CN116087507A - 人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒 - Google Patents

人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于试剂检测技术领域，公开了一种人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒。包括所述试剂盒组成包括Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带、0U/ml的标准血清1、100U/ml的标准血清2、100U/ml的标准血清3、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液、中止液。本发明在国内外，首次提供了一个可以同时检测integrinβ4的IgG和IgA自身抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒不仅敏感性高、特异性好，还易于推广使用。为黏膜类天疱疮的血清学诊断，尤其是integrinβ4自身抗体阳性的黏膜类天疱疮的诊断提供了有效和便利的工具。

Description

人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于试剂检测技术领域，具体涉及人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒。
背景技术
自身免疫性水疱病是一类以皮肤和黏膜损伤为特点的、由自身抗体参与致病的自身免疫性疾病。主要分为天疱疮和类天疱疮两大类。黏膜类天疱疮是类天疱疮的一种，主要表现为口腔、眼等黏膜部位的红斑、水疱、糜烂等，也可伴有皮肤损伤。然而，单纯依靠临床表现无法诊断。目前必须要依靠患者血清中自身抗体的检出才能确诊。黏膜类天疱疮相关的自身抗原目前已知的有6种，分别是BP180、laminin-332、integrinα6β4、BP230、type VIIcollagen和lamininγ1[1]。因此，在可疑患者血清中检测到这些自身抗原的抗体是诊断黏膜类天疱疮的必要条件。
目前在黏膜类天疱疮患者血清中，最常检出的是BP180、laminin-332自身抗体。BP230、type VII collagen自身抗体的检测方法虽然比较多，但是在黏膜类天疱疮中检出率非常低。lamininγ1作为黏膜类天疱疮的自身抗原是本课题组2022年首次报道的，因此，lamininγ1在黏膜类天疱疮患者血清中的检出情况，还需要进一步在大样本的筛查中逐步确认。根据现有文献报道，在黏膜类天疱疮患者血清中integrinα6β4的自身抗体检出率远低于BP180和laminin-332。然而，随着本课题组对黏膜类天疱疮的深入研究发现，其实integrinα6β4的自身抗体检出率，尤其是integrinβ4的自身抗体的检出率并不低[2]。之所以报道较少，主要是因为目前可用于integrinβ4自身抗体的检测方法比较少，且未能在世界范围内推广。
因此，建立容易操作和推广的检测integrinβ4自身抗体的ELISA方法，不仅能促进临床上黏膜类天疱疮的诊断，还能为深入研究integrinβ4自身抗体参与黏膜类天疱疮的机制奠定基础。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，本发明在多年实践经验的基础上建立检测人integrinβ4的IgG和IgA自身抗体的重组蛋白ELISA试剂盒，可以同时进行IgG和IgA自身抗体的检测。具有敏感性高、特异性好、操作简单的特点。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，所述试剂盒组成包括Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带、0U/ml的标准血清1、100U/ml的标准血清2、100U/ml的标准血清3、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液、中止液；其中所述0U/ml的标准血清1成分为含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；所述100U/ml的标准血清2成分为integrinβ4IgG抗体阳性血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；所述100U/ml的标准血清3成分为integrinβ4IgA抗体阳性血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；酶标IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，含量为8.0ml；酶标IgA抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，含量为8.0ml；反应缓冲液为体积占比99.9％的PBS、0.05％Tween20和0.05％NaN3的混合液，含量为50ml；清洗缓冲液为99.95％的PBS、0.05％Tween20的10倍浓缩液，含量为100ml；酶基质液为TMB和H2O2混合溶液，含量为8.0ml，其中TMB使用无水乙醇溶解，浓度为2.5mg/ml，H2O2浓度为0.03％体积比；中止液为0.5N盐酸溶液，含量为8ml。
进一步的，所述Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带为48孔。
进一步的，所述Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带制备方法为：
Integrinβ4胞内区重组蛋白和胞外区重组蛋白，均用PBS溶解，储存浓度为4mg/ml。包被前，两种重组蛋白等体积混合，然后使用PBS进行1000倍稀释，使得重组蛋白混合物终浓度达到2μg/ml。取96孔板进行蛋白的包被，每孔加入稀释后的重组蛋白混合物(2μg/ml)100μl，4度过夜(12-16小时)进行包被。包被完成后弃掉包被的液体，每孔加入200μl5％的脱脂奶粉(使用PBS稀释)，37度封闭1小时，弃掉封闭的液体，PBS洗涤3次(300μl/每孔)。弃净PBS，室温干燥。
人integrinβ4的IgG和IgA抗体检测试剂盒(ELISA)，利用ELISA方法定性测定血清中的Integrinβ4的IgG和IgA抗体。检测时，患者血清和标准血清加入到包被有integrinβ4重组蛋白的微孔条带，integrinβ4的抗体与抗原结合。洗涤后，去除未结合的血清蛋白，然后微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG(或IgA)抗体与人IgG(或IgA)结合，洗涤后，加入辣根过氧化物酶底物与辣根过氧化物酶反应，最后通过加入酸溶液终止酶反应。使用酶标仪测定吸光度，量化检测结果。
本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明在国内外，首次提供了一个可以同时检测integrinβ4的IgG和IgA自身抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒不仅敏感性高、特异性好，还易于推广使用。为黏膜类天疱疮的血清学诊断，尤其是integrinβ4自身抗体阳性的黏膜类天疱疮的诊断提供了有效和便利的工具。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，所述试剂盒组成包括
(1)Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带(48孔)
(2)0U/ml的标准血清1(含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，1.5ml)
(3)100U/ml的标准血清2(integrinβ4IgG自身抗体阳性的患者血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，1.5ml)
(4)100U/ml的标准血清3(integrinβ4IgA自身抗体阳性的患者血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，1.5ml)
(5)酶标IgG抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，8ml)
(6)酶标IgA抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，8ml)
(7)反应缓冲液(含PBS、Tween20和0.05％NaN3的混合液，50ml)
(8)清洗缓冲液(含PBS、Tween20的10倍浓缩液，100ml)
(9)酶基质液(3，3’，5，5’-四甲级联苯胺二氢氯化物/过氧化氢(TMB/H2O2)溶液，8ml)
(10)中止液(0.5N盐酸溶液，8ml)
Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带的制备
(1)包被的材料
原核表达及纯化的人integrinβ4胞内区重组蛋白和胞外区重组蛋白(均含his标签)。
(2)重组蛋白溶解和包被
Integrinβ4胞内区重组蛋白和胞外区重组蛋白，均用PBS溶解，储存浓度为4mg/ml。包被前，两种重组蛋白等体积混合，然后使用PBS进行1000倍稀释，使得重组蛋白混合物终浓度达到2μg/ml。取96孔板进行蛋白的包被，每孔加入稀释后的重组蛋白混合物(2μg/ml)100μl，4度过夜(12-16小时)进行包被。
(3)封闭和干燥
弃掉包被的液体，每孔加入200μl 5％的脱脂奶粉(使用PBS稀释)，37度封闭1小时，弃掉封闭的液体，PBS洗涤3次(300μl/每孔)。弃净PBS，室温干燥。
本发明利用混合的integrinβ4胞内区重组蛋白和胞外区重组蛋白作为ELISA的包被蛋白，用于检测患者血清中存在的抗人integrinβ4的IgG和IgA抗体。
原理：人integrinβ4的IgG和IgA抗体检测试剂盒(ELISA)，利用ELISA方法定性测定血清中的Integrinβ4的IgG和IgA抗体。检测时，患者血清和标准血清加入到包被有integrinβ4重组蛋白的微孔条带，integrinβ4的抗体与抗原结合。洗涤后，去除未结合的血清蛋白，然后微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG(或IgA)抗体与人IgG(或IgA)结合，洗涤后，加入辣根过氧化物酶底物与辣根过氧化物酶反应，最后通过加入酸溶液终止酶反应。使用酶标仪测定吸光度，量化检测结果。
检测方法
(1)试剂准备
实验前，将所有检测材料置于室温下(20-30度)；根据需要用蒸馏水稀释适量的清洗缓冲液(1:10)。
(2)样本准备
1:50稀释每个患者血清：10μl血清加500μl反应缓冲液，混匀。
(3)检测步骤
1)微孔条带加入100μl稀释后样本(1:50)，室温下(20-30度)
孵育60分钟；
2)洗涤微孔条带：200μl/孔稀释后的清洗缓冲液，洗涤4次；
3)加入100μl/孔酶标记IgG或IgA抗体液，室温下(20-30度)
45分钟；
4)洗涤微孔条带：200μl/孔稀释后的清洗缓冲液，洗涤4次；
5)加入100μl/孔酶基质液，室温下(20-30度)孵育30分钟
6)加入100μl/孔终止液
7)读取吸光度(450nm)
8)结果计算和判定
结果计算和判定：
IgG抗体单位值(U/ml)计算公式：
(A450<样品>-A450<标准血清1>)*100/(A450<标准血清2>-A450<标准血清1>)
判定标准：单位值<30为阴性；单位值≥30为阳性。
IgA抗体单位值(U/ml)计算公式：
(A450<样品>-A450<标准血清1>)*100/(A450<标准血清3>-A450<标准血清1>)
判定标准：单位值<40为阴性；单位值≥40为阳性。
质量控制：
每个检测结果必须符合下列条件，否则结果无效：
(1)标准血清1的OD450小于等于0.100
(2)标准血清2和3的OD450大于等于0.500
实验结果：
特异性和敏感性：
Figure BDA0003999632360000061
重复性：
对5个样本，分别进行了6次的重复，每个样本重复的CV％值均小于15％。
检测范围：
本试剂盒的检测范围为5-150U/ml。
干扰物质：
需要避免使用高度溶血的样本，也要避免使用稀释倍数过低的高浓度血清进行检测。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
参考文献
[1]Kuang w,QianH,Zhang Q,Li W,Hashimoto T,Zeng X,LiX(correspondingauthor).Case report:Mucous membrane pemphigoid with IgG and IgA anti-lamininγ1antibodies and IgA anti-lamininα5antibodies.Front Immunol.2022Jun1；13:903174.doi:10.3389/fimmu.2022.903174.
[2]LiX,QianH,Sogame R,Hirako Y,Tsuruta D,Ishii N,Koga H,TsuchisakaA,Jin Z,Tsubota K,Fukumoto A,Sotozono C,Kinoshita S,Hashimoto T.Integrinβ4isamajor target antigen in pure ocular mucous membrane pemphigoid.Eur JDermatol.2016；26(3):247-53.

Claims (3)

1.人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成包括Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带、0U/ml的标准血清1、100U/ml的标准血清2、100U/ml的标准血清3、酶标IgG抗体、酶标IgA抗体、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液、中止液；其中所述0U/ml的标准血清1成分为含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；所述100U/ml的标准血清2成分为integrinβ4IgG抗体阳性血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；所述100U/ml的标准血清3成分为integrinβ4IgA抗体阳性血清稀释于含0.05％叠氮钠的反应缓冲液，含量为1.5ml；酶标IgG抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，含量为8.0ml；酶标IgA抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgA抗体，含量为8.0ml；反应缓冲液为体积占比99.9％的PBS、0.05％Tween20和0.05％NaN3的混合液，含量为50ml；清洗缓冲液为99.95％的PBS、0.05％Tween20的10倍浓缩液，含量为100ml；酶基质液为TMB和H2O2混合溶液，含量为8.0ml，其中TMB使用无水乙醇溶解，浓度为2.5mg/ml，H2O2浓度为0.03％体积比；中止液为0.5N盐酸溶液，含量为8ml。
2.根据权利要求1所述的人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带为48孔。
3.根据权利要求1所述的人integrinβ4自身抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述Integrinβ4胞内区和胞外区重组蛋白微孔条带制备方法为：Integrinβ4胞内区重组蛋白和胞外区重组蛋白，均用PBS溶解，储存浓度为4mg/ml；包被前，两种重组蛋白等体积混合，然后使用PBS进行1000倍稀释，使得重组蛋白混合物终浓度达到2μg/ml。取96孔板进行蛋白的包被，每孔加入稀释后浓度为2μg/ml的重组蛋白混合物100μl，4度过夜进行包被，时间12-16小时；包被完成后弃掉包被的液体，每孔加入200μl使用PBS稀释的5％的脱脂奶粉，37度封闭1小时，弃掉封闭的液体，300μl/每孔条件下PBS洗涤3次；弃净PBS，室温干燥。
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