是，发酵是以2L的规模进行的，并且为了纯化OMV，每次运行都要处理相当于400-550mL过滤上清液的等分。
血液样本在第一次接种前(第0天)、第二次接种后4周(4wp2)和第三次接种后2周(2wp3)采集。在2wp3时进行了阴道清洗。
对免疫应答的分析是在用所有七个批次的2KO FA1090 OMVs免疫的动物的汇合血清上测试4wp2和2wp3进行的。对7个批次中的3个批次(TRD4、TRD5和TRD9)免疫的动物的单一血清2wp3和阴道洗液2wp3进行了更广泛和有统计学依据的免疫应答分析。TRD4、TRD5和TRD9的选择是基于它们的纯度(较少的GROEL蛋白污染)，如Western Blot测定(数据未显示)。
方法：
●hSBA的测量如实施例16中所述。根据实施例12中进行的遗传分析，选择了10个异源菌株(即选择了一个在不同遗传群中具有代表性的菌株小组)。还选择了表达不同PorB变体的菌株，具体如下：
o PorB 1a菌株-SK92-679,WHO-F,WHO-G,WHO-N
o PorB 1b菌株-FA1090,F62,MS11,BG27,WHO-M,BG8.
GC14
●使用Luminex对FA1090 2KO候选疫苗的血清和阴道洗液中的IgG或阴道洗液中的IgA进行量化，基本上如下所述。
-Luminex Magplex珠子在室温下平衡，并根据制造商的说明准备使用。激活和清洗的珠子与悬浮在50mM MES pH 5中的40ug/mL2KO FA1090 OMVs(TRD9)孵育2小时。偶联的珠子最后用PBS/0.05％ Tween清洗两次，并储存在4℃的500μL PBS/0.05％Tween/0.5％BSA(检测缓冲液)中。
-对于单个血清测试，每个平板被认为是一个独立的测试，包含8个空白孔，2个重复的标准血清(STD)和9个待测血清。对于单个阴道洗液测试，每个平板被视为独立的测试，包含10个空白孔，2个标准血清(STD)的复制和10个待测的阴道洗液。
-血清和STD在检测缓冲液中预稀释，然后在96孔微孔板中进行连续8次连续3倍稀释步骤(最终体积为50μL/孔)。对于阴道洗液，连续7次连续3倍稀释步骤进行了分析。
-与2KO FA1090 OMVs TRD9偶联的珠子被制备成分配3000个珠子/孔。在平板中分配之前，立即用涡旋混合珠子约20秒，然后将50μL加入预稀释的血清中，每孔最终体积为100μL。
-板子在RT下，在700rpm的摇床上黑暗中孵育60分钟，孵育后，用200μL PBS(洗涤缓冲液)洗涤板子三次，除去未结合的抗体。
-对于特异性抗OMVs IgG检测，然后在PBS pH 7.2、0.05％Tween 20、0.5％ BSA和平板中每孔装入50μL 2.5μg/mL R-Phycoerythrin-AffiniPure F(ab')2Fragment山羊抗小鼠-IgG Fcγfragment specific(Jackson Immunoresearch 115-116-071)，在RT下以700rpm在平板摇床上在黑暗中孵育60分钟。
-对于特异性抗OMV IgA检测，在PBS pH 7.2、0.05％ Tween 20、0.5％ BSA和平板中每孔装入50μL 5μg/mL R-Phycoerythrin山羊抗小鼠IgA(Southern Biotech 1040-09)，在RT下以700rpm在平板摇床上在黑暗中孵育60分钟。
-洗涤后，将珠子悬浮在100μL的PBS中，在用Bioplex 200分析前摇晃。通过Bioplex Manager 6.2软件(BioRad)实时获取数据，并用于拟合标准曲线模型。
结果：用吸附在明矾上的FA1090 2KO OMV候选疫苗免疫CD1小鼠，可诱导出：
·在所有测试的FA1090 2KO OMV疫苗批次(7个批次)中，4wp2和2wp3汇合血清中针对FA1090同源菌株的hSBA滴度具有可比性-见图24
·与Alum和Bexsero相比，所有FA1090 2KO OMV测试批次(3个批次)的单一2wp3血清对同源菌株FA1090和10个异源菌株测试中8个的人类补体(hSBA)滴度具有统计学意义显著更高的SBA-见图25
·在所有测试的FA1090 2KO OMV疫苗批次(7个批次)中，4wp2和2wp3汇合血清的特异性抗OMV IgG滴度具有可比性-图26
·与明矾和Bexsero相比，所有3个FA1090 2KO OMV测试批次的单一2wp3血清(图27)和阴道清洗液的抗OMV IgG滴度均有统计学意义的提高(图28A和图28B)。
·与Alum和Bexsero相比，所有3个FA1090 2KO OMV测试批次的阴道洗液的抗OMVIgA滴度均有统计学意义上的提高--图29A和图29B
结论：能够阻断不同免疫机制的功能性免疫应答以及与Bexsero商业疫苗相比的优越性，构成了支持FA1090 2KO(Δlpxl1,Δrmp)OMV候选疫苗的重要证据。
FA1090 2KO OMV疫苗能够对同源菌株FA1090和大多数测试的异源菌株诱导出统计学上优越的杀菌滴度(与明矾和Bexsero相比)。
通过对小鼠血清和阴道清洗液的Luminex分析测量的免疫原性应答显示了OMV特异性抗体的显著诱导。特别是，FA1090 2KO OMV疫苗能够诱导更高的抗OMV IgG滴度，与血清和阴道清洗液中的Alum和Bexsero相比，GMR≥2(LL 95％ CI)，与阴道清洗液中的Alum和Bexsero相比，抗OMV IgA滴度GMR≥2(LL 95％ CI)。
最后，在小鼠身上的数据(在实施例16中提出)表明，FA1090 2KO OMV候选疫苗能够激发抗体，抑制三种不同的淋球菌菌株(同源菌株FA1090和两种选定的异源菌株)对代表尿路上皮的原始输尿管细胞系SVHUC-1细胞的粘附。
总之，这些临床前结果支持吸附在明矾上的FA1090 2KO OMV候选疫苗的免疫原性。
实施例20：FA1090疫苗菌株与GC_0817560的比较
目的：从公开的和内部测序的基因组中检索FA1090 2KO OMVs中存在的最丰富的蛋白质序列(见实施例12)，并比较FA1090 2KO((Δlpxl1,Δrmp)和GC_0817640菌株之间OMVs中存在的最丰富的蛋白质序列和多样性，并描述控制功能性OpaB表达的相变束的特征。
材料和方法
FA1090_2KO基因组的组装：本文所介绍的实施例中使用的FA1090 2KO菌株(Δlpxl1,Δrmp)的基因组如实施例9所述进行测序。来自两次测序的原始数据被混合并组装在一起，以产生最终的、封闭的和完整的、总长度为2,161,273bp的染色体和附属短质粒的组装。
GC_0817560基因组的组装：淋球奈瑟菌菌株GC_0817560的基因组序列(重叠群水平)可从PubMLST数据库中公开获得。现有的序列不是封闭的，由151个重叠群组成，总长度为2,154,632bp。该数据库还参考了欧洲核苷酸档案馆(ENA)提供的Illumina原始数据，登录号为ERR349896。
最丰富的GMMA蛋白成分的蛋白质序列的鉴定：如实施例12所述，顶端蛋白成分占OMVs蛋白质量的80％以上。最丰富的蛋白质是。PorB和Opa家族蛋白。
在FA1090 2KO、GC_0817560和其他公开的基因组上鉴定PorB基因：PorB的蛋白质序列是通过DNA和蛋白质序列水平的同源BLAST搜索提取的。搜索是在BLAST同源搜索的基础上用Bigsdb软件进行的。假设PorB的起始和终止基因序列位置是由PubMLST数据库注释的(基因座NEIS2020，FA1090基因组标识符NGO1812)。
Bigsdb软件允许识别基因组序列上的基因座的位置，并为每个基因组中的这些基因座分配基因和蛋白质的唯一标识符。用MUSCLE软件对PubMLST数据库中迄今为止的所有淋球菌菌株的蛋白质序列进行了多重比对。用MEGA软件通过NJ法和序列间的p-距离进行蛋白质系统发育的重建。
用BioEdit软件对从FA1090 2KO和GC_0817560基因组中提取的蛋白质序列进行了图解。可变密码子由Blosum62身份/相似性距离矩阵着色(可变密码子为黑色，具有相似理化性质的可变密码子为方框，由Blosum62矩阵定义并由BioEdit软件报告)。
FA1090 2KO基因组上Opa基因的鉴定：淋球奈瑟菌FA1090菌株基因组的注释(来自GenBank Refseq数据库的登录标识符NC_002946)被用来注释FA1090 2KO(Δlpxl1,Δrmp)封闭基因组上的基因，该基因组是内部测序。用Bedtools getfasta功能提取基因序列，然后用BLAST得到最接近的匹配结果。
对GC_0817560基因组上的Opa基因进行鉴定：鉴定GC_0817560基因组上的基因座的方法与鉴定FA1090 2KO基因组的方法基本相同，从FA1090 2KO基因组及其侧翼区域(上游和下游1000核苷酸)提取的序列开始。这些序列被用来用BLAST确定基因的确切位置。该方法还通过在GC_0817560基因组上搜索被注释为每个Opa基因的上游和下游的侧翼基因的位置而得到补充。
opaB的群体量化：用于评估群体中具有完整版蛋白质翻译序列的细菌数量的分析管道，首先是将Illumina测序读取与FA1090 2KO基因组的封闭基因组序列进行映射。
本实施例中包括的样本有：
·FA1090_野生型(没有基因修饰的野生型FA1090菌株)
·FA1090_2KO_适应型((Δlpxl1,Δrmp)
·从ENA下载的GC_0817560读取(id:ERR349896)
·其他菌株：包括从ENA下载的F62、SK92-679、WHO-F和WHO-G的序列以及WHO-M和WHO-N的公开序列(WHO-M的ID：ERR352751和ERR388420，WHO-N的ID：ERR363586)。
对于映射，使用了默认参数的Burrows-Wheeler Aligner(BWA)mem算法，因为它自动使用母本配对，并将每个读取分配到基因组上的一个位置。这两个特点对于具有密切相似的同族体的基因中读取的准确比对特别重要。比对后，用samtools套件对产生的文件进行分类和索引。通过samtools tview的迭代，一个R脚本被用来提取与感兴趣区域比对的所有读取，直到参考序列(去除空格后)达到封闭基因组上短序列重复(SSR)再加上两个侧翼的碱基的长度。之后，脚本缺失了不完全覆盖该区域的读取，然后总结了每个读取中观察到的SSR的长度。
翻译脚本通过连接以下组装了该基因座的序列：
-从FA1090 2KO基因组中提取的从起始密码子到SSR开头的序列
-从跨整个SSR比对的每个读取中切下的SSR的序列
-从FA1090 2KO基因组中提取的从SSR的末端到终止密码子的序列
然后使用seqinr R软件包的特定功能对每个组装的序列进行翻译，并计算出ON/OFF群体的百分比。
结果
PorB：PorB是FA1090_2KO菌株的OMV中最丰富的蛋白质(见实施例12)。PorB分子的整体淋球奈瑟菌的多样性在图30的系统发育树中得到体现。
来自FA1090_2KO和GC_0817560的PorB蛋白序列的直接比较在图31的蛋白序列比对中被描述出来，其中胞外可变环(1-8)是由PubMLST分类确定的。
这两个菌株所具有的分子被归类为PorB IB等位基因形式。图31显示，两个菌株之间的PorB多样性主要集中在胞外环5、6和7。细胞外环的功能作用对淋球菌PorB分子进行了深入研究(Infect Immun.2013Dec；81(12):4383–4391)，特别是环4-7被证明与补体调节因子C4bp结合，并在抵抗血清介导的杀伤方面发挥了作用。
Opa：在FA1090 2KO菌株中，确定了11个Opa位点(见表8)。其中大部分在基序序列中处于OFF相位变异。对于opaD，在公共数据库上有一个ON序列，我们在内部测序的样本中观察到一个OFF序列。在2KO的FA1090菌株中，opaB占主导地位。
表8：FA1090 2KO基因组上确定的Opa基因座的坐标
染色体 起始 末端 基因 链
1 69142 69956 opaA -
1 74894 75692 opaB -
1 1000502 1001347 opaC -
1 1483931 1484763 opaD +
1 1833181 1834022 opaE -
1 925679 926526 opaF +
1 2039329 2040161 opaG -
1 1533814 1534603 opaH +
1 1428325 1429157 opaI -
1 1035967 1036736 opaJ +
1 1232206 1233036 opaK +
该分析成功地评估了测序群体中导致opaB的完整氨基酸序列的细菌比例。
opaB是FA1090淋球菌OMV中第二丰富的抗原，几乎整个群体都表达了一个可以在FA1090 WT(89％)和2KO(中位数96％)中翻译成完整蛋白质的序列。相反，GC_0817560以及本分析中报道的其他菌株的完整蛋白的数量较少，分别为20％和中位数19％(见图32)。
结论
这一数据表明，所分析的两个菌株的PorB序列在环状区域有差异，与FA1090 2KO(Δlpxl1,Δrmp)相比，GC_0817560菌株中功能性OpaB蛋白的含量预计较少。
PorB和OpaB是存在于淋球菌OMVs中的两个最丰富的蛋白质。
序列表
SEQ ID NO:1–FA1090 Rmp核酸序列
ATGACCAAACAGCTGAAATTAAGCGCATTATTCGTTGCATTGCTCGCTTCCGGCACTGCTGTTGCGGGCGAGGCGTCCGTTCAGGGTTACACCGTAAGCGGCCAATCGAACGAAATCGTACGCAACAACTATGGAGAATGCTGGAAAAACGCCTACTTTGATAAAGCAAGCCAAGGTCGCGTAGAATGCGGCGATGCGGTTGCCGTCCCCGAGCCCGAACCCGCGCCTGTCGCCGTTGTGGAGCAGGCTCCTCAATATGTTGATGAAACCATTTCCCTGTCTGCCAAAACCCTGTTCGGTTTCGATAAGGATTCATTGCGCGCCGAAGCTCAAGACAACCTGAAAGTATTGGCGCAACGCCTGAGTCGAACCAATGTCCAATCTGTCCGCGTCGAAGGCCATACCGACTTTATGGGTTCTGAAAAATACAATCAGGCTCTGTCCGAACGCCGCGCATACGTAGTGGCAAACAACCTGGTCAGCAACGGCGTACCTGCTTCTAGAATTTCTGCTGTCGGCTTGGGCGAATCTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAA
SEQ ID NO:2–FA1090 Rmp蛋白序列
MTKQLKLSALFVALLASGTAVAGEASVQGYTVSGQSNEIVRNNYGECWKNAYFDKASQGRVECGDAVAVPEPEPAPVAVVEQAPQYVDETISLSAKTLFGFDKDSLRAEAQDNLKVLAQRLSRTNVQSVRVEGHTDFMGSEKYNQALSERRAYVVANNLVSNGVPASRISAVGLGESQAQMTQVCQAEVAKLGAKASKAKKREALIACIEPDRRVDVKIRSIVTRQVVPARNHHQH
SEQ ID NO:3-FA1090 lpxl1核酸序列
ATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGGCCTGATCGGTTCGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTCCCGAATGGGACGAAGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCAAAACTGATGCTCGAATACGGCTTATATTGGTACGCGTCTGCCAAATGCCTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTACCCGCACTTTACCGCGTTCGAGATGGCGGTGTACGCGCTTAATCAGGATGTCCCGCTGATCAGTATGTATTCCCACCAAAAAAACAAGATATTGGACGAACAGATTTTGAAAGGCCGCAACCGCTATCACAACGTCTTCCTTATCGGGCGCACCGAAGGGCTGCGCGCCCTCGTCAAACAGTTCCGCAAAAGCAGTGCGCCGTTCCTGTATCTGCCCGATCAGGATTTCGGACGCAACAATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGCATTCAGACGGCAACGATTACCGGCTTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCGGACAATACGGTTACATTGCAATTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGAGTGAAGACGCGCAAGCCGACGCGCAACGTATGAACCGCTTTATCGAAGAACGCGTGCGCGAACACCCGGAACAATATTTCTGGCTGCACAAGCGTTTCAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGA
SEQ ID NO:4-FA1090 Lpxl1蛋白序列
MKFIFFVLYVLQFLPFALLHKIAGLIGSLAYLLVKPRRRIGEINLAKCFPEWDEEKRKTVLKQHFKHMAKLMLEYGLYWYASAKCLKSLVRYRNKHYLDDALAAGEKVIILYPHFTAFEMAVYALNQDVPLISMYSHQKNKILDEQILKGRNRYHNVFLIGRTEGLRALVKQFRKSSAPFLYLPDQDFGRNNSVFVDFFGIQTATITGLSRIAALANAKVIPAIPVREADNTVTLQFYPAWKSFPSEDAQADAQRMNRFIEERVREHPEQYFWLHKRFKTRPEGSPDFY
SEQ ID NO:5–Lpxl1基因座(对应于图12)
CCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCGCGCGGAGCGGCATTGGCGGCTTTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTGGTCGGCAAAGGCAAGGCGGCGAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAAATGCTGGGACTTTCGGGAACGCCGCAGGCGGATGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGAAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGCCTGAAAAGAAAATGTGTACCGAGATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGGCCTGATCGGTTCGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTCCCGAATGGGACGAAGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCAAAACTGATGCTCGAATACGGCTTATATTGGTACGCGTCTGCCAAATGCCTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTACCCGCACTTTACCGCGTTCGAGATGGCGGTGTACGCGCTTAATCAGGATGTCCCGCTGATCAGTATGTATTCCCACCAAAAAAACAAGATATTGGACGAACAGATTTTGAAAGGCCGCAACCGCTATCACAACGTCTTCCTTATCGGGCGCACCGAAGGGCTGCGCGCCCTCGTCAAACAGTTCCGCAAAAGCAGTGCGCCGTTCCTGTATCTGCCCGATCAGGATTTCGGACGCAACAATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGCATTCAGACGGCAACGATTACCGGCTTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCGGACAATACGGTTACATTGCAATTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGAGTGAAGACGCGCAAGCCGACGCGCAACGTATGAACCGCTTTATCGAAGAACGCGTGCGCGAACACCCGGAACAATATTTCTGGCTGCACAAGCGTTTCAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGACTACATAAAATTACAAAACAAATCAGGCGTTTCAGATCAAAAACCCCGATTGTTTTTGGGAATTTGAAACCCGGGTTGTACAAACAGGATTTGCCGGACGGTTTTAACGGTTCAGTTGTTTGTAAAAACAATGCTTTTTTAAAATTGACAAAAAACGAAATCGGTTTTAAAGGCTTATTCCGAGAACAAAGGGGAGTGGATGCCGAAAACCCGGTTAATATATTATAGTGGATTAACAAAAACCAATACGGCGTTGCTTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCCCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGCGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGCCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATAAAATTAAATTTGTTTAAAAACATAAAGTTGTAAACAAGTATCTCATATAAGCCTTTTTCATTAAACAGATAGTCAGATATTTTGTGCTAAAAATTTATATAATATTTAAATTAATATCAAGTTATAAAAAATATATGGAATTTTATTTTGTTTATTTATAATTTTAAGCA
SEQ ID NO:6–从FA1090Δlpxl1,Δrmp菌株提取的Lpxl1基因座(对应于图13)
CCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCGCGCGGAGCGGCATTGGCGGCTTTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTGGTCGGCAAAGGCAAGGCGGCGAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAAATGCTGGGACTTTCGGGAACGCCGCAGGCGGATGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGAAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAGATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGACCTGACGGGTTTGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTTCCGAATGGAGTGAGGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCGAAACTGATGTTGGAATACGGTTTATATTGGTACGCGCCTGCCGGACGTTTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTATCCGCACTTCACCGCTGCAGTTGCAGTGACTAACTAGGAGGAATAAATGGCTAAAATGAGAATATCACCGGAATTGAAAAAACTGATCGAAAAATACCGCTGCGTAAAAGATACGGAAGGAATGTCTCCTGCTAAGGTATATAAGCTGGTGGGAGAAAATGAAAACCTATATTTAAAAATGACGGACAGCCGGTATAAAGGGACCACCTATGATGTGGAACGGGAAAAGGACATGATGCTATGGCTGGAAGGAAAGCTGCCTGTTCCAAAGGTCCTGCACTTTGAACGGCATGATGGCTGGAGCAATCTGCTCATGAGTGAGGCCGATGGCGTCCTTTGCTCGGAAGAGTATGAAGATGAACAAAGCCCTGAAAAGATTATCGAGCTGTATGCGGAGTGCATCAGGCTCTTTCACTCCATCGACATATCGGATTGTCCCTATACGAATAGCTTAGACAGCCGCTTAGCCGAATTGGATTACTTACTGAATAACGATCTGGCCGATGTGGATTGCGAAAACTGGGAAGAAGACACTCCATTTAAAGATCCGCGCGAGCTGTATGATTTTTTAAAGACGGAAAAGCCCGAAGAGGAACTTGTCTTTTCCCACGGCGACCTGGGGGACAGCAACATCTTTGTGAAAGATGGCAAAGTAAGTGGCTTTATTGATCTTGGGAGAAGCGGCAGGGCGGACAAGTGGTATGACATTGCCTTCTGCGTCCGGTCGATCAGGGAGGATATCGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGGAGAAAATAAAATACTATATTTTACTGGATGAATTGTTTTAGTACCTGGAAGGAATAATGAGTCGACAGGATTTCGGACGCAACGATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGTATTCAGACGGCAACGATTACCGGATTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCAGACAATACGGTTACATTGCATTTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGGGTGAAGACGCGAAAGCCGACGCGCAGCGCATGAACCGTTTTATCGAAGACAGGGTGCGCGAACATCCGGAACAATATTTTTGGCTGCACAAGCGTTTTAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGACTACATAAAATTACAAAACAAATCAGGCGTTTCAGATCAAAAACCCCGATTGTTTTTGGGAATTTGAAACCCGGGTTGTACAAACAGGATTTGCCGGACGGTTTTAACGGTTCAGTTGTTTGTAAAAACAATGCTTTTTTAAAATTGACAAAAAACGAAATCGGTTTTAAAGGCTTATTCCGAGAACAAAGGGGAGTGGATGCCGAAAACCCGGTTAATATATTATAGTGGATTAACAAAAACCAATACGGCGTTGCTTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCCCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGCGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGCCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATAAAATTAAATTTGTTTAAAAACATAAAGTTGTAAACAAGTATCTCATATAAGCCTTTTTCATTAAACAGATAGTCAGATATTTTGTGCTAAAAATTTATATAATATTTAAATTAATATCAAGTTATAAAAAATATATGGAATTTTATTTTGTTTATTTATAATTTTAAGCA
SEQ ID NO:7–Rmp基因座(对应于图14)
CAACGGCAATCGTGCGATATGGAAAAAATCCCCCTAAAGTAATGACACGGAATTGATTTTTCGGCATGATAGACTATCAGGAAACAGGCTGTTTTACGGTTGTTTTCAGGCGTTGAGTATTGACAGTCCGCCCCCTGTTTCTTTATAGTGGAGACTGAAATATCCGATTTGCCGCCATGTTTCTACAGCGGCCTGTATGTTGGCAATTCAGCAGTTGCTTCTGTATCTGCTGTACAAATCTAATGAGGGAATAAAATGACCAAACAGCTGAAATTAAGCGCATTATTCGTTGCATTGCTCGCTTCCGGCACTGCTGTTGCGGGCGAGGCGTCCGTTCAGGGTTACACCGTAAGCGGCCAATCGAACGAAATCGTACGCAACAACTATGGAGAATGCTGGAAAAACGCCTACTTTGATAAAGCAAGCCAAGGTCGCGTAGAATGCGGCGATGCGGTTGCCGTCCCCGAGCCCGAACCCGCGCCTGTCGCCGTTGTGGAGCAGGCTCCTCAATATGTTGATGAAACCATTTCCCTGTCTGCCAAAACCCTGTTCGGTTTCGATAAGGATTCATTGCGCGCCGAAGCTCAAGACAACCTGAAAGTATTGGCGCAACGCCTGAGTCGAACCAATGTCCAATCTGTCCGCGTCGAAGGCCATACCGACTTTATGGGTTCTGAAAAATACAATCAGGCTCTGTCCGAACGCCGCGCATACGTAGTGGCAAACAACCTGGTCAGCAACGGCGTACCTGCTTCTAGAATTTCTGCTGTCGGCTTGGGCGAATCTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAAGGCTAGGTAATATCTTGCCGATGCATGAGGTTAGCGGATTTTGTACCGGGTACTGTTGCAATATTCGTGAAACGTCGGCCGGTATCGATGATGTGAAACAAACCCCGCTTTTGCGGGGTTTGTTTTTTTGGGTGGTTTTCTGAAACGGCTATCGTCAGAATCGGGGTGCAGGTTCGGATTCGGATTCAGATTCATGTTTGTGTCCCATTGCCGCGCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACCGGTTTAAATTTAATCCACTATATCGGTTGAAACTCTGATTTTAAGGCGGTAGGATGTGGGTTTGCCCATAGCAAGGGAATCCTTTCTGTATCAAGCCCCGAAAGGGATAATTCATACAAATTCACGCCTTTCCCCCTCATTGGGAAATGGATGGAATCGTGCCCGATGTGTGCGGCACTGTATGCCGGATATGGTTTTATCATCATCCCT
SEQ ID NO:8–从FA1090Δlpxl1,Δrmp菌株中提取的Rmp基因座(对应于图15)
CAACGGCAATCGTGCGATATGGAAAAAATCCCCCTAAAGTAATGACACGGAATTGATTTTTCGGCATGATAGACTATCAGGAAACAGGCTGTTTTACGGTTGTTTTCAGGCGTTGAGCCCGGGACCTCTTTAGCTTCTTGGAAGCTGTCAGTAGTATATCTAATAATTTATCTCCATTCCCTTTAGTAACGTGTAACTTTCCAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTATTTCCTCCCGTTAAATAATAGATAACTATTAAAAATAGACAATACTTGCTCATAAGTAATGGTACTTAAATTGTTTACTTTGGCGTGTTTCATTGCTTGATGAAACTGATTTTTAGTAAACAGTTGACGATATTCTCGATTGACCCATTTTGAAACAAAGTACGTATATAGCTTCCAATATTTATCTGGAACATCTGTGGTATGGCGGGTAAGTTTTATTAAGACACTGTTTACTTTTGGTTTAGGATGAAAGCATTCCGCTGGCAGCTTAAGCAATTGCTGAATCGAGACTTGAGTGTGCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTTGTAGAATCCTTCTTCAACAATCAGATAGATGTCAGACGCATGGCTTTCAAAAACCACTTTTTTAATAATTTGTGTGCTTAAATGGTAAGGAATACTCCCAACAATTTTATACCTCTGTTTGTTAGGGAATTGAAACTGTAGAATATCTTGGTGAATTAAAGTGACACGAATGTTCAGTTTTAATTTTTCTGACGATAAGTTGAATAGATGACTGTCTAATTCAATAGACGTTACCTGTTTACTTATTTTAGCCAGTTTCGTCGTTAAATGCCCTTTACCTGTTCCAATTTCGTAAACGGTATCGGTTTCTTTTAAATTCAATTGTTTTATTATTTGGTTGAGTACTTTTTCACTCGTTAAAAAGTTTTGAGAATATTTTATATTTTTGTTCATGTAATTACTCCTGAAGTGATTACATCTGTAAATAAATACAGAAGTTAAACGATTTGTTTGTAATTTTAGTTATCTGTTTAAAAAGTCATAAGATTAGTCACTGGTAGGAATTAATCTAACGTATTTATTTATCTGCGTAATCACTGTTTTTAGTCTGTTTCAAAACAGTAGATGTTTTATCTACATTACGCATTTGGAATACCAACATGACGAATCCCTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCTAATTTAACTTCAATTCCTATTATACACAAAATTTTAAGATACTGCACTATCAACACACTCTTAAGTTTCCCGGGTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAAGGCTAGGTAATATCTTGCCGATGCATGAGGTTAGCGGATTTTGTACCGGGTACTGTTGCAATATTCGTGAAACGTCGGCCGGTATCGATGATGTGAAACAAACCCCGCTTTTGCGGGGTTTGTTTTTTTGGGTGGTTTTCTGAAACGGCTATCGTCAGAATCGGGGTGCAGGTTCGGATTCGGATTCAGATTCATGTTTGTGTCCCATTGCCGCGCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACCGGTTTAAATTTAATCCACTATATCGGTTGAAACTCTGATTTTAAGGCGGTAGGATGTGGGTTTGCCCATAGCAAGGGAATCCTTTCTGTATCAAGCCCCGAAAGGGATAATTCATACAAATTCACGCCTTTCCCCCTCATTGGGAAATGGATGGAATCGTGCCCGATGTGTGCGGCACTGTATGCCGGATATGGTTTTATCATCATCCCT
SEQ ID NO:9:lpxl1_UP FW
GGCATTTGTATTTTGCCGTCTG
SEQ ID NO:10-lpxl1_DO REV
GCGAAATGTACGCCATTTTCTACGC
SEQ ID NO:11-UpIII-FOR
gctctagaGGTCGTCTATCCGTTCCGTA
SEQ ID NO:12-UpIII-REV
tcccccgggCTCAACGCCTGAAAACAACC
SEQ ID NO:13-DpIII-FOR
tcccccgggTCAAGCGCAAATGACTCAAG
SEQ ID NO:14-DpIII-REV
cccgctcgagGGGAAAGGCGTGAATTTGTA
SEQ ID NO:15-EryR_gono_SmaI-Fw
ATTCGCCCGGGAAACTTAAGAGTGTGTTGATAGTG
SEQ ID NO:16-EryR_gono_SmaI-Rev
ATTCGCCCGGGACCTCTTTAGCTTCTTGG
SEQ ID NO:17-lpxl1 est FW
CCGCCAAACTCAATCCTTCG
SEQ ID NO:18-lpxl1 est REV
GCAAACTTTTGTTTCACCGTTTCCG
SEQ ID NO:19-NGO_lpxL1wtcheck-Fw
CCGCGTTCGAGATGG
SEQ ID NO:20-NGO_lpxL1wtcheck-Rev
GCGGAACTGTTTGACGAG
SEQ ID NO:21-UP_CHECK_NGO1577-Fw
GTGTGTCCAGTCGTAGCAGG
SEQ ID NO:22-DW_CHECK_NGO1577-Rev
AGGGATGATGATAAAACCATATCC
SEQ ID NO:23-INTwt_NGO1577-Fw
TCGTACGCAACAACTATGGAG
SEQ ID NO:24-INTwt_NGO1577-Rev
CATCAACATATTGAGGAGCCTG
SEQ ID NO:25-FA1090 2KO PorB蛋白
MKKSLIALTLAALPVAAMADVTLYGAIKAGVQTYRSVEHTDGKVSKVETGSEIADFGSKIGFKGQEDLGNGLKAVWQLEQGASVAGTNTGWGNKQSFVGLKGGFGTIRAGSLNSPLKNTGANVNAWESGKFTGNVLEISGMAQREHRYLSVRYDSPEFAGFSGSVQYAPKDNSGSNGESYHVGLNYQNSGFFAQYAGLFQRYGEGTKKIEYDGQTYSIPSLFVEKLQVHRLVGGYDNNALYVSVAAQQQDAKLYGAMSGNSHNSQTEVAATAAYRFGNVTPRVSYAHGFKGTVDSANHDNTYDQVVVGAEYDFSKRTSALVSAGWLQEGKGADKIVSTASAVVLRHKF
SEQ ID NO:26–FA1090 2KO PorB蛋白(环1)
TYRSVEHTDGKVSKVETGSEIA
SEQ ID NO:27–FA1090 2KO PorB蛋白(环2)
ASVAGTNTGWG
SEQ ID NO:28–FA1090 2KO PorB蛋白(环3)
LNSPLKNTGANVNAWESGKFTGNVLEISGMAQREHRY
SEQ ID NO:29–FA1090 2KO PorB蛋白(环4)
APKDNSGSNGE
SEQ ID NO:30-FA1090 2KO PorB蛋白(环5)
RYGEGTKKIEYDGQTYSIPSLFVEKL
SEQ ID NO:31–FA1090 2KO PorB蛋白(环6)
DAKLYGAMSGNSHN
SEQ ID NO:32–FA1090 2KO PorB蛋白(环7)
FKGTVDSANHDNT
SEQ ID NO:33–FA1090 2KO PorB蛋白(环8)
GWLQEGKGADKIVSTA
Figure IDA0004118932490000011
Figure IDA0004118932490000021
Figure IDA0004118932490000031
Figure IDA0004118932490000041
Figure IDA0004118932490000051
Figure IDA0004118932490000061
Figure IDA0004118932490000071
Figure IDA0004118932490000081
Figure IDA0004118932490000091
Figure IDA0004118932490000101
Figure IDA0004118932490000111
Figure IDA0004118932490000121
Figure IDA0004118932490000131
Figure IDA0004118932490000141
Figure IDA0004118932490000151
Figure IDA0004118932490000161
Figure IDA0004118932490000171
Figure IDA0004118932490000181

Claims (16)

1.一种菌株FA1090的基因修饰的淋球菌，其包含以下基因修饰：
a.减少或消除脂质A生物合成月桂酰基转移酶(lpxl1)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能；以及
b.减少或消除还原修饰蛋白(rmp)基因、mRNA和/或多肽的表达和/或功能。
2.根据权利要求1所述的淋球菌，其中所述lpxl1基因包含与SEQ ID NO:3所示序列至少80％相同的序列，并且其中所述rmp基因包含与SEQ ID NO:1中所示序列至少80％相同的序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的淋球菌，其中所述基因修饰：
a.减少或消除所述Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及
b.减少或消除所述Rmp多肽的表达和/或功能。
4.根据权利要求1-3所述的淋球菌，其中所述Lpxl1多肽包含与SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，并且所述Rmp多肽包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4所述的淋球菌，其中所述基因修饰由以下组成或包含以下：
a)破坏或缺失内源性lpxl1和rmp基因；或
b)在包含野生型lpxl1和rmp基因的菌株中抑制Lpxl1和Rmp多肽的表达。
6.一种产生根据权利要求1-5所述的淋球菌的方法，所述方法包括以下任何一项：
a)减少或消除淋球菌FA1090细菌中lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌中rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌；或
b)减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的rmp基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第一淋球菌FA1090细菌，和减少或消除所述第一淋球菌FA1090细菌的lpxl1基因mRNA和/或多肽的表达和/或功能，以产生第二淋球菌FA1090细菌。
7.一种从FA1090菌株淋球菌获得或可获得的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡包含降低水平或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽两者，任选地，其中所述降低水平或不可检测到水平的Lpxl1和Rmp多肽两者是与从野生型FA1090细菌获得的外膜囊泡相比测量的。
8.一种来自基因修饰的FA1090菌株淋球菌的外膜囊泡(OMV)，所述基因修饰的FA1090菌株淋球菌包含以下基因修饰：a)减少或消除lpxl1基因、lpxl1 mRNA、和/或Lpxl1多肽的表达和/或功能；以及b)减少或消除rmp基因、rmp mRNA和/或Rmp多肽的表达和/或功能，
所述OMV包含：
I.与来自缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比，降低水平的Rmp多肽；和
II.与来自所述比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比，降低水平的六乙酰化脂质A。
9.一种外膜囊泡，其获得自或可获得自根据权利要求1-5中任一项所述的淋球菌。
10.根据权利要求9所述的外膜囊泡，其包含减少或消除表达的所述Lpxl1多肽和减少或消除表达的所述Rmp多肽。
11.根据权利要求9所述的外膜囊泡，其包含与缺乏所述基因修饰的淋球奈瑟菌菌株FA1090的比较者OMV中的Rmp多肽水平相比降低水平的Rmp多肽，和与来自所述比较者OMV的六乙酰化脂质A的水平相比降低水平的六乙酰化脂质A。
12.根据权利要求7、权利要求8或权利要求9-11所述的外膜囊泡，其中所述外膜囊泡是原生外膜囊泡，即未经去污剂抽提。
13.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求7-12中任一项所述的外膜囊泡，任选地，其中所述免疫原性组合物还包含佐剂，任选地，其中所述佐剂是铝盐佐剂，例如氢氧化铝。
14.一种疫苗，其包含段落7-12中任一项的外膜囊泡或权利要求13所述的免疫原性组合物，和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的疫苗，其用于医药。
16.根据权利要求13所述的免疫原性组合物或根据权利要求14所述的疫苗，其用于治疗或预防由奈瑟菌例如淋球奈瑟菌引起的疾病。
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