CN116082417A

CN116082417A - 一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法

Info

Publication number: CN116082417A
Application number: CN202111307464.3A
Authority: CN
Inventors: 周剑; 张宝蓉; 龚云麒; 方芳; 刘军锋
Original assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: KPC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2023-05-09

Abstract

本发明属于天然药物制备领域，公开了一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，包括：(1)提取：采用提取溶剂对拉萨大黄原料进行提取，浓缩，得提取浓缩液；(2)沉淀：将提取浓缩液静置，过滤，得过滤液；(3)大孔树脂纯化：将过滤液上样于大孔吸附树脂，收集含曲札茋苷的洗脱液，洗脱液浓缩，得浓缩液；(4)脱色：将所述浓缩液上样于脱色树脂层析柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，得浓缩液；(5)中高压制备色谱纯化：将所得的浓缩液样品注入中高压制备色谱，收集洗脱液，减压浓缩；(6)结晶：将所得的浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。本发明方法制备的曲札茋苷纯度高，生产效率高，生产工艺绿色环保，产品质量稳定。

Description

一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法

技术领域

本发明属于天然药物制备领域，具体地说，涉及一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法。

背景技术

曲札茋苷，中文名为白皮杉醇-3’-O-β-D-吡喃葡萄糖，英文名piceatannol-3’-O-β-D-glucopyranoside，类白色至淡黄色结晶性粉末。是从蓼科植物拉萨大黄的干燥根茎中提取分离得到的二苯乙烯的茋类化合物。因其对缺血后的脑神经保护和溶栓后神经保护方面具有较好的疗效，所以在心血管治疗方面有较大开发潜力。曲札茋苷能够抑制血栓形成、保护血管，相对于传统的抗血栓药，曲札茋苷没有胃肠道损伤、出血等副作用。

茋类化合物的分离方法传统上采用的是硅胶柱层析，所用的洗脱溶剂有乙腈、石油醚等有机溶剂。曲札茋苷粗分离物中丹叶大黄素与曲札茋苷结构极其相似，较难分离。硅胶柱层析纯化法用乙腈-水体系进行分离虽然可以提高曲札茋苷的纯度。但是乙腈属于二类溶剂，在原料药溶剂残留中具有较高的要求且存在很大的安全隐患。同时，硅胶填料也存在载样量小、层析效率低、使用次数少、固废量大等缺点。因此，一种高效、经济且稳定的曲札茋苷提取纯化方法对后续曲札茋苷药物的研究具有重要意义。

在现有技术中，公开号为CN102659861A的专利申请公开了一种曲札茋苷的提取纯化方法，采用95％乙醇提取，利用大孔树脂和脱色树脂进行分离纯化，并用重结晶法进行精制，得到纯度为98.7％的曲札茋苷纯品；公开号为CN107474083A的专利申请公开了一种大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，采用高浓度乙醇提取，再用树脂柱分离，最后用高速逆流色谱进行纯化，得到纯度为98.5％的苯乙烯类化合物。以上专利中采用重结晶方法进行纯化，所得样品纯度低，而采用高速逆流色谱方法纯化，生产规模较小，不利于工业化生产，为后续曲札茋苷产业化放大生产带了很大的影响。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法。本发明在现有技术的基础上，对曲札茋苷提取纯化工艺进行改进，采用中高压制备色谱纯化法制备高纯度的曲札茋苷，大大提高了曲札茋苷的生产效率，并且整个过程只使用了安全无毒的溶剂水和乙醇，生产工艺绿色环保，产品质量稳定，为曲札茋苷的提取纯化工艺提供一种新思路。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，包括：

(1)提取：采用提取溶剂对拉萨大黄原料进行提取，浓缩，得提取浓缩液；

(2)沉淀：将提取浓缩液静置，过滤，得过滤液；

(3)大孔树脂纯化：将过滤液上样于大孔吸附树脂，收集含曲札茋苷的洗脱液，洗脱液浓缩，得浓缩液；

(4)脱色：将所述浓缩液上样于脱色树脂层析柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，得浓缩液；

(5)中高压制备色谱纯化：将步骤(4)所得的浓缩液样品注入中高压制备色谱，收集洗脱液，减压浓缩；

(6)结晶：将步骤(5)所得的浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

本发明的制备方法，将拉萨大黄原料依次进行提取，沉淀，大孔树脂纯化、脱色树脂层析脱色，中高压制备色谱纯化，结晶，得到高纯度的曲札茋苷。所得曲札茋苷纯品中曲札茋苷含量均在99％以上，纯度大大提高。本发明在现有技术的基础上，对曲札茋苷提取纯化工艺进行改进，采用中高压制备色谱纯化法制备高纯度的曲札茋苷，并摸索优化了中高压制备色谱纯化法的纯化条件，既提高了产品纯度，同时还可以提高生产效率。本发明方法的整个过程只使用了安全无毒的溶剂水和乙醇，生产工艺绿色环保，产品质量稳定

进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，中高压制备色谱系统中填充的聚合物填料选自Uni PS，Uni PSA，Uni PSN，Uni PMM中的任意一种，粒径大小为5～70μm，孔隙大小为

优选的，所述中高压制备色谱的压力为5～25bar。

进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的1～3倍。例如，聚合物填料单位可以为mL，拉萨大黄原料重量可以为g。或者，聚合物填料单位可以为L，拉萨大黄原料重量可以为Kg。

作为较优选的方案，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的2～3倍。

进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，设定的波长为319nm。

进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，采用乙醇-水的体系进行平衡和洗脱。

本发明的中高压制备色谱纯化中，采用乙醇-水的体系进行平衡和洗脱，既能够实现很好的洗脱曲札茋苷，而且洗脱剂为水醇混合液，成本低，对环境友好。

进一步的方案，步骤(5)中，所述洗脱程序为：20％～35％乙醇水溶液洗脱，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇；再100％乙醇洗脱1～2倍柱体积进行冲洗，洗脱结束后用20％～35％乙醇水溶液平衡；

优选的，上样流速为50～100mL/min；洗脱和平衡线流速为200～400mL/min。

进一步的方案，步骤(4)中，采用乙醇-水的洗脱体系进行等梯度洗脱；

优选的，步骤(4)中，乙醇的洗脱浓度为80％以上，洗脱体积为2～8倍。

进一步的方案，步骤(4)中，大孔吸附树脂包括D101型吸附树脂。

进一步的方案，步骤(3)中，采用乙醇-水的洗脱体系进行等梯度洗脱；

优选的，步骤(3)中，乙醇的洗脱浓度为20～40％，洗脱体积为2～8倍。

进一步的方案，步骤(3)中，脱色树脂层析柱可以采用现有技术中已有的脱色树脂。

进一步的方案，步骤(2)中，将提取浓缩液加水进行搅拌溶散后静置，过滤；

优选的，加水量为1～3倍，静置时间为24～48小时。

本发明中提取浓缩液经过沉淀步骤，加水静置的沉淀效果好，部分脂溶性成分、杂质在静置沉淀中析出，有利于纯化。

进一步的方案，步骤(1)中，向拉萨大黄粗粉中加入乙醇溶液，连续加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液；

优选的，乙醇溶液的体积用量为拉萨大黄粗粉质量的6～8倍；

优选的，所述乙醇溶液的浓度为80～95％。

本发明中，制备得到的曲札茋苷纯品的含量采用高效液相色谱法进行测定。

检测方法：

色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟1.0ml；检测波长为319nm；柱温30℃；理论板数按曲札茋苷峰计算应不低于2000。

测定法取本品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加95％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加95％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明对曲札茋苷提取纯化工艺进行改进，采用中高压制备色谱纯化法制备高纯度的曲札茋苷，并摸索优化了中高压制备色谱纯化法的纯化条件，既提高了产品纯度，同时还可以提高生产效率。本发明的方法进一步降低了杂质水平，所得曲札茋苷纯品中曲札茋苷含量在99％以上，较传统工艺有了明显的提升。

(2)本发明摸索优化了中高压制备色谱纯化法纯化曲札茋苷的纯化条件，适用性好，中高压制备色谱中聚合物填料处理效率高，且聚合物填料可以重复使用，节约成本，还可以提高生产效率，可运用于工业化生产。

(3)本发明方法的整个过程只使用了安全无毒的溶剂水和乙醇，生产工艺绿色环保，产品质量稳定。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是实施例1中曲札茋苷纯化后HPLC谱图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)提取：向2.5kg拉萨大黄粗粉中加入8倍的95％的乙醇溶液，连续加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液。

(2)提取液沉淀：将提取浓缩液加4L水搅拌溶散进行搅拌溶散后静置，过滤。

(3)大孔树脂层析：取滤液过D101大孔树脂层析柱进行分离，采用25％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，洗脱体积为7倍，从第2倍体积开始收集，第6倍体积结束，将洗脱液减压浓缩至无醇。

(4)脱色：将上述浓缩液过脱色树脂层析柱，采用90％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，洗脱体积为7倍，从第2倍体积开始收集，第6倍体积结束，将洗脱液减压浓缩至无醇。

(5)中高压制备色谱纯化：将5L聚合物填料Uni PS 40-300装入中高压制备色谱系统中，粒径大小为40μm，孔隙大小为

设定波长为319nm，用将上述浓缩液注入中高压制备色谱中，采用25％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，控制流速为400mL/min，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇。再100％乙醇洗脱2倍柱体积，洗脱结束后用25％乙醇水溶液平衡；上样流速为70mL/min；洗脱和平衡线流速为400mL/min。

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

纯化的曲札茋苷的HPLC谱图如图1所示。

实施例2

设定波长为319nm，用将上述浓缩液注入中高压制备色谱中，采用30％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，控制流速为400mL/min，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇。再100％乙醇洗脱2倍柱体积，洗脱结束后用30％乙醇水溶液平衡；上样流速为70mL/min；洗脱和平衡线流速为400mL/min。

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

实施例3

(5)中高压制备色谱纯化：用5L聚合物填料Uni PS 40-300装入中高压制备色谱系统中，粒径大小为40μm，孔隙大小为

设定波长为319nm，用将上述浓缩液注入中高压制备色谱中，采用35％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，控制流速为400mL/min，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇。再100％乙醇洗脱2倍柱体积，洗脱结束后用25％乙醇水溶液平衡；上样流速为70mL/min；洗脱和平衡线流速为400mL/min。

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

实施例4

(5)中高压制备色谱纯化：用4.5L聚合物填料Uni PS 30-300装入中高压制备色谱系统中，粒径大小为30μm，孔隙大小为

设定波长为319nm，用将上述浓缩液注入中高压制备色谱中，采用25％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，控制流速为400mL/min，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇。再100％乙醇洗脱2倍柱体积，洗脱结束后用30％乙醇水溶液平衡；上样流速为70mL/min；洗脱和平衡线流速为400mL/min。

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

实施例5

(5)中高压制备色谱纯化：用4.5L聚合物填料Uni PS 40-300装入中高压制备色谱系统中，粒径大小为40μm，孔隙大小为

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

实施例6

设定波长为319nm，用将上述浓缩液注入中高压制备色谱中，采用35％乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，控制流速为400mL/min，从曲札茋苷出峰时开始收集洗脱液，直至曲札茋苷出峰结束后停止收集，洗脱液减压浓缩至无醇。再100％乙醇洗脱2倍柱体积，洗脱结束后用35％乙醇水溶液平衡；上样流速为70mL/min；洗脱和平衡线流速为400mL/min。

(6)结晶：将上述浓缩液静置结晶，过滤，得曲札茋苷纯品。

对比例1

按照专利CN102659861A中实施例1的曲札茋苷提取纯化方法进行重复试验。

对比例2

按照专利CN101787061A中实施例3的曲札茋苷提取纯化方法进行重复试验。

将实施例1-6和对比例1-2制备的曲札茋苷产品采用高效液相色谱法进行测定，具体包括：

对照品溶液的制备：精密称取曲札茋苷对照品适量，置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：分别取实施例1-6和对比例1-2制备的曲札茋苷纯品10mg，各置于置50ml量瓶中，加95％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加95％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按下表中的规定进行梯度洗脱，测定，即得。

检测方法：

结果：实施例1-6及对比例1-2的检测结果如下表1所示：

表1

从试验结果可知，使用本发明提取纯化方案曲札茋苷纯品中曲札茋苷含量均在99.2％以上，有较高的提升。

试验例1中高压制备色谱纯化的条件筛选优化

(1)考察不同洗脱液的影响

本试验与实施例1的区别在于，中高压制备色谱纯化步骤中分别采用不同浓度的洗脱液，其他方法和步骤与实施例1相同。采用上述测定方法分别检测各组得到的曲札茋苷的含量，结果如下表所示。

表2

乙醇浓度(％)	曲札茋苷含量(％)
		25	99.8
30	99.1
		35	98.6
40	95.4

如上表2结果所示，中高压制备色谱纯化步骤中采用20％～35％乙醇水溶液进行洗脱时，得到的曲札茋苷含量高，其中，25％乙醇水溶液洗脱纯化效果最好。当乙醇的浓度超过35％时，曲札茋苷含量下降。

(2)考察不同洗脱液的影响

本试验与实施例1的区别在于，中高压制备色谱纯化步骤中采用的聚合物填料体积与拉萨大黄重量的比值不同，其他方法和步骤与实施例1相同。采用上述测定方法检测各组得到的曲札茋苷的含量，结果如下表3所示。

表3

填料体积/药材重量	曲札茋苷含量(％)
		1(2.5L/2.5kg)	96.4
2(5L/2.5kg)	99.8
		3(7.5L/2.5kg)	99.7

如上表3结果所示，中高压制备色谱纯化步骤中，聚合物填料体积为拉萨大黄重量2-3倍时，得到的曲札茋苷的含量更高，达到99.7％以上。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，包括：

(2)沉淀：将提取浓缩液静置，过滤，得过滤液；

2.根据权利要求1所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，中高压制备色谱系统中填充的聚合物填料选自Uni PS，Uni PSA，Uni PSN，Uni PMM中的任意一种，粒径大小为5～70μm，孔隙大小为

优选的，所述中高压制备色谱的压力为5～25bar。

3.根据权利要求1或2所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的1～3倍；

优选的，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的2～3倍。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，设定的波长为319nm。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，采用乙醇-水的体系进行平衡和洗脱。

6.根据权利要求5所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述洗脱程序为：20％～35％乙醇水溶液洗脱1～8倍柱体积，收集曲札茋苷；100％乙醇洗脱1～2倍柱体积进行冲洗，洗脱结束后用20％～35％乙醇水溶液平衡；

7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，采用乙醇-水的洗脱体系进行等梯度洗脱；

8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，采用乙醇-水的洗脱体系进行等梯度洗脱；

9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，将提取浓缩液加水进行搅拌溶散后静置，过滤；

优选的，加水量为1～3倍，静置时间为24～48小时。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种高纯度曲札茋苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，向拉萨大黄粗粉中加入乙醇溶液，连续加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液；

优选的，所述乙醇溶液的浓度为80～95％。