CN116082448A - 一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用，属于谷物及食源活性肽开发技术领域。其将米糠蛋白加入水中，通过调节pH使蛋白充分溶解后，加入具有亮氨酸倾向酶切位点的碱性蛋白酶进行第一阶段酶解，1h后再加入中性蛋白酶进行第二次酶解得到所述米糠蛋白降血糖肽。采用两步针对性酶解，可简便、快速的获得回收率高、α‑葡萄糖苷酶抑制活性高的的米糠蛋白肽。该生物活性肽可用于糖尿病预防/治疗药物，或作为功能食品配料，供糖尿病患者长期治疗保健使用。

Description

一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用，属于谷物及食源活性肽开发技术领域。
背景技术
近年来，随着我国经济实力的不断提升和国内物质生活的极大丰富，人口老龄化、亚健康和慢性疾病成为危害健康的主要因素。糖尿病是由于胰岛素分泌绝对或相对不足，及机体靶组织或靶器官对胰岛素敏感性降低引起的以血糖水平升高，可伴有血脂异常等为特征的代谢性疾病。根据国际糖尿病联盟发布的第十版全球糖尿病地图显示，在20～79岁的成年人中约有5.37亿患有糖尿病，占该年龄组全球人口的10.5％，预计到2030年该总人数将上升至6.43亿(11.3％)，到2045年更将上升至7.83亿(12.2％)。大量研究显示餐后血糖升高是导致糖尿病的主要原因之一。目前，α-葡萄糖苷酶被认为是预防和治疗糖尿病的主要靶标酶，抑制α-葡萄糖苷酶活性也是当前通过膳食降低餐后血糖水平的重要途径。目前上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，但该类药物常伴有腹胀、腹痛、腹泻、恶心、呕吐等副作用。因此，开发新型食品源α-葡萄糖苷酶抑制剂对膳食预防糖尿病具有重要意义。
健康中国概念开始引导居民形成更好的生活习惯和摄入更健康的食品。植物基食品因其对人体健康的诸多益处成为新热点，一些植物基食品已经形成较好的市场效益。植物蛋白是目前最受关注的植物基组分之一。国内外相关研究表明，以米糠蛋白为原料，经蛋白酶酶解或微生物发酵等方法可制得具有生物活性的蛋白肽。其中研究较多的有抗氧化、调节免疫、降血压、低致敏等，而源自米糠蛋白的降血糖肽目前关注较少。大量研究已证实生物活性肽具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，可作为膳食预防糖尿病的功能性配料。相关文献中对如何获得高活性的米糠蛋白降血糖肽没有进行针对性研究。因此，亟需开发一种稳定简便的且有降血糖效果的米糠蛋白肽制备工艺。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种米糠蛋白降血糖肽及其制备方法和应用，具有降血糖作用，且其源自天然植物蛋白，具有安全、易吸收等特点，可进行大规模工业化生产。
本发明的技术方案，一方面，本发明提供了一种米糠蛋白降血糖肽，所述米糠蛋白降血糖肽包含附表中所示的32个肽段的一种或多种。
进一步地，所述米糠蛋白降血糖肽应包含SEQ ID No.1-SEQ ID No.18中至少一种。
进一步地，所述米糠蛋白降血糖肽应包含肽段SEQ ID No.1。
具体的，所述米糠蛋白降血糖肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具体的，所述的米糠蛋白降血糖肽来源于米糠蛋白提取或人工合成。
另一方面，本发明提供了一种米糠蛋白降血糖肽的制备方法，所述制备方法通过双酶分步水解的方式，实现可控酶解制备降血糖肽，包括如下步骤：
(1)前处理：将米糠蛋白加入水中，混合均匀，得到米糠蛋白溶液；调节所述米糠蛋白溶液的pH值，搅拌使蛋白完全舒展溶解；
(2)一次酶解：加入具有明显的亮氨酸位点酶切倾向性的蛋白酶进行酶解；
(3)二次酶解：调节所得酶解液pH，加入中性蛋白酶进行二次酶解反应，灭酶，得到二次酶解液；
(4)后处理：将步骤(3)所述酶解液进行离心处理，取上清液，抽滤，旋蒸，冻干或喷雾干燥得到米糠蛋白降血糖肽；
(5)筛选：将所得米糠蛋白降血糖肽进行结构鉴定和虚拟筛选，得到高活性米糠蛋白降血糖肽。
进一步地，步骤(1)中将米糠蛋白按照料液比2％-8％加入超纯水中，30-50℃水浴搅拌混合，得到米糠蛋白的水溶液，随后调节pH值调节为8-10，充分搅拌至pH值稳定，得到预处理液。
进一步地，步骤(2)中加入亮氨酸位点酶切倾向性的蛋白酶的加入量为10-30U/mg米糠蛋白，酶解温度为40-60℃，pH不小于8进行酶解反应，时间为1-3h。
进一步地，步骤(3)中性蛋白酶加入量为10-30U/mg米糠蛋白，所述的酶解温度为35-40℃，调节pH值至6-8进行酶解反应，时间为1-3h。
进一步地，步骤(4)中取步骤(3)所述酶解液于沸水中煮沸10-20min灭酶，冷却至室温后离心，离心速度7000-9000g，离心时间10-30min；取上清液，0.1MPa抽滤，50-55℃旋蒸至肽液浓稠，-80℃冻干40-50h或在140℃下喷雾干燥得到米糠蛋白降血糖肽。
进一步地，步骤(5)中结构鉴定方法为HPLC-QTOF-MS/MS，将鉴定得到的肽段序列采用Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模版筛选出得分较高的配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，进而得到对α-葡萄糖苷酶具有高抑制活性的米糠蛋白肽；虚拟筛选结果显示1-18条肽段与α-葡萄糖苷酶结合打分小于-6kcal/mol，即1-18条肽段具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性。
以上方法中采用的pH调节剂具体为：碱性调节剂为1M的NaOH溶液，酸性调节剂为1M HCl溶液。
另一方面，本发明还提供了一种通过人工合成米糠蛋白降血糖肽的方法，具体如下：根据目标多肽的重量及分子量预估每个氨基酸投料量，每个氨基酸均使用带保护原料。将2-Cl(Trt)-Cl resin氯树脂放入反应器中，并加入二氯甲烷DCM浸泡30min；二甲基甲酰胺DMF洗涤树脂，然后抽干，重复4次。称取Fmoc-AA-OH(C端第一个氨基酸)和DCM、N,N-二异丙基乙胺DIEA加入到反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应2小时；补加0.5mL DIEA，0.5mL甲醇，2mL DCM，反应20min，封闭树脂上未反应的基团。向反应器中加入适量体积比20％的哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，反应20min，脱去Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤4次，然后抽干；称取Fmoc-AA-OH(C端第二个氨基酸，摩尔量为第一个氨基酸的3倍)，适量的HOBT和DIC加入到反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应1小时。DMF洗涤树脂，然后抽干，重复4次。向反应器中加入体积比20％的哌啶溶液，反应20min，脱去Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤4次，然后抽干；茚三酮法检测树脂颜色，判断脱保护是否成功；按照上述步骤依次连接剩余氨基酸。最后用切割试剂将多肽保护基团全部切除，并从树脂上切割下来，含有多肽的剪切液加入到冰乙醚中，多肽沉降后，体系离心去除上清，得到目标多肽。
又一方面，本发明提供了上述米糠蛋白降血糖肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
又一方面，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂包含上述米糠蛋白降血糖肽。
又一方面，本发明提供了上述米糠蛋白降血糖肽在制备降血糖药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种降血糖药物，所述的降血糖药物包含上述米糠蛋白降血糖肽。
具体地，所述的降血糖药物还包括药学上可接受的载体，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的降血糖药物为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
进一步具体地，所述的口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂或囊泡剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的注射制剂采用皮内、皮下、肌内、局部或静脉内注射作为给药方式。
又一方面，本发明还提供了上述米糠蛋白降血糖肽在制备降血糖保健品中的应用。
又一方面，本发明还提供了一种降血糖保健品，所述的降血糖保健品包含上述米糠蛋白降血糖肽。
本发明的有益效果：本发明提供了一种米糠蛋白降血糖肽，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其源于植物蛋白，安全性好，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。该生物活性肽可用于制备糖尿病治疗和/或预防药物，或作为功能食品添加剂，供糖尿病患者长期治疗保健使用。
本发明所述的生物活性肽来源于天然植物蛋白，具有安全、人体易吸收等特点，其制备原料为米糠蛋白，价格低廉且来源广泛，可进行大规模工业化生产。
附图说明
图1为米糠蛋白肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线图。
图2为米糠蛋白肽对小鼠餐后血糖的降低效果。
图3为米糠蛋白肽对血糖变化曲线下面积(AUC)影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1通过米糠蛋白提取米糠蛋白降血糖肽
使用双酶水解法得到米糠蛋白肽，具体步骤如下：首先按照料液比2％-8％称取米糠蛋白，加入超纯水中，搅拌至溶解后，调pH至10后加入10-30U/mg碱性蛋白酶，保持温度40℃，pH不小于8酶解1h。第一阶段酶解结束后，调整温度至50℃，调整pH至7，加入10-30U/mg中性蛋白酶继续酶解，水解过程保持温度为50℃，pH不小于6。水解结束后，水解液于沸水中煮沸10-20min，灭酶。冷却至室温后离心速度8000g，时间20-30min。取上清液0.45μm的抽滤膜进行抽滤，将获得的滤液进行旋蒸浓缩，冷冻干燥即为所述米糠蛋白降血糖肽。
结构鉴定方法为HPLC-QTOF-MS/MS，将鉴定得到的肽段序列采用Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模版筛选出得分较高的配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，进而得到对α-葡萄糖苷酶具有高抑制活性的米糠蛋白肽；虚拟筛选结果显示1-18条肽段与α-葡萄糖苷酶结合打分小于-6kcal/mol，即1-18条肽段具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性。
实施例2人工合成米糠蛋白降血糖肽
根据目标多肽的重量及分子量预估每个氨基酸投料量，每个氨基酸均使用带保护原料。将2-Cl(Trt)-Cl resin氯树脂放入反应器中，并加入二氯甲烷DCM浸泡30min；二甲基甲酰胺DMF洗涤树脂，然后抽干，重复4次。称取Fmoc-AA-OH(C端第一个氨基酸)和DCM、N,N-二异丙基乙胺DIEA加入到反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应2小时；补加0.5mLDIEA，0.5mL甲醇，2mL DCM，反应20min，封闭树脂上未反应的基团。向反应器中加入适量体积比20％的哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，反应20min，脱去Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤4次，然后抽干；称取Fmoc-AA-OH(C端第二个氨基酸，摩尔量为第一个氨基酸的3倍)，适量的HOBT和DIC加入到反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应1小时。DMF洗涤树脂，然后抽干，重复4次。向反应器中加入体积比20％的哌啶溶液，反应20min，脱去Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤4次，然后抽干；茚三酮法检测树脂颜色，判断脱保护是否成功；按照上述步骤依次连接剩余氨基酸。最后用切割试剂将多肽保护基团全部切除，并从树脂上切割下来，含有多肽的剪切液加入到冰乙醚中，多肽沉降后，体系离心去除上清，得到目标多肽。
实施例3米糠蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测
检测方法：在96孔酶标板中依次加入50μL 0.1mol/L PBS(0.01M，pH6.8)、50μL0.5U/mLα-葡萄糖苷酶及50μL米糠蛋白肽(Rice Bran Peptides,RBPs)或阿卡波糖(Acarbose)溶液(用PBS配制不同浓度的米糠肽/阿卡波糖溶液)，混匀后于37℃恒温反应15min后加入100μL 1.5mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-PNPG)，混匀后于酶标仪内37℃孵育30min后检测其在405nm波长下的吸光度值，重复实验3次，取平均值。
酶活性抑制率计算公式：I％＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100％；式中：A1为样液组的吸光度值，A2为以PBS代替酶溶液测得的样液组背景吸光度值，A3为以PBS溶液代替样品溶液测得的空白对照组吸光度值，A4为以PBS溶液代替样液与以PBS溶液代替酶溶液测得的空白对照组背景吸光度值。配制不同浓度多肽/阿卡波糖溶液后检测其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，检测结果如图1所示。
结果显示：米糠蛋白肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为2.265mg/mL，与阿卡波糖(IC50＝1.304mg/mL)相当。
实施例3米糠蛋白肽对小鼠餐后血糖变化影响
以ICR雄性小鼠为研究对象，实验开始前禁食不禁水过夜(12h)，检测空腹血糖(0h血糖)，按照空腹血糖值进行分组。之后分别以10mL/kg.bw对1-3组动物除均灌胃麦芽糖外，第二组动物在灌胃麦芽糖的同时灌胃阿卡波糖作为阳性对照，第三组动物在灌胃麦芽糖的同时灌胃米糠蛋白肽。以阿卡波糖为阳性对照，考察米糠蛋白肽的降血糖效果。灌胃后5、15、30、60、90、120min时尾静脉取血检测实时血糖，并计算各组别血糖变化曲线下面积。图2结果显示，与仅灌胃麦芽糖组相比，阿卡波糖组小鼠血糖升高趋势显著减弱。此外，米糠蛋白肽组小鼠灌胃后血糖升高值低于对照组，显示出良好降血糖效果。此外，如图3所示，对血糖变化曲线下面积分析发现，与对照组相比，米糠蛋白肽组血糖曲线下面积显著低于对照组，提示米糠蛋白肽具有优异的减缓餐后血糖升高活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种米糠蛋白降血糖肽，其特征是：其氨基酸序列包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.32所述肽段中的一种或多种。
2.如权利要求1所述米糠蛋白降血糖肽，其特征是：其氨基酸序列包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.18所述肽段中至少一种。
3.权利要求1所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：通过米糠蛋白提取或人工合成。
4.如权利3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：通过米糠蛋白提取的具体步骤如下：
(1)前处理：将米糠蛋白加入水中，混合均匀，得到米糠蛋白溶液；调节所述米糠蛋白溶液的pH值，搅拌使蛋白完全舒展溶解；
(2)一次酶解：加入具有明显的亮氨酸位点酶切倾向性的蛋白酶进行酶解；
(3)二次酶解：调节所得酶解液pH，加入中性蛋白酶进行二次酶解反应，灭酶，得到二次酶解液；
(4)后处理：将步骤(3)所述酶解液进行离心处理，取上清液，抽滤，旋蒸，采用冻干或喷雾干燥的方式得到米糠蛋白降血糖肽；
(5)筛选：将所得米糠蛋白降血糖肽进行结构鉴定和虚拟筛选，得到高活性米糠蛋白降血糖肽。
5.根据权利要求3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：步骤(1)中将米糠蛋白按照料液比2％-8％加入超纯水中，30-50℃水浴搅拌混合，得到米糠蛋白的水溶液，随后调节pH值调节为8-10，充分搅拌至pH值稳定，得到预处理液。
6.根据权利要求3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：步骤(2)中加入亮氨酸位点酶切倾向性的蛋白酶的加入量为10-30U/mg米糠蛋白，酶解温度为40-60℃，pH不小于8进行酶解反应，时间为1-3h。
7.根据权利要求3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：步骤(3)中性蛋白酶加入量为10-30U/mg米糠蛋白，所述的酶解温度为35-40℃，调节pH值至6-8进行酶解反应，时间为1-3h。
8.根据权利要求3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：步骤(4)中取步骤(3)所述酶解液于沸水中煮沸10-20min灭酶，冷却至室温后离心，离心速度7000-9000g，离心时间10-30min；取上清液，0.1MPa抽滤，50-55℃旋蒸至肽液浓稠，-80℃冻干40-50h或在140℃下喷雾干燥得到米糠蛋白降血糖肽。
9.根据权利要求3所述米糠蛋白降血糖肽的制备方法，其特征是：步骤(5)中结构鉴定方法为HPLC-QTOF-MS/MS，将鉴定得到的肽段序列采用Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模版筛选出得分较高的配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，进而得到对α-葡萄糖苷酶具有高抑制活性的米糠蛋白肽；虚拟筛选结果显示1-18条肽段与α-葡萄糖苷酶结合打分小于-6kcal/mol，即1-18条肽段具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性。
10.权利要求1所述米糠蛋白降血糖肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂或制备降血糖药物和保健品中的应用。
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