CN116083439A - 一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用，涉及生物工程技术领域，其技术方案要点是：选择对霜疫霉菌稳定感病的荔枝品种和对抗病的荔枝品种的果实作为样品；将霜疫霉菌侵染后不同时间点的样品，利用转录组测序分析，获得一批差异表达基因；在从步骤S2中获得的所述差异表达基因中获得一个抗病相关基因CLP；基于转录组数据，克隆该基因序列全长；利用qRT‑PCR验证LcCLP1基因的相对表达水平。该基因具有广谱抗性，如果利用抗病资源的创制，可以达到一个基因的超表达可以对2种病原菌(荔枝炭疽菌和霜疫霉菌)防御的效果；该基因具有广谱抗性，在分子标记辅助育种中，早期选择抗病资源时，可以减少50％的工作量。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，它涉及一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用。
背景技术
荔枝是我国南方重要果树，在农业产业经济中占有重要的低位。但是，生产中荔枝容易遭受各种病虫害的侵袭，如荔枝炭疽菌和荔枝霜疫霉病。荔枝炭疽菌可以在全年整个树体发生，造成叶片枯死影响光合作用，花穗和幼果脱落，影响成花和结果，果实采后贮运过程中容易大范围爆发，严重影响果实的贮藏期和货架期。荔枝霜疫霉病一般发生在果穗和成熟果，影响成花和坐果，在采后果实上发生，造成果实的褐变和腐烂。荔枝炭疽病和霜疫霉病的为害是采后荔枝果实腐烂的主要原因。
目前生长中防治病害多采用杀菌剂，以化学杀菌剂为主，长久使用容易造成病害的耐药性增加，环境污染，果品农药残留等问题。利用抗性基因开展生物技术育种是解决病害的主要方法，也是长久有效的方法。而关键抗病基因的筛选是关键之一。
通过多年的研究，发现了稳定的荔枝霜疫霉高感的资源‘桂味’和高抗的资源‘黑叶’(Sunetal，2019)。以此为研究对照，开展了霜疫霉侵染后果皮的转录组测序分析(Sunetal，2019)，获得了一批差异表达基因(Sunetal，2019)。其中，一个仙茅甜蛋白类甘露糖结合凝集素家族蛋白(Curculin-likemannose-binding lectinfamilyprotein，CLP)基因相应抗病原菌的入侵在抗性资源的果皮中上调表达。在拟南芥中的研究发现，该基因在信号转导方面发挥作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用，分析该基因在荔枝抗病方面的功能，以期用于后续分子辅助育种，提高育种效率。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用，包括如下步骤：S1：选择对霜疫霉菌稳定感病的感病荔枝品种和对霜疫霉菌抗病的抗病荔枝品种的果实作为样品；
S2：将霜疫霉菌侵染后不同时间点的样品，利用转录组测序分析，获得一批差异表达基因；
S3：在从步骤S2中获得的所述差异表达基因中获得一个抗病相关基因CLP；进行转录，基于转录组数据，克隆该基因序列全长并命名为LcCLP1；
S4：以抗病荔枝品种和感病荔枝品种接种后的果皮为材料，利用qRT-PCR验证LcCLP1基因的相对表达水平。
本发明进一步设置为：步骤S3中所述的差异表达基因，其在对霜疫霉菌抗病品种的果皮中表达水平较高，在感病的品种的果皮表达水平较低。
本发明进一步设置为：所述步骤S1中，感病荔枝品种为‘桂味’荔枝品种，所述抗病荔枝品种为‘黑叶’荔枝品种。
综上所述，本发明具有以下有益效果：1.该基因具有广谱抗性，如果利用抗病资源的创制，可以达到一个基因的超表达可以对2种病原菌(荔枝炭疽菌和霜疫霉菌)防御的效果；2.该基因具有广谱抗性，在分子标记辅助育种中，早期选择抗病资源时，可以减少50％的工作量。
附图说明
图1是本发明实施例中转录组分析结果图；
图2是本发明实施例中接种炭疽菌的荔枝叶片中LcCLP1基因的相对表达水平；
图3是本发明实施例中4份荔枝资源CLP基因的核酸序列比对结果；
图4是本发明实施例中4份荔枝资源CLP基因的氨基酸序列比对结果。
具体实施方式
以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明。
实施例：一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白和应用，如图1、图2所示，包括利用对霜疫霉菌稳定感病的品种‘桂味’和抗病的‘黑叶’的果实为材料，以病原菌侵染后不同时间点的样品，利用转录组测序分析，获得一批差异表达基因(Sunetal，2019)。
在差异表达基因中获得一个抗病相关基因CLP(Curculin-like mannose-bindinglectinfamilyprotein，CLM)，其在对霜疫霉菌抗病品种的果皮中表达水平较高，在感病的品种的果皮表达水平较低；
在差异表达基因中，CLP基因(Litc.03B008940)在抗病的品种‘黑叶’中早期(接种后6h)表达水平快速升高，随后降低，从接种后48-72h表达水平继续升高(图1)。在感病的品种‘桂味’中表达水平持续较低，初步预测为抗病相关基因。
基于转录组数据，克隆该基因序列全长，命名为LcCLP1。该基因序列全长为1356bp，编码451个氨基酸。在图1中，I-guiwei：接种霜疫霉菌的桂味荔枝果皮；I-heiye：接种霜疫霉菌的黑叶荔枝果皮。以‘黑叶’和‘桂味’接种后的果皮为材料，利用qRT-PCR验证LcCLP1基因的相对表达水平。结果与转录组分析结果基本一致。
以不同荔枝基因型叶片为材料，接种炭疽菌，分析该基因的相应炭疽菌侵染的表达水平变化，如图2。发现，在对炭疽菌具有较强抗病性的材料ZW107中，该基因相对表达水平较高且随发病程度增加，表达水平上升；在对炭疽菌抗病性较差的材料ZW72中，该基因的相对表达水平随也随发布时间推迟而增加，但是相对表达水平较低，且变化较小。
克隆该基因，发现在不同的基因型中，该基因的DNA序列和氨基酸序列均有差异。感病的荔枝资源‘桂味’和ZW72的核酸序列和氨基酸序列一致，而抗病的资源‘黑叶’和ZW107与前两者均存在差异。‘黑叶’和前两者有15处核酸序列的差异，ZW107与前两者有3处核酸序列的差异。在氨基酸序列上，‘黑叶’和前两者有8个氨基酸序列的差异，ZQ107和前两者有3个氨基酸序列的差异。见图3，图4。
可见该基因具有广谱的抗病功能，可以用于生物技术育种研究，创制抗病资源，开发分子标记辅助育种技术。该基因具有广谱抗性，如果利用抗病资源的创制，可以达到一个基因的超表达可以对2种病原菌(荔枝炭疽菌和霜疫霉菌)防御的效果；该基因具有广谱抗性，在分子标记辅助育种中，早期选择抗病资源时，可以减少50％的工作量。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白，其特征是：包括如下步骤：
S1：选择对霜疫霉菌稳定感病的荔枝品种和抗病的荔枝品种的果实作为样品；
S2：将霜疫霉菌侵染后不同时间点的样品，利用转录组测序分析，获得一批差异表达基因；
S3：在从步骤S2中获得的所述差异表达基因中获得一个抗病相关基因CLP；进行转录，基于转录组数据，克隆该基因序列全长并命名为LcCLP1；
S4：以抗病荔枝品种和感病荔枝品种接种后的果皮为材料，利用qRT-PCR验证LcCLP1基因的相对表达水平。
2.根据权利要求1所述的一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白，其特征是：步骤S3中所述的差异表达基因，其在对霜疫霉菌抗病品种的果皮中表达水平较高，在感病的品种的果皮表达水平较低。
3.根据权利要求1所述的一种荔枝霜疫霉菌抗病基因LcCLP1及编码蛋白，其特征是：所述步骤S1中，感病荔枝品种为‘桂味’荔枝品种，所述抗病荔枝品种为‘黑叶’荔枝品种。
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